עמאד עווד

נור אלדין אבו רמוז

HPLC כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה דו''ח מסכם:

מהלך ניסוי:

חלק א':הכנת הסטנדרטים:

4שקלנו mg(מכל אחד מהסטנדרטים Caffeine,Benzoic Acid ,Aspartame) של כל אחד מהסטנדרטיםmg 4ושמנו כל אחד בכוס כימית,אחר כך שקלנו

.MIXושמנו אותם ביחד בתוך כוס כימית אשר קראנו לה ( -80%במקביל הוכנה הפזה הנעה אשר מורכבת מ Acetic Acid 1 M

, 20% Methanol-העברנו ל.)MIX 10 ולכל אחד מהסטנדרטים mLשל הפזה .הנעה

התחלנו להמיס את האבקה ע''י ערבוב בוורטקס כי המכשיר מודד את היהBenzoic Acidהדוגמאות בפזה נוזלית,כל החומרים התמוססו חוץ מה-

קשה להמיס אותו,לכן נסינו להמיס עם פלטה חשמלית ומגנט עד שראינושהכל התמוסס.

ביצענו תהליך סינון ע''י מזרק ופילטרים על מנת לסלק את כל החלקיקים MIX ,העברנו את כל הסטנדרטים וה-HPLCאשר עלולים להפריע לבדיקה ב-

שאחרי סינון לויאלים מסומנים כהכנה לבדיקה.

: HPLC חלק ב':בדיקת הדוגמאות במכשיר

-התחלנו לבדוק את הMIX והסטנדרטים במכשיר HPLCשמנו את הויאלים, בתוך מגש בסדר הבא:

1:BLANK. 2:MIX. 3:Caffeine. 4:Benzoic Acid. 5:Saccharin.

כאשר הויאל של הבלנק מכיל את הפזה הנעה לבד.-בהזרקה ראשונה הזרקנו את כל הסטנדרטים והMIX 1.5 בקצב זרימה של

mL/min עם pH=2 דקות .10.כך שמשך ההפרדה -בהזרקה שניה שינינו את הpH-ל pH=3 1.5 עם קצב זרימה של mL/minכך

דקות כי היתה7 עם בלנק.עצרנו את ההפרדה אחרי MIXשבדקנו את ה-הפרדה טובה.

בהזרקה שלישית בדקנו את כל הדוגמאות עםpH=4 1.5 בקצב זרימה של mL/min דקות.10.הפרדה למשך

-0.75בהזרקה רביעית עשינו שינוי בקצב הזרימה ל mL/min עם pH=2 דקות.10ובדקנו את כל הדוגמאות,ההפרדה היתה למשך

דיון ותוצאות :

PH , ההשפעה של HPLCבניסוי אנו בדקנו את ההפרדה של חומרים שונים ב הפאזה הנעה על איכות ההפרדה וזמן השהיה וגם את קצב הזרימה על איכות

ההפרדה , בניסוי שלנו אנו בדקנו את החומרים הממתיקים והתוספים שיש . Caffiene , Benzoic Acid , Saccharinבמשקאות הקלים חומרים אלו הם :

חומרים אלו מסיסים לכן דרך טובה לבדוק את הימצאותם במשקאות היא על ידיHPLC שהיא כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה , ההפרדה ב HPLCמתאימה לבדיקה

ואת קצב הזרימה במכשיר. PHכמותית ואיכותית, בניסוי שלנו אנו שנינו את ה

ml/min 1.5 ומהירות זרימה PH=2הזרקה ב .1החומרים שנבדקו הסטנדרטים של החומרים ותערובת שלהם

BLANKהזרקה של חומר ה

% של חומצה אצטית בריכוז80הבלנק מכיל את הפאזה הנעה לבד שזה 20% ו 1Mשל

של מתאנול , הזרקה של הבלנק באה במטרה שנבדוק כי הפאזה הנעה נקייה מזיהומים , ניתן לראות בכרומטוגרמה של הבלנק כי מופיע פיק שלילי

כתוצאה מהפרעה בשיווי משקל בתוך הקולונה .

הזרקה של תערובת הסטנדרטים

בהזרקה של התערובת היו צפוי שנקבל שלושה פיקים בזמנים שונים עבור כל אחד מהחומרים שבתוך התערובת , ניתן לראות כי קיבלנו שני פיקים אשר צמודים אחד

דקות , ניתן לראות כי הפיקים מחוברים בבסיס2.01 דקות והשני ב 1.26בזמן של שלהם ואין הפרדה טובה בנוסף הפיק של החומר השלישי לא מופיע וזה בגלל

חומציPHהחפיפה והפרדה לא טובה אשר נובעת מהתנאים של הפאזה הנעה ב מאוד איכות ההפרדה נפגמת בצורה גדולה וזה מסביר את הרזולוציה הנמוכה

והקושי בלזהות את שלושת החומרים והפיקים שלהם.

הזרקה של סטנדרטים

Benzoic Acid

Caffeine

Saccharin

בהזרקה של הסטנדרטים עבור כל כרומטוגרמה של חומר היה צפוי כי נראה פיק אחד בודד אבל ניתן לראות כי בכל הכרומטגרמות ישנם שני פיקים אחד מהם קטן ובנוסף לצורת הכתף של הפיקים בבסיס , הבסיס המשותף של הפיקים מסביר את איכות הרזולוציה וההפרדה וזה נובע מהתנאים של הפאזה הנעה אשר לא נמצאת

האופטימלי , הפיק הנוסף שבדרך כלל מופיע בגובה נמוך הוא היתכנות שלPHב מציאת זיהום מסוים במערכת .

ml/min 1.5 ומהירות זרימה PH=3הזרקה ב .2החומרים שנבדקו הם התערובת של הסטנדרטים והבלנק

BLANKהזרקה של

בהזרקה של הבלנק היה צפוי כי לא נקבל פיקים אשר מעידים על הימצאות חומרים , אבל קיבלנו מספר פיקים אשר מעידים על זיהום שנמצא בתוך

הקולונה , גם כן ניתן לראות כי במשך כל ההפרדה הקו של הכרומטוגרמה עולה ויורד באופן לא קבוע ניתן לתאר את הימצאות של הפיקים וההפרעה

דקות של ההפרדה על ידי שיש הפרעה בשיווי10בכרומטוגרמה לאורך ה משקל בקולונה , ניתן היה להתגבר על הבעיה אם היינו מבצעים שטיפה של

הקולונה לפני ההרצה או שנותנים יותר זמן להרצה של הבלנק על שהתנאים יתייצבו בתוך הקולונה וזאת בגלל שאנו עברנו מהפרדה ברמת

PH=2 לרמת PH=3וכנראה שהסביבה מושפעת מהחומציות הגבוהה שהייתה.

הזרקה של תערובת הסטנדרטים

ניתן לראות כי איכות הכרומטוגרמה יותרPH=3בהזרקה של התערובת ב , וניתן לראות מספר פיקים אשר לאPH=2טובה מאשר הכרומוטוגרמה ב

נבלעים אחד בשני , ניתן לראות כי יש פיצול של הפיקים וזה נובע בגלל ריכוזגבוה של החומר שמוזרק להפרדה או זיהום בתוך הקולונה.

ניתן לראות כי הפיקים לא מופרדים בצורה טובה בבסיס שלהם וזה מעיד על רוזולוציה נמוכה בהפרדה, בכללי ניתן לשער ולזהות את החומרים אשר

הוזרקו בתערובת אבל לא באופן מדויק.ml/min 1.5 ומהירות זרימה PH=4הזרקה ב .3

החומרים שנבדקו הסטנדרטים של החומרים ותערובת שלהם

BLANKהזרקה של ה

10ניתן לראות כי הכרומטוגרמה של הבלנק לא היתה טובה ולא יציבה לאורך של דקות ההפרדה , וזה נובע מאותם סיבות אשר הזכרנו שהם הפרעה בשיווי משקל

. PH=4 ל PH=3של הקולונה , התנאים בקולונה לא יציבים כתוצאה ממעבר מ

הזרקה של סטנדרטים

Caffeine

Benzoic Acid

Saccharin

בכרומטוגרמות שקיבלנו עבור כל אחד מהסטנדרטים לבד ניתן לראות שהתקבל שני פיקים אשר הפיק הגבוה ביותר מייצג את החומר הרצוי לעומת הפיק הנוסף

נובע מזיהום במערכת. אך2שהופיע בכל הכרומטוגרמות בסביבות דקות אשר מבחינת איכות ההפרדה ניתן לראות שהפיקים עם בסיס יותר צר אשר זה מעיד על

PH=3 בהשוואה לאיכות ההפרדה ב PH=4רזולוציה יותר טובה בהפרדה בתנאים של .

הזרקה של תערובת הסטנדרטים

ב הסטנדרטים תערובת של פיקיםPH=4בהזרקה עם כרומטוגרמה קיבלנו ברזולוציה טובה יותר כך שהבסיס של הפיקים יותר צר,אך הפיקים הגבוהים מאודצמודים ולא מופרדים היטב כך שקשה להבדיל בין שני החומרים, זה נובע מכך שה

Caffeine-ו Benzoic Acidשניהם עם זמן השהיה מאוד דומה לכן למרות השיפור ברזולוציה עדיין איכות ההפרדה לא היתה מספיק טובה כדי להבדיל ביניהם, ואזה עבור הפיקים. מצימוד להיפטר מנת על מקסימלית לרזולוציה להגיע צריך

Saccharinניתן לראות בכרומטוגרמה של התערובת את הפיקים שמייצגים אותו דקות.0.99,1.26אשר הופיעו בזמנים

ml/min 0.75 ומהירות זרימה PH=2.הזרקה ב 4

החומרים שנבדקו הסטנדרטים של החומרים ותערובת שלהם

הזרקה של תערובת הסטנדרטים

הזרקה של סטנדרטים

Caffeine

Benzoic Acid

Saccharin

בחלק זה של הניסוי שינינו את הפרמטרים של המכשיר כדי לבדוק את ההשפעה על הוא מהירות הזרמת הפאזהHPLCאיכות ההפרדה , אחד הפרמטרים החשובים ב

הנעה לתוך הקולונה, ככל שהמהירות של הפאזה הנעה גבוהה יותר אזי ההפרדה תהיה גרועה יותר וזה בגלל שהחומר לא ביצע מספיק אינטראקציות עם הפאזה הנחה , וככל שמקטינים את מהירות הזרימה אמור שנקבל הפרדה טובה יותר בגלל

שזמן האנטראקציות גבוה יותר .

לפי ההזרקותml/min 0.75 וקצב זרימה של PH=2במצב שלנו אנו עבדנו עם ה רמת כי יודעים אנו , לפני מניתוחPHשביצענו כתוצאה טובה לא הזאת

ל עד הזרימה מהירות הורדת , נמוכה היתה 0.75הכרומטוגרמה שהרזולוציה ml/minהסטנדרטים של הכרומטגרמות לפי , הרזולוציה את לשפר במטרה

היא יותרPHוהתערובת זה לא עזר בהרבה , הסיבה העיקרית היא כי השפעת ה דומיננטית .

דיון מסכם :

היא אחת השיטות הנפוצות ביותר בתעשיית הפארמה ובזיהויHPLCשיטת ההפרדה חומרים מסיסים , מבחינת קביעה איכותית וכמותית ניתן לזהות תרכובות של תמיסות

באמצעות הכרומטגרמותHPLCוכימות כל חומר בנפרד , מנתחים את תוצאות ה שיוצאות אחרי הזרקה של חומר מסוים, לפי הכרומטגרמות ניתן לראות את איכותיותר פיצולים בפיקים או תופעות של כתף או ההפרדה של החומרים ככל שיש

צימוד של הפיקים זה נובע מפרמטרים לא אופטימליים בעבודה עם החומרים.

משפיע באופן גדול מאוד על איכות ההפרדה וזה כתוצאה מההשפעה עלPHה אופן האינטראקציות בין החומרים בפאזה הנעה לאלו בפאזה הנחה .

מהירות הזרימה של הפאזה הנעה גם כן משפיעה על הרזולוציה של ההפרדה וזהכתוצאה מפחות אינטראקציות בפרק זמן הנתון .

הפיצול בפיקים נובע מזיהום בקולונה וריכוז גבוהה של החומר ניתן לטפל בעניין עלידי החלפת או על והמערכת מהימצאות של כל חומר אחר, ניקוי הקולונה ידי

הקולונה וניתן גם לשנות את ההרכב של הפאזה הנעה.

( נובע מפגם מסוים בקולונה או בועות אוויר אשר נמצאותTailingאפקט של זנב ) לא אופטימלי בפאזה הנעה , טמפרטורה לא תקינה , ניתןPHבמערכת וגם כן יש

, שימוש בקולונה ידי שטיפה של הקולונה באופן הפוך לטפל בבעיה הזאת על PH , לחומרים בסיסיים נשתמש ב PHארוכה יותר , שליטה בפאזה הנעה ורמות ה

נמוך ולהפך.

על ידי הורדת מהירות הזרימהPH=3בניסוי שלנו ניתן לשפר את איכות ההפרדה ב וכמות זמן וכך בקולונה זמן יותר ישאר יגרום שהחומר וזה הנעה, של הפאזה יותר ניתן לראות רוזולוציה גבוהה יותר גבוה וכתוצאה מזה יהיה האינטראקציות

בהפרדה .

יגרום ליותר חשיפה ואינטראקציות שיגרמו בנוסף ניתן להאריך את הקולונה וזה לשיפור ברזולוציה ופחות פיצולים.

ביבליוגרפיה

Brlan A. Bldlingmeyer, Journal of Chemical Education, 68, 1991, A195

http://www.proteinsandproteomics.org/content/free/protocols_1/pro04.pdf

Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry Settle 1997