Hướng dẫn kỹ thuật lấy mẫu, bảo Hướng dẫn kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm quản và vận chuyển bệnh phẩm

cúm Acúm A

ThS. Nghiêm Mỹ NgọcThS. Nghiêm Mỹ Ngọc

Khoa Xét Nghiệm Khoa Xét Nghiệm Bệnh viện Bệnh Nhiệt ĐớiBệnh viện Bệnh Nhiệt Đới

Tháng 04 năm 2014Tháng 04 năm 2014

Nội dungNội dung

Mục đích và tầm quan trọng của việc lấy mẫu xét nghiệm

Phương pháp lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm cúm A

Xét nghiệm chẩn đoán virus cúm A

Mục tiêu lấy mẫu xét nghiệm Mục tiêu lấy mẫu xét nghiệm

Xác định ca bệnhXác định ca bệnh Xác định ổ dịch do virus Xác định ổ dịch do virus Theo dõi sự biến đổi gen của virusTheo dõi sự biến đổi gen của virus Phát hiện đột biến kháng thuốcPhát hiện đột biến kháng thuốc

Nguyên tắc lấy bệnh phẩmNguyên tắc lấy bệnh phẩm

Đảm bảo chất lượng của xét nghiệm virus cúm Đảm bảo chất lượng của xét nghiệm virus cúm A/H7N9A/H7N9 Thời điểm lấy bệnh phẩmThời điểm lấy bệnh phẩm Loại bệnh phẩmLoại bệnh phẩm Chất lượng của bệnh phẩmChất lượng của bệnh phẩm Điều kiện bảo quản và vận chuyển bệnh phẩmĐiều kiện bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm

Đảm bảo các quy tắc an toàn sinh họcĐảm bảo các quy tắc an toàn sinh học Lấy bệnh phẩmLấy bệnh phẩm Vận chuyển bệnh phẩmVận chuyển bệnh phẩm Thực hiện xét nghiệm cúm A/H7N9Thực hiện xét nghiệm cúm A/H7N9

Tiêu chuẩn chất lượng mẫu bệnh phẩmTiêu chuẩn chất lượng mẫu bệnh phẩm

Đúng thời điểmĐúng thời điểm 3 ngày đầu của bệnh3 ngày đầu của bệnh Trước khi dùng thuốc kháng virusTrước khi dùng thuốc kháng virus

Đúng chủng loạiĐúng chủng loại Đúng thao tácĐúng thao tác Bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm Bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm

đúng cáchđúng cách

Bệnh phẩm xét nghiệm cúm ABệnh phẩm xét nghiệm cúm A

Mục tiêu phát hiệnMục tiêu phát hiện Loại bệnh phẩmLoại bệnh phẩm Kỹ thuật xét nghiệmKỹ thuật xét nghiệm

Vật liệu di truyền RNA Vật liệu di truyền RNA của viruscủa virus

Tế bào biểu mô đường Tế bào biểu mô đường hô hấphô hấp

Dịch tiết đường hô hấpDịch tiết đường hô hấp

- RT PCR- RT PCR

- Real time RT-PCR- Real time RT-PCR

- Nucleotide sequencing- Nucleotide sequencing

Kháng nguyên virus Kháng nguyên virus - Test nhanh

- Miễn dịch sắc kí

Virus toàn vẹnVirus toàn vẹn Cấy phân lập trên tế bào hoặc phôi trứng gà

Kháng thể kháng virusKháng thể kháng virus Huyết thanhHuyết thanh - Hemagglutination Inhibition Test.

- Micro-Neutralization Assay

Đường hô hấp trênĐường hô hấp trên Dịch họngDịch họng Dịch mũiDịch mũi Dịch tỵ hầuDịch tỵ hầu

Đường hô hấp dướiĐường hô hấp dưới Dịch nội khí quảnDịch nội khí quản Dịch phế nangDịch phế nang

Huyết thanh Huyết thanh Giai đoạn cấpGiai đoạn cấp Giai đoạn hồi phục Giai đoạn hồi phục

(2 mẫu cách nhau 10-14 (2 mẫu cách nhau 10-14 ngày)ngày)

Bệnh phẩm xét nghiệm cúm ABệnh phẩm xét nghiệm cúm A

Kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản và Kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm cúm Avận chuyển bệnh phẩm cúm A

Chuẩn bị thu thập bệnh phẩmChuẩn bị thu thập bệnh phẩm Dụng cụ, môi trườngDụng cụ, môi trường Phiếu thu thập bệnh phẩmPhiếu thu thập bệnh phẩm Sử dụng trang phục bảo hộ cá nhânSử dụng trang phục bảo hộ cá nhân

Dụng cụ - môi trườngDụng cụ - môi trường

Dụng cụ thu thập bệnh phẩmDụng cụ thu thập bệnh phẩm Tăm bông vô trùngTăm bông vô trùng Dây nhựa mềm (catheter)Dây nhựa mềm (catheter) Cây đè lưỡiCây đè lưỡi Dây garoDây garo Bơm tiêm vô trùngBơm tiêm vô trùng Túi nylon để gói bệnh phẩmTúi nylon để gói bệnh phẩm Bình lạnh bảo quản mẫuBình lạnh bảo quản mẫu Dung dịch sát trùng: ethanol Dung dịch sát trùng: ethanol

70%, 70%, chlorine (Sodium hypochlorite) hoặc Chloramine B

Dụng cụ - môi trườngDụng cụ - môi trường

Môi trường vận chuyển virusMôi trường vận chuyển virus Do Do Viện Pasteur TPHCMViện Pasteur TPHCM hoặc hoặc

BV. Bệnh Nhiệt ĐớiBV. Bệnh Nhiệt Đới cung cấp cung cấp Thành phần: albumine bò,

kháng sinh, kháng vi nấm, phenol red

Bảo quản ở Bảo quản ở 22-8-8ooCC KHÔNG dùng khi môi trường có

màu đục hay chuyển từ màu hồng sang tím hoặc vàng Môi trường vận chuyển virus

(VTM)

Phiếu thu thập bệnh phẩmPhiếu thu thập bệnh phẩm

Phụ lục 6, thông tư 43/2011/TT-Phụ lục 6, thông tư 43/2011/TT-BYT ngày 5/12/2011 của Bộ BYT ngày 5/12/2011 của Bộ trưởng Bộ Y tếtrưởng Bộ Y tế

Bao gồm thông tinBao gồm thông tin Bệnh nhânBệnh nhân Loại bệnh phẩmLoại bệnh phẩm Ngày thu thập Ngày thu thập Dịch tễDịch tễ

Gởi kèm theo mẫu bệnh phẩmGởi kèm theo mẫu bệnh phẩm

Hướng dẫn cách lấy bệnh phẩmHướng dẫn cách lấy bệnh phẩm

Dịch mũiDịch mũi Đưa tăm bông vào dọc theo sàn Đưa tăm bông vào dọc theo sàn

mũi tới khoang mũi họngmũi tới khoang mũi họng Để tăm bông thấm ướt dịch mũiĐể tăm bông thấm ướt dịch mũi Xoay tròn, miết mạnh vào thành Xoay tròn, miết mạnh vào thành

mũi và rút ra từ từmũi và rút ra từ từ Cho tăm bông vào lọ đựng mẫu Cho tăm bông vào lọ đựng mẫu

đã có sẵn môi trường vận đã có sẵn môi trường vận chuyển.chuyển.

Chất lượng chẩn đoán tốt hơn phết họng đối với cúm người

Hướng dẫn cách lấy bệnh phẩmHướng dẫn cách lấy bệnh phẩm

Dịch họngDịch họng Đưa tăm bông vào vùng hầu Đưa tăm bông vào vùng hầu

họng để cho dịch thấm ướt đầu họng để cho dịch thấm ướt đầu tăm bông.tăm bông.

Miết mạnh và xoay tròn tăm Miết mạnh và xoay tròn tăm bông tại khu vực 2 amidan và bông tại khu vực 2 amidan và thành sau họngthành sau họng

Cho tăm bông vào lọ đựng mẫu Cho tăm bông vào lọ đựng mẫu có môi trường vận chuyển.có môi trường vận chuyển.

Chất lượng chẩn đoán tốt hơn phết mũi đối với cúm A/H5N1

Hướng dẫn cách lấy bệnh phẩmHướng dẫn cách lấy bệnh phẩm

Dịch mũi hầu (NPA)Dịch mũi hầu (NPA) Nối dụng cụ lấy mẫu với hệ thống hút chân khôngNối dụng cụ lấy mẫu với hệ thống hút chân không Đưa catheter vào mũi theo hướng song song với vòm miệng, độ sâu Đưa catheter vào mũi theo hướng song song với vòm miệng, độ sâu

bằng đường nối mũi, tai.bằng đường nối mũi, tai. Từ từ đưa catheter ra ngoài vừa đưa ra vừa xoáy.Từ từ đưa catheter ra ngoài vừa đưa ra vừa xoáy. Tương tự như vậy với mũi bên kia, có thể sử dụng chung một Tương tự như vậy với mũi bên kia, có thể sử dụng chung một

catheter.catheter. Hút 3 ml dung dịch vận chuyển để rửa catheter, chia mẫu vào lọ Hút 3 ml dung dịch vận chuyển để rửa catheter, chia mẫu vào lọ

đựng mẫu.đựng mẫu.

Cho kết quả nhạy hơn phết mũi/ phết họng

Tối ưu cho xét nghiệm cúm A (WHO)

Hướng dẫn cách lấy bệnh phẩmHướng dẫn cách lấy bệnh phẩm

Dịch nội khí quản  Dịch nội khí quản         Dùng 1 ống hút dịch đặt theo Dùng 1 ống hút dịch đặt theo

đường nội khí quảnđường nội khí quản Dùng bơm tiêm hút dịch nội khí Dùng bơm tiêm hút dịch nội khí

quản theo đường ống đã đặt từ quản theo đường ống đã đặt từ 1-2 ml1-2 ml

Chuyển dịch khí quản vào ống Chuyển dịch khí quản vào ống chứa sẵn 3 ml môi trường vận chứa sẵn 3 ml môi trường vận chuyển viruschuyển virus

Dịch khí quản trong VTM

Bệnh phẩm cho độ nhạy cao nhất

Hướng dẫn cách lấy bệnh phẩmHướng dẫn cách lấy bệnh phẩm

Mẫu huyết thanhMẫu huyết thanh (phát hiện kháng thể) (phát hiện kháng thể) Lấy 3-5 ml máu tĩnh mạch cho vào lọ không có chất chống đông Ly tâm mẫu máu tốc độ thấp 2000 v/p để tách huyết thanh Lấy máu kép:

Máu 1: lấy càng sớm càng tốt Máu 2: lấy cách 10-14 ngày

Huyết thanh

Gel ngăncách

Cục máu đông

Mẫu huyết thanh

Bảo quản mẫu bệnh phẩm cúmBảo quản mẫu bệnh phẩm cúm

Giữ trong môi trường vận Giữ trong môi trường vận chuyển virus (VTM)chuyển virus (VTM)

Nhiệt độ thích hợpNhiệt độ thích hợp 44ooC trong 48 giờC trong 48 giờ - 70- 70ooC hoặc -20C hoặc -20ooC trên C trên

48 giờ48 giờ Hạn chế làm đông và rã Hạn chế làm đông và rã

đông bệnh phẩm nhiều lầnđông bệnh phẩm nhiều lần

Môi trường vận chuyển virus (VTM)

Bảo quản mẫu bệnh phẩm cúmBảo quản mẫu bệnh phẩm cúm

Mẫu huyết thanhMẫu huyết thanh (phát hiện kháng thể) (phát hiện kháng thể) Sau khi quay ly tâm: bảo quản trong tủ lạnh Sau khi quay ly tâm: bảo quản trong tủ lạnh

44ooC-8C-8ooC trong vòng 10 ngàyC trong vòng 10 ngày Nếu không có điều kiện ly tâm: bảo quản Nếu không có điều kiện ly tâm: bảo quản

trong tủ lạnh 4trong tủ lạnh 4ooC trong 24 giờC trong 24 giờ Nếu cần bảo quản lâu hơn: -20Nếu cần bảo quản lâu hơn: -20ooC hoặc -80C hoặc -80ooC C Không làm đông và rã đông nhiều lầnKhông làm đông và rã đông nhiều lần

Cách ghi nhãn và phiếu xét nghiệmCách ghi nhãn và phiếu xét nghiệm

Dán nhãn trên mỗi lọ bệnh phẩm: ghi mã số, họ tên, tuổi bệnh nhân, loại bệnh phẩm, ngày lấy bệnh phẩm

Điền đầy đủ thông tin vào phiếu xét nghiệm

Trên các bao bì bệnh phẩm phải ghi tên loại bệnh phẩm

Nhãn

(“BỆNH PHẨM CHẨN ĐOÁN”

hoặc “BỆNH PHẨM LÂM SÀNG”)

Nguyên tắc đóng gói bệnh phẩm cúm Nguyên tắc đóng gói bệnh phẩm cúm

Mẫu bệnh phẩm phải được đóng gói ba lớpMẫu bệnh phẩm phải được đóng gói ba lớp Lớp thứ nhất:Lớp thứ nhất: không thấm nước, không rò rĩ, có chứa vật không thấm nước, không rò rĩ, có chứa vật

thấm nước.thấm nước. Lớp thứ haiLớp thứ hai: bằng vật liệu bền, không thấm nước (túi : bằng vật liệu bền, không thấm nước (túi

nilon), không rò rĩ. nilon), không rò rĩ. Lớp ngoài cùng:Lớp ngoài cùng: đảm bảo chịu lực, chống va chạm. Giữa đảm bảo chịu lực, chống va chạm. Giữa

lớp thứ hai và lớp ngoài cùng có 1 lớp đệm chống va đậplớp thứ hai và lớp ngoài cùng có 1 lớp đệm chống va đập

Nguyên tắc đóng gói bệnh phẩm cúmNguyên tắc đóng gói bệnh phẩm cúm

Đóng gói riêng biệtĐóng gói riêng biệt với các loại hàng hóa khác với các loại hàng hóa khác Các ống bệnh phẩm phải được Các ống bệnh phẩm phải được đặt thẳng đứngđặt thẳng đứng Khi đựng nhiều mẫu trong lớp thứ hai: Khi đựng nhiều mẫu trong lớp thứ hai: tách riêng mẫu, tách riêng mẫu,

tránh tiếp xúctránh tiếp xúc Ghi nhãn trên bao bì vận chuyểnGhi nhãn trên bao bì vận chuyển

Nhiệt độ bảo quảnNhiệt độ bảo quản Tên loại bệnh phẩmTên loại bệnh phẩm Thông tin người gởi và người nhận: tên, địa chỉ, số Thông tin người gởi và người nhận: tên, địa chỉ, số

điện thoạiđiện thoại Gởi kèm phiếu xét nghiệm và phiếu điều tra dịch tễGởi kèm phiếu xét nghiệm và phiếu điều tra dịch tễ

Vận chuyển bệnh phẩm cúm Vận chuyển bệnh phẩm cúm

Do Do nhân viên y tếnhân viên y tế thực hiện thực hiện Thông báo cho phòng thí nghiệmThông báo cho phòng thí nghiệm tiếp nhận tiếp nhận

Phương tiện vận chuyển Phương tiện vận chuyển Thời gian dự kiến sẽ tới phòng thí nghiệmThời gian dự kiến sẽ tới phòng thí nghiệm

Lựa chọn phương tiện vận chuyển: Lựa chọn phương tiện vận chuyển: đảm bảo đảm bảo thời gian vận chuyển ngắn nhất.thời gian vận chuyển ngắn nhất.

Các chất bảo quản bệnh phẩm trong quá trình Các chất bảo quản bệnh phẩm trong quá trình vận chuyển (đá ướt, đá khô)vận chuyển (đá ướt, đá khô) Phù hợp các yêu cầu về an toàn khi vận chuyển Phù hợp các yêu cầu về an toàn khi vận chuyển Đảm bảo chất lượng bệnh phẩmĐảm bảo chất lượng bệnh phẩm

Xét nghiệm và thông báo kết Xét nghiệm và thông báo kết quả xét nghiệmquả xét nghiệm

Đơn vị xét nghiệm khẳng định virus cúm A/H7N9Đơn vị xét nghiệm khẳng định virus cúm A/H7N9 Viện Vệ sinh dịch tễ trung ươngViện Vệ sinh dịch tễ trung ương Viện Pasteur TP. Hồ Chí MinhViện Pasteur TP. Hồ Chí Minh

Đơn vị lấy mẫu xét nghiệm: Trung tâm Y tế dự Đơn vị lấy mẫu xét nghiệm: Trung tâm Y tế dự phòng các tỉnh, thành phố, các bệnh việnphòng các tỉnh, thành phố, các bệnh viện Lấy mẫu bệnh phẩm các trường hợp nghi ngờ do Lấy mẫu bệnh phẩm các trường hợp nghi ngờ do

virus cúm A/H7N9virus cúm A/H7N9 Đóng gói và vận chuyển đến phòng xét nghiệmĐóng gói và vận chuyển đến phòng xét nghiệm

Xét nghiệm chẩn đoán viêm

phổi do virus cúm A

Xét nghiệm sinh hóa-Xét nghiệm sinh hóa-huyết họchuyết học

Công thức máu ngoại viCông thức máu ngoại vi Một số trường hợp số lượng tế bào TCD4 Một số trường hợp số lượng tế bào TCD4

giảm < 200 tế bào /mmgiảm < 200 tế bào /mm33

Khí máuKhí máu Giảm oxy máu khi bệnh tiến triển nặngGiảm oxy máu khi bệnh tiến triển nặng

Men ganMen gan Tăng men gan mức độ nhẹ hoặc trung bìnhTăng men gan mức độ nhẹ hoặc trung bình

Đường huyếtĐường huyết Một số trường hợp có tăng đường huyếtMột số trường hợp có tăng đường huyết

Tăng creatinin trong trường hợp suy Tăng creatinin trong trường hợp suy thậnthận

Xét nghiệm vi khuẩnXét nghiệm vi khuẩn Mục đíchMục đích

Chẩn đoán phân biệt với Chẩn đoán phân biệt với bệnh do vi khuẩn (viêm phổi bệnh do vi khuẩn (viêm phổi do phế cầu, vi trùng lao,…)do phế cầu, vi trùng lao,…)

Phát hiện trường hợp bội Phát hiện trường hợp bội nhiễmnhiễm

Phương phápPhương pháp Cấy máuCấy máu Soi-cấy đàm và dịch phế quảnSoi-cấy đàm và dịch phế quản Cấy dịch màng phổi.Cấy dịch màng phổi.

Xét nghiệm virus cúm AXét nghiệm virus cúm A Phương pháp nuôi cấyPhương pháp nuôi cấy Phương pháp không nuôi Phương pháp không nuôi

cấycấyHình thái họcHình thái họcMiễn dịch họcMiễn dịch họcDi truyền họcDi truyền học

Phôi gà

Tế bào MDCK

M2 protein

RNA

Neuraminidase (N1-N9)

Hemagglutinin (H1-H16)

Phân nhóm theo 2 kháng nguyên Hemagglutinin (HA) : 16H

Neuraminidase (NA):9NGia cầm có tất cả H và NNgười chỉ có H1, H2, H3 và N1, N2

Đặc điểm virus Đặc điểm virus cúm Acúm A

Thử thách trong chẩn đoán virus cúm AThử thách trong chẩn đoán virus cúm A

1918: “Spanish Flu”

1957: “Asian Flu”

1968: “Hong Kong Flu”Tăng độc lực

&Mở rộng tế bào chủ

Thử thách trong chẩn đoán virus cúm AThử thách trong chẩn đoán virus cúm A

Cúm A chủng pandemic H1N1 2009Cúm A chủng pandemic H1N1 2009 Cúm A chủng S-OtrH3N2 2011Cúm A chủng S-OtrH3N2 2011 Cúm A/H5N1 (cúm gia cầm)Cúm A/H5N1 (cúm gia cầm) Cúm A/H7N9Cúm A/H7N9

Quy tắc về an toàn sinh học Quy tắc về an toàn sinh học trong phòng Xét nghiệmtrong phòng Xét nghiệm

Xử lý mẫu bệnh phẩm cúm A Xử lý mẫu bệnh phẩm cúm A Class II biological safety cabinets

Nuôi cấy, phân lập virus Nuôi cấy, phân lập virus Lab an toàn sinh học cấp độ 3 (Biosafety Level 3 Lab)

Bệnh viện Bệnh Nhiệt Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Đới

TP.Hồ Chí MinhTP.Hồ Chí Minh

Chứng nhận phòng xét nghiệm

Sinh Học Phân TửChứng nhận phòng Xét nghiệm

An toàn sinh học cấp độ III

Quy trình xét nghiệm virus cúm A Quy trình xét nghiệm virus cúm A tại BV. Bệnh Nhiệt Đới tại BV. Bệnh Nhiệt Đới

Sử dụng quy trình Real-time Sử dụng quy trình Real-time RT-PCR của CDCRT-PCR của CDC

Thời gian trả kết quả: 24 giờThời gian trả kết quả: 24 giờ Đạt chuẩn ISO15189Đạt chuẩn ISO15189 Tham gia chương trình ngoại Tham gia chương trình ngoại

kiểm của WHOkiểm của WHO

Nguyên lý PCR (Polymerase Chain Nguyên lý PCR (Polymerase Chain Reaction)Reaction)

Quy trình xét nghiệm virus cúm A Quy trình xét nghiệm virus cúm A (Quy trình CDC)(Quy trình CDC)

Chẩn đoán virus cúm A

Định danh virus cúm A

(H1, H3, H5, H7)

Chẩn đoán virus cúm B

Định danh virus cúm A

(N1, N9)

Quy trình xét nghiệm virus cúm AQuy trình xét nghiệm virus cúm A

Mẫu bệnh phẩm

Tách chiết RNA virus

Influenza A Influenza B H1p2009 H3 H5 RNP

Phân tích kết quả

Real time RT-PCR

H7 N9

Biện luận kết quảBiện luận kết quả

Phối hợp với yếu tố dịch tễ và bệnh cảnh lâm sàng

Bệnh nhân phải được cách ly chờ kết quảBệnh nhân phải được cách ly chờ kết quả Một kết quả PCR âm tính không loại trừ Một kết quả PCR âm tính không loại trừ

được bệnhđược bệnh

Tiêu chuẩn chất lượng mẫu bệnh phẩmTiêu chuẩn chất lượng mẫu bệnh phẩm

Đúng thời điểmĐúng thời điểm 3 ngày đầu của bệnh3 ngày đầu của bệnh Trước khi dùng thuốc kháng virusTrước khi dùng thuốc kháng virus

Đúng chủng loạiĐúng chủng loại Đúng thao tácĐúng thao tác Bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm Bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm

đúng cáchđúng cách

Chân thành cảm ơnChân thành cảm ơn