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Hyperthermie steigert die Zytotoxizität von Cisplatin und Doxorubicin durch Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung und der damit einhergehenden Verhinderung der Replikationsblockade Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) Fakultät Naturwissenschaften Universität Hohenheim Hauptberichter: Prof. Dr. Walter E. Aulitzky Mitberichter: Prof. Dr. Martin Blum Institut für Zoologie, Universität Hohenheim Dr. Margarete Fischer-Bosch-Institut für klinische Pharmakologie, Stuttgart und Universität Tübingen vorgelegt von Lea Schaaf aus Stuttgart 2015

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Hyperthermie steigert die Zytotoxizität von Cisplatin und Doxorubicin durch Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung

und der damit einhergehenden Verhinderung der Replikationsblockade

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades

der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

Fakultät Naturwissenschaften Universität Hohenheim

Hauptberichter: Prof. Dr. Walter E. Aulitzky

Mitberichter: Prof. Dr. Martin Blum

Institut für Zoologie, Universität Hohenheim

Dr. Margarete Fischer-Bosch-Institut für klinische Pharmakologie, Stuttgart und Universität Tübingen

vorgelegt von

Lea Schaaf

aus Stuttgart

2015

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I

Dekan: Prof. Dr. Heinz Breer 1. berichtende Person: Prof. Dr. Walter E. Aulitzky 2. berichtende Person: Prof. Dr. Martin Blum Eingereicht: Juni 2015 Mündliche Prüfung am 31.Juli 2015 Die vorliegende Dissertation wurde am 31.Juli 2015 von der Fakultät Naturwissenschaft der Universität Hohenheim als „ Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissen-schaften“ angenommen.

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Inhaltsverzeichnis VI

Inhalt

Inhalt ................................................................................................................................................... ii  

Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................................................... VI  

Zusammenfassung ............................................................................................................................ viii  

Summary ........................................................................................................................................... 10  

1   Einleitung ....................................................................................................................................... 1  

1.1  Peritonealkarzinose ........................................................................................................................ 1  

  Regionale Chemotherapie zur Behandlung von Peritonealkarzinosen ............................. 1   1.1.1   Multimodale Therapiekonzepte auf der Basis regionaler Chemotherapien ...................... 1   1.1.2   Stellenwert der Hyperthermie bei der intraperitonealen Chemotherapie .......................... 2   1.1.3

1.1.3.1   HIPEC bei kolorektalen Karzinomen ..................................................................... 2   1.1.3.2   HIPEC bei Ovarialkarzinomen ............................................................................... 3  

1.2  Molekulare Mechanismen der Hyperthermie ................................................................................ 4  

  Einfluss von Hyperthermie auf zelluläre Todesprozesse und Zellzyklus ......................... 5   1.2.1

1.3  Synergistische Effekte von Hyperthermie mit zytotoxischen Substanzen .................................... 5  

  Einfluss von Hyperthermie auf DNA-Reparatur .............................................................. 5   1.3.1   Einfluss von Hyperthermie auf DNA-Replikation ............................................................ 7   1.3.2

1.4  Ziele der Arbeit .............................................................................................................................. 9  

2   Material und Methoden ................................................................................................................ 10  

2.1  Zellkultur ...................................................................................................................................... 10  

  Zellinien .......................................................................................................................... 10   2.1.1   Kultivierung .................................................................................................................... 10   2.1.2   Kryokonservierung .......................................................................................................... 11   2.1.3   Kultur von primärem Zellmaterial .................................................................................. 11   2.1.4

2.1.4.1   Kultivierung von Frischgewebeschnitten aus Ovarial-und Kolonkarzinomen ..... 11   2.1.4.2   Kultivierung von Tumorzellen aus Ovarial-und Kolonkarzinomen ..................... 11  

2.2  Reagenzien ................................................................................................................................... 12  

  Induktion von genotoxischem Stress .............................................................................. 12   2.2.1   Inhibition der Poly(ADP-Ribosyl)ierung ........................................................................ 13   2.2.2

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Inhaltsverzeichnis VI

2.3  Zellviabilitäts-Assays ................................................................................................................... 13  

  Durchflusszytometrische Zellanalysen (FACS) .............................................................. 13   2.3.1

2.3.1.1   Nachweis von Zelltod mittels AnnexinV-FITC/ -Färbung ................................... 13   2.3.1.2   Zellzyklusanalyse mittels BrdU-Proliferationsassay ............................................ 14  

  MTT -Assay .................................................................................................................... 15   2.3.2

2.4  Koloniebildungstest ..................................................................................................................... 15  

2.5  Untersuchung der DNA-Reparaturkapazität ................................................................................ 15  

  Alkalischer Comet-Assay ............................................................................................... 16   2.5.1   Neutraler Comet-Assay ................................................................................................... 16   2.5.2

2.6  Protein Analyse ............................................................................................................................ 17  

  Western Blot ................................................................................................................... 17   2.6.1

2.6.1.1   Proteinextraktion ............................................................................................... 17   2.6.1.2   Auftrennung der Proteine durch SDS-PAGE ....................................................... 18   2.6.1.3   Western Blot ............................................................................................... 18  

  Zellanalyse mittels Immunfluoreszenzfärbung ............................................................... 19   2.6.2

2.6.2.1   Immunfluoreszenzfärbungen von Zellen in Chamberslides ................................. 19   2.6.2.2   Immunfluoreszenzfärbungen von Gewebeschnitten ............................................. 20  

2.7  High-throughput qPCR mit Hilfe des BioMarkTM-HD-Systems ............................................... 21  

  Herstellung von RNA ...................................................................................................... 21   2.7.1   Spektrometrische Quantifizierung von RNA .................................................................. 21   2.7.2   cDNA Synthese ............................................................................................................... 21   2.7.3

2.8  ATP-Test ...................................................................................................................................... 24  

2.9  DNA-Fiber Assay ........................................................................................................................ 24  

  Markierung mit IdU und CldU ........................................................................................ 24   2.9.1   Spreizen der IdU und CldU-markierten DNA auf Objektträger ..................................... 25   2.9.2   Immunfärbung der Chromatin Fasern ............................................................................. 25   2.9.3   Auswertung mit Image J ................................................................................................. 26   2.9.4

2.10   Statistik .................................................................................................................................... 26  

3   Ergebnisse .................................................................................................................................... 27  

3.1  Eine Temperatur von mindestens 40°C ist notwendig zur signifikanten Steigerung der

Zytotoxizität von Cisplatin und Doxorubicin .............................................................................. 27  

  Temperaturen über 40°C für eine Stunde in-vitro steigern signifikant die zytotoxischen 3.1.1Wirkungen von Cisplatin und Doxorubicin .................................................................... 27  

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Inhaltsverzeichnis VI

  Konstante Temperaturen ab 40°C werden in den meisten Patienten während der HIPEC 3.1.2erreicht ............................................................................................................................ 29  

3.1.3   Der Temperaturschwellenwert von 40°C über mindestens 40 Minuten ist entscheidend für das progressionsfreie- bzw. Gesamtüberleben von HIPEC-behandelten PC-Patienten31  

3.2  Hyperthermie hat keinen Einfluss auf Chemotherapie-induzierte Apoptose oder

Zellzyklusarrest. ........................................................................................................................... 33  

3.2.1   Hyperthermie alleine hat nur marginale Effekte auf die transkriptionelle Regulation von Zellzyklus- und Apoptose-assoziierten Genen ............................................................... 33  

3.2.2   Die synergistischen Effekte von Hyperthermie und Zytostatika sind unabhängig von der transkriptionellen Regulation von Stress-assoziierten Genen ......................................... 34  

  Hyperthermie alleine, sowie die Kombination mit Zytostatika führt zu keinen 3.2.3signifikanten Veränderungen in der Apoptoserate und der Zellzyklusverteilung .......... 37  

3.3  Hyperthermie führt zu einer veränderten Zytostatika-Aufnahme ................................................ 41  

  Bei Temperaturen von mehr als 40°C kommt es zu einer Erhöhung der intrazellulären 3.3.1Doxorubicin-Konzentration, während die Anzahl der DNA-Cisplatin-Adukkte nicht beeinflusst wird ............................................................................................................... 41  

  Die Temperatur-vermittelte Steigerung der Zytotoxizität ist nicht hauptsächlich 3.3.2abhängig von einer veränderten Doxorubicin-Aufnahme ............................................... 43  

3.4  Die synergistischen Effekte von Cisplatin und Doxorubicin bei erhöhter Temperatur sind auf

eine reduzierte DNA-Reparaturkapazität zurückzuführen ........................................................... 44  

  Hyperthermie führt nicht zu einer veränderten Anzahl an DNA-Strangbrüchen ........... 44   3.4.1   Hypertherme Doxorubicin-Behandlung führt zu einer beeinträchtigten DNA- 3.4.2

Strangbruch-Reparatur-Kapazität ................................................................................... 46     Hypertherme Cisplatin-Behandlungen führen zu einem vermindertem Abbau der DNA- 3.4.3

Cisplatin-Addukte ........................................................................................................... 50     Hyperthermie verhindert die Zytostatika-induzierte Poly-(ADP-ribosyl-)ierung .......... 52   3.4.4

3.4.5   Die durch Hyperthermie blockierte PARylierung ist ursächlich für das reduzierte Langzeitüberleben nach Zytostatikabehandlung ............................................................. 56  

  Hyperthermie führt nicht zu einer veränderten Proteinexpression von PARP und PARG58   3.4.6   Hyperthermie führt nicht zu einem signifikanten Verlust des zellulären ATP-Gehalts . 59   3.4.7   Die Hemmung von PARP durch Hyperthermie ist ursächlich für die verzögerten DNA- 3.4.8

Reparatur nach Zytostatikabehandlung ........................................................................... 60  

3.5  Nur Zytostatika die eine PARylierung induzieren können durch Hyperthermie gesteigert werden62  

  Platin-haltige Zytostatika und Doxorubicin können durch Hyperthermie in ihrer 3.5.1Zytotoxischen Wirkung verstärkt, während dies nicht für 5-FU und Paclitaxel zutrifft 62  

  Nur Substanzen, die in ihrer Wirkung durch Hyperthermie verstärkt werden, profitieren 3.5.2gleichermaßen von einer PARP-Inhibition ..................................................................... 64  

  Die verzögerte DNA-Strangbruchreparatur führt zu vermehrten DNA-Doppelstrang- 3.5.3brüchen ............................................................................................................................ 66  

  Die durch die hypertherme Cisplatin oder Doxorubin-Behandlung induzierten DSB 3.5.4werden vermehrt über NHEJ repariert ............................................................................ 71  

  Die DNA-Doppelstrangbrüche entstehen nur in replizierenden Zellen .......................... 73   3.5.5

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Inhaltsverzeichnis VI

3.6  Hypertherme Cisplatin und Doxorubicin Behandlungen beeinträchtigen die Replika-tion ........ 74  

  Chemotherapie-induzierte Replikationblockaden werden durch Hyperthermie oder 3.6.1pharmakologische PARP-Inhibition aufgehoben ............................................................ 76  

  PARP-Hemmung durch Hyperthermie oder durch pharmakologische Inhibitoren 3.6.2minimiert die durch Zytostatika induzierte Hemmung der Neuinitiation, sowie den Abbruch der Replikation. ................................................................................................ 79  

4   Diskussion .................................................................................................................................... 83  

4.1  Temperaturen von mindestens 40°C führen in-vitro zu einer erhöhten Zytotoxizität von

Chemotherapeutika sowie zu einem verlängertem Überleben von PC-Patienten ....................... 83  

4.2  Kurzzeiteffekte bezüglich der Zytostatika-induzierten Apoptose bzw. Viabilität sind nicht durch

Hyperthermie beeinflusst ............................................................................................................. 85  

4.3  Hyperthermie führt nur zu einer marginalen transkriptionellen Regulationen von Stress-

assoziierten Genen ....................................................................................................................... 86  

4.4  Hyperthermie führt zu einer veränderten intrazellulären Zytostatikakonzentration .................... 88  

4.5  Hyperthermie führt zu einer verminderten Reparaturkapazität ................................................... 89  

4.6  Hyperthermie führt nach DNA-Schädigung zu einer verminderten PAR ................................... 90  

  Hyperthermie steigert die Zytotoxizität nur von Zytostatika, die eine PARylierung 4.6.1induzieren ........................................................................................................................ 92  

4.7  Die verzögerte DNA-Strangbruchreparatur- und Addukteliminierung führt zu vermehrten DSB,

die über das NHEJ repariert werden ............................................................................................ 93  

4.8  Chemotherapie induzierte Blockaden der Replikation werden durch Hyperthermie und PARP-

Inhibition verhindert .................................................................................................................... 95  

5   Ausblick ....................................................................................................................................... 98  

6   Literaturverzeichnis ................................................................................................................... 100  

7   Eigene Veröffentlichungen ........................................................................................................ 115  

8   Danksagung ................................................................................................................................ 117  

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Abkürzungsverzeichnis IX

Abkürzungsverzeichnis

A Amper

APS Ammoniumpersulfat

BER Base Excision Repair

BIR breakage induced replication

BrdU 2-Bromo-5-desoxyuridin

BSA bovine serum albumin

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

cDNA complementary DNA

CldU Chlorodeoxyuridin

CRS Zytordeduktive Chirurgie

DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

DSB Double strand break

DSBR Doppelstrangbruchreparartur

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

FACS fluorescence activated cell sorter

FC fold change

FCS Fötales Kälberserum

FITC Fluoreszein-Isothiocyanat

FSC forward scatter

g Gramm

HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic

HIPEC Hypertherme intraperitoneale Chemotherapie

HR Homologe Rekombination

HRP horse radish peroxidase

ICL Interstrangvernetzung

IdU Iododeoxyuridin

IP Intraperitoneal

IV Intravenös

kDA Kilodalton

l Liter

LMTA low melting temperature agarose

m Milli-

M Molar (mol/l)

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Abkürzungsverzeichnis IX

min Minute

n Nano-

NHEJ Non-homologous end joining

N-terminal Amino-terminal

µ Mikro-

p phosphoryliert

PAR Poly(ADP-Ribosyl)ierung

PARP Poly(ADP-Ribose) Polymerase

PARG Poly(ADP-Ribose) Glykohydrolase

PBS phosphate buffered saline

PCR polymerase chain reaction

qPCR quantitative real time polymerase chain reaction

RNA Ribonukleinsäure

rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per min)

RT Raumtemperatur

Ser Serin

SD Standardabweichung

SDS Sodiumdodecylsulfat

SDS-PAGE SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

sec Sekunden

SSB single strand break

SSBR single strand break repair

SSC side scatter

TBST tris buffered saline plus Tween

TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin

TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

u.a. unter anderem

V Volt

v/v Volumen/Volumen

w/v Masse/Volumen

z.B. zum Beispiel

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ZUSAMMENFASSUNG XI

Zusammenfassung

Bei der Peritonealkarzinose handelt es sich um eine Metastasierung des Bauchfells (Peritoneum), die insbesondere von Ovarial- und Kolonkarzinomen im Laufe der Tumorprogression ausgeht. Lange Zeit galt diese weit fortgeschrittene Tumorerkrankung als extrem schwer therapierbar, sodass in der Regel nur palliativmedizinische Maßnahmen durchgeführt wurden. Dies hat sich in den letzten Jahren durch die Einführung multimodaler Behandlungsoptionen maßgeblich gewan-delt. Diese bestehen aus einer kompletten makroskopischen Tumorreduktion (CRS) gefolgt von einer intraoperativen, intraperitonealen hyperthermen Chemotherapie (HIPEC). Unbestritten ist, dass durch die lokal begrenzte Applikation wesentlich höhere Konzentrationen der Chemothera-peutika im Vergleich zur systemischen-Therapie verabreicht werden können. Der Stellenwert der Hyperthermie in diesem multimodalen Konzept ist bislang allerdings nicht eindeutig geklärt.

So existieren bis heute keine klinischen Studien, die einen Benefit der erhöhten Temperatur bei der intraperitonealen Chemotherapie (IP-Chemotherapie) eindeutig belegen. Weitgehend ungeklärt ist auch, welche Temperaturen für eine Zytotoxizitätssteigerung der Chemotherapie wirklich notwendig sind und welche molekularen Mechanismen einer solchen Effizienzsteigerung zugrunde liegen.

Um diese Fragen beantworten zu können wurde in vorliegender Arbeit zunächst ein in vitro-Modell etabliert, das die Situation der HIPEC-Prozedur möglichst exakt wiederspiegelt. Mit Hilfe dieses Modells gelang es, einen sehr präzisen Temperaturschwellenwert zu identifizieren, ab welchem eine effiziente Steigerung der Zytotoxizität von Cisplatin und Doxorubicin erzielt werden kann. Dieser Temperaturschwellenwert von 40°C ist auch von klinischer Relevanz. So weisen Patienten, die diese Temperatur an zwei Stellen im Bauchraum, nämlich Bursa omentalis und Pelvis, über mindestens 40 Minuten erreichten, ein signifikant erhöhtes Gesamt- und progressionsfreies Überleben auf.

In-vitro führt Hyperthermie zu einer gesteigerten intrazellulären Doxorubicin-Konzentration. Interessanterweise bleibt allerdings die Synergie von Hyperthermie mit Doxorubicin selbst dann erhalten, wenn die Doxorubicindosierung auf Werte reduziert wird, die auch bei 37°C erreicht werden. Zusammen mit dem Befund, dass Hyperthemie keinen Einfluss auf die Menge der DNA-Cisplatin-Addukte hat, weisen diese Ergebnisse sehr klar darauf hin, dass die erhöhte Zytostatika-Aufnahme nicht der prädominante Mechanismus hinter den Synergieeffekten von Zytostatika und Hyperthermie ist. Vielmehr konnte eine durch Hyperthermie kompromittierte DNA-Reparatur-kapazität sowohl nach Doxorubicin als auch nach Cisplatin gezeigt werden. Die signifikante Verzögerung der DNA-Reparatur konnte auf eine Hyperthermie bedingte Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung (PARylierung) zurückgeführt werden. Interessanterweise kann durch Hyperthermie ausschließlich die Effizienz solcher Zytostatika gesteigert werden, die eine PARylierung induzieren. Die These, dass die Hemmung der PARylierung eine zentrale Rolle für die Synergie zwischen Hyperthermie und Chemotherapie darstellt, wird darüber hinaus durch den Befund gestützt, dass spezifische pharmakologische PARP-Inhibitoren zu vergleichbaren Zytotoxizitätssteigerungen von Cisplatin und Doxorubicin führen wie sie durch Hyperthermie erreicht werden. Insofern konnte die PARylierung als

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ZUSAMMENFASSUNG XI

molekularer Marker für einen präklinischen Substanzscreen für HIPEC-Zytostatika identifiziert werden. Darüber hinaus zeigen diese in-vitro-Ergebnisse erstmals, dass es durchaus Alternativen zu der mit erheblichen Nebenwirkungen behafteten Hyperthermie-Behandlung gibt. So könnte eine intraperitoneale Chemotherapie mit einer systemischen Vorbehandlung der Patienten mit den sehr verträglicheren PARP-Inhibitoren kombiniert werden. Die Hyperthermie-vermittelte Hemmung der PARylierung führt zu vermehrten DNA-Doppel-strangbrüchen (DSB), welche tendenziell im Vergleich zur normothermen Behandlung eher über das fehlerbehaftete NHEJ repariert werden. So kommt es durch die Kombination mit Hyperthermie in signifikant mehr Zellen zu einer P-53BP1-Foci-Formierung, während sowohl der prozentuale Anteil der Zellen mit RAD51-Foci als auch die Gesamt-RAD51-Proteinmenge unverändert bleibt. Der Befund, dass diese DSB ausschließlich in S-Phasen-Zellen auftreten, wies auf einen Replikations-assoziierten Mechanismus hin. Tatsächlich konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals gezeigt werden,dass die Zytostatika-induzierten Replikationsblockaden durch die Hyperthermie-vermittelte Hemmung der PARylierung aufgehoben werden. Das Resultat dieser ungehinderten Progression der Replikationsgabeln durch die Hemmung der PARylierung nach Hyperthermie oder pharmakologischer PARP-Inhibition ist dann vermutlich die beobachtete Zunahme der DNA-DSB sowie das signifikant reduzierte Langzeitüberleben.

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Summary XIII

Summary

Peritoneal carcinomatosis describes widespread metastases of cancerous tumors in the peritoneal cavity particularly arising from ovarian and colon cancers. For long time this far advanced tumor disease was considered extremely difficult to treat. Therefore, only palliative measures were carried out in most cases. This has changed significantly in recent years with the introduction of multimodal treatment options consisting of a complete macroscopic tumor reduction (CRS) followed by an intraoperative intraperitoneal hyperthermic chemotherapy (HIPEC). It is undisputed that this local chemotherapy application allows treatment with much higher drug concentrations as compared to the systemic therapy. However, the role of hyperthermia in this multimodal approach has not been fully clarified so far. There is still no clinical study available showing a clear benefit of elevated temperature in the intraperitoneal chemotherapy. Largely unknown is also which level of temperatures are really needed for an elevated cytotoxicity of chemotherapeutics. Furthermore, the molecular mechanisms behind this synergistic effect are poorly investigated.

To answer these questions, an in vitro model was established mimicking the situation of the HIPEC procedure as closely as possible. This model allowed to define a very precise temperature threshold of 40°C. An effective increase in cytotoxicity of cisplatin and doxorubicin was only observed at temperatures of 40°C or above. Importantly, this temperature threshold was also of clinical relevance. Patients who reached this temperature over at least 40 minutes at two sites in the abdominal cavity, namely omental bursa and pelvis, showed a significantly increased overall and progression free survival. In-vitro hyperthermia leads to an increased intracellular concentration of doxorubicin. Interestingly, however, the synergy of hyperthermia with doxorubicin was observed even after reducing the drug concentrations to values which are also reached at 37° C. Together with the finding that hyperthermia had no effect on the amount of DNA-cisplatin adducts, these results clearly indicate that the increased intracellular drug accumulation is not the predominant mechanism behind the synergistic effects of chemotherapeutics and hyperthermia. Rather a compromised repair of cisplatin and doxorubicin induced DNA damages upon hyperthermia treatment could be identified to be important for the observed

effects. This significantly delayed DNA repair depends on inhibition of the poly(ADP-ribosyl)ation (PARylation) by hyperthermia. Interestingly, hyperthermia selectively increased the efficiency of cytotoxic agents that induce PARylation. The hypothesis that inhibition of PARylation plays a key role for the synergy between hyperthermia and chemotherapy is further supported by the finding that the treatment with specific pharmacological PARP inhibitors resulted in a comparable elevation of cisplatin and doxorubicin induced cytotoxicity. In this respect PARylation could be identified as a molecular marker for a preclinical substance-screen to identify drugs acting together with hyperthermia. In addition, these in-vitro results for the first time show that there are alternatives to the hyperthermic treatment, which is associated with considerable side effects. Thus, intraperitoneal chemotherapy could be combined with systemic PARP inhibitor pre-treatment. Clinically approved specific PARP inhibitors are far better tolerated by patients than hyperthermia.

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Summary XIII

Hyperthermia mediated inhibition of PARylation led to an increase in the percentage of cells with DNA double-strand breaks (DSB). Interestingly, the results of this work indicate a hyperthermia-induced switch from HR to the error-prone NHEJ. In combination with hyperthermia there was a significant increase in P-53BP1 foci formation, while both the percentage of cells with Rad51 foci and Rad51 protein level remained unchanged. The finding that these DSBs occur only in S-phase cells points to a replication-associated mechanism. In fact, in the framework of this work it could be demonstrated for the first time that drug-induced stalled replication forks are circumvented by the hyperthermia-mediated inhibition of PARylation. The unhindered progression of replication forks upon inhibition of PARylation by hyperthermia or pharmacological PARP inhibition presumably results in the increase of DNA DSBs as well as in the significantly reduced long-term-survival.

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Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Peritonealkarzinose

Bei der Peritonealkarzinose handelt es sich um einen Tumorbefall des Bauchfells (Peritoneum) mit unterschiedlicher Ausdehnung - von einzelnen Tumornestern bis hin zu größeren, multiplen Knoten im gesamten Bauchraum und auf der Oberfläche der inneren Organe. Insbesondere Ovarial- und Kolonkarzinome zeigen eine Tendenz zur peritonealen Dissemination. Etwa 75% aller Ovarialkarzinome, sowie etwa 15-30% aller kolorektaler Tumore (Robert-Koch-Institut, 2002) führen im Laufe der Tumorprogression zu einer Peritonealkarzinose. Aufgrund der multiplen Metastasen im Abdomen kann es zu massiven Funktionsstörungen der inneren Organe kommen, sehr häufig kommt es zu einem Darmverschluss, einem Harnaufstau, sowie dem Auftreten von Flüssigkeit im Bauchraum (Carraro et al., 2001). Insgesamt ist die Peritonealkarzinose charakterisiert durch eine sehr schlechte Prognose, wobei hier das initiale Stadium der Peritonealkarzinose bezüglich des Therapieansprechens entscheiden ist (Blair et al., 2001; Jayne et al., 2002; Sadeghi et al., 2000).

Regionale Chemotherapie zur Behandlung von Peritonealkarzinosen 1.1.1

Lange Zeit galt das Auftreten einer Peritonealkarzinose als kaum therapierbares Krebsleiden. Ursächlich hierfür sind in erster Linie die Eigenschaften des Peritoneums, welches nur einen geringen Austausch zwischen Extra- und Intraperitonealraum zulässt, wodurch therapeutische Ansätze nur eingeschränkt wirken können. Durch die Entwicklung der regionalen Chemotherapie, bei der im Gegensatz zur herkömmlichen – also systemischen – Chemotherapie die Zytostatika nur örtlich oder regional verabreicht werden, konnte die Therapie peritoneal metastasierter Tumor erheblich verbessert werden (Dedrick et al., 1978). Die regionale Applikation ist durch eine minimierte systemische Resorption und infolgedessen auch durch eine geringere systemische Toxizität gekennzeichnet. Die systemischen Nebenwirkungen einer konventionellen, intravenös verabreichten Chemotherapie sind die bedeutendsten, Dosis-limitierenden Faktoren. Im Gegensatz hierzu kann bei regionaler Chemotherapie durch die reduzierte Resorption der Zytostatika in den Körperkreislauf eine wesentlich höhere Dosierung der Chemotherapeutika verabreicht werden. So können im Vergleich zur systemischen Chemotherapie bis zu 20-fach höhere Konzentrationen verabreicht werden (Dedrick et al., 1978; Howell, 2008)

Multimodale Therapiekonzepte auf der Basis regionaler Chemotherapien 1.1.2

Basierend auf einer regionalen, intraperitonealen Chemotherapie wurden in den letzten 10 Jahren neue multimodale Therapiekonzepte, zur Behandlung peritoneal metastasierter Tumore entwickelt. Ein herausragendes Beispiel hierfür ist die hypertherme intraperitoneale Chemotherapie (HIPEC). Einer aufwendigen zytoreduktiven Chirurgie folgt eine intraperitoneale Chemotherapie, welche durch eine Erwärmung der Zytostatika auf Temperaturen zwischen 39°C und 48°C komplementiert wird (Cioppa et al., 2008; Di Giorgio et al., 2008; Sugarbaker and Chang, 1999; Yan et al., 2009).

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Einleitung 2

Die Zytoreduktion (CRS) umfasst zunächst die Entfernung aller sichtbaren und resektablen Tumorknoten mit dem Ziel der kompletten Tumorfreiheit. Meist müssen in Abhängigkeit des Ausmaßes Multiviszeralresektionen, also die Entfernung verschiedener Teile innerer Organe durchgeführt werden. Anschließend an diesen ausgedehnten, komplizierten Eingriff erfolgt direkt die intraperitoneale Chemotherapie. Ziel dieser Vorgehensweise ist es, die durch die CRS nicht erfassten Tumorreste sowie die durch den Eingriff frei gewordenen Tumorzellen möglichst effektiv abzutöten.

Für diesen Zweck wird die Zytostatikalösung zunächst erwärmt und je nach Protokoll über einen Zeitraum von 30-120 Minuten mittels einer Herz-Kreislauf-Maschine und einem Wärme-Austauscher über einen Katheter in den Bauchraum eingebracht, sowie über weitere Drainagen während der gesamten Perfusionsdauer im Abdomen rezirkuliert.

Stellenwert der Hyperthermie bei der intraperitonealen Chemotherapie 1.1.3

Neben der Tatsache, dass Hyperthermie allein anti-tumorale Wirkung hat (Giovanella et al., 1976), konnte in präklinischen Studien gezeigt werden, dass Hyperthermie die Zytotoxizität einiger Chemotherpeutika erhöht (Alberts et al., 1996; Barlogie et al., 1980; de Bree et al., 2006; Haveman et al., 1995; Hermisson and Weller, 2000; Los et al., 1994; Maymon et al., 1994; Meyn et al., 1980; Mohamed et al., 2003; Rietbroek et al., 1997; Takemoto et al., 2003; Urano and Ling, 2002; van de Vaart et al., 1998; Wang et al., 1987; Xu and Alberts, 1988)

Die kombinierte intraperitoneale Applikation von Hyperthermie und Chemotherapie wurde erstmals 1980 in einem Kanninchenmodell und im Menschen erfolgreich durchgeführt (Spratt et al., 1980a, 1980b). Seitdem wurde die HIPEC zur Behandlung unterschiedlicher Tumorentitäten, wie z.B. Magentumore (Fujimoto et al., 1997), Mesotheliome (Loggie et al., 2001), Appendix Karzinome (Sugarbaker and Chang, 1999), Endometriumkarzinome (Helm et al., 2007), und kolorektale Karzinome (Witkamp et al., 2001) angewendet.

1.1.3.1 HIPEC bei kolorektalen Karzinomen

Insgesamt zeigen einige Studien gute Ansprechraten durch die HIPEC bei Patienten mit kolorektalen Karzinomen. So konnte in einer randomisierten Phase-III-Studie nach CRS und HIPEC eine signifikante Verlängerung des Überlebens auf 22.3 Monate erzielt werden im Vergleich zu lediglich 12,6 Monaten nach konventioneller, intravenöser Chemotherapie (Verwaal et al., 2003). Elias et al. zeigten ebenfalls für kolorektale Karzinome in einer Case-Control-Studie ein Gesamtüberleben im CRS und HIPEC-Arm von 62,7 Monaten mit einem 5-Jahresüberleben von 54%, wohingegen der Standard-Chemotherapie-Arm ein Gesamtüberleben von 23.9 Monaten und einem 5-Jahresüberleben von 28% aufwies (Elias et al., 2007). Die Interpretation der Daten dieser Studie wird allerdings durch die Tatsache, dass neben der Temperatur auch unterschiedliche Zytostatika, sowie die verschiedenen Applikations-Techniken verwendet wurden erheblich er-schwert (Elias et al., 2007). Der Vorteil einer CRS kombiniert mit regional applizierter Hochdosis-therapie und Hyperthermie gegenüber einer herkömmlichen, systemischen Therapie scheint aber

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Einleitung 3

eindeutig zu sein. Belegt wird dies auch durch eine Metaanalyse von 4 vergleichenden Studien (Cao et al., 2009) sowie weiterer unabhängiger Studien für das kolorektale Karzinom (Glehen et al., 2010; Tentes et al., 2011).

Die Behandlung von peritoneal metastasierten Kolorektalenkarzinomen mit einer CRS und HIPEC wurde aufgrund der überzeugenden, aber dennoch lückenhaften Datenlage als „Kann-Option“ in die Leitlinien aufgenommen. So heißt es in den S3-Leitlinien: „Bei Patienten mit einer isolierten und limitierten Peritonealkarzinose ausgehend von einem kolorektalen Karzinom kann eine zytoreduktive Chirurgie gefolgt von einer HIPEC durchgeführt werden“.

1.1.3.2 HIPEC bei Ovarialkarzinomen

Bezüglich des Ovarialkarzinoms existieren insbesondere Studien, die die herkömmliche Standart-Therapie mit einer IP-Applikation ohne zusätzliche Hyperthermie vergleichen. So untersuchen drei prospektiv-randomisierte Studien eine optimale CRS gefolgt von einer intravenösen Chemo-therapie im Vergleich zu einer intraperitonealen Chemotherapie. Hier konnte durch die IP-Chemotherapie eine signifikante Verlängerung des Überlebens von 49 bis zu 66 Monaten im Vergleich zu 41 bis zu 49 Monaten bei intravenöser Standart-Therapie festgestellt werden (Alberts et al., 1996; Armstrong et al., 2006; Markman et al., 2001). Der Vorteil der IP-Applikation im Vergleich zur systemischen Therapie wird sehr eindeutig durch eine Metaanalyse aller bis 2006 durchgeführten randomisierten Studien zur Therapie von Ovarialkarzinomen belegt (Jaaback and Johnson, 2006).

Neben dem klinischen Vergleich von IV- mit IP-Applikation gibt es auch einige klinische Studien, die die HIPEC bezüglich des Überlebens untersucht, jedoch fehlen hier auch die adäquaten Vergleichsgruppen. So zeigt die Studie von Deraco et al. ein 5-Jahresüberleben von 60,7%, sowie mittleres progressionsfreies-Überleben von 30 Monaten (Deraco et al., 2011), aber leider ohne eine IP-Vergleichsgruppe z.B. unter normothermen Bedingungen. Eine aktuelle randomisierte Studie vergleicht die CRS mit HIPEC und darauf folgender systemischen Chemotherapie mit einer CRS und systemischer Chemotherapie (Spiliotis et al., 2015). Hier wurden 120 Patientinnen mit fortgeschrittenem Ovarialkarzinom einbezogen. Es zeigte sich ein Überlebensvorteil der HIPEC-Gruppe von 13,4 zu 26,7 Monaten im Mittel. Eindrucksvoll ist das 3-Jahresüberleben von 75% in der HIPEC-Gruppe im Vergleich zu 18% ohne HIPEC (Spiliotis et al., 2015). Jedoch gibt es auch in dieser Studie keine Vergleichsgruppe zur HIPEC.

Zusammenfassend belegt die vorhandene Studienlage somit eindeutig, dass die CRS und IP-Hochdosistherapie in ausgewählten Patienten einer konventionellen, systemischen Therapie überlegen ist. Allerdings bleibt der Stellenwert der Hyperthermie bei der IP nach wie vor unklar. Dies ist umso bemerkenswerter als durchaus bekannt ist, dass Hyperthermie mit einer signifikant erhöhten Morbiditäts- und Mortalitätsraten einhergeht (Bristow et al., 2002; Rafii et al., 2012; Saxena et al., 2010). Eine systematische Zusammenfassung von 24 Studien zeigt eine Morbiditätsrate von 28.8 % im Mittel, sowie 2,9% Mortalität (Chua et al., 2009). So scheint es unabdingbar den potentiellen Benefit der Hyperthermie durch einen systematischen Vergleich einer IP-Chemotherapie unter normothermen und hyperthermen Bedingungen tatsächlich zu belegen,

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Einleitung 4

und zwar ohne dabei zusätzliche Variablen bezüglich Art der Chemotherapie, der Technik oder des Patientenkollektiv einzuschließen.

Demzufolge wird vom National Cancer Institute (NCI) ausschließlich die Behandlung bestehend aus CRS und IP-Chemotherapie für das fortgeschrittene Ovarialkarzinom empfohlen (National Cancer Institute). In dieser Empfehlung wurde klar hervorgehoben, dass es bislang keine echten Belege für ein verbesserten Überlebens durch die Kombination mit Hyperthermie existieren. Sehr klar ist jedoch, dass es weiterhin einen dringenden Bedarf einer veränderten, verbesserten Therapie gibt. So zeigte die bereits genannte Studie von Armstrong et al. zwar ein um 16 Monate verlängertes Gesamtüber-leben, nichtsdestotrotz nur ein 5 Monate längeres progressionsfreies-Überleben und eine Rezidivrate von 65% durch herkömmliche Therapieoptionen (Armstrong et al., 2006). Eine Möglichkeit zur Verbesserung könnte die HIPEC, wie die Daten von Spilotis et al., andeuten, darstellen. Nicht zuletzt aufgrund dieser sehr lückenhaften Datenlage ist die HIPEC bisher kein Bestandteil der S3-Leitlinien und soll außerhalb von Studien bei der Behandlung von Primären und auch sekundären epithelialen Ovarialkarzinomen nicht durchgeführt werden. So besteht die Standard-therapie des fortgeschrittenen Ovarialkarzinoms weiterhin laut Leitlinien aus einer CRS gefolgt von einer platin-, bzw. taxanbasierten systemischen Chemotherapie (Bristow et al., 2002; Griffiths and Fuller, 1978). Zu dieser Therapie existieren viele prospektive und weltweit akzeptierte klinische Studien (Stuart et al., 2011).

1.2 Molekulare Mechanismen der Hyperthermie

Erste Forschungen zu Hyperthermie fanden bereits 1910 mit der Entdeckung Hitze-induzierter Mutationen in Drosophila statt (Plough, 1917; Plough and Ives, 1935). Die Entdeckung neuer chromosomaler Puff-Muster induziert durch Hitze (Ritossa, 1962) führte zur Entdeckung der Hitze-schockproteine (Ashburner and Bonner, 1979; Peterson et al., 1979). Bereits 1913 konnte Lambert zeigen, dass durch Hyperthemie im Tumorgewebe im Gegensatz zu Normalgewebe erhöhte zyto-toxische Effekte erreicht werden können (Lambert, 1913).

In diesem Zusammenhang zeigte sich, dass Bindegewebe Temperaturen von bis zu 43°C über mindestens sechs Stunden aushalten können, während Sarkomzellen der Aorta maximal 3 Stunden bei diesen erhöhten Temperaturen überleben (Hornback, 1989). Heute ist jedoch sehr klar, dass viele Mechanismen durch Hitze induziert bzw. beeinträchtigt werden. So induziert Hyperthermie die Transkription vieler Gene, deren Produkte eine zentrale Rolle beispielsweise für die Proteinfaltung, -Degradation oder DNA-Reparatur spielen (Gasch et al., 2000; Gething and Sambrook, 1992; Hartl, 1996). Insgesamt lag der Fokus der Hyperthermie bis heute hauptsächlich auf den HSPs (Morimoto, 2011; Richter et al., 2010). Dennoch gibt es eine Reihe an Arbeiten, die den Effekt der Hyperthermie auf die DNA-Replikation, -Reparatur oder Transkription, wie auch Effekte auf Zell-Zyklus-Alterationen und Induktion von Apoptose analysiert haben. Auf diese wird im Folgenden genauer eingegangen.

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Einleitung 5

Einfluss von Hyperthermie auf zelluläre Todesprozesse und Zellzyklus 1.2.1

Es konnte gezeigt werden, dass Hitze zu einer erhöhten Membranliquidität und damit zu einer Destabilisierung von Membranbestandteilen führt (Lin et al., 1978; Vigh et al., 1998). Ein weiteres Charakteristikum ist eine Veränderung der Zellform bedingt durch Modifizierung des Cytoskeletts (Luchetti et al., 2004) oder des Microfilaments (Pawlik et al., 2013). Zusammenfassend erscheint es nicht verwunderlich, dass solche massiven Veränderungen zu einer Abnahme der zellulären Viabilität durch Induktion von Apoptose oder Nekrose führen. Die Art des Zelltods hängt, wie auch die meisten anderen hier beschriebenen Hyperthermie-vermittelten Prozesse, von der Art und der Länge der Temperaturapplikation ab (Pawlik et al., 2013; Takahashi et al., 2004). So wird beispielsweise Nekrose durch akute Hyperthermie bei Temperaturen von über 45°C induziert (Harmon et al., 1990; VanderWaal et al., 1997). Ebenfalls wurden durch Hitzeschock Zellzyklu-salterierungen festgestellt. sowie eine erhöhte Sensitivität von Zellen in S-Phase oder der Mitose gezeigt (Palzer and Heidelberger, 1973; Westra and Dewey, 1971). Die Art des Todes hängt darüber hinaus vom Zelltyp ab, so konnte nach Hyperthermie eine Induk-tion von Apoptose in HL60 und U937 Zellen jedoch nicht in K562 Zellen gezeigt werden (Falcieri et al., 2000). Erste Hinweise dieser unterschiedlichen Reaktionen deuten auf unterschiedliche Proteinlevel der pro- und antiapoptotischen BCl-2-Familie hin (Amarante-Mendes et al., 1998). Interessanterweise scheint die durch Hyperthermie induzierte Apoptose z.T. nicht über klassische Mechanismen zu verlaufen. So wird Caspase-3 unabhängig von den klassischen Initiator-Caspasen (-2, -8 oder 9) aktiviert (Milleron and Bratton, 2006). Insgesamt wurden zwei Arten des Zelltodes identifiziert, ein schneller und ein verzögerter (Vidair and Dewey, 1988). So konnten neben den bereits erwähnten Prozessen auch beispielsweise Zentrosomenschädigungen, Zellteilungsstörungen und die sogenannte mitotische Katastrophe gezeigt werden. Bis heute wird der Mechanismus der Hitze induzierten Apoptose diskutiert (Milleron and Bratton, 2007). 1.3 Synergistische Effekte von Hyperthermie mit zytotoxischen Substanzen

Einfluss von Hyperthermie auf DNA-Reparatur 1.3.1

Verschiedene DNA-Reparaturwege werden durch Hyperthermie beeinträchtigt. UV-Bestrahlung, und einige andere alkylierenden Substanzen induzieren DNA-Crosslinks und Pyrimidin-Dimere. Solche Läsionen werden mittels der „Nucleotide Excission Repair“ (NER) eliminiert (Kamileri et al., 2012; Martin et al., 2008). Die Erkennung der Schäden erfolgt bei der globalen genomischen NER (GG-NER) durch einen Komplex aus XP-C, XP-A und HR23B, während dies in der transkriptionsgekoppelten NER (TC-NER) durch CSA und CSB erfolgt. Beide Komplexe führen zur Rekrutierung des Multiproteinkomplex Transkriptionsfaktors IIH (TFIIH), bestehend aus den Helikasen XP-B und XP-D. Ebenso werden die Schadenserkennungsfaktoren XPA und RPA rekrutiert. Für XPA konnte eine Interaktion mit der PARylierung gezeigt werden (Fu et al., 2012; Gagné et al., 2008). Der DNA-Strang wird um die Schäden herum geöffnet. RPA bindet zur Stabilisierung der vorläufigen Struktur die einzelsträngige DNA. Die XP-G-Nuklease schneidet das geschädigte Fragment auf der 3’-Seite, während ERCC1 zusammen mit XPF als Heterodimer auf

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der 5’Seite schneidet. Die Lücke wird durch die Polymerase ε und δ gefüllt. Auf dieses System hat Hyperthermie einen großen Einfluss. Schmidt-Rose et al., konnten eine vermindete NER von UV-Bestrahlungs-induzierten Pyrimidin-Dimeren unter Hitze zeigen (Schmidt-Rose et al., 1999). Ebenso XPA, eine sehr zentrale Komponente der NER, wird unter Hitzestress reprimiert (Muenyi et al., 2011).

Gleichermaßen konnte ein Einfluss auf die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur (DSB) beschrieben werden. Höhere Organismen besitzen zwei Mechanismen zur Reparatur dieser Schäden: Die Homologe Rekombination (HR) und die Nicht-Homologe End-zu-End-Verknüpfung (NHEJ) (Chapman et al., 2012). Die Wahl der Reparatur des DSB entweder über die HR oder das NHEJ kann unter Anderem durch PARP-1 beeinflusst werden (Mansour et al., 2010; Paddock et al., 2011; Shrivastav et al., 2008).

Zunächst erfolgt bei der HR die Aktivierung der ATM-Kinase durch einen DSB. Als Folge wird das Histon H2AX phosphoryliert (γH2AX). Es kommt zu einer Bildung des sogenannten IRIFs, eine Kolokalisation am DSB von γH2AX, 53BP1, BRCA1 und MRN-Proteinen (Nelms et al., 1998) und Rekrutierung weiterer Reparaturproteine. Für die HR ist ein einzelträngiges Ende des Doppelstranges mit einem 3’-Hydroxyl-Überhang essentiell. Dies wird durch BRCA1 und den MRN-Komplex, bestehend aus Mre11, RAD50, Nbs1 bewerkstelligt, die Stabilisierung wird von RAD51 und RPA, indem ein Nukleoproteinfilament synthetisiert wird, übernommen (Wold, 1997). PARP-1 ist innerhalb dieses Prozesses an blockierten Replikationsgabeln durch Bindung der kurzen einzelsträngigen Überhänge und Rekrutierung von Mre11 involviert (Bryant et al., 2009a). RAD52 und RAD54 übernehmen anschließend die Suche des homologen Bereichs auf dem Schwesterchromatid (Gasior et al., 1998). Demzufolge handelt es sich bei der HR um eine sehr genaue Reparatur mittels Template-Sequenzen (San Filippo et al., 2008). Das NHEJ hingegen ist wesentlich fehlerbehafteter (Lieber, 2010). An die freien Enden des DSB bindet das Heterodimer Ku70/Ku80 und rekrutiert die DNA-abhängigen Proteinkinase (DNA-PKcs), sowie XRCC4 und die DNA-Ligase IV. KU und PARP-1 interagieren innerhalb dieses Prozesses miteinander (Dong et al., 2010) wodurch die Kinase Aktivität von DNA-PK signifikant gesteigert wird (Ruscetti et al., 1998).

Das DNA-PK-Holoenzym führt anschließend die beiden Bruchenden zusammen (Bliss and Lane, 1997; Gottlieb and Jackson, 1993). Der MRN-Komplex bestehend aus Rad50, MRE11 und NBS1 übernimmt die Prozessierung der Enden (Nelms et al., 1998). Die anschließende Ligation erfolgt durch den DNA-Ligase IV/ XRCC4-Komplex (Grawunder et al., 1997). Aufgrund von einer Hyperthermie-vermittelten Hemmung beider DSB-Reparatur-Wege (Corry et al., 1977; Wong et al., 1995) sind Zellen, die Hyperthermie ausgesetzt werden sensitiver gegenüber Ionisierender Bestrahlung (Dewey, 1984; Raaphorst, 1992; Urano, 1992). Hyperthermie beeinträchtigt das NHEJ indem die KU aggregiert wird, so dass die DNA-Bindung von KU unterbunden wird (Burgman et al., 1997). Die HR wird durch Hyperthermie gehemmt, indem BRCA2 degradiert wird, wodurch eine Strahlensensitivierung erzielt werden kann (Genet et al., 2013; Krawczyk et al., 2011). Aber auch andere Reparaturwege werden durch Hyperthermie beeinträchtigt, so inaktiviert Hyperthermie die DNA-Polymerase β, welche essentiell ist bei der „Base Excission Repair„ (BER) (Dikomey et al., 1987; Spiro et al., 1983). In einer weiteren in-vitro-Untersuchung wurde durch die Gabe von Cisplatin bei erhöhter Temperatur eine gesteigerte

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Einleitung 7

Apoptoserate erzielt, möglicherweise verursacht durch eine verminderten Reparatur des Cisplatin-induzierten Schadens (Ohtsubo et al., 2001)

Einfluss von Hyperthermie auf DNA-Replikation 1.3.2

Im Rahmen von Hitzeschock wurden einige Effekte auf die Replikation, wie die Hemmung der Initiation neuer Replikons (Warters and Stone, 1983), der Elongation von Replikationsgabeln (Wong et al., 1989), sowie der komplette Replikations-Stopp bei Temperaturen über 45°C (Velichko et al., 2012) gezeigt. Jedoch ermöglicht ein Replikations-Arrest einen besseren Zugang von DNA-Reparaturproteinen (Roti Roti, 2008). So konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der Replikation die S-Phasen-Hypersensitivität gegenüber Hitzeschock durch 45°C abwenden kann (Roti Roti, 2008). Werden Zellen mit Inhibitoren der Replikation behandelt, so benötigen diese eine effiziente HR zum Überleben (Saintigny et al., 2001). Während der Replikation wird die genomische DNA verdoppelt, dieser Prozess findet während der S-Phase des Zellzykluses statt. Der Beginn der Replikation erfolgt an den Replikationsursprüngen, die etwa alle 110-150kb voneinander über die gesamte DNA hinweg verteilt sind (Edenberg and Huberman, 1975). Cdc45 und MCM10 führen zur Entwindung der DNA-Doppelhelix. An jedem Replikationsursprung sind zwei Replikationsgabeln, die in bidirektionale Richtung den neuen Strang synthetisieren. Treffen diese Replikationsgabeln auf benachbarte wird die Replikation terminiert (Postow et al., 2001). Die Elongation erfolgt durch Synthetisierung der Einzelstränge der DNA-Helix als Vorlage der neuen komplementären Tochterstränge. Die DNA-Polymerasen fügen hierzu die Nukleotide durch Verknüpfung neuer Phosphodiesterbindungen hinzu (Johnson and O’Donnell, 2005). Die Polymerasen synthetisieren stets in 5’3’-Richtung, so das es einen kontinu-ierlichen Leitstrang und einen diskontinuierlichen Folgestrang aus Okazaki-Fragmenten gibt. Insgesamt sind hier drei Polymerasen, die Polα, Polδ, und Polε beteiligt (Burgers, 2009). Zur Erhaltung der genomischen Stabilität ist die fehlerfreie Replikation unabdingbar. Trifft eine Replikationsgabel auf einen Schaden, werden in Abhängigkeit der Schäden Signalkaskaden zur Reparatur dieser aktiviert (Ciccia and Elledge, 2010). Insgesamt scheint die HR während der Replikation eine essentielle Rolle einzunehmen (Lu et al., 2005; Al-Minawi et al., 2008). Mehrere Prozesse auf der Basis der HR, die für die Reparatur blockierter und kollabierter Replikations-gabeln wichtig sind wurden neben den Funktionen der klassischen HR beschrieben. So kann ein DSB entstehen, wenn eine Replikationsgabel auf einen unreparierten SSB trifft, die Reparatur solcher Schäden erfolgt über die „Breakage-Induced-Replikation“ (BIR) (Ashour et al., 2015). So konnten eine durch Hyperthermie verhinderte HR während einer durch Gemcitabin induzierten Replikationsblockaden beschrieben werden (Raoof et al., 2014). Bei der BIR steht im Gegensatz zur klassischen HR nur ein DNA-Ende zur Verfügung (Llorente et al., 2008). Ebenso ist die HR bei blockierten Replikationsgabeln wichtig. So gibt es Hinweise, dass angehaltene Gabeln in umgekehrter Richtung synthetisieren können. Dabei entsteht eine Zwischenform, die sogenannte Chicken-Foot Struktur, die zu Holliday Junctions führt (Kuzminov, 2001). Nach dem Auflösen dieser Strukturen kann die Replikation mittels RecQ-Helikasen wieder fortfahren (Karow et al., 2000). DNA-DNA-Quervernetzungen (Interstrang-Crosslinks) bedingen ein kollabieren von Replikations-gabeln und damit einhergehen die Induktion von DSB (Niedernhofer et al., 2004).

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Einleitung 8

Dabei wird über ATR der Fanconi-Signalweg aktiviert, innerhalb dessen die HR Bestandteil ist (Kim and D’Andrea, 2012).. Insgesamt beeinflusst Hyperthermie die HR an mehreren Stellen, so z.B. den MRN-Komplex oder BRCA-2 (Dynlacht et al., 2011; Krawczyk et al., 2011).

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Ziele

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1.4 Ziele der Arbeit

Zur Therapie der in der Regel infaust verlaufenden Peritonealkarzinose scheint eine möglichst vollständige makroskopischen Tumorreduktion (CRS) gefolgt von einer intraoperativen, intrap-eritonealen hyperthermen Chemotherapie (HIPEC) vielversprechend. Unbestritten ist der Vorteil der lokalen intraperitonealen Chemotherapie gegenüber einer systemischen Behandlung. Der Stellen-wert der Hyperthermie ist allerdings nach wie vor offen. So ist die Frage, mit welchen Medika-menten die Hyperthermie überhaupt zu einer effizienten Steigerung der Chemotherapie-induzierten Zytotoxizität beitragen kann, bislang weitgehend unbeantwortet. Ebenfalls unzureichend geklärt sind die molekularen Mechanismen, die dieser Temperatur-abhängigen Effizienzsteigerung zugrunde liegen. Ein vertieftes Wissen über diese molekularen Zusammenhänge ist zweifelsohne die Vorraussetzung für die Identifikation von gezielteren und besser verträglichen Alternativen zur Hyperthermie.

Im Einzelnen sollten daher folgende Fragen in vorliegender Arbeit beantwortet werden:

1. Welche Temperaturen sind für eine effiziente Steigerung der Chemotherapie nötig?

2. Was sind die der Hyperthermie vermittelten Zytotoxizitätssteigerung zugrunde liegenden molekularen Mechanismen?

4. Welche Chemotherapeutika werden durch Hyperthermie in ihrer Effizienz gesteigert? Steigert Hyperthermie allgemein die Toxizität von Zytostatika oder ist dies abhängig von dem Wirkmechanismus der verwendeten Substanz?

3. Welche Signalmoleküle mediieren die beobachteten Wirkungen und können diese als Zielstrukturen genutzt werden, um auf pharmakologischem Wege eine Effizienzsteigerung der Chemotherapie zu erreichen? Können also besser verträgliche Alternativen zur Hyperthermie identifiziert werden?

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Material & Methoden 10

2 Material und Methoden

2.1 Zellkultur

Zellinien 2.1.1

In Tabelle 1 aufgelistete Zelllinien wurden in dieser Arbeit verwendet

Tabelle 1: verwendete Zelllinien Zelllinie Herkunft Erhalten von

OVCAR3 Ovarialkarzinom NCI-60

OVCAR8 Ovarialkarzinom NCI-60

OVCAR4 Ovarialkarzinom NCI-60

HCT116 Kolonkarzinom Pellets wurden freundlicherweise von Prof.Scheurich (Universität Stuttgart, IZI) zur Verfügung gestelltgestellt

Colo-205 Kolonkarzinom

LOVO Kolonkarzinom

Kultivierung 2.1.2

Zelllinien wurden in RPMI-1640 mit folgenden Zusätzen kultiviert.

RPMI-1640 Medium Biochrom Zusatzstoffe à 500 ml RPMI-Medium: 10 % (v/v) FCS Gibco 0.1 g/l Penicillin/Streptomycin Gibco 10 mM HEPES, pH 7.4 Merck 2 mM L-glutamine Biochrom 0.13 mM L-asparagine Serva 0.05 mM 2-mercaptoethanol Merck 1 mM SDS Gibco 3 ml 100x nicht essentielle Aminosäuren Biochrom

Zellen wurden bei 37 °C, 95% Luftfeuchtigkeit mit 5 % CO2 und 3 % O2 kultiviert und alle 2-3 Tage mittels Trypsin/EDTA passagiert.

Zellkulturflaschen Sarstedt Pipetten Corning 50 ml Röhrchen Becton Dickinson Trypsin/EDTA Gibco Bench Heraeus Inkubator Heraeu

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Material & Methoden 11

Die Zellzahl, bzw. Die Viabilität wurde mittels Trypan-Blau-Ausschlussfärbung und einer Neubauer Zählkammer bestimmt.

Trypan Blau 0.5 % (w/v) Biochrom Neubauer Zählkammer Roth Mikroskop Zeiss

Kryokonservierung 2.1.3

Die Zelllinien wurden zur Vermeidung von genetischen Veränderungen durch Selektionsprozesse in Abständen von sechs Monaten neu in Kultur genommen. Zellen wurden je 1x106 Zellen/ml in DMSO:FCS (1:10) in flüssigem Stickstoff gelagert.

DMSO Sigma-Aldrich, Taufkirchen 1.8 ml CryoTubeTM Nalgene Nunc International 5100 Cryo 1 °C Freezing container “Mr. Frosty” Nalgene Nunc International

Kultur von primärem Zellmaterial 2.1.4

2.1.4.1 Kultivierung von Frischgewebeschnitten aus Ovarial-und Kolonkarzinomen

Für die Herstellung der Gewebeschnitte wurde frisches Tumorgewebe von Peritonealkarzinose-Patienten verwendet. Für das Gewebe lag ein Ethikvotum und eine Einverständniserklärung der Patienten vor. Metastasen wurden unter sterilen Bedingungen zu Gewebestücken von etwa einem Durchmesser von ungefähr 5 mm hergestellt. Diese konnten dann mit Hilfe eines Leica Vibratoms VT1200 S in kaltem 1X PBS+ 0.1% Pen Strep zu 250 µm dicken Frischgewebeschnitten geschnitten werden. Kultiviert wurden die einzelne Schnitt in einer Vertiefung einer 24-Loch Platte in 1 ml Medium. Nach 24h bei 37°C, 5%CO2 und 3%O2 erfolgte die Behandlung. Am Ende der Behandlung wurden die Slices in 4% gepuffertem Formalin fixiert und über Nacht bei 4°C inkubiert. Im Anschluss daran wurden die so fixierten Schnitte in der Pathologie des RBK entwässert, fixiert und in Paraffin eingebettet.

2.1.4.2 Kultivierung von Tumorzellen aus Ovarial-und Kolonkarzinomen

Die Isolierung von Tumorzellen erfolgte aus frischem Tumorgewebe von PC-Patienten, welches direkt nach der Operation aufgearbeitet wurde. Für das Gewebe lag ein Ethikvotum und eine Einverständniserklärung der Patienten vor. Zunächst wurde das Gewebe mechanisch zerkleinert, so dass der enzymatische Verdau mittels Cell Rinse Puffer (mit Kollagenase (167 U/ml), DNase (250 U/ml) und Protease (0,25mg/ml) möglichst effektiv verläuft. Nach einer 90-minütigen Inkubation

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Material & Methoden 12

bei 37°C wurde das Gemisch aus zerkleinertem Gewebe und Puffer über ein Zellsieb mit einer Porengröße von 70 filtriert so dass nur vereinzelte Zellen weiterverarbeitet wurden. Nach einem Zentrifugationsschritt wurde das Pellet in Kulturmedium aufgenommen und in einer Kulturflasche bei 37°C , 5%CO2 und 3%O2. Die Aggregate bestehend aus Tumorzellen wurden am nächsten Tag durch Entnahme des Überstandes isoliert.

Cell Rinse Puffer 120 mM NaCl 15,6 mM Glucose 2,5 mM MgCl2x6H2O 5,4 mM KCl 1 mM NaH2PO4 20 mM HEPES pH 7,2

DNase (250 U/ml) Sigma, Taufkirchen Kollagenase (167 U/ml) Sigma, Taufkirchen Protease (0,25 mg/ml) Sigma, Taufkirchen Cell Strainer 70 µ m Becton Dickinson, USA

2.2 Reagenzien

Induktion von genotoxischem Stress 2.2.1

Genotoxischer Stress wurde durch Cisplatin (40 µM) ,Doxorubicin (15, 7, 6.5 µM), Oxaliplatin (40 µM), 5-FU (12 µM) und Paclitaxel (12 µM) induziert. Alle Zytostatika wurden von der Apotheke des Robert-Bosch Krankenhauses bezogen.Platinhaltige Zytostatika führen zu Intra- und Interstrangvernetzungen mit der DNA, wodurch sowohl Replikation, als auch die Transkription gehemmt werden. Doxorubicin interkaliert ebenfalls in die DNA und blockiert dadurch die Transkription. Zusätzlich wird Topoisomerses II gehemmt. 5-FU ist ein Antimetabolit und wird anstelle von Uracil in die RNA eingebaut. Ebenso wird die Thymidilat-Synthase gehemmt. Paclitaxel bindet β-Tubulin, wodurch der Abbau der Mikrotubuli und damit einhergehend die Mitose gestört wird. Die Behandlungen mit den Zytostatika erfolgten generell für 1 Stunde bei unterschiedlichen Temperaturen bei 3%O2. Im Anschluss daran erfolgte ein Mediumwechsel und die weitere Kultivierung bei atmosphärischen Sauerstoffkonzentrationen.

Cisplatin (1 mg/ml) Robert-Bosch-Hospital, Stuttgart Oxaliplatin (10 mg/ml) Robert-Bosch-Hospital, Stuttgart Doxorubicin (2 mg/ml) Robert-Bosch-Hospital, Stuttgart Paclitaxel(2 mg/ml) Robert-Bosch-Hospital, Stuttgart 5-FU (2 mg/ml) Robert-Bosch-Hospital, Stuttgart

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Material & Methoden 13

Inhibition der Poly(ADP-Ribosyl)ierung 2.2.2

PARP Inhibitoren wirken als katalytische Inhibitoren, indem sie die NAD-Bindedomäne von PARP binden (Virág and Szabó, 2002). Zur pharmakologischen Hemmung der PARP Aktivität wurde 4 µM PJ34 (Phenanthridin-Derivat), 0,4 µM Rucaparib, welches sich derzeit in Phase II Studien zur Behandlung solider Tumor mit BRCA Mutationen befindet und 20nM A966492 (Penning et al., 2010) verwendet. Die Behandlung mit PARP Inhibitoren erfolgte generell 2 Stunden vor der Zytostatika Behandlung.

PJ34 Selleckchem Rucaparib Selleckchem PJ34 Calbiochem

2.3 Zellviabilitäts-Assays

Durchflusszytometrische Zellanalysen (FACS) 2.3.1

Das hier verwendete Durchflusszytometer detektiert neben dem Vorwärtsstreulicht (forward scatter, FSC), und dem Seitwärtsstreulicht (side scatter, SSC) vier verschiedene Fluoreszenz-spektralbereiche (FL 1-4). Die Rohdaten wurden mit Hilfe von CellQuestTM ausgewertet.

Fluorescence Activated Cell Analyzer ‚FACSCalibur‘ Becton Dickinson, USA

Laser: luftgekühlter Argon-Ionen Laser: 488 nm roter Diodenlaser: 635 nm

Detektoren/Filter: 530 nm (Kurzpassfilter) 585 nm (Kurzpassfilter) 661 nm (Kurzpassfilter) 670 nm (Langpassfilter)

CELLQuestTM Pro Software Becton Dickinson, USA

2.3.1.1 Nachweis von Zelltod mittels AnnexinV-FITC/ -Färbung

Ausgelöst durch Apoptotische-Prozesse kommt es zum Verlust der Membransymmetrie, wodurch das Phospholipid Phosphatidylserin von der inneren Membranseite auf die äußere transloziert. Dieses Phospholipid wird hoch affin von AnnexinV gebunden. Mittels einer Konjugation von Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC) an AnnexinV wird es möglich die frühe Apoptose in Zellen zu quantifizieren.

Zur Quantifizierung der Apoptose wurden die Zellen trypsiniert und pelletiert (5 min, 1400 rpm, RT). Vor der Inkubation der Zellen für 15 min im Dunkeln mit 100 µl AnnexinV-FITC-Färbe-

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Material & Methoden 14

lösung (5% (v/v) AnnexinV-FITC, 2,5% (v/v) PI-Lösung (Stammlösung 50 µg/ml), 92,5% (v/v) ABP) erfolgte je ein Waschritt mit PBS und mit Annexin-Bindepuffer (ABP; 0,1 M HEPES/NaOH pH7,4, 1,4 M NaCl, 25 mM CaCl2). Zur Messung am FACS Anschließend 400 µl ABP zugegeben.

AnnexinV-FITC BD PharMingen, USA Propidiumiodid Sigma-Aldrich, Taufkirchen

2.3.1.2 Zellzyklusanalyse mittels BrdU-Proliferationsassay

Die Quantifizierung der einzelnen Zellzyklusstadien erfolgt anhand der Messung des DNA-Gehaltes. Der Farbstoff Propidiumiodid, interkaliert in doppelsträngige Nukleinsäuren wodurch der DNA-Gehalt einer Zelle bestimmt werden kann. Neben dem DNA-Gehalt kann auch die Synthese von DNA nachgewiesen werden, hierfür wurden den Zellen 45 min vor der Ernte BrdU im Medium zugeführt. BrdU ist ein Uridinderivat, welches während der S-Phase anstelle von Thymidin in die DNA eingebaut werden kann. Der Einbau von BrdU wurde durch die Zugabe eines Fluorochrom-markierten anti-BrdU-Antikörpers nachgewiesen. Die SubG1-Phase ist charakterisiert durch Zellen, die zum einen BrdU negativ und zum anderen weniger als 2N DNA besitzen. G1-Phase Zellen besitzen einen einfach Chromosomensatz und sind BrdU negativ, da sie keine DNA synthetisieren. Die Replikation, also der Einbau von BrdU in den neu gebildeten DNA Doppelstrang findet in der S-Phase statt, dementsprechend sind diese BrdU positiv und haben einen DNA Gehalt der zwischen 2N und 4N liegt. Die G2-Phase-Zellen mit einem doppelten Chromosomensatz sind BrdU negativ, da die DNA-Synthese abgeschlossen ist und die Zellen in die Mitosephase eintreten können. Zur Zellzyklusanalyse wurden die Zellen nach der Inkubationszeit mit BrdU durch trypsinieren geerntet, zentrifugiert (5 min, 1400 rpm, RT) und das Pellet mit 1 ml -20°C kaltem 70% (v/v) Ethanol über Nacht oder länger fixiert. Nach erneutem Pelletieren (5 min, 900 rpm, RT) der Zellen wurden diese zur Denaturierung mit 1 ml 2N HCL für 30min inkubiert, erneut zentrifugiert und mit 0,1M Boraxlösung neutralisiert. Anschließend folgten mehrere Waschschritte mit einer PBS/BSA/Tween-Lösung (1% (v/v) BSA, 0,5% (v/v) Tween). Daraufhin wurde das Zellpellet mit dem Anti-BrdU-Antikörper für 30 min bei 4°C inkubiert. Der FITC markierte Sekundärantikörper wurde nach einem erneuten Waschschritt für 30min bei 4°C zu den Zellen gegeben. Nach einem weiteren Waschschritt in Glucose/PBS wurden die Zellen in PI-Färbelösung (5% (v/v) PI-Lösung (Stammlösung 1mg/ml), 1% RNase A (Stammlösung 100 mg/ml), 95% (v/v) PBS) aufgenommen. Die darin enthaltene RNase A dient zum Verdau der RNA und verhindert so deren störende Färbung. Nach einer Inkubationszeit von 10 min wurden die Zellen am FACS analysiert.

Anti-BrdU- Antikörper Becton Dickinson, USA GAM-FITC Sekundärantikörper Dianova, Hamburg Tween 20 Merck, Darmstadt Ethanol Merck, Darmstadt

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Material & Methoden 15

Glucose Sigma-Aldrich, Steinheim

MTT -Assay 2.3.2

Die Quantifizierung der Zellviabilität wurde mittels MTT-Assay bestimmt (Mosmann, 1983). Viable Zellen reduzieren das gelbe Tetrazol MTT mittels Dehydrogenase in das violette Formazan. Dieser Farbumschlag kann durch ein Spektrophotometer quantifiziert werden. Je Loch wurden 7500 Zellen in eine 96 Well Platte ausgesät und im Anschluss an die Behandlung für 48h kultiviert. Die Zugabe von 10 µl MTT Lösung (10 mg/ml MTT in PBS) erfolgte für 2h bei RT, gefolgt von einer Zelllyse mit 90 µl MTT Lysepuffer (15 % SDS in DMF-Wasser (1:1); pH 4.5). Nach einer Inkubation für weitere 24h im Dunkeln bei Raumtemperatur wurde die Formazan Färbung mittels Photometer bei 570 nm quantifiziert.

MTT Sigma, Taufkirchen ELISA-Reader Enspire Perkin Elmer Dimethylformamid Aldrich, Steinheim

2.4 Koloniebildungstest

Mittels des Koloniebildungstests kann die klonogene Wachstumsfraktion einzelner ausgesäter Zellen unbehandelt und nach genotoxischer Schädigung getestet werden.

Hierfür werden die Zellen im Anschluss an die jeweilige Behandlung trypsiniert und in einer Zelldichte von 500 Zellen (unbehandelte Ansätze) oder 1000 Zellen (behandelte Ansätze) in eine 0,25cm2 Zellkulturflasche ausgesät. Nach einer Kultivierung von 10 Tagen kann die klonogene Wachstumsrate durch Auszählen von Kolonien, die aus mindestens 50 Zellen bestehen, ausgewertet werden. Hierfür wird das Medium abgesaugt und die Kolonien mit PBS gewaschen. Nach einer 10-minütigen Fixierung mit eiskaltem Methanol, können die Zellen mit Hämtoxylin gefärbt und anschließend mit Definiens-Tissue-Studio ausgezählt werden.

Zellkulturflaschen Greiner, Frickenhausen Hämatoxylin Merck, Darmstadt Methanol 99% Sigma-Aldrich, Taufkirchen

2.5 Untersuchung der DNA-Reparaturkapazität

Die Einzelzell-Gelelektrophorese (Comet-Assay) wurde zur Untersuchung der Fähigkeit von Zellen DNA-Strangbrüche zu reparieren herangezogen. Hierfür werden die Zellen im Anschluss an die DNA-Schädigung zwischen Agarose-Schichten auf einen Objektträger aufgebracht. Eine Lyse führt zur Durchlässigkeit der Membranen für die entstandenen DNA-Bruchstücke, die in einer

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Material & Methoden 16

darauffolgenden Elektrophorese der Größe nach unterschiedlich weit aus dem Kern Richtung Kathode diffundieren. Unter alkalischen Bedingungen können mittels dieser Methode sowohl SSB als auch DSB analysiert werden. Während unter neutralen Bedingungen aufgrund der nicht denaturierten DNA nur DSB detektiert werden können. Nach der Auftrennung wird die DNA mit DAPI gefärbt und die sogenannten Comets können unter dem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet werden. Je länger derentstandene Schweif ist, desto mehr Schäden enthält diese Zelle. Je Ansatz wurden drei Objektträger hergestellt und jeweils mindestens 100 Zellen aufgenommen. Die Auswertung erfolgte mittels der Analysesoftware CometScoreTMFreeware. Der Anteil der aus dem Kern ausgetretenen DNA-Bruchstücke diente als Maß für die Anzahl der DNA-Brüche.

Alkalischer Comet-Assay 2.5.1

Objektträger wurden mit 1 % LMT-Agarose/PBS (low melting temperatur) beschichtet und über Nacht getrocknet. Die Zellzahl wurde im Anschluss an die DNA-Schädigung auf 2 x 106 Zellen/ml in PBS eingestellt. Aus dieser Zellsuspension wurden für den Versuch 90 µl mit jeweils 400 l 0,5 % LMT-Agarose/PBS resuspendiert. Je Objektträger wurden 90 µl dieser Lösung auf den Objektträger beschichtet und für 20 min auf Eis abgekühlt. Die Agarose-Zellschicht wurde erneut mit 90 µl 0,5 % LMT-Agarose überschichtet und mit je 100 µl Lysepuffer (2,5 M NaCl, 0,1 M Na2EDTA, 10 mM Tris, 1 % Triton X-100, pH 10) für 10 min auf Eis inkubiert. Im Anschluss wurden die Objektträger in einer mit Elektrophoresepuffer (0,3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA) gefüllten Elektrophoresekammer (20 min, 4 °C) inkubiert. Danach erfolgte die Auftrennung bei 25 V, 300 mA für 15 min bei 4°C. Nach der Elektrophorese wurden die Objektträger nach zweimaligem Waschen für 10 min mit Neutralisationspuffer (0,4 M Tris) mit DAPI gefärbt und analysiert.

Neutraler Comet-Assay 2.5.2

Für den neutralen Comet wurden Objektträger mit 0,5 % LMT-Agarose überschichtet. Die Zellen wurden analog zum alkalischen Comet eingestellt und ebenfalls gleichermaßen mit 400 µl 0,5 % LMT-Agarose/PBS gemischt. Die Zellen wurden erneut analog in Agarose auf die Objektträger geschichtet. Nun wurden die Objektträger für 1,5 h (im Dunkeln, 4 °C) in mit Lysepuffer (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1 % N-Lauroylsarcosin Natriumsalz, pH 9,5) gefüllten Küvetten inkubiert. Anschließend wurde 3 x 5 min mit Elektrophoresepuffer (0,3 M Natriumacetat, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,3) gewaschen und für 1 h bei 4 °C in diesem inkubiert. Die Elektrophorese erfolgte bei 11 V und 25 mA für 1 h bei 4 °C. Nach erneutem Waschen mit Neutralisationspuffer (0,4 M Tris) wurde mit DAPI gefärbt und die Zellen analysiert.

CometScoreTMFreeware, Version 1.5.2.6 TriTek Corporation, USA Vectashield Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories,USA Fluoreszenzmikroskop Leica Tcssp8 Leica Mikrosysteme, Wetzlar Super Frost Objektträger R. Langenbrinck, Teningen LMT-Agarose NuSieve Sigma-Aldrich, Taufkirchen Na2EDTA Roth,Karlsruhe

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Material & Methoden 17

Elektrophoresekammer: Sub-Cell Model 96 Bio-Rad, München Tris-HCl PUFFERAN Roth, Karlsruhe EDTA Sigma-Aldrich,Taufkirchen N-Lauroylsarcosin Natriumsalz, 30 % wässrige Lösung Sigma-Aldrich, Taufkirchen Natriumacetat Merck, Darmstadt

2.6 Protein Analyse

Western Blot 2.6.1

2.6.1.1 Proteinextraktion

Für die Proteinextraktion wurden die Zellen trypsiniert und pelletiert (4°C, 1400 rpm, 5 min). Nach einem Waschritt mit 1 ml kaltem 1xPBS und dem Entfernen des Überstandes wurden die Zellpellets in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Zur Zelllyse wurde ein Triton-X basierender Lysepuffer (50 mM Tris, 250 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 5 mM EDTA, pH 8,0) mit zugesetzten Protease- als auch Phosphataseinhibitoren verwendet. Zum vollständigen Aufschließen der Zellen wurden diese sonifiziert (50 Zyklen, 20 sec) und anschließend abzentrifugiert (4°C, 13000 rpm, 15 min). Der Überstand wurde zur nachfolgenden Proteinbestimmung nach Bradford weiterverwendet. Hierzu wurden je 1 l Probe 800 µl H2O und 200 µl Bradfordreagenz vermischt. Ebenso wurde zur Erstellung einer Standardkurve eine BSA-Verdünnungsreihe hergestellt. Die photometrischen Messung zur Bestimmung der optischen Dichte erfolgte bei 595 nm.Gleiche Probenmengen wurden mit 1xLämmli-Puffer (62,5 mM Tris/HCl, 20% (v/v), Glycerol, 5% (v/v) β-Mercaptoethanol, 2% (w/v) SDS, 1% Bromphenolblau, pH 6,8) verdünnt und für 5 min bei 95°C aufgekocht.

TRIS Roth, Karlsruhe EDTA Sigma-Aldrich, Steinheim Triton X-100 Fluka Chemie AG, Buchs (CH) NaCl Merck, Darmstadt PhosphoSTOP (phosphatase Roche, Mannheim inhibitor cocktail tablets) protease inhibitor cocktail tablets Roche, Mannheim Ultraschall Homogenisator Sonopuls HD200 Bandelin Elektronik, Berlin MS72 Mikrospitze aus Titan advanced protein assay reagent (5x) Cytoskeleton Inc., USA BSA Sigma-Aldrich, Steinheim Novaspec II Visible Spectrophotometer GE Healthcare, München Glycerol Meck, Darmstadt Bromphenolblau Sigma-Aldrich, Steinheim

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Material & Methoden 18

2.6.1.2 Auftrennung der Proteine durch SDS-PAGE

Proteine wurde in Anlehnung an ihr Molekulargewicht mittels SDS-Polyacrylamidgel-elektrophorese aufgetrennt (SDS-PAGE). Die hier verwendeten Gele bestehen aus Acrylamid, 1,5 mM Tris-Puffer pH 8,8 und SDS. Die Dichte der Gele variierte je nach Molekulargewicht der zu detektierenden Proteine in einer unterschiedlichen Acrylamidkonzentrationen. Proteine mit niedrigem Molekulargewicht werden mit hochprozentigen Acrylamidgelen und entsprechend Proteine mit hohem Molekulargewicht mit niederprozentigen Gelen aufgetrennt. Zur Größenidentifikation wurden neben den Proben ein Proteinmarker aufgetragen. Die Proteinauftrennung mit Elektrophoresepuffer (25 mM Tris-Base, 0,2 M Glycin, 1% SDS) erfolgte bei 6 mA konstant, über Nacht in einer Elektrophoresekammer.

Ammoniumpersulfat (APS) Bio-Rad, München TEMED Roth, Karlsruhe 30% Acrylamid/Bis-Lösung (37, 5:1) Bio-Rad, München Vertikal-Elektrophoresekammer, Protean® II xi Cell‘ Bio-Rad, München Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) Cell Signaling, USA

2.6.1.3 Western Blot

Aufgetrennte Proteine wurden elektrophoretisch mittels Trans-Blot®-Semi-Dry-Transferkammer auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Hierzu wurden in die Kammer je 3 Lagen Filterpapier um die vorinkubierte Membran (0,025 M Tris-HCl, 0,192 M Glycin, 20% (v/v) Methanol, 1% (w/v) SDS) aufgebracht. Geblottet wurde mit konstanten 15 V für 1,5 h. Waschritte der Membran erfolgten mit 1xTBST (400 g NaCl, 10 g KCl, 150 g Tris-Base, pH 7,4; ad. 5000 ml Aqua dest.), die Blockierung zur Unterbindung unspezifischer Bindungen inkubiert wurde für 1h in 5% Magermilch durchgeführt. Im Anschlus an drei weitere Waschschritte in TBST, erfolgte die Inkubation mit den Primärantikörpern. Diese wurden entsprechen der Tabelle 2 zu entnehmen, eingesetzt und bei 4°C über Nacht inkubiert.

Tabelle 2: verwendete primäre Antikörper. Antikörper Spezies Firma Verdünnung

anti-PARP1 Kanninchen UpstateBiotech. USA

1:1000 in 5 % (w/v) Magermilch in TBST

anti-PARG Maus Trevigen in 5 % BSA in TBST

anti-RAD51 Hase Cell Signaling in 5 % (w/v) skim milk in TBST

anti-GAPDH Maus Biodesign, USA 1:2000 in 5 % (w/v) Magermilch in TBST

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Material & Methoden 19

Tabelle 3: Sekundäre Antikörper. Antikörper Spezies Firma Verdünnung

anti-rabbit-IgG-HRP Ziege Cell Signaling 1:2000 in 5 % (w/v) Magermilch in TBST

anti-mouse-IgG-HRP Ziege Cell Signaling 1:2000 in 5 % (w/v) Magermilch in TBST

Nach der Antikörperbindung wurde vier mal je 15 min in 1xTBST gewaschen und anschließend für 1h bei RT mit einem Peroxidase (POD)-gekoppelten Sekundärantikörper (siehe Tabelle 3) inkubiert. Nach erneuten Waschschritten (vier mal je 15 min in 1xTBST) wurde mittels „SuperSignal® West Dura Extended Duration Substrate“ das Signal detektiert. Die Kontrolle der Beladungen wurde durch Behandlung mit SDS-β-Mercaptoethanol-Stripping-Lösung bei 52°C für 20 min (62,5 mM Tris-HCl, 2% (w/v) SDS, 100 mM β-Mercaptoethanol; pH 6,7) und einer erneuten Antikörperfärbung gegen GAPDH (Glycerinalgehyd 3-phosphat Dehydrogenase), ein Haushaltsgen bestätigt.

Magermilchpulver Fluka, Buchs (CH) KCl Merck, Darmstadt Methanol Merck, Darmstadt PVDF Membran Boehringer Mannheim Trans-Blot® Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad, München Filterpapier ‚Gel-Blotting Papier‘ Schleicher & Schuell, Dassel ‚Western Blocking Reagent‘ Roche, Mannheim ‚SuperSignal® West Dura Extended Pierce Biotechnology, USA Duration Substrate‘ ‚LAS-1000‘, Luminescent imager Medical Systems, USA

Zellanalyse mittels Immunfluoreszenzfärbung 2.6.2

2.6.2.1 Immunfluoreszenzfärbungen von Zellen in Chamberslides

Für die Immunfluoreszenz von Zellen auf Chamberslides wurden diese auf zuvor mit Poly-L-Lysin behandelte Objektträger ausgesät. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 30 min. fixiert. Danach wurden die fixierten Zellen kurz in 1x PBS gewaschen und in 0,2% Triton für 20 min. bei RT permeabilisiert. Daraufhin wurden die Objektträger und Zellen in einer feuchten Kammer bei 37°C mit 100 µl DNAseI inkubiert (Roche, 10000U/ml 1/10 in PBS) und danach erneut in 1x PBS gewaschen.

Die Blockierung unspezifischer Bindungen (PBS +1%BSA+2%FCS) erfolgte für 30 min. bei RT. Der Inkubation der primären Antikörper bei RT für 1Stunde in Blockierlösung folgten drei 10-minütige Waschschritte in 1xPBS. Die sekundären Antikörper wurden 1:1000 ebenfalls für 1h bei RT in Blockierlösung inkubiert. Nach dreimaligen PBS-Waschschritten wurden die Objektträger mit Eindeckmedium und DAPI eingedeckelt.

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Material & Methoden 20

Poly-L-Lysin Biochrom, Berlin Paraformaldehyd 4% in PBS, pH7,4 Sigma, Taufkirchen PBS Biochrom, Berlin Triton-X-100 Sigma, Taufkirchen DNAseI Roche, Mannheim Super-Frost-Plus Objektträger Menzel, Braunschweig

2.6.2.2 Immunfluoreszenzfärbungen von Gewebeschnitten

Für die immunfluoreszenz-Färbungen wurden die Paraffinblöcke zunächst mit einem RM 2255 Mikrotom (Leica) in Schnitte mit einer Stärke von 3 µm geschnitten und auf Super-Frost-Plus Glasobjektträger aufgezogen. Um das Gewebe mit dem Objektträger zu verbinden wurden die so präparierten Objektträger bei 56°C über Nacht inkubiert. Anschließend wurden die Paraffinschnitte mittels Microclear entparaffiniert und durch eine absteigende Alkoholreihe (100% Ethanol, 96% Ethanol, 70% Ethanol, H2O) rehydriert. Die Epitopdemaskierung erfolgte durch eine 20 min Inkubation der Objektträger im Dampfgarer in Target Retrieval Solution pH9oder pH6 (Dako, Dänemark). Die Schnitte wurden weitere 30 min im Puffer abgekühlt, bevor eine weitere Inkubation für 20 min zur Permeabilisierung ( 1x PBS, 0,2% Triton X100). Nach einem kurzen Waschschritt in 1x PBS erfolgte ein 1 stündiger DNAse-Verdau (1:10 in PBS) bei 37°C. Die Blockierung unspezifischer Antikörperbindungen (1xPBS, 1% BSA, 2%FCS) erfolgte dann für 1h. In dieser Waschlösung wurden anschließend die primären Antikörper über Nacht in einer feuchten Kammer inkubiert. Am darauffolgenden Tag, vor und nach der Inkubation mit den sekundären Antikörpern für 1h wurde erneut 3x 10 min mit 1x PBS gewaschen. Die Objektträger wurden mit Vectashield mit DAPI eingedeckelt und bei -20°C aufbewahrt.

Citratpuffer pH9/pH6 DakoCytomation, Dänemark Ethanol Merck, Darmstadt Ethanol 96% Merck, Darmstadt Isopropanol 70% Merck, Darmstadt Microclear 100% Merck, Darmstadt Rotationsmikrotom RM 2255 Leica Microsystems, Wetzlar DNAseI Roche, Mannheim Vectashield DAPI Vector, USA Anti-H2AX-Antikörper CellSignalling, USA Anti-P-53BP1-Antikörper CellSignalling, USA Anti-PAR-Antikörper Trevigen, USA Anti-Geminin-Antikörper Gentex, USA Anti-cleaved caspase3-Antikörper CellSignalling, USA Anti-RAD51-Antikörper CellSignalling, USA

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Material & Methoden 21

2.7 High-throughput qPCR mit Hilfe des BioMarkTM-HD-Systems

Herstellung von RNA 2.7.1

Die Zellen wurden trypsiniert, pelletiert (4°C, 1400rpm, 5min) und RNA isoliert mittels mirVana miRNA Isolation Kit nach Angaben des Herstellers.

RNeasy kit Quiagen

Spektrometrische Quantifizierung von RNA 2.7.2

Zur Quantifizierung wurde die Absorption im ultravioletten Spektralbereich gemessen. Zur Zur Konzentrationsbestimmung wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen, sowie zu Bestimmung deren Reinheit bei 280 nm. NanoDrop ND-100Spectrophotometer Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen

cDNA Synthese 2.7.3

Zur cDNA Synthese wurde 250 ng RNA eingesetzt und cDNA mittels RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit nach Herstellerangaben synthetisiert.

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Fermentas Mastercycler Gradient Eppendorf

Zur Genexpressionsanalyse wurde das BioMarkTM-HD-System vewendet, dies ermöglicht die simultane Analyse von 48 Gene und 48 Proben mit dem kleinen- oder 96 Gene und 96 gProben mit dem großen- Chip. Wie der Hersteller empfiehlt wurde zunächst eine specific target amplification (STA) zur spezifischen Anreicherung der Gene durchgeführt. Die verwendeten Assays für das 48x48 System sind in Tabelle 4 aufgelistet.

Tabelle 4: Verwendete TaqMan® Gene Expression Assays im 48x48 Format # Genname Assay Nummer 1 ABCB1 Hs01067802_m1 2 AIFM2 Hs01097300_m1 3 APAF1 Hs00559441_m1 4 ATF3 Hs00231069_m1 5 BAX Hs00180269_m1 6 BBC3 Hs00248075_m1

# Genname Assay Nummer 24 HGF Hs00300159_m1 25 hTERT Hs00972656_m1 26 IER3 Hs00174674_m1 27 IGFBP3 Hs00426287_m1 28 LRDD Hs00388035_m1 29 Mdm2 Hs00234753_m1

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Material & Methoden 22

7 Bcl-2 Hs00608023_m1 8 Bcl-xl Hs00236329_m1 9 BID Hs00609632_m1 10 BTG2 Hs00198887_m1 11 CD95 Hs00531110_m1 12 CDC25C Hs00156411_m1 13 CDK1 Hs00938777_m1 14 CDKN1A Hs00355782_m1 15 CGNG1 Hs00171112_m1 16 c-myc Hs00905030_m1 17 Cyclin B1 Hs01030097_m1 18 CyclinA Hs00996788_m1 19 CyclinK Hs00171095_m1 20 EGFR Hs01076078_m1 21 FasL Hs00181225_m1 22 Fos Hs00170630_m1 23 GADD45α Hs00169255_m1

30 Mdm4 Hs00159092_m1 31 Met Hs01565584_m1 32 P53AIP1 Hs00986095_m1 33 PCNA Hs00696862_m1 34 PMAIP1 Hs00560402_m1 35 RB1 Hs01078066_m1 36 TBP Hs00427620_m1 37 TNFRSF10A Hs00269492_m1 38 TNFRSF10B Hs00366278_m1 39 TNFRSF10C Hs00182570_m1 40 TNFRSF10D Hs00388742_m1 41 TP53 Hs01034249_m1 42 TP53i3 Hs00153280_m1 43 TP53INP1 Hs01003820_m1 44 TP63 Hs00978340_m1 45 TP73 Hs01056230_m1 46 ZMAT3 Hs00536976_m1

Für das 96x96 Format wurden die in Tabelle 5 aufgelisteten TaqMan® Gene Expression Assays verwendet. Tabelle 5: Verwendete TaqMan® Gene Expression Assays im 96x96 Format

Genname Assay Nummer 1 ALOX12 Hs00911144_m1 2 ATF2 Hs01095345_m1 3 ATF4 Hs00909569_g1 4 ATF6 Hs00232586_m1 5 ATG12 Hs00740818_m1 6 ATG5 Hs00355492_m1 7 ATG7 Hs00197348_m1 8 ATM Hs00175892_m1 9 ATR Hs00169878_m1 10 BAD Hs00188930_m1 11 BAK Hs00940250_g1 12 BCL2A1 Hs00187845_m1 13 Bcl2L13 Hs00209787_m1 14 Bcl2L14 Hs00373302_m1 15 Bcl2L2 Hs00187848_m1 16 BECN1 Hs01011599_m1 17 BIK Hs00154189_m1 18 BIRC2 Hs01112284_m1 19 BLM Hs00172060_m1 20 BMF Hs00372937_m1 21 BNIP3 Hs00969289_m1 22 BRCA1 Hs01556185_m1

Genname Assay Nummer 48 HSP90AA1 Hs00743767_sH 49 HSPA4 Hs00382884_m1 50 HSPA5 Hs99999174_m1 51 HSPB2 Hs00155436_m1 52 Jun Hs99999141_s1 53 JunD Hs04187679_s1 54 KLF6 Hs00810569_m1 55 MAFF Hs00544822_m1 56 MAPK8 Hs00177083_m1 57 Mcl1 Hs01050896_m1 58 MLH1 Hs00179866_m1 59 MSH2 Hs00954125_m1 60 NLRP2 Hs00215284_m1 61 NOS2A Hs01075523_m1 62 NQO1 Hs00168547_m1 63 Oas1 Hs00973635_m1 64 P2RY13 Hs01090437_g1 65 PARP1 Hs00242302_m1 66 PLA2G6 Hs00185926_m1 67 PPP1R15A Hs00169585_m1 68 PRDX1 Hs00602020_mH 69 PVR Hs00197846_m1

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Material & Methoden 23

23 CDKN1B Hs00153277_m1 24 CFLAR Hs01116281_m1 25 CHEK1 Hs00967506_m1 26 Cyr61 Hs00155479_m1 27 DDB2 Hs03044953_m1 28 DDIT3 Hs01090850_m1 29 DNAJC3 Hs00534489_m1 30 DUSP1 Hs00610256_g1 31 EDEM1 Hs00976004_m1 32 EDEM2 Hs01076556_m1 33 EGR1 Hs00152928_m1 34 EPHB1 Hs00174725_m1 35 ETS1 Hs00428293_m1 36 FANCA Hs01116661_m1 37 FANCD2 Hs00395700_m1 38 FANCG Hs00184947_m1 39 FANCM Hs00326216_m1 40 FEN1 Hs01099393_g1 41 FOSL1 Hs04187685_m1 42 FTH1 Hs01000476_g1 43 GRB2 Hs01074929_m1 44 GSTP1 Hs00168310_m1 45 HIF1A Hs00153153_m1 46 HMOX1 Hs01110250_m1 47 HRK Hs01388767_g1

70 RAD51 Hs00947968_m1 71 RIPK1 Hs00169407_m1 72 RPA1 Hs00161419_m1 73 RPRM Hs04189060_s1 74 RRM2B Hs00968430_m1 75 Senp2 Hs00989699_m1 76 SESN1 Hs00902787_m1 77 SFN Hs00968567_s1 78 SHISA5 Hs00429977_m1 79 SIRT1 Hs01009005_m1 80 SOD1 Hs00916176_m1 81 SOD2 Hs00167309_m1 82 SQSTM1 Hs00177654_m1 83 SUMO1 Hs02339311_g1 84 TBP Hs00427620_m1 85 TRAF1 Hs01090169_m1 86 TRAF2 Hs00184192_m1 87 TXN Hs00828652_m1 88 XBP1(S) Hs03929085_g1 89 XBP1(U) Hs02856596_m1 90 XIAP Hs00745222_s1 91 XPC Hs01104213_m1 92 XRCC1 Hs00959834_m1 93 XRCC3 Hs00193725_m1 94 Zfp36 Hs00185658_m1

Jede Probe wurde mit den vereinigten TaqMan® Gene Expression Assays und mit TaqMan PreAmp Master Mix (2x) versetzt und amplifiziert (10 min bei 95°C, 14 Zyklen: 15 sec 95°C, 4 min 60°C). Die weiteren Schritte der Genexpressionsanalyse mittels BioMarkTM-HD-System wurde nach Anleitung des Herstellers durchgeführt.

20x TaqMan® Gene Expression Assays Applied Biosystems, USA TaqMan® PreAmp Master Mix (2x) Applied Biosystems, USA 2x Assay Loading Reagent Fluidigm, USA 20x GE Sample Loading Reagent Fluidigm, USA TaqMan® Universal PCR Master Mix (2x) Applied Biosystems, USA 48.48 Dynamic ArrayTM IFC Fluidigm, USA 96.96 Dynamic ArrayTM IFC Fluidigm, USA IFC Controller MX Fluidigm, USA IFC Controller HX Fluidigm, USA BioMarkTM-HD-System Fluidigm, USA

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Material & Methoden 24

2.8 ATP-Test

Die ATP-Konzentration wurde in dem hier verwendeten Kit mit dem Luciferase-Luciferin System bestimmt. Luciferin wird unter ATP-Hydrolyse zu Oxyluciferin umgesetzt, so dass von der gemessenen Lichtintensität auf den ATP Gehalt der Probe geschlossen werden kann. 7500 Zellen wurden pro Loch einer 96-Loch Platte kultiviert. Nach der Behandlung werden 50 µl Lysepuffer zugeführt und für 30 min auf einem Schüttler inkubiert. 50 µl Zellsuspension je Probe wurden in eine weiße Mikrotiterplatte überführt und mit 50 µl Luciferin-Luciferase-Reagenz versetzt. Die Messung erfolgte am Photometer.

Lyse-Puffer DCs Innovative Diagnostik-Systeme, Hamburg Luciferin-Luciferase-Reagenz DCs Innovative Diagnostik-Systeme, Hamburg Rekonstitutionspuffer DCs Innovative Diagnostik-Systeme, Hamburg

2.9 DNA-Fiber Assay

Mittels DNA Fiber Assay ist es möglich die Initiation, die Elongation und die Termination der Replikation auf Nukleotid-Ebene zu analysieren. Hierzu werden halogenierte Thymidinanaloga verwendet durch welche es mittels anschließender Immunfärbung ermöglicht wird replizierte DNA an Chromatin Fasern nachzuweisen. Die Thymidin-Analoga Iododesoxyuridine (IdU) und Chlor-desoxyuridine (CldU) wurden den Zellen im Medium zugeführt und während der Replikation anstelle von Thymidin eingebaut.

Markierung mit IdU und CldU 2.9.1

Exponentiell wachsenden Ovarial- bzw. Kolonkarzinom-Zelllinien, sowie primäre Tumorzellen wurden für jeweils 45min mit 0,25 mM IdU-haltigem Medium mit und ohne Zytostatika inkubiert. Anschließend wurde das IdU-haltige Medium gegen 0,025 mM CldU-haltiges Medium für 45 min ausgetauscht. Die Zellen wurden trypsiniert und mit eiskaltem PBS gewaschen und anschließend in 1ml eiskaltem PBS resuspendiert. Die Zellzahl wurde mittels Neubauer Zählkammer auf 0.5x 106 Zellen pro ml eingestellt und bis zum Spreizen der Zellen auf dem Objektträger auf Eis gehalten.

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Material & Methoden 25

Spreizen der IdU und CldU-markierten DNA auf Objektträger 2.9.2

Für die Präparation der DNA aus den Zellen wurden pro Versuch 2µl der Zellsuspension auf einen Objektträger nahe dem Beschriftungsfeld pipettiert und zur Haftung an den Objektträger für 5 min trocknen gelassen. Eine Zugabe von 7µl des Lysepuffers auf die Zellsuspension erfolgte für 2 min. Hierdurch werden die Zellen zum Platzen gebracht und Proteine in den Zellen denaturieren. Zum Spreizen der der DNA wurde der Objektträger exakt mit einem Winkel von 15° gekippt, so dass der Tropfen bestehen aus Zellen und Lysepuffer bis zum Ende des Objektträgers herunter lief. Anschließend wurde der Objektträger für 4h im Dunkeln luftgetrocknet und im weiteren Verlauf in Methanol/Essigsäure (3:1) für 10 min fixiert und erneut für 2h luftgetrocknet. Die so behandelten Objektträger wurden bei -20°C über Nacht gelagert.

Immunfärbung der Chromatin Fasern 2.9.3

Zur Rehydrierung der DNA wurden die Objektträger einmal für 5 min mit H2O gespült. Für eine Denauturierung der DNA wurde die Objektträger einmal für 5 min mit 2,5 M HCL äquilibriert und anschließend weitere 75 min mit 2,5 M HCL inkubiert. Anschließend daran wurde dreimal kurz in PBS gespült bevor die Blockierung, zur Vermeidung unspezifischer Bindungen der Antikörper (3%BSA, 0,01 %Tween 20 in 1xPBS) für 1 h erfolgte. Für die Detektion der IdU-Nukleotide wurde ein primärer, monoklonaler anti-BrdU aus der Maus (1:25), sowie ein primärer, monoklonaler anti-BrdU aus der Ratte (1:400) für 1h bei RT in einer feuchten Kammer eingesetzt. Anschließend wurden die Objektträger erneut einmal kurz und dreimal 10 min mit Blockingwaschlösung gewaschen. Im nächsten Schritt wurde die DNA sowie die daran gebundenen Antikörper mit 4 % Paraformaldehyd für 10 min fixiert und erneut wie im Schritt zuvor gewaschen. Für die Detektion des anti-BrdU-Antikörpers wurde ein sekundärer anti-maus AlexaFluor 549 (1:500) sowie ein sekundärer anti-rat AlexaFluor 488 (1:500) für 1,5h bei RT verwendet. Nach der Inkubation wurden die Objektträger erneut einmal kurz und dreimal 10 min mit Blockingwaschlösung gewaschen. Die Objektträger wurden mit Vectashield mounting Medium eingedeckt und bei -20°C gelagert. Zur Auswertung der Chromatin Fasern wurden mit dem 63er Öl-Objektiv Fluoreszenzmikroskopische Bilder aufgenommen und mit ImageJ ausgewertet.

Super-FrostPlus Objektträger Menzel, Braunschweig IdU Sigma, Seelze CldU Sigma, Seelze Anti-BrdU-Antikörper Maus BD Bioscience, USA Anti-BrdU-Antikörper Ratte BD Bioscience, USA Vectashield, DAPI Vector, USA

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Material & Methoden 26

Auswertung mit Image J 2.9.4

Für die Auswertung der Chromatin-Fasern wurden je Ansatz 3 Objektträger hergestellt, pro Objekt-träger wurden mindestens 10 Fluoreszenzaufnahmen gemacht. Für die Analyse der verschiedenen Replikations-Strukturen wurde das Plug-In Analyze von ImageJ verwendet.

Zur Messung der Länge der Chromatin-Fasern erfolgte mittels Segmented lines von ImageJ.

2.10 Statistik

Die Auswertungen erfolgten mit dem Programm GraphPad Prism. Bei den dargestellten Werten handelt es sich um Mittelwerte ±SD von drei unabhängigen Experimenten. Unterschiede in zwei Gruppen wurden mit dem zweiseitigen, gepaarten Students t-Test ausgewertet (*: p≤0.05, **: p≤0.01, ***: p≤0.001, ****: p≤0.0001).

GraphPad Prism GraphPad Prism Software USA

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Ergebnisse 27

3 Ergebnisse

Die hypertherme intraperitoneale Chemotherapie (HIPEC) in Verbindung mit einer radikalen Chirurgie (CRS) ist derzeit eine vielversprechende Behandlungsoption von Patienten mit peritoneal metastasierten Tumoren. Aufgrund lückenhafter klinischer Daten, erheblicher Nebenwirkungen, sowie einem rudimentären Verständnis der molekularen Mechanismen der Hyperthermie vermit-telten Effizienssteigerung von Zytostatika ist diese Therapie jedoch bislang nicht als Leitlinien-therapie festgelegt und wird generell kritisch diskutiert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es des-halb die molekularen Mechanismen, die dieser Temperatur-abhängigen Effizienzsteigerung zugrunde liegen, näher zu beleuchten, um so die Grundlage für eine gezieltere, effizientere, sowie besser verträglichere Therapieoption zu schaffen.

3.1 Eine Temperatur von mindestens 40°C ist notwendig zur signifikanten Steigerung der

Zytotoxizität von Cisplatin und Doxorubicin

Bislang existieren für die HIPEC keine verbindlichen Richtlinien. So werden in verschiedenen Zentren Temperaturen von 39,5°C bis zu 48°C angewandt (Glehen et al., 2004; Shen et al., 2003). Hohe Temperaturen sind allerdings mit einer Reihe von Nebenwirkungen verbunden (Saxena et al., 2010), und der tatsächliche Nutzen für den Patienten ist nach wie vor unklar. So ist es notwendig sowohl allgemein den Benefit der Hyperthermie als auch die minimal nötige Temperatur für eine Effizienzsteigerung der Chemotherapie zu klären, um das Nebenwirkungsspektrum möglichst gering zu halten.

Temperaturen über 40°C für eine Stunde in-vitro steigern signifikant die 3.1.1

zytotoxischen Wirkungen von Cisplatin und Doxorubicin

Um den Effekt der Temperatur auf das Langzeitüberleben in-vitro zu untersuchen, wurde zunächst ein auf Zelllinien basiertes Model etabliert, welches die Therapie in der Klinik sehr nah wider-spiegelt. Zellen wurden hierzu bei 37°C und 3% 02 kultiviert, lediglich die Behandlung fand bei der entsprechenden Temperatur für exakt eine Stunde bei atmosphärischen Sauerstoff-konzentrationen statt. Zur Untersuchung von Langzeiteffekten der verschiedenen Temperaturen auf Cisplatin und Doxorubicin wurden zunächst je eine Kolonkarzinom- und Ovarialkarzinomzelllinie für eine Stun-de in 1°C-Schritten von 37°C bis zu 42°C alleine, sowie in Kombination mit den zu untersuchten Chemotherapeutika behandelt und zur Analyse des Langzeitüberlebens in einer Zelldichte von 500 bzw. 1000 Zellen je Flasche ausgesät. Nach 10 Tagen wurde das klonogene Wachstum bestimmt. Interessanterweise hat die Hyperthermie in dem hier untersuchten Temperaturbereich bis 42°C keinen Einfluss auf das klonogene Wachstum der Zellen (Abb. 1). Wie erwartet kommt es im Gegensatz dazu nach Behandlung mit Cisplatin und Doxorubicin bereits bei 37°C zu einer signifikanten Reduktion der klonalen Effizienz in allen untersuchten Zelllinien. So zeigt die OVCAR8 nach Cisplatin Behandlung eine Reduktion der klonalen Effizienz von 59% auf nunmehr 26% und nach Doxorubicin-Behandlung auf 12,5%. Die HCT116 zeigen eine Reduktion der

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Ergebnisse 28

klonalen Effizienz von 63% auf nunmehr 28% und nach Doxorubicin-Behandlung auf 16%. Dies konnte durch Erhöhung der Temperaturen auf bis zu 39°C nicht weiter gesteigert werden. Jedoch ist eine signifikante Steigerung der Zytostatika durch Temperaturen ab 40°C in allen untersuchten Zelllinien sowie durch beide verwendete Zytostatika zu sehen (Abb.1). So ist es möglich in-vitro einen signifikanten Temperatur-Schwellenwert ab 40°C sowohl für Cisplatin, wie auch für Doxorubicin zu definieren (Abb. 1B) Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es in-vitro eine sehr klar definierte Temperaturschwelle bei 40°C gibt, ab der die Zytotoxizität von Cisplatin und Doxorubicin signifikant gesteigert werden kann.

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Ergebnisse 29

Abbildung 1: 40°C ist der Schwellenwert, der in-vitro zur signifikanten Steigerung der Cisplatin- und Doxorubicinwirkung führt. Zellen wurden trypsiniert und bei Temperaturen von 37°C-42°C mit oder ohne 40 µM Cisplatin, bzw. 15 µM Doxorubicin für 1h behandelt. Anschließend wurden die Zellen in einer Zell-dichte von 500 oder 1000 Zellen je Flasche ausgesät. Nach 10 Tagen wurde die klonogene Wachstums-eigenschaft durch Auszählen der Kolonien, mit mehr als 50 Zellen bestimmt. A) Klonale Effizienz bei Temp-eraturen von 37°C bis 42°C mit und ohne Zytostatika. Die Abbildung zeigt Mittelwerte ±SD von drei unab-hängigen Experimenten. B) Zusammengefasste Daten behandelter Zellen bei Temperaturen unterhalb, bzw. oberhalb von 40°C. Die Abbildung zeigt log2-fache Veränderungen (behandelt vs. Kontrolle) von drei unab-hängigen Experimenten.

Konstante Temperaturen ab 40°C werden in den meisten Patienten während der 3.1.2HIPEC erreicht

Um die Frage zu klären, welche Temperaturen während der HIPEC in Patienten erreicht werden und inwieweit diese konstant aufrechterhalten werden, wurden retrospektiv Temperaturverläufe, die während der HIPEC im Robert-Bosch Krankenhaus bei 31 PC-Patienten gemessen wurden analysiert und für jeden Patienten aufgetragen. Temperatur-messungen erfolgten alle 10 Minuten, insgesamt über 60 Minuten am Einstrom und Ausstrom sowie an zwei intraperitonealen Stellen, dem Pelvis und der Bursa omentalis im Abdomen (Abb.2).

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Ergebnisse 30

Abbildung 2: Konstante Temperaturen von mindestens 40°C uns 40 Minuten werden in 68% der HIPEC-Patienten in der Klinik erreicht. Temperaturmessungen erfolgten alle 10 Minuten an vier Mess-punkten (Einstrom, Ausstrom, Bursa omentalis und Pelvis) über die gesamte 60minütige HIPEC. Messpunkte der Temperaturverläufe jedes Patienten sind in verbundenen Linien dargestellt. Aus diesem Patientenkollektiv wurden 2 Gruppen identifiziert A) die hypertherme Gruppe, charakterisiert durch Temperaturen über 40°C für mindestens 40 Minuten und in allen intraabdominalen Bereichen B) Patienten der Nicht-Hyperthermen Gruppe erreichen diese Temperaturen entweder nicht im Pelvis (blaue Linien) oder in der Bursa omentalis (rote Linien) oder in keinem intraabdominalen Bereich (graue Linien). In Anlehnung an die in Abbildung 1B gezeigten Daten wurden die Temperaturverläufe in zwei Gruppen unterteilt. Die hypertherme Gruppe, die die Temperatur von mindestens 40°C über mindes-tens 40 Minuten in allen gemessenen Bereichen erreicht und die Nicht-hypertherme Gruppe, die diese Kriterien nicht erfüllt. 68% der Patienten wurden demnach der Hyperthermen Gruppe (Abb. 2A grüne Linien) und 32% der Nicht-Hypertherme Gruppe (Abb 2B) zugewiesen. Tabelle 6 enthält die Patientencharakteristika sowie die Einteilung in die beiden Gruppen. In Letzterer wurden 4 Patienten identifiziert, bei denen der Temperatur-Schwellenwert von 40°C zwar in der Bursa omentalis, jedoch nicht im Pelvis erreicht werden konnte (Abb, 2B blaue Linien), drei weitere Patienten erreichten diese Temperaturen ausschließlich im Pelvis (rote Linien) während bei drei Patienten die Temperatur in keinem Kompartiment konstant bei 40°C erhalten werden konnte (graue Linien).

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Ergebnisse 31

Tabelle 6: Charakteristika der HIPEC-Patienten. Ovarialkarzinom (O), Magenkarzinom (M), Kolonkarzinom (K), Gruppe 1 entspricht der Hyperthermen-Gruppe, Gruppe 2 entspricht der Nicht-hyperthermen-Gruppe. 3.1.3 Der Temperaturschwellenwert von 40°C über mindestens 40 Minuten ist entscheidend

für das progressionsfreie- bzw. Gesamtüberleben von HIPEC-behandelten PC-Patienten

Die beiden in 3.1.2 beschriebenen Patientengruppen wurden im Folgenden bezüglich des progressionfreien- und Gesamtüberlebens verglichen. Betrachtet man das gesamte Kollektiv zeigt sich ein mittleres Gesamtüberleben von 23,5 Monaten und ein mittleres progressionsfreies Überleben von 7,5 Monaten.

Werden die beiden Gruppen miteinander verglichen ergibt sich für die Patienten der Hyperthermen Gruppe im Gegensatz zur Nicht-Hyperthermen Gruppe ein signifikant verlängertes Gesamt-überleben, sowie eine verlängerte progressionsfreie Zeit. Während die Nicht-Hypertherme Gruppe ein mittleres Gesamtüberleben von 11 Monaten zeigt, wird dieses bei der Hyperthermen Gruppe um weitere 14 Monaten verlängert.

Das progressionsfreie Überleben wird in der Hyperthermen Gruppe von 3 Monaten um weitere 8,5 Monaten verlängert (hazard ratio, 0,064; 95% CI, 0,016 to 0, 26; log-rank P= 0.0001 für das Gesamtüberleben und hazard ratio, 0,22; 95% CI, 0,071 to 0,73; log-rank P=0.012 für das Progressionsfreie Überleben). Dieses verbesserte Überleben der Hyperthermen Gruppe geht einher mit einem signifikant erhöhte Clavien-Dindo-Score, der ein Maß für Nebenwirkungen ist (chi-square Trendtest; P=0.0023). Bezüglich aller anderer Parameter, wie Alter, Allgemeinzustand, die

Patient Gruppe m/w Alter Diagnose CC PCI 1 1 m 52 M 0 14 2 1 w 69 O 0 19 3 1 w 53 O 0 12 4 2 w 60 O 0 7 5 1 w 33 O 0 25 6 2 w 58 O 2 20 7 1 w 53 M 0 12 8 1 w 71 K 0 4 9 1 w 79 O 0 5

10 1 w 51 M 0 3 11 2 w 62 O 0 7 12 1 w 53 O 1 11 13 1 m 38 M 1 4 14 1 w 61 O 1 14 15 2 w 61 M 0 8 16 1 w 52 O 0 8 17 2 w 53 M 0 39 18 1 w 58 O 0 14 19 1 w 62 O 1 28 20 2 w 75 O 1 26 21 1 w 48 O 1 20 22 2 m 70 M 3 10 23 1 m 63 P 0 19 24 1 w 67 O 1 19 25 2 m 56 M 0 11 26 1 w 56 M 0 8 27 1 w 75 O 1 25 28 1 w 64 P 1 36 29 1 w 59 O 0 10 30 2 w 61 O 0 17 31 2 w 53 O 0 12

!

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Ergebnisse 32

Tumoraussaat (definiert durch den “peritoneal cancer index”, PCI), Dauer der Chirurgie und dem CC-Score, der ein Maß für die erreichte Tumorfreiheit nach Operation ist zeigen beide Gruppen keine signifikanten Unterschiede (Tabelle 7).

Abbildung 3: Der Temperaturschwellenwert von 40°C konstant über mindestens 40 Minuten während einer HIPEC ist signifikant für das Gesamt- und progressionsfreie Überleben von PC-Patienten. A) Kaplan-Meier-Analysen des Gesamt- und progressionsfreien Überleben aller Patienten des Kollektivs. B) Kaplan-Meier-Analysen des Gesamt- und progressionsfreien Überleben der beiden Gruppen im Vergleich

Tabelle 7: Klinische Charakteristika der Hyperthermen- und der Nicht-Hyperthermen-Gruppe.

Klinische Charakteristika der Hyperthermen-Gruppe und der Nicht-Hyperthermen-Gruppe

Variablen Kategorien Hypertherme-Gruppe Nicht-Hypertherme-Gruppe

Alter median (IQ range) 57.9 (52.4,63.8) 60.5 (56.2,62) PCI median (IQ range) 14.7(8,9) 15.7 (8.5,19.25) CC-Score 0 61.9% 70% 1 38.1% 10% 2 0% 20% BMI median (IQ range) 24.4 (22.4,30) 22.8 (21.7,23.4) Dauer der Op median (IQ range) 8,34h (6.57,10) 9.2h (6.7,10.27) Clavien-Dindo-Score

3a 4,7% 0%

3b 19% 10% 2 23.8% 20% 1 9.5% 10% 0 42.8% 60%

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Ergebnisse 33

3.2 Hyperthermie hat keinen Einfluss auf Chemotherapie-induzierte Apoptose oder Zellzyklusarrest.

3.2.1 Hyperthermie alleine hat nur marginale Effekte auf die transkriptionelle Regulation

von Zellzyklus- und Apoptose-assoziierten Genen

Um die molekularen Hintergründe des reduzierten Langzeitüberlebens zu untersuchen, wurde zunächst die Aktivität einer Reihe zentraler Stresswege nach Hyperthermie-Behandlung analysiert. Hierzu wurde die Expression von 134 Transkripten (Tabelle 4) in einem Hochdurchsatzverfahren gemessen. Die differentielle Regulation dieser Transkripte soll daher als Indikator von zellulärem Stress dienen. Dargestellt ist die differentiellen Genexpression 8 Stunden nach einstündiger Hyperthermie-Behandlung (Abb. 4). Insgesamt wird in beiden untersuchten Zelllinien ausschließlich ABCB1 hochreguliert. Die OVCAR8 zeigt neben der differentiellen Regulation von ABCB1 auch eine Regulation von BCL2L13. Signifikant herunterregulierte Gene konnten nicht identifiziert werden.

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Ergebnisse 34

Abbildung 4: Hyperthermie zeigt keinen Einfluss auf die Regulation von 134 Transkripte zentraler Stresswege. Differentielle Expression von 134 Transkripte zentraler Stresswege nach 1-Stündiger Hyperthermie-Behandlung bei 42°C. Nach 8 h Inkubation bei 37°C und 42°C erfolgte die Isolation der RNA mit anschließender Genexpressionsanalyse. Die Diagramme zeigen log2-ΔΔCt-Werte. Jeder Balken ent-spricht dem Mittelwert aus zwei unabhängigen Experimenten. 3.2.2 Die synergistischen Effekte von Hyperthermie und Zytostatika sind unabhängig von

der transkriptionellen Regulation von Stress-assoziierten Genen

Im Folgenden sollte die transkriptionelle Regulation dieser 134 Zielgene nach hyperthermer Zytostatika-Behandlung untersucht werden. Abbildung 5 zeigt die differentielle Genexpression. Die Diagramme zeigen log2-ΔΔCt-Werte der jeweiligen Behandlung bei 37°C (x-Achse) aufgetragen gegen die log2-ΔΔCt-Werte nach der entsprechenden hyperthermen Behandlung (y-Achse). Sehr auffällig ist insgesamt die relativ geringe Regulation dieser Gene durch Cisplatin. Betrachtet man ausschließlich die DDR-assoziierten Gene werden in der OVCAR8 nach Doxorubicin bei 37°C nur TP53INP1 um das mehr als 2fache hochreguliert und FANCM herrunterreguliert. Jedoch gibt es auch hier keine Überschneidung mit der HCT116, welche nur die Hochregulation von TP53I3 zeigt. Bezüglich der p53-Targets wird nach Cisplatin in der HCT116 ausschließlich ABCB1 differentiell reguliert, während in der OVCAR8 keine differentiellen

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Ergebnisse 35

Regulationen stattfinden. Nach Doxorubicin werden einige Gene differentiell reguliert, dies sind für die OVCAR8 HGF, TP53INP1, BCL2A1, BAK, FOS und TP53AIP1. Die HCT116 zeigt die differentielle Regulation von TNFRSF10D, CDC25 und ebenfalls FOS. Bei den NFkB-Zielgenen werden bezüglich der Schädigung durch Cisplatin in beiden Zelllinien bis auf ABCB1 keine differentiell regulierten Targets gefunden. Nach Doxorubicin werden in der OVCAR8 TP53AIP1, FASLG, TP53INP1, HMOX1, BCL2A1 und TP73 reguliert, während die HCT116 bis auf die Hochregulation von TP53AIP1 keine Überschneidungen mit der OVCAR8 zeigt.

Die Analyse der Stressresponse-Wege zeigt deutlich, dass es nahezu keine Stressgene gibt, die in beiden Linien durch Erhöhung der Temperatur differentiell reguliert werden. Dieses Ergebnis deutet darauf hin dass die Aktivierung der Stressresponse-Wege durch die Erhöhung der Temperatur nicht maßgeblich beeinflusst wird.

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Ergebnisse 36

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Ergebnisse 37

Abbildung 5: Hypertherme Zytostatika-Behandlungen zeigen nur eine marginalen Einfluss auf die Regulation von 134 Stress-abhängigen Targets. Differentielle Expression der 134 Stress-abhängigen Targets nach 1-Stündiger Cisplatin- bzw. Doxorubicin-Behandlung bei 37°C, bzw. 42°C. Nach 8 h Behandlung bei 37°C und 42°C erfolgte die Isolation der RNA mit anschließender Genexpressionsanalyse. Die Diagramme zeigen die log2-ΔΔCt-Werte der normothermen Behandlug (x-Achse) aufgetragen gegen die log2-ΔΔCt-Werte nach hyperthermer Behandlung (y-Achse). Jeder Punkt entspricht dem Mittelwert aus zwei unabhängigen Experimenten.

Hyperthermie alleine, sowie die Kombination mit Zytostatika führt zu keinen 3.2.3signifikanten Veränderungen in der Apoptoserate und der Zellzyklusverteilung

Der Einfluss der erhöhten Temperatur auf die Wirkung klinisch relevanter Zytostatika bezüglich des Zelltodes wurde in 3 Ovarialkarzinom- und 3 Kolonkarzinomzelllinien mittels Annexin-FITC, sowie Viabilitätsbestimmungen via MTT untersucht.

Für die durchflusszytometrische Analyse wurden die Zellen für eine Stunde mit 40 µM Cisplatin, 15 µM Doxorubicin, 40 µM Oxaliplatin, 12 µM 5-FU und 12 µM Paclitaxel bei 37°C und 42°C behandelt. Im Anschluss daran erfolgte ein Mediumwechsel, sowie eine weitere Kultivierung bei atmosphärischer Sauerstoffkonzentration und 37°C für 48h.

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Ergebnisse 38

Interessanterweise konnten keine signifikanten Unterschiede innerhalb der beiden Temperaturen über alle untersuchten Zelllinien und Zytostatika hinweg gefunden werden (Abb. 6). Ebenfalls findet sich kein Unterschied innerhalb der hier untersuchten Entitäten.

Neben der Annexin-Färbung wurden zusätzlich Viabilitätsbestimmungen durch MTT-Messungen nach Cisplatin- bzw. Doxorubicin-Behandlung bei 37°C und 42°C durchgeführt. Vergleichbar mit der Messung der Apoptose zeigt sich kein signifikanter Unterschied bezüglich der Viabilität der Zellen, lediglich die OVCAR4 zeigt eine marginal reduzierte Viabiliät nach Cisplatin bzw. Doxorubicin bei 42°C (Abb. 6B).

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Ergebnisse 39

Abbildung 6: Hyperthermie zeigt keinen Einfluss auf die Zytostatika-induzierte Apotose oder Zellviabilität. A) Die Induktion von Zelltod 48h nach Cisplatin, Doxorubicin, Oxaliplatin, 5-FU und Paclitaxel-Behandlung bei 37°C (weiß) und 42°C (grau) sind dargestellt. Im Gegensatz zur klonogenen Wachstumsrate konnte kein Einfluss der Hyperthermie auf die Induktion von Apoptose nachgewiesen werden. Die Messung des Zelltods erfolgte durch eine AnnexinV-FITC-Färbung am Durchflusszytometer. Dargestellt wurde die prozentuale Induktion AnnexinV-FITC positiver Zellen nach Behandlung. Die Werte entsprechen den Mittelwerten aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. B) 8000 Zellen wurden in 150 µl je Loch einer 95-well-Platte ausgesät und mit den oben angegebenen Zytostatika in entsprechenden Konzentrationen behandelt. Anschließend wurde die Viabilität der Zellen mit Hilfe des MTT-Assays bestimmt. Dargestellt ist die Viabiliät der Zellen 48h nach der Behandlung. Die Werte entsprechen den Mittelwerten aus drei unabhängigen Experimenten ±SD.

Neben dem Einfluss auf den Zelltod, sollte die Zellzyklusverteilung nach hyperthermer Cisplatin-Behandlung analysiert werden. Cisplatin führt in der OVCAR8 unabhängig von der Temperatur zu einem S-Phasen-Arrest. Bei der HCT116 scheint es auf den ersten Blick Unterschiede zwischen beiden Temperaturen bezüglich des Anteils von Zellen in S- und G2- nach Cisplatin-Behandlung zu geben. Da Zellen in der Regel nicht mit einem G2-Arrest auf Cisplatin reagieren liegt dies vermutlich daran, dass der S-Phasenarrest in der normothermen Behandlung bereits aufgelöst ist und die Zellen synchron im Zyklus weiter gehen. Durch die hypertherme Behandlung wird dieser Übergang minimal reduziert (Abb. 7).

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Ergebnisse 40

Abbildung 7: Hyperthermie beeinflusst die Zellzyklusverteilung 48 Stunden nach Zytostatikagabe nur minimal. Dargestellt ist die Zellzyklusverteilung mit und ohne Behandlung und Hyperthermie. Cisplatin induziert in der OVCAR8 unabhängig der Temperatur einen S-Phasen Arrest, während die HCT116 einen S-Phasen-Arrest dessen Auflösung in einer Akkumulation in G2/M mündet, diese ist nach der Hyperthermen-Behandlung leicht verzögert. Die Zellzyklusmessung erfolgte durch die Färbung von eingebautem BrdU, sowie die Quantifizierung der DNA durch Propidiumiodid am Durchflusszytometer. Dargestellt ist die prozentualen Verteilung der Zellen in SubG1-, G1-, S- und G2-Phase nach Behandlung. Die Werte entsprechen den Mittelwerten aus drei unabhängigen Experimenten ±SD.

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Ergebnisse 41

3.3 Hyperthermie führt zu einer veränderten Zytostatika-Aufnahme

Ein in der Literatur beschriebener Vorteil der Hyperthermie während der HIPEC ist die Erhöhung der intrazellulären Konzentration des verwendeten Zytostatikums.

Bei Temperaturen von mehr als 40°C kommt es zu einer Erhöhung der intrazellulären 3.3.1Doxorubicin-Konzentration, während die Anzahl der DNA-Cisplatin-Adukkte nicht beeinflusst wird

Um den Einfluss von Hyperthermie auf die intrazelluläre Doxorubicin-Konzentration zu untersuchen wurde die für Doxorubicin typische Eigenfluoreszenz genutzt und mittels Durchfluss-zytometer quantifiziert. Hierfür wurden die OVCAR8 und HCT116 mit 15 µM Doxorubicin für eine Stunde bei unterschiedlichen Temperaturen behandelt. Direkt anschließend an diese Behand-lung wurden die Zellen geerntet und am Durchflusszytometer analysiert. Tatsächlich korreliert die intrazelluläre Doxorubicin-Konzentration mit der Temperatur. Bei einer Doxorubicin-Behandlung mit 15 µM erhält man bei 42°C im Gegensatz zur 37°C-Behandlung in beiden untersuchten Zelllinien in etwa die doppelte intrazelluläre Konzentration (Abb. 9A).

Werden die Zellen mit Doxorubicin bei Temperaturen beginnend bei 37°C in Gradschritten bis zu 42°C inkubiert, erkennt man erneut den Temperaturschwellenwert bei 40°C (Abb. 8A). In dem Temperaturbereich von 37°C bis 39°C verändert sich die intrazelluläre Konzentration nur marginal, während diese bei 40°C bereits signifikant erhöht ist und bis zu 42°C weiter gesteigert wird.

Für die Quantifizierung der DNA-gebundenen Cisplatin-Menge in den Zellen wurde ein spezi-fischer DNA-Cisplatin-Addukt-Antikörper verwendet. Dieser ermöglicht mittels Immunfluores-zenz die Quantifizierung der durch Cisplatin induzierten DNA-Addukte. Konträr zu Doxorubicin hat die zusätzliche Behandlung mit Hyperthermie keinen Einfluss auf Fluoreszenzintensität, die ein Maß für die Menge der nukleären Platin-DNA-Addukte darstellt (Abb. 8B). Demzufolge konnte eine Hyperthermie-vermittelte Veränderung der Zytostatika-Aufnahme für Doxorubicin, nicht aber für Cisplatin gezeigt werden.

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Ergebnisse 42

Abbildung 8: Temperaturen von mehr als 40°C führen zu erhöhten intrazellulärer Doxorubicin-Konzentrationen, wohingegen keine Veränderung der DNA-Cisplatin-Addukte-Menge durch Hyper-thermie feststellbar ist. Zellen wurden für eine Stunde mit 15 µM Doxorubicin bzw. 40 µM Cisplatin mit unterschiedlichen Temperaturen behandelt. A) Die intrazelluläre Doxorubicin-Konzentration wurde mittels FACS analysiert. Werte repräsentieren log2-fache Veränderungen (Behandelt vs Kontrolle) von drei unabhängigen Experimenten. B) Zellen wurden mit und ohne 40µM Cisplatin für eine Stunde bei 37°C und 42°C behandelt. DNA-Cisplatin-Adukkte wurden mittels eines spezifischen Addukt-Antikörpers durch eine Immunfluoreszensfärbung nachgewiesen. Die Quantifizierung erfolgte mittels Definiens-Tissue-Studio. Dargestellte Werte repräsentieren Mittelwerte ±SD von drei unabhängigen Experimenten.

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Ergebnisse 43

Die Temperatur-vermittelte Steigerung der Zytotoxizität ist nicht hauptsächlich 3.3.2abhängig von einer veränderten Doxorubicin-Aufnahme

Um herauszufinden, ob der durch die Temperatur veränderte Transport im Falle von Doxorubicin ursächlich für die erhöhte Zytotoxizität ist, wurden die Doxorubicin-Konzentration so angepasst, dass sowohl bei 37°C, als auch bei 42°C gleiche intrazelluläre Doxorubicin-Konzentrationen vor-liegen (Abb. 9A). Hierzu wurde die Doxorubicin-Konzentration bei 42°C in kleinen Konzen-trationsschritten so weit nach unten titriert bis intrazelluläre Konzentrationen erreicht wurden, die denen nach Behandlung mit 15 µM bei 37°C entsprachen. Demzufolge wurden in den weiteren Behandlungen bei der OVCAR8 nur 6.5 µM und bei der HCT116 7 µM Doxorubicin bei der hyperthermen Behandlung eingesetzt (Abb. 9A). Wie in 2.4 beschrieben wurde das klonogene Wachstum nun unter Verwendung der angepassten Konzentrationen untersucht. Weiterhin ist eine signifikante Reduktion des Langzeitüberlebens nach der hyperthermen Behandlung mit diesen geringeren Konzentrationen zu beobachten (Abb. 9B). Die Reduktion ist minimal geringer als bei den unangepassten Konzentrationen, demzufolge ist der Mechanismus der erhöhten Zytotoxizität durch Hyperthermie hauptsächlich nicht abhängig vom Transport, sondern beruht auf einem anderen Mechanismus.

Abbildung 9: Hyperthermie führt auch nach Anpassung der intrazellulären Doxorubicin-Konzentra-tion zu einer verstärkten Zytotoxizität. Zellen wurden für eine Stunde mit 15 µM Doxorubicin bei 37°C und mit 6,5 µM (OVCAR8) bzw. 7 µM (HCT116) bei 42°C behandelt. Das klonogene Wachstum wurde bestimmt. Die Daten zeigen Mittelwerte ±SD von drei unabhängigen Experimenten.

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3.4 Die synergistischen Effekte von Cisplatin und Doxorubicin bei erhöhter Temperatur sind auf eine reduzierte DNA-Reparaturkapazität zurückzuführen

Eine durch Hyperthermie vermittelte Beeinträchtigung der DNA-Reparatur wurde mehrfach postuliert. So wurden beispielsweise in Osteosarkomzellen und in Ovarialzellen des Hamsters durch Hyperthermie die Degradation von BRCA2 nach Bestrahlung beobachtet (Genet et al., 2013; Krawczyk et al., 2011). In einer anderen Arbeit wurde durch Hyperthermie die Aggregation von KU, einer Untereinheit der DNA-PK nach Bestrahlung und die damit verbundene Hemmung der DSB-Reparatur beschrieben (Burgman et al., 1997). Die Dauer und Art der Hyperthermie-Applikation in diesen Arbeiten unterscheidet sich allerdings von der hier verwendeten klinisch-applizierbaren Hyperthermie. Daher stellte sich im Folgenden die Frage, ob auch durch die sehr kurze Behandlung mit Hyperthermie und der hier verwendeten gleichzeitigen Gabe von Cisplatin bzw. Doxorubicin die Reparatur der gesetzten DNA-Schäden beeinflusst wird.

Hyperthermie führt nicht zu einer veränderten Anzahl an DNA-Strangbrüchen 3.4.1

Mit Hilfe des Comet-Assays soll im Folgenden der Einfluss von Hyperthermie auf die DNA-Schadensinduktion analysiert werden. Der Comet-Assay ermöglicht je nach Modifikation der Methode, die Analyse verschiedener Brüche auf Einzelzellebene.

Bei dem hier verwendeten alkalischen Comet-Assay handelt es sich um das von Singh et al. veränderte Protokoll, das die Detektion von Einzelstrang- bzw. Doppelstrangbrüchen sowie von Alkali-labilen-Stellen ermöglicht (Singh et al., 1988).

Zunächst sollte untersucht werden, ob Hyperthermie die Induktion von DNA-Strang-brüchen direkt nach Schadensinduktion oder insgesamt das Ausmaß der Schäden verändert. Hierzu wurden im Folgenden die Zellen nach einer einstündigen Inkubation bei der entsprechenden Temperatur direkt mittels ionisierender Strahlung geschädigt und gleich im Anschluss daran analysiert. Hier ist es nicht möglich, Cisplatin oder Doxorubicin als schädigendes Agenz einzusetzen, da während der einstündigen Inkubation bereits Reparaturprozesse einsetzen könnten und damit keine aussage-kräftige Antwort bezüglich direkt induzierter Schäden möglich wird. In Abbildung 10 ist eine Häufigkeitsverteilung der jeweiligen behandelten Zellen zu sehen. Je höher der DNA-Gehalt im Schweif, desto mehr Schäden enthält diese Zelle und desto weiter links befindet sich diese. Insgesamt, über alle untersuchten Zelllinien hinweg ist kein Unterschied zwischen den normotherm und hypertherm behandelten Zellen zu sehen (Abb. 10).

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Abbildung 10: Hyperthermie führt zu keiner veränderten Induktion von DNA-Strangbrüchen nach Schadensinduktion durch Bestrahlung. Drei Ovarialkarzinom- und zwei Kolonkarzinomzelllinien wurden für eine Stunde bei 37°C und 42°C inkubiert und direkt anschließend daran mit 30 GY bestrahlt und danach geerntet. Nach der Analyse im Comet-Assay wurde der Anteil der DNA im Kopf als Maß für DNA-Strangbrüche bestimmt. Je Ansatz wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt, wobei pro Experiment mindestens 100 Zellen ausgewertet wurden. A) Repräsentative fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen. Mittels der Freeware CometScoreTM wurden die Bilder in Falschfarben zur Verdeutlichung der Fluoreszenzintensität dargestellt. B) Exemplarische Quantifizierung der Brüche, der verschiedenen Zelllinien, jeweils bei 37°C bzw. bei 42°C inkubiert und mit 30 GY bestrahlt.

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Ergebnisse 46

Hypertherme Doxorubicin-Behandlung führt zu einer beeinträchtigten DNA-3.4.2Strangbruch-Reparatur-Kapazität

Um nun den Einfluss von Hyperthermie alleine und in Kombination mit Doxorubicin auf die DNA-Strangbruchreparatur zu analysieren, wurden die Zellen für eine Stunde bei 37°C und 42°C mit Doxorubicin behandelt und direkt (0h), 3h sowie 8h nach Behandlung geerntet, eingebetet und mittels Comet-Assay analysiert.

Zwar zeigt Hyperthermie keinen Einfluss auf die Induktion von Strangbrüchen (Abb. 11 0h-Zeitpunkte) oder auf konstitutive DNA-Strangbrüche vor der Schädigung durch Doxorubicin (Abb. 11 Kontrollen), jedoch ist im Verlauf der Reparatur, insbesondere nach 8 Stunden mit Hyperthermie eine signifikant verzögerte DNA-Strangbruchreparatur zu sehen.

Insgesamt zeigen alle untersuchten Zelllinien dieses Phänomen, jedoch in minimal unterschied-licher Ausprägung. Die LOVO-Zellen reagieren schwächer auf die Behandlung und zeigen direkt nach der Behandlung etwa 65% DNA im Kopf, wohingegen die anderen drei Zelllinien maximal 40% aufweisen. Dennoch zeigen alle untersuchten Zelllinien nach der Doxorubicin Behandlung bei 37°C eine Verschiebung nach Rechts, welche als Maß einer DNA-Reparatur zu sehen ist, wohin-gegen dies mit Hyperthermie nicht stattfindet.

Neben der Darstellung als Häufigkeitsverteilungen erfolgte eine weitere Auswertung der Comets. Hierzu wurde ein Cut bei 70% DNA im Kopf gelegt und zur entsprechenden Behandlungszeit der prozentuale Anteil oberhalb dieses Grenzwertes aufgetragen. So zeigt Abbildung 12 sehr deutlich innerhalb der normothermen Behandlung im Verlauf der Kinetik eine DNA-Reparatur gemessen anhand der Erhöhung des prozentualen Anteils an Zellen mit mehr als 70% DNA im Kopf. In der hyperthermen Behandlung wird dieser prozentuale Anteil innerhalb der untersuchten Zeitpunkte nicht erhöht.

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Ergebnisse 48

Abbildung 11: Hyperthermie führt zu einer verzögerten DNA-Strangbruchreparatur nach Doxorubicin-Behandlung. Zwei Ovarialkarzinom- und zwei Kolonkarzinomzelllinien wurden für eine Stunde bei 37°C und 42°C mit Doxorubicin behandelt und in einer Zeitreihe bis zu 8 Stunden nach Schädigung geerntet. Nach der Analyse im Comet-Assay wurde der Anteil der DNA im Kopf als Maß für DNA-Strangbrüche bestimmt und in einer Häufigkeitsverteilung dargestellt. Je Ansatz wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt, wobei pro Experiment mindestens 100 Zellen ausgewertet wurden. A)-D) Exemplarische Abbildungen der verschiedenen Zelllinien, jeweils bei 37°C bzw. bei 42°C für eine Stunde mit Doxorubicin behandelt. Dargestellt sind die Kontrollen direkt, 3h und 8h nach Schädigung. E) Nach der Analyse im Comet-Assay wurde der Anteil der DNA im Kopf, als Maß für DNA-Strangbrüche bestimmt der prozentuale Anteil von mehr als 70% im Kopf aufgetragen. Je Ansatz wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt, wobei pro Experiment mindestens 100 Zellen ausgewertet wurden.

Da die Verwendung des alkalischen Comets eine Differenzierung zwischen Einzel- und Doppelstrangbrüchen nicht ermöglicht, sollte mittels neutralem Comet geklärt werden, welche Art von Brüchen von der verzögerten Reparatur durch Hyperthermie betroffen sind. Wie erwartet ist der DNA-Gehalt in den Schweifen nach zytotoxischer Behandlung beim neutralen Comet im Vergleich zum alkalischen deutlich geringer, was darauf hindeutet, dass deutlich weniger DSB als SSB auftreten. Interessanterweise kann aber auch für die Reparatur der DSB eine Verzögerung bei Hyperthermie-Behandlung beobachtet werden. Neben der Darstellung als Häufigkeitsverteilungen erfolgte eine weitere Auswertung der Comets. Hier wurde der Cut jedoch bei 80% DNA im Kopf gelegt und zur entsprechenden Behandlungszeit der prozentuale Anteil oberhalb dieses Grenzwertes aufgetragen. So zeigt sich innerhalb der normothermen Behandlung im Verlauf der Kinetik die Tendenz hin zu einer DNA-Reparatur. In der hyperthermen Behandlung wird dieser prozentuale

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Ergebnisse 49

Anteil innerhalb der untersuchten Zeitpunkte tendenziell eher etwas verringert was darauf hindeutet, dass es zu einer vermehrten Anzahl von DNA-DSB kommt (Abb. 12).

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Ergebnisse 50

Abbildung 12: Hyperthermie führt zu Beeinträchtigung der DNA-DBSR nach Doxorubicin-Behandlung. A)-D) Zwei Ovarialkarzinom- und zwei Kolonkarzi-nomzelllinien wurden für eine Stunde bei 37°C und 42°C mit Doxorubicin behandelt und in einer Zeitkinetik bis zu 4 Stunden nach Schädigung geerntet. Nach der Analyse im neutralen Comet-Assay wurde der Anteil der DNA im Kopf, als Maß für DNA-Strangbrüche bestimmt und in einer Häufigkeitsverteilung dargestellt. Je Ansatz wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt, wobei pro Experiment mindestens 100 Zellen ausgewertet wurden. A-D) Exemplarische Abbildungen der verschiedenen Zelllinien, jeweils bei 37°C, bzw. bei 42°C für eine Stunde mit Doxorubicin behandelt. Dargestellt sind die Kontrollen, direkt, und 4h nach Schädigung. E) Nach der Analyse im Comet-Assay wurde der Anteil der DNA im Kopf, als Maß für DNA-Strangbrüche bestimmt der prozentuale Anteil von mehr als 80% im Kopf aufgetragen. Je Ansatz wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt, wobei pro Experiment mindestens 100 Zellen ausgewertet wurden.

Hypertherme Cisplatin-Behandlungen führen zu einem vermindertem Abbau der 3.4.3

DNA-Cisplatin-Addukte

Aufgrund der durch Cisplatin vielfach induzierten DNA-DNA-Interstrangvernetzungen ist es unter normalen Bedingungen nicht möglich einen Comet-Assay durchzuführen (Merk and Speit, 1999). Daher wurde hier als Maß für die Reparatureffizienz die Menge der DNA-Platin-Addukte mit Hilfe des DNA-Cisplatin-Addukt-Antikörpers analysiert. Die Zellen wurden entsprechend für eine Stunde bei 37°C und 42°C mit 40 µM Cisplatin behandelt und wie in 3.3.1 direkt, 3h und 6h nach Behandlung geerntet. Mittels Immunfloureszenz wurden anschließend die DNA-Platin-Addukte quantifiziert. Die normotherme Behandlung zeigt eine signifikante Reduktion der Addukte. Bereits nach 6 Stunden sind in beiden Linien nahezu keine DNA-Addukte mehr nachweisbar, was auf

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Ergebnisse 51

einen sehr schnelle und effiziente Reparatur dieser Cisplatin-induzierten Schäden schließen lässt. Bei 42°C ist dieser Abbau der DNA-Cisplatin-Addukte signifikant verzögert (Abb. 13). Diese Daten lassen den Schluss zu, dass analog zu den Beobachtungen mit Doxorubicin auch Cisplatin verursachte DNA-Schäden bei erhöhter Temperatur nur verzögert repariert werden können.

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Ergebnisse 52

Abbildung 13: Hyperthermie führt zu einem verlangsamten Abbau der DNA-Cisplatin-Addukte. Eine Ovarialkarzinom- und eine Kolonkarzinomzelllinien wurden für eine Stunde bei 37°C und 42°C mit Cisplatin behandelt und in einer Zeitreihe bis zu 6 Stunden nach Schädigung geerntet, eingebettet und mittels Immunfluoreszens mit einem Anti-Cisplatin-Addukt-Antikörper detektiert. A) Repräsentative fluoreszens-mikroskopische Aufnahmen. B) Die Bestimmung der Fluoreszenzintensität erfolgte mittels Definiens-Tissue-Studio. Dargestellt sind die Mittelwerte ±SD von drei unabhängigen Experimenten.

Hyperthermie verhindert die Zytostatika-induzierte Poly-(ADP-ribosyl-)ierung 3.4.4

Doxorubicin und Cisplatin sind zwei Zytostatika mit völlig unterschiedlichen Wirkmechanismen. Doxorubicin interkaliert in die DNA zwischen benachbarte Basen, was zu einer veränderten helikalen Struktur und damit einhergehend zu Funktionsbeeinträchtigungen DNA-bindender Enzyme führt (Di Marco et al., 1984). Dadurch kommt es zur Hemmung der Topoisomerase II und zur Entstehung von DNA-DSB (Hortobagyi et al., 1997). Zum anderen werden durch Doxorubicin freie Radikale gebildet, die ebenso zu DNA-DSB führen können (Mizutani et al., 2003). Folglich werden diese Doxorubicin induzierten DNA-Schäden über die DSB-Reparatur repariert. Cisplatin hingegen induziert insbesondere1,2-GG- und 1,2-AG-Intrastrangvernetzungen, die 90% der DNA-Addukte ausmachen (Bellon et al., 1991). Die daraus verursachten massiven Struktur-veränderungen führen zur Rekrutierung von Reparaturproteine und leiten die Reparaturprozesse ein. Hierbei spielt die Reparatur über die NER eine essentielle Rolle (Reed, 1998). Die DNA-Reparaturprozesse von Doxorubicin und Cisplatin scheinen somit auf den ersten Blick fundamental unterschiedlich zu sein. Jedoch ist beiden Prozessen gemeinsam, dass zur Rekrutierung der Reparaturproteine eine Veränderung der Chromatinstruktur vorangehen muss.

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Ergebnisse 53

Sowohl bei der NER, als auch bei der DNA-Strangbruchreparatur kommt es zu einer PARylierung unter Anderem von Histonen, welche zu einer Chromatindekondensation führt (Frechette et al., 1985; Niedergang et al., 1985), die wiederum eine Voraussetzung für die Bindung von Transkriptionsfaktoren und Reparaturenzymen an die DNA darstellt. Diese PARylierung wird von PARP-1 und 2 übernommen.

Um die PARylierung von PARP selbst, sowie von wichtigen Zielproteinen zu untersuchen,

wurden Zellen bei 37°C bzw. 42°C mit Cisplatin und Doxorubicin für eine Stunde behandelt und mit einem spezifischen Anti-PAR-Antikörper detektiert. Als Kontrollen wurden drei pharmakologische PARP-Inhibitoren mitgeführt. Zum einen PJ34, ein PARP Inhibitor, der ausschließlich experimentell eingesetzt wird, Rucaparib, welcher bereits in Phase-I-Studien zur Behandlung fortgeschrittener solider Tumore (Plummer et al., 2005) und in Phase-II-Studien für Brust- und Ovarialkarzinome mit BRCA1 oder BRCA2-Mutation eingesetzt wurde. Weiterhin wurde der PARP-Inhibitor A-966492 verwendet (Penning et al., 2010).

Wie Abbildung 14 zeigt, wird die PARylierung in etwa 80% aller Zellkerne nach Cisplatin und Doxorubicin bei 37°C stark induziert. Interessanterweise kommt es zu einer signifikanten Reduktion der Zytostatika-induzierten PARylierung bei Hyperthermie. Die Hemmung der PARy-lierung durch Hyperthermie ist vergleichbar mit der, die durch pharmakologische Blockade der PARP1/2-Enzymaktivität erreicht wird.

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Ergebnisse 54

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Ergebnisse 55

Abbildung 14: Hyperthermie führt zu einer verminderten PARP-abhängigen poly-(ADP-Ribosyl)-ierung Eine Ovarialkarzinom- und eine Kolonkarzinomzelllinien wurden für eine Stunde bei 37°C und 42°C mit Cisplatin und Doxorubicin behandelt und mittels Immunfluoreszens mit einem Anti-PAR-Antikörper detektiert. Zur Kontrolle wurden verschiedene PARP-Inhibitoren eingesetzt und zur vollständigen Hemmung von PARP1/2 für 2 Stunden vorinkubiert. A) und C) Repräsentative fluoreszensmikroskopische Aufnahmen. B) und D) Die Bestimmung der Fluoreszenzintensität erfolgte mittels Definiens-Tissue-Studio. Dargestellt sind die Mittelwerte ±SD von drei unabhängigen Experimenten.

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Ergebnisse 56

3.4.5 Die durch Hyperthermie blockierte PARylierung ist ursächlich für das reduzierte Langzeitüberleben nach Zytostatikabehandlung

Um die Frage zu klären, ob die reduzierte PARylierung ursächlich für das reduzierte Langzeit-überleben ist, wurden im Folgenden analoge Experimente durchgeführt wie in Abschnitt 3.1.1 beschrieben, nun aber unter Verwendung pharmakologischer PARP-Inhibitoren bei Normothermie

Um eine vollständige Hemmung von PARP zu gewährleisten wurden die Zellen vor der Behandlung für 2 Stunden mit den PARP-Inhibitoren vorinkubiert. Direkt anschließend daran erfolgte die Behandlung mit Cisplatin und Doxorubicin für eine Stunde bei 37°C und 42°C. Zellen wurden wie in 2.4 beschrieben ausgesät und das klonogene Wachstum nach 10 Tagen bestimmt.

Wie in Abbildung 15 zu sehen, hat weder die Hyperthermie noch die PARP-Inhibitoren alleine einen signifikanten Einfluss auf das klonogene Wachstum der Zellen. Die Kombination aus PARP-Inhibition mit Cisplatin bzw. Doxorubicin resultiert im Vergleich zur alleinigen Zytostatika-Behandlung analog zur hyperthermen Behandlung in einem signifikant reduzierten Langzeitüberleben. So wird in der OVCAR8 durch PARP-Inhibition eine Reduktion des Langzeitüberlebens auf etwa 8% bei Cisplatin und 3% bei Doxorubicin erzielt. Die HCT116 zeigen eine Reduktion durch PARP-Inhibitoren auf 11% mit Cisplatin und 8% mit Doxorubicin Behandlung. Diese Reduktionen durch PARP-Inhibitoren sind in beiden untersuchten Zelllinien und mit beiden Zytostatika nahezu ident mit den jeweiligen hyperthermen-Behandlungen.

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Ergebnisse 57

Abbildung 15: PARP-Inhibitoren und Cisplatin bzw. Doxorubicin vermindern das Langzeitüberleben im selben Ausmaß wie die hypertherme Behandlung mit Cisplatin, bzw. Doxorubicin. Zellen wurden mit und ohne PARP-Inhibitoren für 2 Stunden inkubiert, danach mit oder ohne 40 µM Cisplatin oder 15 µM/6.5 µM oder 7 µM Doxorubicin bei 37°C oder 42°C für 1h behandelt. Anschließend wurden die Zellen in einer Zelldichte mit 500 oder 1000 Zellen je Flasche ausgesät. Nach 10 Tagen wurde die klonogene Wachstumseigenschaft durch zählen der Kolonien, die größer als 50 Zellen sind, bestimmt. Die Abbildung zeigt Mittelwerte ±SD von drei unabhängigen Experimenten.

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Ergebnisse 58

Hyperthermie führt nicht zu einer veränderten Proteinexpression von PARP 3.4.6und PARG

Bei der PARP abhängigen poly-(ADP-Ribosyl)ierung handelt es sich um eine streng regulierte post-translationale Modifikation. PARP-1 katalysiert die kovalente Bindung von ADP-Ribose an Zielproteine, daraus resultieren Poly-(ADP-Ribose)-Ketten (PAR), hierbei wird insbesondere PARP-1 selbst modifiziert (Huletsky et al., 1989; Lindahl, 1976).

Diese reversible Modifikation wird durch Poly-(ADP-Ribose)-Glykohydrolase (PARG) mittels seiner endo- und exoglykosidischen Aktivität wieder abgespalten (Desnoyers et al., 1995; Miwa et al., 1974). Um zu überprüfen, ob die verminderte PAR nach hyperthermer Cisplatin- bzw. Doxorubicin-Behandlung (Abb. 14) bedingt ist durch eine veränderte Proteinexpression von PARP oder PARG, wurden Zellen mit und ohne Cisplatin bzw. Doxorubicin bei 37°C und 42°C behandelt, nach weiteren 8 Stunden geerntet und Proteine isoliert. Durch einen spezifischen PARP- sowie PARG-Antikörper wurden Proteinlevel in den Proben gleicher Zellzahl bestimmt. Wie Abb. 16 zeigt, wird die Expression beider Proteine weder in An- noch Abwesenheit von zytotoxischen Substanzen durch Hyperthermie signifikant verändert.

Abbildung 16: Die Hyperthemie bedingte Reduktion der PAR ist nicht abhängig von einer veränderten PARP- oder PARG-Proteinexpression. Zellen wurden für eine Stunde mit und ohne Cisplatin oder Doxorubicin bei 37°C (grün) und 42°C (rot) behandelt und nach 8 Stunden Proben entnommen. Mittels Western-Blot wurde die Proteinexpression von PARP und PARG nachgewiesen. Der repräsentative Blot steht für drei unabhängige Experimente. Als Beladungskontrolle diente GAPDH.

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Ergebnisse 59

Hyperthermie führt nicht zu einem signifikanten Verlust des zellulären ATP-Gehalts 3.4.7

Die PARP-Aktivierung führt abhängig vom Ausmaß der Schadensinduktion entweder zu Aktivierung der DNA-Reparatur oder zum Zelltod und spielt so eine zentrale Rolle für die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität. Bei starker DNA-Schädigung und gleich-zeitiger PARP-Überaktivierung werden in Folge die NAD+ - und anschließend die ATP-Vorräte der Zelle erschöpft. Beschrieben von Berger et al. als „Selbstmord-Hypothese“ wird der Zelltod durch den daraus resultierenden Energie-Mangel hervorgerufen (Berger, 1985). Nun stellt sich hier die Frage, ob Hyperthermie zu einem signifikanten Verlust von ATP führt und so die Energie-intensive PARylierung verhindert wird und aufgrunddessen das reduzierte Langzeitüberleben zustande kommt. Nach der DNA-Schädigung kommt es sowohl mit Cisplatin, als auch mit Doxorubicin zu einer Abnahme der ATP-Konzentration. Die Erhöhung der Temperatur hat aber offensichtlich weder per se noch in Kombination mit den hier verwendeten DNA-schädigenden Substanzen einen signifikanten Einfluss auf den Energiehaushalt der Zelle (Abb. 17).

Abbildung 17: Hyperthermie führt nicht zu einem massiven ATP-Verlust. OVCAR8- und HCT116-Zellen wurden in 500µl Medium je Loch mit 15 µM Doxorubicin bzw. 40 µM Cisplatin unter normothermen und hyperthermen Bedingungen für 1 Stunde behandelt. Die Zellen wurden durch das Luciferin-Luciferase-Lyse-Reagenz lysiert und die Lumineszenz analysiert.

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Ergebnisse 60

Die Hemmung von PARP durch Hyperthermie ist ursächlich für die verzögerten DNA-3.4.8Reparatur nach Zytostatikabehandlung

Im Folgenden Abschnitt sollte weiterhin geklärt werden, ob die Hemmung von PARP durch Hyperthermie die Ursache für die verzögerte DNA-Strangbruchreparatur ist.

Demzufolge wurden die Analysen der DNA-Reparatur mit PARP-Inhibitoren unter normothermen Bedingungen durchgeführt. Hier müsste vergleichbar der hyperthermen Behandlung eine verminderte Kapazität der Reparatur zu sehen sein.

Zellen wurden wie 2.2.2 für 2 Stunden mit PARP-Inhibitoren vorinkubiert und anschließend wie in 2.5 beschrieben behandelt und analysiert.

Durch die PARP-Inhibition bei 37°C werden die durch Doxorubicin induzierten Schäden nahezu nicht repariert. Diese reduzierte DNA-Strangbruchreparatur ist ident mit der nach hyperthermer Behandlung. Im Vergleich dazu zeigt die normotherme Behandlung nach 8 Stunden bereits eine fast vollständige Reparatur dieser DNA-Schäden.

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Ergebnisse 61

Abbildung 18: PARP-Inhibitoren in Kombination mit Doxorubicin führen zu einer verzögerten DNA-Strangbruchreparatur. PARP-Inhibitoren wurden für 2 Stunden vorinkubiert, anschließend wurde für eine Stunde bei 37°C mit Doxorubicin behandelt und in einer Zeitreihe bis zu 8 Stunden nach Schädigung geerntet. Nach der Analyse im Comet-Assay wurde der Anteil der DNA im Kopf als Maß für DNA-Strangbrüche bestimmt und in einer Häufigkeitsverteilung dargestellt. Je Ansatz wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt, wobei pro Experiment mindestens 100 Zellen ausgewertet wurden. A) Exemplarische Abbildungen der fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen. B) Häufigkeitsverteilung der unterschiedlich behandelten/ unbehandelten Zellen direkt, 3h und 8h nach Schädigung.

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Ergebnisse 62

3.5 Nur Zytostatika die eine PARylierung induzieren können durch Hyperthermie gesteigert werden

Die bisherigen Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass die Hemmung der PARylierung der prädominante Mechanismus ist, über den Hyperthermie eine Steigerung der Chemotherapie-wirkung erzielt. Um diese Hypothese weiter zu untermauern, werden im Folgenden auch Zytosta-tika untersucht, die keine PARylierung verursachen. Falls die PARP-Aktivität eine zentrale Rolle für die Zytotoxizitätssteigerung durch Hyperthermie hat, so sollte Hyperthermie mit solchen Zytostatika keine synergistische Wirkung zeigen.

Platin-haltige Zytostatika und Doxorubicin können durch Hyperthermie in 3.5.1

ihrer Zytotoxischen Wirkung verstärkt, während dies nicht für 5-FU und Paclitaxel zutrifft

Klonale Wachstumsraten wurden im Anschluss an die Behandlung mit Cisplatin, Doxorubicin, Oxaliplatin, 5-FU und Paclitaxel bei 37°C und 42°C in 3 Ovarialkarzinom- und 2 Kolon-karzinomzelllinien untersucht. Sehr eindeutig und über alle Linien hinweg wird mit Cisplatin, Doxorubicin und Oxaliplatin eine Zytotoxizitätsteigerung durch Hyperthermie erzielt (Abb. 19). Interessanterweise ist keine signifikante zusätzliche Zytotoxizitätssteigerung mit 5-FU und Paclitaxel durch Hyperthermie in allen untersuchten Zelllinien zu erzielen.

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Ergebnisse 63

Abbildung 19: Platinhaltige Zytostatika sowie Doxorubicin führen durch Hyperthermie zu einer Zytotoxizitätssteigerung, wohingegen Hyperthermie keinen Einfluss auf die Zytotoxizität von 5-FU und Paclitaxel hat. Zellen wurden mit oder ohne 40 µM Cisplatin, 15 µM Doxorubicin, 40 µM Oxaliplatin, 12 µM 5-Fu und 12 µM Paclitaxel für 1h bei 37°C und 42°C behandelt. Anschließend wurden die Zellen in einer Zelldichte mit 500 bzw. 1000 Zellen je Flasche ausgesät. Nach 10 Tagen wurde die klonogene Wachstumseigenschaft durch Zählen der Kolonien, die größer als 50 Zellen sind, bestimmt. Dargestellt ist die klonale Effizienz bei Temperaturen von 37°C bis 42°C mit und ohne Zytostatika. Die Abbildung zeigt Werte ±SD von drei unabhängigen Experimenten. unabhängigen Experimenten (*: p≤0.05, **: p≤0.01, ****: p≤0.0001).

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Ergebnisse 64

Nur Substanzen, die in ihrer Wirkung durch Hyperthermie verstärkt werden, 3.5.2profitieren gleichermaßen von einer PARP-Inhibition

5-FU und Paclitaxel können nicht durch Hyperthermie in ihrer Zytotoxizität verstärkt werden. Nun stellt sich die Frage, ob diese Zytostatika von einer zusätzlichen PARP-Inhibition profitieren.

Hierzu wurde analog zu 3.4.5 die klonale Wachstumsrate mit und ohne Vorinkubation mit PARP Inhibitoren bestimmt. Kongruent mit der aufgestellten These zeigen die 5-FU oder Paclitaxel behandelten Ansätze keine signifikante Reduktion mit Hyperthermie oder PARP-Inhibitoren im Vergleich zur alleinigen normothermen Behandlung auf das klonale Wachstum, während Oxali-platin wie zuvor mit Hyperthermie gezeigt zu einer signifikanten Reduktion des klonalen Wachstums bei zusätzlicher PARP Inhibition führt (Abb. 20).

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Ergebnisse 65

Abbildung 20: Nur Substanzen, die durch Hyperthermie potentiert werden können, profitieren gleichermaßen von einer PARP-Inhibition. OVCAR8 und HCT116 Zellen wurden für eine Stunde bei 37°C und 42°C mit Oxaliplatin, 5-FU und Paclitaxel behandelt und in einer Dichte von 500 bzw. 1000 Zellenje Flasche ausgesät. Nach 10 Tagen wurde durch Auszählen von Kolonien die klonogene Wachstumsrate bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte ±SD von drei unabhängigen Experimenten. Daher wurden im Folgenden die PARylierung durch Immunfluoreszenzfärbungen wie in 3.4.4 nach Oxaliplatin, 5-FU und Paclitaxel untersucht. Tatsächlich führt weder die Behandlung mit 5-FU noch mit Paclitaxel in diesen Linien zu einer nachweisbaren PARylierung, während Oxaliplatin eine Induktion von PAR zur Folge hat, die vergleichbar ist mit der nach Cisplatin oder Doxo-rubicin. Demzufolge werden ausschließlich Substanzen, die eine Parylierung induzieren von einer hyperthermen-Behandlung gleichermaßen von einer pharmakologischen PARP-Inhibition ver-stärkt. Diese Ergebnisse untermauern den PARP-abhängigen Mechanismus der Hyperthermie.

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Ergebnisse 66

Abbildung 21: Nur Substanzen, die zur PARylierung führen, können durch Hyperthermie verstärkt werden. OVCAR8 Zellen wurden für eine Stunde bei 37°C und 42°C mit Oxaliplatin, 5-FU und Paclitaxel behandelt und mittels Immunfluoreszens mit einem anti-PAR-Antikörper gefärbt. Dargestellt sind repräsen-tative Fluoreszensmikroskopische Aufnahmen von drei unabhängigen Experimenten.

Die verzögerte DNA-Strangbruchreparatur führt zu vermehrten DNA-Doppelstrang-3.5.3brüchen

Hyperthermie führt über die Hemmung von PARP sowohl bei Cisplatin als auch Doxorubicin zu einer verzögerter DNA-Reparatur-Kapazität und einem reduzierte Langzeitüberleben. Eine ineffiziente DNA-Reparatur ist insbesondere für die genomische Stabiliät ein enormes Risiko für die Zelle. So ist PARP essentiell für die Reparatur von SSB und DSB, wie sie durch Doxorubicin induziert werden können, aber auch bei der Rekrutierung von zentralen Faktoren bei der NER, welche wichtig bei der Reparatur von Cisplatin-Schäden ist. In der NER ist PARP essentiell für die Rekrutierung von XPF und ERCC1, die als Endonukleasen agieren und den beschädigten DNA-Strang vor dem Schaden schneiden. Des Weiteren entstehen während der NER SSB. Werden nun SSB nicht richtig repariert kann dies zu lethalen DSB führen (Bryant et al., 2009b). Diese könnten dann einen Hinweis auf das reduzierte Langzeitüberleben nach Hyperthermie-Behandlung liefern.

Eine gängige Methode zum Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen ist das Histon H2AX welches an DSB an der Stelle Ser139 phosphoryliert vorliegt (γ-H2AX) (Rogakou et al., 1998, 1999). Zusätzlich zu γ-H2AX kann P-53BP1 als zweiter Marker von DSB herangezogen werden (Panier and Boulton, 2014). P-53BP1 wird ebenfalls an DSB rekrutiert und fördert die Reparatur über das NHEJ, indem es die DNA-Endresektion, ein essentieller Vorgang der HR unterbindet (Chapman et al., 2012; Symington and Gautier, 2011). γ-H2AX und P-53BP1-Foci werden in beiden untersuchten Zelllinien erwartungsgemäß durch Cisplatin und Doxorubicin 3h nach der Behandlung gleichermaßen induziert. Der These dieser vorliegenden Arbeit entsprechend ist eine signifikant vermehrte Anzahl der γ-H2AX- und P-53BP1-Foci bei zusätzlicher hyperthermer oder

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Ergebnisse 67

PARP-Inhibitor-Behandlung zu sehen. Diese vermehrte Foci-Formierung kann sowohl für Cisplatin, wie auch für Doxorubicin beobachtet werden.

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Ergebnisse 68

Abbildung 22: Hyperthermie bzw. PARP-Inhibitoren führen in Kombination mit Cisplatin oder Doxo-rubicin zu einer vermehrten Anzahl an DSB-Foci. Eine Ovarialkarzinom- und eine Kolonkarzinomzell-linien wurden für eine Stunde bei 37°C und 42°C mit Cisplatin und Doxorubicin mit und ohne PARP Inhibitoren behandelt und für weitere 3 Stunden unter normalen Bedingungen weiterkultiviert. Mittels Immunfluoreszens mit einem Anti-γ-H2AX und Anti-P-53BP1-Antikörper werden DSB detektiert. A) Repräsentative fluoreszensmikroskopische Aufnahmen. B) Die Quantifizierung der Foci erfolgte mittels Definiens-Tissue-Studio. Dargestellt sind die Mittelwerte ±SD von drei unabhängigen Experimenten. Die Kontrollzellen beider untersuchter Zelllinien zeigen sowohl bei Normothermie als auch Hyperthermie höchstens 2% Foci-positiver Zellkerne auf. Nach Cisplatinbehandlung kommt es in der HCT116 zu einer Induktion von 38% γ-H2AX und 42,5% P-53BP1 positiver Kerne, wohingegen die Iduktion durch zusätzliche Hyperthermie zu 56%-, respektive 75% positiver Kerne führt. Die Doxorubicin-Behandlung induziert γ-H2AX in mindestens 5 Foci in 21% und P-53BP1

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Ergebnisse 69

in 13% der Zellkerne. Die hypertherme Doxorubicin-Behandlung führt jedoch zu 53% induziert γ-H2AX- und 42% P-53BP1-positiver Zellkerne. Analog dazu zeigt auch die Zytostatika-PARP-Inhibitor-Behandlung im Vergleich zur normothermen Behandlung ebenfalls eine vermehrte Anzahl positiver Zellkerne (Abb. 23). Neben dem vermehrten prozentualen Anteil an Zellen mit mehr als 5 Foci im Kern, weisen diese Zellen nach hyperthermer- oder PARP-Inhibitor-Behand-lung gleichermaßen mehr dieser γ-H2AX- und P-53BP1-Foci auf. Diese Daten belegen, dass es durch die Hemmung von PARP, unabhängig davon ob diese durch Hyperthermie oder durch pharmakologische Hemmung stattfindet, zu einer signifikanten Steigerung der DNA-DSB kommt.

Abbildung 23: Hyperthermie vergleichbar wie pharmakologische PARP-Inhibitoren führen in Kombination mit Cisplatin bzw. Doxorubicin zu einer vermehrten Anzahl an DSB-Foci. Eine Ovarial-karzinom- und eine Kolonkarzinomzelllinien wurden für eine Stunde bei 37°C und 42°C mit Cisplatin und Doxorubicin mit und ohne PARP Inhibitoren behandelt und für weitere 3 Stunden unter normalen Bedingungen weiterkultiviert. Mittels Immunfluoreszens mit einem Anti-γ-H2AX- und Anti-P-53BP1-Antikörper werden DSB detektiert. Die Quantifizierung der Foci erfolgte mittels Definiens-Tissue-Studio. Positive Zellkerne sind durch mindestens 5 Foci pro Zellkern definiert. Dargestellt sind die Mittelwerte ±SD von drei unabhängigen Experimenten.

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Ergebnisse 70

Um nun nachfolgend der Frage nachzugehen, ob es sich in den hier gezeigten Ergebnissen um artifizielle Zelllininephänomene handelt, wurden analog Gewebeschnitte aus Tumoren von PC-Patienten wie in 2.1.4 beschrieben hergestellt und die Induktion von DSB nach entprechenden Behandlungen zu untersuchen. Die Kontrollen zeigen eine geringe Anzahl sowohl γ-H2AX- als auch P-53BP1-positiver Zellen. Die Induktion beider Marker wird auch in Tumorgewebe nach Cisplatin induziert, wobei analog zu den Beobachtungen mit Zellliniensystemen auch in primären Tumorzellen im natürlichen Tumorgewebeverband die Induktion durch zusätzliche Hyperthermie oder PARP Inhibition wesentlich verstärkt wird.

Abbildung 24: Die reduzierte DNA-Strangbruchreparatur führt in primärem Tumorgewebe von PC-Patienten zu vermehrten DNA-Doppelstrangbrüchen. Tissue-Slices aus vitalem Tumorgewebe wurden hergestellt und nach 24h Kultivierung für eine Stunde bei 37°C und 42°C mit Cisplatin und Doxorubicin mit und ohne PARP Inhibitoren behandelt und für weitere 3 Stunden unter normalen Bedingungen weiterkulti-viert. Mittels Immunfluoreszens mit einem Anti-γ-H2AX- und Anti-P-53BP1-Antikörper werden DSB detektiert. Dargestellt sind repräsentative fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen.

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Ergebnisse 71

Die durch die hypertherme Cisplatin oder Doxorubin-Behandlung induzierten DSB 3.5.4werden vermehrt über NHEJ repariert

Einigen Arbeiten zeigen eine Strahlensensitivierung durch Hyperthermie (Bergs et al., 2013; Krawczyk et al., 2011). Diese Daten zeigen eine gehemmte homologe Rekombination durch Hyperthermie-Applikation von über 43°C (Bergs et al., 2013; Genet et al., 2013; Krawczyk et al., 2011; Sakogawa et al., 2013). Genet et al. postulieren hierbei einen Mechanismus, der auf einer temperaturabhängigen Dissoziation von RAD51 Foci beruht, ein stromaufwärts gelegenes Protein der HR (Genet et al., 2013). RAD51 bildet mit Hilfe von BRCA2 an zuvor im Laufe der HR prozessierte einzelsträngige DNA-Nukleoproteinfilamente, die vor Abbau schützen (San Filippo et al., 2008; Thorslund and West, 2007). Krawczyk et al. konnten neben der Abnahme der RAD51-Foci zusätzlich eine Temperatur-abhängige Degradation von BRCA-2 zeigen (Krawczyk et al., 2011).

In Anlehnung an diese Beobachtungen soll hier im Folgenden der Einfluss von Hyperthermie und Zytostatika auf die Foci-Formierung von RAD51 untersucht werden.

Sowohl Cisplatin als auch Doxorubicin führen zu einer Induktion von RAD51. Jedoch anders als in oben genannten Arbeiten wird die RAD51-Foci-Formierung durch die Hyperthermie nicht verhindert. Insgesamt ergibt die Auswertung dreier unabhängiger Experimente keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl positiver Zellen zwischen der normothermen und der hyperthermen Behandlung innerhalb aller untersuchten Zelllinien. Mittels Western-Blot, wurde wie in 2.6 beschrieben zusätzlich zur Foci-Formierung die Proteinexpression mit den gleichen Ansätzen 6 Stunden nach Behandlung analysiert. Hier zeigt sich ebenfalls kein Einfluss der Hyperthermie auf die Proteinexpression von RAD51. Wie in Kapitel 3.5.3 gezeigt kommt es durch Hemmung der PARylierung nach Hyperthermie oder pharmakologischer PARP-Hemmung zu einer signifikanten Zunahme von Zellen mit DSB und P-53BP1-Foci sowie eine Zunahme der Foci je Zelle. Der Befund, dass gleichzeitig aber die Zahl der Zellen mit RAD51-Foci nicht zunimmt deutet darauf hin, dass die Reparatur der vermehrten DSB über das fehlerbehaftete NHEJ repariert werden.

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Ergebnisse 72

Abbildung 25: Hyperthermie hat keinen Einfluss auf die Zytostatika-induzierte RAD51-Foci-Formierung bzw. –Proteinexpression. Eine Ovarialkarzinom- und eine Kolonkarzinomzelllinien wurden für eine Stunde bei 37°C und 42°C mit Cisplatin und Doxorubicin behandelt. A) Mittels Immunfluoreszenz und einem Anti-RAD51-Antikörper wurden RAD51-Foci detektiert (nicht konfokal). B) Die Quantifizierung der Foci erfolgte mittels Definiens-Tissue-Studio. Positive Zellkerne sind durch mindestens 5 Foci pro Zellkern definiert. Dargestellt sind die Mittelwerte ±SD von drei unabhängigen Experimenten. C) RAD51-Proteinexpression wurde 6 Stunden nach Behandlung mittels Western-Blot untersucht.

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Ergebnisse 73

Die DNA-Doppelstrangbrüche entstehen nur in replizierenden Zellen 3.5.5

Im Weiteren sollten nun geklärt werden, ob diese vermehrten DNA-Strangbrüche abhängig sind von der Proliferation. Hierzu eignet sich der Nachweis von Geminin, zusätzlich zur Detektion der DSB durch γ-H2AX Färbung.

Geminin ist während der G1-Phase nicht detektierbar, und akkumuliert während S-, G2-und M-Phase. Im Metaphase/Anaphasen-Übergang der Mitose wird Geminin vom Anaphase-Promoting-Complex (APC) degradiert (McGarry and Kirschner, 1998).

Sehr eindeutig zeigt Abbildung 26 ausschließlich γ-H2AX-Foci in Geminin-positiven Zellen. Auch die durch Hyperthermie bzw. PARP-Inhibitoren verursachten zusätzlichen Strangbrüche sind ausschließlich in Geminin-positiven Zellen detektierbar. So lässt sich zusammenfassen, dass ausschließlich replikative Zellen durch diese Behandlung geschädigt werden. Weiterhin zeigt sich mittels der Geminin-Färbung, dass es keinen Unterschied durch die unterschiedlichen Behand-lungsmodalitäten auf die Anzahl replizierender Zellen gibt.

Abbildung 26: Die HIPEC-adaptierte Behandlung führt ausschließlich in replizierenden Zellen zu DSB. Die HCT116-Zellen wurden für eine Stunde bei 37°C und 42°C mit Cisplatin mit und ohne PARP-Inhibitoren behandelt und mittels Immunfluoreszens mit einem Anti-γ-H2AX- und Anti-Geminin-Antikörper ko-gefärbt. Die Abbildung zeigt repräsentative fluoreszensmikroskopische Aufnahmen.

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Ergebnisse 74

3.6 Hypertherme Cisplatin und Doxorubicin Behandlungen beeinträchtigen die Replika-tion

Da alle induzierten Schäden unabhängig der hier untersuchten Behandlungen ausschließlich in Zellen detektiert werden können, die sich in S- und G2-Phase befinden, soll im Folgenden der Einfluss der Hyperthermie in Kombination mit Zytostatika auf die Replikation untersucht werden.

Der DNA Fiber Assay wie in 2.8 beschrieben bietet die Möglichkeit auf Nukleotidebene die Initiation der Replikation, die Elongation sowie das Stoppen von Replikationsgabeln zu visualisieren. Der Nachweis erfolgt mittels Thymidin-Analoga, Chlordesoxyuridine (CldU) und Iododesoxyuridine (IdU), die von replizierenden Zellen aufgenommen und anstelle von Thymidin in die DNA eingebaut werden.

CldU und IdU können später immunologisch durch unterschiedlich markierte Fluoreszenz-Antikörper an zuvor auf Objektträgern gespreizten Chromatin-Fasern nachgewiesen werden. Durch den kontinuierlichen Einbau der Analoga kann eine Aussage bezüglich der Richtung, der Einbaurate sowie der Anzahl der Replikationsursprünge getroffen werden. Diese Methode ermöglicht auch komplexere Analysen wie die von Genamplifikationen, Tandem-Repeats, oder auch die Detektion von spezifischen Gensequenzen direkt an Chromatin-Fasern (Weier, 2001).

Abbildung 27: Schematische Darstellung des hier angewandten Markierungsprotokolls. Zelllinien und Tumorzellen wurden für 2h mit PARP-Inhibitoren vorinkubiert, dann für 45 min mit Idu markiert. Innerhalb dieser Zeit erfolgte die zusätzliche Schädigung durch Zytostatika. Nach einem Mediumswechsel erfolgte eine weitere Inkubation für 45 min mit CldU-haltigem Medium. Für die Detektion von IdU wurde ein Anti-Maus-BrdU und ein sekundärer GamDyLight-549-Antikörper verwendet. Für CldU wurde ein Anti-Kanninchen-BrdU und ein sekundärer GarDyLight-488-Antikörper verwendet. Die Chromatinfasern wurden mikrosko-pisch mit einem 63-Ölobjektiv aufgenommen.

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Ergebnisse 75

In dem hier dargestellten Markierungsprotokoll (Abb. 27) wurden die Zellen für 45 Minuten mit einem IdU-haltigen Medium mit und ohne Zytostatika bei 37°C oder 42°C inkubiert. Nach einem Mediumswechsel erfolgt die erneute 45 Minütige Inkubation mit CldU ohne Zytostatika. Anschließend an diese Behandlung wurden die Zellen auf Eis gekühlt und entsprechend 2.8.2 zur Analyse weiterverarbeitet. Mit Hilfe dieses Markierungsprotokolls wurde im Folgenden die Replikation im Anschluss an die induzierten Schäden analysiert.

Abbildung 28: Übersicht der identifizierten Replikationsstrukturen. (1) elongierende Replikationsgabel, (2) zwei bidirektionale elongierende Replikationsgabeln, (3) zwei terminierende Replikationsgabeln zweiter Ordnung (4) Replikationsblockade nach DNA-Schädigung, (5) Replikationsursprung zweiter Ordnung, (6) Terminierende Replikationsgabeln erster Ordnung Abbildung 28 zeigt die durch dieses Markierungsprotokoll identifizierten Replikationsstrukturen. Stuktur 1 zeigt normale elongierende Chromatinfasern. Hier ist die Länge des roten Anteils ähnlich des grünen Anteils, nach der ersten Markierungsphase konnte also die Replikation ungehindert fortfahren. Struktur 2 zeigt zwei elongierende Replikationsgabeln, die von einem Replikationsur-sprung aus in bidirektionale Richtung laufen. Die dritte Struktur ist eine terminierende Replika-tionsgabel zweiter Ordnung. Die Struktur 4 zeigt eine typisch für Cisplatin induzierte Replikations-blockade. Die ausschließlich grün markierte Faser in Teil 5 zeigt einen Replikationsursprung zwei-ter Ordnung. Hier konnte im Anschluss an die Behandlung eine neue Replikation beginnen. Die roten Fasern (Struktur 6) sind terminierende Replikationsgabeln erster Ordnung. Hier konnte nach der ersten Markierung nicht weiter repliziert werden.

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Ergebnisse 76

Chemotherapie-induzierte Replikationblockaden werden durch Hyperthermie 3.6.1oder pharmakologische PARP-Inhibition aufgehoben

Anhand der Länge der unterschiedlich markierten Fasern können nun Aussagen bezüglich der Replikationsprogression in Anlehnung an die Behandlung getroffen werden.

Zunächst wurden die Replikationsstrukturen charakterisiert. Die nicht mit Zytostatika behandelten Kontrollen bei 37°C und 42°C in Abbildung 29 zeigen in etwa gleich lange rote und grüne Chromatinfasern. Offensichtlich hat somit Hyperthermie alleine keinen Einfluss auf die Replikat-ionsprogression. Würde es zu einer verlangsamten Progression oder gar zu einem Replikations-stopp kommen, würde man dies anhand einer verminderten Länge der grünen Fasern erkennen. Nach Schädigung sowohl durch Cisplatin, als auch durch Doxorubicin bei 37°C sind eindeutige Replikationsblockaden, sogenannte „Stalled Replication Forks“ anhand des Abbruchs der grünen Fasern zu erkennen (Abb. 29). Interessanterweise wird diese Blockade unter hyperthermen Beding-ungen komplett verhindert. Nach Behandlung mit Cisplatin oder Doxorubicin bei 42°C sind analog zu den unbehandelten Kontrollen typische elongierende Chromatinfasern mit normalem CldU-Ein-bau detektierbar. Wird anstelle der hyperthermen Behandlung PARP inhibiert können iden-tische Ergebnisse erzielt werden. Auch hier sind nahezu normal elongierende Chromatinfasern zu sehen.

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Ergebnisse 77

Abbildung 29: Hyperthermie oder pharmakologische PARP-Inhibition verhindern die Zytostatika-induzierte Replikationsblockade. Exemplarische Replikationsstrukturen der OVCAR8 und HCT116 unbe-handelt, sowie nach Schädigung durch Zytostatika. Nach Zytostatika-Behandlung sind typische Replikations-blockaden zu sehen. Durch hypertherme- bzw. PARP-Inhibition können keine Replikationsblockaden mehr identifiziert werden. Um diese Längenunterschiede genau zu quantifizeren, also die Progression, mit der CldU bzw. IdU in die DNA eingebaut werden, wurden je Ansatz mindestens 100 elongierende Fasern vermessen und die Länge der Chromatinfasern in µm dargestellt (Abb. 30). Sowohl die Hyperthermie als auch die pharmakologische PARP-Inhibition alleine zeigen in beiden Zelllinien keine signifikanten Unterschiede in der Replikationsprogression (Abbildung 30A). Unabhängig von der Temperatur ist über alle Ansätze hinweg eine reduzierte Länge des CldU- im Vergleich zum IdU-Einbau zu beobachten. Die HCT116 besitzen IdU-Fasern im Durchschnitt von 37 µm, sowie CldU-Fasern von 22 µm. Die etwas langsamer replizierende OVCAR8 zeigt IdU-Fasern von etwa 23 µm und CldU-Fasern von durch-schnittlich 18 µm. Während CldU in der hyperthermen Cisplatin-, bzw. in der Cisplatin-PARP-Inhibitor-Behandlung Fasernlängen von 23 µm aufweist, zeigt die alleinige Cisplatin Behandlung eine mittlere CldU-Faserlänge von 11 µm. Ein analoger Effekt ist in der OVCAR8 zu sehen. Hier zeigt sich eine Reduktion der Replikationsprogression durch CldU-Faser-längen von 23 µm auf 13 µm im Mittel. Auch in dieser Zelllinie ist die Replikationsprogression

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Ergebnisse 78

zwischen dem Hyperthermie- und dem PARP-Inhibitor-Ansatz vergleichbar. Doxo-rubicin alleine (Abbildung 30B) führt analog zu Cisplatin zu einer Replikationsblockade, welche bei zusätzlicher Hyperthermie oder PARP-Inhibition wieder aufgehoben ist. Die HCT116 weisen eine durchschnitt-liche CldU-Faserlänge von 10 µm nach Doxorubicin auf, wohingegen die hypertherme- bzw. PARP-Inhibitor-Behandlung eine mittlere Länge von 37µm aufweisen. Die OVCAR8 zeigt eine durchschnittliche Reduktion von 8 µm auf 18 µm. Insgesamt zeigt die IdU-Einbaurate bis auf kleine Unterschiede in der OVCAR8 nach Doxorubicin keine Beeinträchtigung der Replikations-progression.

Diese Ergebnisse belegen, dass es durch die Hemmung der PARP-Aktivität, sowohl auf pharmako-logischem Weg als auch über Hyperthermie, zu einer vollständigen Hemmung der durch Zytosta-tika induzierten Replikationsblockade kommt.

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Ergebnisse 79

Abbildung 30: Zytostatika-Behandlungen führen zu einer verminderten Replikationsprogression, die durch Hyperthermie bzw. PARP-Inhibition aufgehoben wird. A) -F) Die Einbauraten von IdU (rot) und CldU (grün) wurden durch Messung der Längen bestimmt. Nur elongierende Replikationsstrukuren wurden hier analysiert. C) -F) Cisplatin, bzw. Doxorubicin führen zu einer signifikanten Verlangsamung der Progression des CldU-Einbaus. Diese kann durch zusätzliche Hyperthermie oder PARP-Inhibition wieder aufgehoben werden (*: p≤0.05, **: p≤0.01, ****: p≤0.0001).

PARP-Hemmung durch Hyperthermie oder durch pharmakologische Inhibitoren 3.6.2minimiert die durch Zytostatika induzierte Hemmung der Neuinitiation, sowie den Abbruch der Replikation.

Wie oben beschrieben (Abb. 28) sind ausschließlich IdU-markierte Fasern ein Charakter-istika von terminierenden Replikationsgabeln, während rein CldU-markierte Fasern die Neuinitiation der Replikation zeigen. Um terminierende und neuinitierte Replikationsgabeln zu untersuchen, wurden ausschließlich IdU- oder CldU-markierte Chromatinfasern analysiert (siehe Abb. 28 Strukturen 5 & 6). Abbildung 31 zeigt das Verhältnis teminierender (rote Balken) zu neuinitiierender (grüne Balken) Replikationsgabeln. Erneut ist innerhalb der nicht mit Zytostatika behandelten Kontrollen in beiden Zelllinien kein Unterschied zwischen 37°C und 42°C zu sehen. Die HCT116 weisen 1 bis 2% termi-nierende und etwa 19% neuinitiierte Replikationsgabeln auf. Die OVCAR8 zeigt analog 2% terminierende und zwischen 15 und 18% neuinitiierte Replikationsgabeln (Abb. 31A).

Cisplatin wie auch Doxorubicin führen zu einer signifikanten Zunahme terminierender Replikations-gabeln. So weisen die HCT116 nach Doxorubicin 35% und nach Cisplatin 23%, die OVCAR8 22,5% und 15% Replikationsabrüche auf. Gleichermaßen ist die Neuinitiation der Replikation nach Zytostatikabehandlung verändert. So zeigt die HCT116 nach Doxorubicin keinerlei und nach Cisplatin lediglich 1% neu gestartete Replikationsgabeln. Die OVCAR8 zeigt bei beiden Zytostatika eine jeweils 1%ige Neuinitiation. Interessanterweise sind sowohl die vermehrten Teminations- wie auch die verminderten Neuinitiationsereignisse nach Zytostatika-Behandlung durch Hemmung der PARylierung nach Hyperthermie oder Behandlung mit pharmakologischen PARP-Inhibitoren nicht

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Ergebnisse 80

mehr detektierbar (Abbildung 31). So zeigen sich in der HCT116 nach Hyperthermie- oder PARP-Inhibitor-Behandlung nur noch 10% bzw. 5% sowie in der OVCAR8 5% bzw. 4% terminierende Gabeln. Darüber hinaus sind in der HCT 10% Neuinitiationen der Replikation und in der OVCAR8 5% nach Hyperthermie und 6% nach PARP Inhibition zu sehen.

Abbildung 31: Hyperthermie bzw. pharmakologische PARP-Inhibitoren minimieren die durch Zytostatika induzierte Hemmung der Neuinitiation, sowie den Abbruch der Replikation. Die prozentuale Anzahl an terminierenden (rote Balken) bzw. Neuinitiierten (grüne Balken) Replikationsgabeln wurde bestimmt. A) in den unbehandelten Zellen, B) nach Schädigung durch Doxorubicin und in C) nach Cisplatin-Behandlung.

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Ergebnisse 81

Um auszuschließen, dass es sich in den hier gezeigten Ergebnissen nicht nur um artifizielle Zelllininephänomene handelt, wurden analog auch primäre Tumorzellen von PC-Patienten wie in 2.1.4 beschrieben vereinzelt und für 24 h kultiviert. Die Tumorzellen bilden Aggregate und sind im Gegensatz zu Fibroblasten nicht adherent und können somit durch Abnahme des Mediums von den anderen Zelltypen abgetrennt werden. Die Zellen wurden wie in 2.9 beschrieben, behandelt und analysiert.

Analog zu den in Zelllinien gemachten Beobachtungen führt Cisplatin auch in primären Tumorzellen zu einer Blockade der Replikation, welche durch Hyperthermie oder Behandlung mit PARP-Inhibitoren verhindert wird. Nach Hemmung der PARylierung durch Hyperthermie oder pharmakologische-Inhibitoren werden überwiegend normal elongierende Chromatinfasern detektiert, wohingegen die alleinige Zytostatika-Behandlung eindeutig zu Replikationsblockaden führt. (Abb. 32A). Gleichermaßen ist die Progression der Replikation der CldU-markierten Fasern von durchschnittlich 13 µm (Hypertherme Cisplatin-, bzw. kombinierte PARP-Inhibitor- und Cisplatin-Behandlung) auf 7 µm reduziert (Abb. 32B). Analog zu den Zellliniendaten konnte auch für primäre Tumorzellen ein Einfluss der Hyperthermie bzw. pharmakologischen PARP-Inhibition auf die Replikations-Neuinitiation bzw. -Termination beobachtet werden (Abb. 32C). In Abwesenheit zytotoxischer Substanzen weisen die Zellen bei 37°C, 42°C und nach PARP-Inhibitor-Behandlung bis zu 2% terminierende und bis zu 18 % neuinitiierende Replikationsgabeln auf. Cisplatin führt zu einer signifikanten Zunahme terminierender (23%) und signifikanten Abnahme neuinitiierender (1%) Replikationsgabeln. Diese Effekte können durch Hyperthermie bzw. PARP-Inhibition signifikant vermindert werden. So weist die hypertherme Cisplatin-Behandlung nurnoch 10% terminierende, dafür aber 12% neuinitiierte Replikationsgabeln auf. Die zusätzliche PARP-Inhhibition führt zu einer Abnahme der terminierenden auf. Pharmakologische PARP-Inhibition führt analog zu einer Abnahme derterminierenden auf 6% und auf eine Zunahme der neuinitiierten Replikationsgabeln auf 10% (Abb. 32C). Die Hemmung der PARP-Aktivität durch Hyperthermie oder durch pharmakologische Inhibitoren verhindert somit sowohl die durch Zytostatika verursachte Blockade der Replikation als auch die Induktion der Replikationstermination. Dieses Phänomen ist nicht nur in schnell proliferierenden Zellliniensystemen sondern auch in primären Tumorzellen aus PC-Metastasen detektierbar.

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Ergebnisse 82

Abbildung 32: Das Hyperthermie oder PARP Inhibition vermittelte Aufheben der Zytostatika induzierten Replikationsblockade, sowie die minimierte Hemmung der Neuinitiation und der Termination der Replikation finden analog in primären Tumorzellen statt. A) exemplarische fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Chromatinfasern. Doxorubicin führt zu Replikationsblockaden, die durch Hyperthermie, bzw. PARP-Inhibition aufgehoben werden. B) Berechnung der Replikationsprogression durch Messung der Fasern in µm. Cisplatin führt zu einer signifikant reduzierten CldU Einbaurate, welche durch Hyperthermie, bzw. PARP-Inhibition auf das normale Level der Kontrollzellen gebracht wird. C) Prozentualer Anteil terminierender- und neuinitiierender Replikationsgabeln. Nach Cisplatin kommt es zu einer Häufung terminierender Gabeln, bei gleichzeitiger Reduktion Neuinitiierender. Diese wird durch Hyperthermie, bzw. PARP-Inhibition aufgehoben (*: p≤0.05, **: p≤0.01, ****: p≤0.0001).

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Diskussion 83

4 Diskussion

Multimodale Konzepte bestehend aus einer radikalen Chirurgie und einer hyperthermen intraperitonealen Chemotherapie scheinen vielversprechende Ansätze zur Therapie von peritoneal metastasierten Tumoren zu sein. Jedoch existieren keine validen experimen-tellen oder klinischen Daten, die den Stellenwert der Hyperthermie bei der Wirkungs-steigerung von Chemotherapeutika wirklich belegen (Johanna Verhulst, 2014). In präklinischen Ansätzen wurden eine ganze Reihe von Daten zur Hyperthermie publiziert, allerdings sehr häufig unter Anwendung eines Temperatur-bereichs und einer Applikationsdauer, welche klinisch nicht anwendbar sind. So können die aus diesen präklinischen Studien gewonnenen Erkenntnisse und Hypothesen nur schwer auf das klinische Setting der HIPEC übertragen werden. Sehr klar ist, dass Hyperthermie in Abhängigkeit von der Höhe der Temperatur und der Länge der Applikation eine Vielzahl unterschiedlicher Auswirkungen hervorruft (Pawlik et al., 2013; Takahashi et al., 2004). So führt die Hyperthermie ab 43°C zu Nekrose, während Temperaturen um ein halbes Grad niedriger sehr gut von Zellen toleriert werden können (VanderWaal et al., 1997).

Problematisch für die klinische Anwendung der HIPEC ist in erster Linie das mit Hyperthermie einhergehende signifikant gesteigerte Nebenwirkungsspektrum (Saxena et al., 2010), das streng-genommen bei dem derzeitig noch nicht eindeutig belegten Nutzen dieser besonderen Applikation nur schwer tolerierbar ist. So ist es beispielsweise nicht geklärt, welche Zytostatika von einer hyperthermen Therapie hinsichtlich ihrer Zytotoxizität überhaupt profitieren. Demzufolge ist es essentiell die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen der Wirkungsverstärkung von Chemo-therapie durch Hyperthermie zu klären. Zum einen könnten dadurch gezielt nur solche Zytostatika verwendet werden, deren Effizienz auch tatsächlich durch Hyperthermie gesteigert wird, zum anderen könnte die nebenwirkungsreiche Hyperthermie möglicherweise durch besser verträgliche pharmakologische Modulatoren sogar komplett ersetzt werden.

4.1 Temperaturen von mindestens 40°C führen in-vitro zu einer erhöhten Zytotoxizität von Chemotherapeutika sowie zu einem verlängertem Überleben von PC-Patienten

Die klinische Applikation der Hyperthermie parrallel zur IP-Chemotherapie ist ein sehr aufwendiges, kostenintensives und kritisches Verfahren. Die erwärmte Zytostatikalösung wird mit Hilfe einer Pumpe und Drainagen intraperitoneal zirkuliert. Unklar ist hierbei, ab welchen Temperaturen eine effiziente Steigerung der Zytostatika, bei gleichzeitig möglichst geringen Nebenwirkungen erzielt werden kann. Retrospektive Analysen klinischer Studien ermöglichen aufgrund von unzähligen Variablen keine klare Antworten auf diese Fragen (Johanna Verhulst, 2014). So wurde in der vorliegenden Arbeit zunächst ein in-vitro Model etabliert, welches die HIPEC-Bedingungen und die klinische Situation möglichst exakt widerspiegelt. Ovarialkarzinom- und Kolonkarzinomzelllinien wurden unter hypoxischen Bedingungen (3% Sauerstoff), ähnlich der Situation im Bauchraum kultiviert. Die Behandlung erfolgte für exakt eine Stunde bei unter-schiedlichen Temperaturen bei nunmehr atmosphärischen Sauerstoffkonzentrationen, wiederum

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Diskussion 84

analog zur HIPEC bei eröffnetem Abdomen. Die verwendeten Zytostatika-Konzentrationen entsprachen der Hochdosis-Gabe einer HIPEC. Im Anschluss an die Behandlung wurde das Zytostatikahaltige Medium gegen frisches ausgetauscht und die Zellen wurden unter hypoxischen Bedingungen weiter kultiviert. Des Weiteren wurden zur Untersuchung der zytotoxischen Wirk-ungen die klonogene Wachstumsrate, also die Fähigkeit einzelner Zellen zur Teilung, bestimmt, welche relevantere Aussagen im Gegensatz zu Apoptose- oder Viabilitäts-Messungen ermöglichen.

Mit diesem Modellsystem konnte in der vorliegenden Arbeit ein sehr präziser Temperatur-schwellenwert identifiziert werden, ab welchem eine effiziente Steigerung der Zytotoxizität von Cisplatin und Doxorubicin erzielt werden kann. Bis 40°C konnten keinerlei Effekte auf das Lang-zeitüberleben identifiziert werden, während es bei Temperaturen über 40°C zu einer sehr ein-deutigen und signifikanten Steigerung der Zytotoxizität von Cisplatin und Doxorubicin kommt, wobei diese bei Temperaturen bis zu 42°C noch weiter erhöht werden kann (Abb. 1A). Demgemäß konnte hier eine klare Eingruppierung bezüglich der Effizienzsteigerung unterhalb von 40°C und oberhalb von 40°C erfolgen (Abb. 1B). Um nun diese in-vitro-Daten auf deren klinische Relevanz zu testen, wurden Temperaturverläufe während der HIPEC von PC-Patienten erhoben. Hierzu wurde die Temperatur zusätzlich zum Einstrom und Ausstrom an zwei intraperitonealen Stellen, im Bereich des Oberbauches (omental bursa) und im Bereich des Beckens (pelvis) in 10-Minuten Abständen während der gesamten 60-minütigen Perfusionsdauer mittels Temperatursonden dokumentiert (Abb. 2).

Dem in-vitro festgestellten Temperaturschwellenwertes folgend wurden die Patienten anhand der Temperaturverläufe in zwei Gruppen eingeteilt. Die hypertherme Gruppe und die Nicht-hyper-therme Gruppe. Insgesamt erreichten von 31 Patienten 68% eine Temperatur von mindestens 40°C über mindestens 40 Minuten im gesamten abdominal Bereich (Abb. 2A hypertherme Gruppe), während 10 Patienten dies nicht erreichten (Abb. 2B Nicht-hypertherme Gruppe). Angesichts dieser Temperaturerhebungen wird deutlich, dass die konstante Temperaturverteilung während der HIPEC technisch kompliziert und nicht immer erreicht werden kann. Um nun zu überprüfen, ob der in-vitro festgelegte Schwellenwert auch für das Überleben relevant ist, wurden Kaplan-Meier-Analysen durchgeführt (Abb. 3). Das Gesamtüberleben dieser Kohorte lag im Median bei 23,6 Monaten, mit einem medianen progressionsfreien Überleben von 8 Monaten. In Anbetracht der sehr weit fortgeschrittenen Tumorprogression, erkennbar durch den hohen „Peritoneal Cancer Index“ (PCI) sind die hier erhobenen Überlebensdaten in etwa vergleichbar mit denen anderer Studien (Verwaal et al., 2003). Im Folgenden wurden nun die beiden Gruppen im Vergleich zueinander analysiert. Hierbei ergab sich ein signifikanter Unterschied sowohl im Gesamt-, als auch im progressionsfreien Überleben (p=0,01 und p= 0,0034). Während die hypertherme Gruppe ein mittleres Gesamtüberleben von über 25 Monaten mit einem progressionsfreien Intervall von knapp 12 Monaten erreicht, zeigte die Nicht-Hypertherme Gruppe ein mittleres Überleben von 11 Monaten mit einem progressionsfreien Intervall von weniger als 5 Monaten (Abb. 3B). Da es sich hier um eine sehr gemischte Kohorte bezüglich der Entität, der Tumorausdehnung (PCI) und weiterer Patientenmerkmale handelte, wurden Parameter wie die Dauer der Operation, der BMI, Alter, Allgemeinzustand, PCI sowie die durch die Chirurgie erzielte Tumorfreiheit (CC-Score)

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zwischen den beiden Gruppen analysiert. Wie Tabelle 7 zeigt, sind diese aufgeführten Charakteristika über beiden Gruppen einheitlich verteilt und beeinflussen nicht die Statistik. Lediglich ist das Nebenswirkungsspektrum, dargestellt durch den Clavien-Dindo-Score bei der Hyperthermen-Gruppe signifikant erhöht. Diese vermutlich durch die Hyperthermie hervor-gerufenen Nebenwirkungen wurden häufig in Studien beschrieben (Saxena et al., 2010). Diese Daten weisen damit erstmals sehr klar darauf hin, dass die Temperatur während der HIPEC tatsächlich einen Einfluss auf das Überleben von PC-Patienten hat. Es existieren zwar eine Reihe klinischer Studien, jedoch gibt es keine Studie, die es ermöglicht, den Stellenwert der Hyperthermie zu ermitteln (Johanna Verhulst, 2014). Entweder werden hier die HIPEC mit einer Standardtherapie oder einer mehrfach wiederholten normothermen IP-Chemotherapie verglichen. Ein direkter Vergleich verschiedener Temperaturen in einem Patientenkollektiv war bislang nicht verfügbar. Insgesamt zeigen die verfügbaren Studien in der Regel einen klaren Benefit der CRS und HIPEC im Vergleich zur herkömmlichen Standardtherapie (de Bree et al., 2008; Elias et al., 2009; Glehen et al., 2010). Die Studie von Shen et al., welche Temperaturen um die 39,5°C mit einem mittleren Überleben von 16 Monaten im Vergleich zu einer Studie mit Temperaturen um 45°C mit einem mittleren Überleben von 32,9 Monaten für die HIPEC wählte, kann ebenfalls als kleiner Hinweis der effizienten Wirkung von erhöhten Temperaturen interpretiert werden (Glehen et al., 2004; Shen et al., 2003). Insgesamt kann aus den verfügbaren Studien gefolgert werden, dess ein standardisiertes HIPEC-Verfahren bislang nicht vorliegt. So unterscheiden sich die Studien sowohl bezüglich der Höhe der Temperatur als auch in der Wahl der Zytostatika. Darüber hinaus gibt es keine Studie, die einen potentiellen Benefit von Hyperthermie durch den direkten Vergleich der normothermen mit der hyperthermen Behandlung belegen könnte. Der in vorliegender Arbeit durchgeführte retrospektive Vergleich zwischen Patienten, die den in-vitro identifizierten Schwellenwert von 40°C über einen ausreichend langen Zeitraum erreicht hatten mit solchen, die unterhalb dieser Schwelle blieben, deutet sehr klar auf einen Überlebensvorteil nach Hyperthermie-therapie hin. Größere, prospektive Studien, die eine hypertherme mit einer einmaligen normo-thermen IP-Applikation vergleichen, sind jedoch für die Bestätigung dieser Hinweise unabdingbar.

4.2 Kurzzeiteffekte bezüglich der Zytostatika-induzierten Apoptose bzw. Viabilität sind nicht durch Hyperthermie beeinflusst

Temperaturstress kann in Zellen zu einer enormen Veränderung der Morphologie führen. Dies manifestiert sich durch ein Abkugeln und Schrumpfen der Zellen, aufgrund von Modifikationen des Zytoskellets (Luchetti et al., 2004). Daher scheint es nicht verwunderlich, dass solche massiven Veränderungen zellulärer Komponenten zu einer Abnahme der Viabilität und Zelltod führen. Jedoch konnte gezeigt werden, dass die Induktion von Zelltod sehr von der Stärke und Dauer des Hitzeschocks abhängt (Pawlik et al., 2013; Takahashi et al., 2004). In dieser Arbeit wurde die Induktion der Apoptose durch Annexin-Messungen 48h nach den ensprechenden Behandlungen quantifiziert. Abbildung 6 zeigt jeweils drei Ovarialkarzinom- und Kolonkarzinom-Zelllinien, die jeweils für eine Stunde mit Cisplatin, Doxorubicin, Oxaliplatin, 5-FU und Paclitaxel unter hyperthermen bzw. normothermen Bedingungen behandelt wurden. Die alleinige Inkubation mit

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42°C für eine Stunde führt in keiner der untersuchten Zelllinien zu einer vermehrten Apoptose-induktion im Vergleich zur entsprechenden normothermen Behandlung. Ebenfalls hat die Hyper-thermie keinen Einfluss auf die Apoptoseinduktion durch Zytostatika. Neben der Apoptose wurde ebenfalls die Viabilität der Zellen via MTT bestimmt. Kongruent zur Apoptoseinduktion konnte ebenfalls hier kein signifikanter Unterschied identifiziert werden. Es existiert eine Reihe präklin-ischer Studien, die mit vergleichbaren Methoden mögliche hyperthermie-vermittelte Zytotoxizitäts-steigerungen untersuchen. So zeigte Zhang et al., unter anderem für Oxaliplatin morphologischer Veränderungen in Lymphomzellen ab 43°C. Diese Veränderungen können jedoch in diesem Temperaturbereich auch in unbehandelten Zellen beobachtet werden. Daneben zeigen sich in dieser Arbeit ebenfalls Zellzyklus-veränderungen ab 43°C, die jedoch erneut gleichermaßen in Kontroll-zellen stattfinden (Zhang et al., 2012). Das hieraus gezogene Fazit, dass ab Temperaturen von 43°C gesteigerte Zytotoxizitäten erreicht werden können, beruht wahrscheinlich eher auf der Tatsache, dass diese Temperaturen bereits alleine zur Induktion von Zelltod führen können (Pawlik et al., 2013). Andere Arbeiten untersuchen diese Fragen mittels Zellzählung nach Trypanausschluss-färbung (Istomin et al., 2008). Die hier erhobenen Daten legen nahe, dass Kurzzeitmessungen der Apoptose bzw. Viabilität nicht geeignet sind, um Hyperthermie-vermittelte Zytotoxizitätssteiger-ungen zu untersuchen.

4.3 Hyperthermie führt nur zu einer marginalen transkriptionellen Regulationen von Stress-assoziierten Genen

Zellen müssen sich sehr schnell durch Änderung der Genexpression an veränderte Umweltbeding-ungen anpassen. So zeigen Studien eine veränderte Expression von mehr als 100 Genen nach Hitzeschock, die unter anderem für Proteinfaltung, Degradation, Transport, Metabolische Signal-wege wichtig sind (Gasch et al., 2000; Richter et al., 2010; Tabuchi et al., 2008). In vorliegender Arbeit sollte nicht nur auf Hitzeschockreaktionen fokussiert, sondern vielmehr die Aktivierung unterschiedlicher Stresswege parallel analysiert werden. Die Idee war dadurch eine Vorstellung der molekularen Mechanismen, die die beobachtete Zytotoxizitätssteigerung durch Hyperthermie bedingen, zu erhalten. Dementsprechend wurde mittels der Analyse von 134 Targets der zelluläre Stress über ein breites Spektrum hinweg untersucht werden (Tabelle 4 & 5). Ein kleiner Anteil der Transkripte kodiert für Proteine, deren Funktion direkt im jeweiligen Stressweg eine zentrale Rolle einnimmt (wie beispielsweise DNA-Reparaturgene). Etwa 90% der Gene, die hier gewählt wurden, dienten hingegen eher als molekulare Marker für eine Veränderung in der Aktivität von Stresswegen. Die Funktion der entsprechenden Genprodukte stand dabei dann nicht mehr im Vordergrund. So sind ein großer Teil der ausgewählten Gene typische Targets von zentralen Transkriptionsfaktoren, die innerhalb bestimmter Stresswege typischerweise aktiviert werden. Die Regulation dieser Targetgene dient so als perferter Marker für die Aktivität dieser Transkriptions-faktoren und so indirekt auch für die Aktivierung der Signalwege. Beispiele hierfür sind Target von p53, NFkappaB oder HIF1α. Andere Gene wurden gewählt, weil sie in ihrer Promotorregion Stress-Response-Elemente enthalten und deshalb typischerweise nach Aktivierung dieser Wege

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differentiell reguliert werden. Bestes Beispiel hierfür sind Gene, die im Zuge von ER-Stress aktiviert werden und ERSE in ihrer Promoterregion aufweisen.

Zunächst sollte durch Hyperthermie alleine ohne zusätzliche Schädigung die Aktivierung unter-schiedlicher Stresswege analysiert werden. Ausschließlich eine differentielle Regulation von ABCB1 und BCL2L13 im Vergleich zur normothermen Behandlung konnten in der OVCAR8 identifiziert werden (Abb.4). BCL2L13 gehört zu den pro-apoptotischen Proteinen. Signifikant herrunterregulierte Gene konnten nicht identifiziert werden. Die HCT116 zeigen lediglich eine differentielle Regulation ebenfalls von ABCB1. ABCB1 kodiert für einen ABC-Transporter, der unter ATP Verbrauch, unter Anderem zytotoxische Substanzen aus der Zelle pumpt. Diese Hyperthermie-vermittelte Regulation von ABCB1 konnte bereits in einer Studie gezeigt werden (Stein et al., 2001). Insgesamt können durch Hyperthermie alleine, nur marginale differentielle Regulationen gefunden werden, das bedeutet, dass die Hyperthermie in dieser hier verwendeten Applikation zu keiner Veränderung zentraler Stresswege führt. So wird auch mittels diesen Ergebnissen die Tatsache unterstützt, dass die Hyperthermie, in dieser Applikation keine Apoptose oder goßen Veränderungen im Zellzyklus induziert (Abb.6).

Fokussiert wurde in vorliegender Arbeit auf den Synergismus von Hyperthermie und Zytostatika, daher wurden neben der Untersuchung der Hyperthermie alleine, ebenfalls Analysen nach Schädigung durch Cisplatin bzw. Doxorubicin durchgeführt. Hier zeigt sich bei Betrachtung der DNA-Reparatur-Targets keinerlei differentielle Regulation nach Cisplatin, die in beiden untersuchten Zelllinien uniform geht. Nach Schädigung durch Doxorubicin werden in der OVCAR8 TP53INP1 bei 37°C hochreguliert und FANCM herunterreguliert, während in der HCT116 ausschließlich die Hochregulation von TP53I3 identifiziert werden konnte. Bezüglich der p53-Zielgene konnte nach Cisplatin eine differentielle Hochregulation von ABCB1 gefunden werden. Dies stimmt mit der Beobachtung von Kohno et al. überein, die eine temperaturabhängige Hochregulation dieses Transportergens in Kolonkarzinomzelllinien nachweisen konnten (Kohno et al., 1989). Doxorubicin führt in beiden Zelllinien zu einer differentiellen Hochregulation von FOSL-1 und TP53AIP1. Fosl-1 ist ein Leucin-Zipper Protein, welches durch Dimerisierung mit Proteinen der JUN Familie zur Bildung des Transkriptionsfaktorkomplexes AP-1 führt. Eine Rolle von Fosl-1 bei der Regulation von Proliferation, Differenzierung und Transformation wurde beschrieben (Diesch et al., 2014). P53AIP1 führt zur p53- abhängigen Apoptose (Oda et al., 2000). Durch Cisplatin gibt es keine transkriptionellen Veränderungen durch Hyperthermie.

Insgesamt wird durch Hyperthermie die transkriptionelle Antwort auf zellulären Stress durch zytotoxische Substanzen nur marginal beeinflusst. So kommt es also keinesfalls zu einer verminderten Transkription, wie es durch Hitzeschock bei 43°C für 3 Stunden berichtet wurde (Gasch et al., 2000; Tabuchi et al., 2008). Die gesteigerte Zytotoxizität durch Hyperthermie beruht also eher nicht auf einem transkriptionell gesteuerten Mechanismus.

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Diskussion 88

4.4 Hyperthermie führt zu einer veränderten intrazellulären Zytostatika-konzentration

Ein weiterer Mechanismus von Hyperthermie ist eine gesteigerte intratumorale Zytostatikakonzen-tration, bedingt durch eine gesteigerte Durchblutung und erhöhte Permeabilität der Membranen (Schlemmer et al., 2004).

Die für Doxorubicin gezeigte erhöhte intrazelluläre Konzentration durch Hyperthermie (Jacquet et al., 1998; Larrivée and Averill, 2000) konnte in vorliegender Arbeit unter Verwendung des hier verwendeten in-vitro-Models sehr eindeutig reproduziert werden. So konnte in vorliegender Arbeit für Doxorubicin eine signifikant erhöhte intrazelluläre Konzentration nach Hyperthermie mittels Messung der Doxorubicin-Eigenfluoreszenz am FACS festgestellt werden. Zellen, die bei 42°C mit Doxorubicin behandelt wurden, weisen im Vergleich zu solchen bei 37°C fast die doppelte intrazelluläre Doxorubicin-Konzentration auf, obwohl ABCB1 signifikant hochreguliert wird. Werden die Konzentrationen in 1°C-Schritten von 37°C bis zu 42°C gemessen, wird erneut die Temperaturschwelle von 40°C deutlich erkennbar (Abb. 8A). Ab diesen Temperaturen kommt es zu einer signifikanten Steigerung der intrazellulären Konzentration. Um nun zu untersuchen, ob die in Abbildung 1 gezeigte erhöhte Zytotoxizität allein auf veränderten Transport zurückzuführen ist, wurde die Doxorubicin-Konzentration bei 42°C in kleinen Konzentrationsschritten so weit nach unten titriert bis intrazelluläre Konzentrationen erreicht wurden, die denen nach Behandlung mit 15 µM bei 37°C entsprechen (Abb. 9A). Sehr deutlich konnte anhand der klonalen Wachstumsrate, welche trotz der nun angepassten intrazellulären-Konzentrationen weiterhin bei erhöhter Temperatur signifikant reduziert war, gezeigt werden, dass die Zytostatika-Steigerung durch Hyperthermie nicht maßgeblich von eine erhöhten Zytostatika-Aufnahme abhängt (Abb. 9B). Auf die Anzahl der Cisplatin-DNA-Addukte konnte in dieser Arbeit in allen untersuchten Zellen kein Einfluss der Hyperthermie direkt nach der einstündigen Behandlung gezeigt werden (Abb. 8A). Dieses Ergebnis deutet ebenfalls auf andere prädominante Mechanismen hinter den Synergieeffekten von Zytostatika und Hyperthermie.

In der Literatur ist die Datenlage bezüglich Cisplatin nicht eindeutig. So konnten vermehrte Cisplatin-DNA Interstrandcrosslinks in L1210 Zellen nach Hyperthermie gemessen werden (Ohno et al., 1994), während in einem Rattenmodel analog zu den hier vorliegenden Ergebnissen keine Unterschiede der Cisplatin-Konzentrationen zwischen einer hyperthermen- und normothermen intraperitonealen Perfusion über ein großes Konzentrationspektrum hinweg gezeigt werden konnte (Zeamari et al., 2003). Zu beachten ist, dass in der Sudie von Ohno et al. ausschließlich Intrastrangvernetzungen untersucht wurden, die nach Cisplatinbehandlung nur einen kleinen Teil der Addukte ausmachen. Der in vorliegender Arbeit verwendete Antikörper zum Nachweis der DNA-Platinverbindungen, detektiert sowohl Intra- als auch Interstrandcrosslinks. Mögliche Unter-schiede bezüglich Interstrandcrosslinks sind also damit nicht auszuschließen.

Eine veränderte Aufnahme von Zytostatika nach Hyperthermie scheint somit nicht der predomi-nante Mechanismen hinter der synergistischen Wirkung zwischen Hochdosis-Chemotherapie und Hyperthermie zu sein (Abb. 9).

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Diskussion 89

4.5 Hyperthermie führt zu einer verminderten Reparaturkapazität

Eine Reihe von Daten, insbesondere zur Strahlensensitivierung, zeigen eine durch Hyperthermie bedingte Hemmungen von DNA Reparatur-Wegen. So wird beispielsweise XPA, als zentraler Bestandteil der Nucleotide Excision Repair (NER) durch Hitzestress verdrängt (Muenyi et al., 2011). Ein weiterer Hinweis ist die verhinderte Reparatur von UV-induzierten Pyrimidin-Dimeren nach Hyperthermie, welche ebenfalls durch NER elimiert werden (Schmidt-Rose et al., 1999). Dieser Reparaturweg spielt insbesondere bei der Reparatur von Cisplatin-induzierten DNA-Schäden eine essentielle Rolle (Reed, 1998). Es wurde aber auch eine durch Hyperthermie kompromittierte DSB-Reparatur gezeigt. So führt Hyperthermie in Zellen, die mit Bestrahlung behandelt wurden zur Hemmung der HR und zwar durch Degradation von BRCA2 (Krawczyk et al., 2011).

Demzufolge wurde in dieser Arbeit der Einfluss der hyperthermen Zytostatika-Behandlungen auf die DNA-Strangbruch-Kapazität untersucht. In einer Zeitkinetik bis zu 8 Stunden konnte gezeigt werden, dass Doxorubicin bei 42°C die DNA-Reparatur-Kapazität stark kompromittiert, während die induzierten Schäden bei einer normothermen Behandlung innerhalb von 8 Stunden fast komplett repariert werden (Abb. 11). Zur selektiven Untersuchung von DNA-DSB wurde der Comet ebenfalls unter neutralen Bedingungen durchgeführt (Abb. 12 ). Analog zum alkalisch durchgeführten Comet, konnte auch hier eine Induktion von DSB nach Doxorubicin-Behandlung festgestellt werden, wenn auch in geringerem Ausmaß. Interessanterweise deuten aber auch die mit dem neutralen Comet erhaltenen Daten auf eine verzögerte Reparatur nach Hyperthermie hin. Somit scheint sowohl die Reparatur von SSB wie auch von DSB nach Doxorubicin durch Hyperthermie negativ beeinflusst. Ähnliche Ergebnisse konnten vor einiger Zeit für die thermale Radiosensitivierung mit HeLa-Zellen gezeigt werden (Jorritsma and Konings, 1984).

Zur Untersuchung der DNA-Reparaturkapazität nach Cisplatin-Behandlungen wurde die Addukt-eliminierung als Indikator der Reparatur-Kapazität herangezogen. Für die initiale Anzahl der DNA-Cisplatin-Addukte konnte zwischen der normothermen und der hyperthermen Behandlung kein Unterschied gefunden werden (Abb. 8). Allerdings zeigte sich bereits nach 3 Stunden eine deutlich längere Persistenz der Cisplatin-Addukte bei der hyperthermen-Behandlung (Abb. 13). Nach 6 Stunden sind die Addukte bei 37°C fast vollständig entfernt, während sie bei 42°C nur minimal reduziert wurden. So lässt sich auch hier für Cisplatin erstmals eine stark reduzierte Reparatur-Kapazität nach hyperthermer Behandlung nachweisen.

Die verminderte Reparaturkapazität sowohl nach Doxorubicin induzierten DNA-Strangbrüchen, als auch die verminderte Cisplatin-Addukteliminierung zeigen deutlich, dass sehr unterschiedliche DNA-Schädigungen durch Hyperthermie verzögert repariert werden. Bei Cisplatin und Doxorubicin handelt es sich um Zytostatika mit sehr unterschiedlichen Wirkmechanismen und damit einhergehend mit unterschiedlichen Reparaturmechanismen die nach Schädigung der DNA durch diese beiden Substanzen aktiviert werden. So werden Cisplatinaddukte vorwiegend durch NER (Reed, 1998), Doxorubicin-Schäden hingegen durch Strangbruchreparaturwege beseitigt (Hortobagyi et al., 1997). Interessanterweise haben aber diese sehr unterschiedlichen Reparatur-wege eine Gemeinsamkeit. So spielt sowohl bei der Addukt- als auch bei der Strangbruch-Erkennung PARP und die durch dieses Enzym katalysierte PARylierung eine zentrale Rolle. PARP

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Diskussion 90

interagiert mit XPA bei der Erkennung der DNA-Addukte (Fu et al., 2012; Gagné et al., 2009) aber auch durch Interaktionen mitt Mre11 (Bryant et al., 2009b) und KU (Dong et al., 2010; Ruscetti et al., 1998) bei der Erkennung und Reparatur der DSB.

Cisplatin-Addukte können aber auch ebenfalls über das NHEJ entfernt werden können.

So konnte eine Interaktion der DNA abhängigen Proteinkinase (DNA-PK) mit Cisplatin-DNA Schäden gezeigt werden (Turchi and Henkels, 1996). Ebenso wie die Hemmung der Kinaseaktivität von KU durch Cisplatin-Addukte in Ovarialkarzinom-Zellen (Henkels and Turchi, 1997). In diesem Zusammenhang ist die hypertherme Strahlensensitivierung auf eine Aggregierung von Ku und damit einhergehend auf eine Inaktivierung des NHEJ zurückzuführen (Burgman et al., 1997).

Da Hyperthermie zu einer verzögerten Reparatur dieser unterschiedlichen Schäden führt, bedingt dies eine Beeinträchtigung eines gemeinsamen Reparaturproteins. So lässt sich vermuten, dass hierbei PARP eine Rolle spielen könnte. Obgleich PARP nicht per se bei diesen Reparatur-prozessen involviert ist, initiiert und moduliert PARP-1 diese Reparaturwege und ist folglich wichtig für die genomische Stabilität (Dantzer et al., 2006; Schreiber et al., 2002, 2006).

4.6 Hyperthermie führt nach DNA-Schädigung zu einer verminderten PAR

Insgesamt existieren 17 verschiedene PARP, die für die genomische Stabilität, Apoptose, Entzündungsprozessen und bei der Regulation von Genexpressionen eine Rolle spielen (Kim et al., 2005; Papeo et al., 2013). Innerhalb dieser 17 Proteine sind PARP-1 und PARP-2 die einzigen Enzyme, deren katalytische Aktivität durch DNA-Strangbrüche aktiviert wird (Tentori and Graziani, 2005), wobei PARP-1 hier die wichtigste Rolle übernimmt (Altmeyer et al., 2009). PARP-1 ist insbesondere wegen seiner Funktion als Schadenssensor bekannt. Durch Bindung an geschädigte DNA wird die katalytische Aktivität verstärkt und damit verbundenen die Reparatur von SSB und DSB veranlasst (Woodhouse et al., 2008). Die Erkennung ungewöhnlicher DNA Strukturen, wie Brüche, Knicke oder Verbindungen werden hauptsächlich durch die N-terminale Bindedomäne bewerkstelligt (Ikejima et al., 1990; Langelier et al., 2011). Als sehr frühes Ereignis erkennt dieses Protein die DNA-Brüche, bindet daran und infolge der Aktivierung werden durch PARP-1 negativ geladene Polymerketten aus ADP-Riboseresten (poly-(ADP-Ribose)ketten, PAR) an Akzeptor-proteine, unter Anderem Histone und DNA-Reparaturproteine synthetisiert. Dieser Mechanismus wird streng reguliert, so baut PARG diese PAR wieder ab (Rouleau et al., 2010). Konsequenterweise konnte sowohl für PARP, als auch für PARG eine wichtige Rolle in der Erhaltung der genomischen Stabilität beschrieben werden (D’Amours et al., 1999; Zhou et al., 2010).

Die Analyse der PARP-Aktivität durch Nachweis der PARylierung zeigte in den Kontrollzellen weder bei 37°C noch bei 42°C eine Induktion. Sehr deutlich wird diese jedoch durch Cisplatin, bzw. Doxorubicin bei 37°C induziert. Dies konnte bereits in vorhergehenden Arbeiten gezeigt werden (Bürkle et al., 1993; Pacher et al., 2002).

Interessanterweise konnte aber in dieser Arbeit durch hypertherme Behandlungen mit Cisplatin, bzw. Doxorubicin keine globale PARylierung mehr nachgewiesen werden (Abb. 14). Die Spezifität dieser Methode wurde eindeutig durch den kompletten Verlust der Zytostatika-induzierten PARylierung nach Behandlung der Zellen mit spezifischen PARP-Inhibitoren gezeigt.

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Diskussion 91

Diese Hemmung der globalen Parylierung durch Hyperthermie wurde zuvor nicht beschrieben. Interessanterweise gibt es in der Literatur eher Hinweise in Richtung einer gesteigerten PARP-Aktivität durch Hyperthermie. So konnte gezeigt werden, dass es lokal an bestimmten Promotoren durch Hitze zu einer starken Induktion von PAR kommt. Diese lokale PAR führt dann zu einer transkriptionellen Induktion vorallem von Hitzeschockgenen (Ouararhni et al., 2006). PARP nimmt hier also die Funktion eines Coaktivators ein. Eine solche sehr lokal auf bestimmte Promotor-regionen begrenzte PARylierung liegt mit größter Wahrscheinlichkeit unterhalb der Detektions-grenze des in vorliegender Arbeit angewandten Immunfluoreszenz-Nachweises. Diese Daten deuten darauf hin, dass der in vorliegender Arbeit beobachtete Verlust der PARylierung nach DNA-Stress nicht auf einer durch Degradation oder Inaktivierung von PARP durch Hitze zurückzuführen ist. Vermutlich wird viel eher durch Hitze die Bindeaffinität von PARP an verschiedene DNA-Strukturen verändert.

Wie die allermeisten Proteine wird auch PARP-1 posttranslational modifiziert. So wird PARP-1 unter anderem sumoyliert (Blomster et al., 2009; Messner et al., 2009; Ryu et al., 2010). Interessanterweise kann diese posttranslationale Modifikation durch Hyperthermie ausgelöst werden (Martin et al., 2009). Messner et al., zeigten, dass die PARP-Sumoylierung die Expression der Hypoxie-Gene reduziert, wahrscheinlich über die Hemmung der Interaktionen zwischen PARP-1 und der Acetyltransferase CBP/p300 (Messner et al., 2009). An anderen Promotoren, wie beispielsweise denen des HSP70-Gens, führt die Bindung von symoyliertem PARP zur transkritionellen Aktivierung (Martin et al., 2009). Diese Modifikation hat jedoch keinen Einfluss auf die PARP-Aktivität selbst (Messner et al., 2009). Eine Reihe weiterer Modifikationen von PARP sind bekannt. So führte eine Proteomicsanalyse zur Identifikation einer Reihe von Phosphorylierungen (Gagné et al., 2009). PARP-1 wird beispielsweise durch ERK1/2 an Ser372 und Thr373 phosphoryliert und diese Modifikationen sind nötig für die maximale PARP-1 Aktivierung nach DNA-Schädigung (Kauppinen et al., 2006).

Mittels biochemischer (Bauer et al., 1992) und zellbasierten (Beckert et al., 2006) Verfahren konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung von PARP-1 über die Proteinkinase C zu einer verminderten PARP-1-DNA-Bindung und einer reduzierten katalytischen Aktivität führt.

PARP wird darüber hinaus auch acetyliert (Haenni et al., 2008; Hassa et al., 2005). Die funktion-elle Bedeutung dieser postranslationelaen Funktion ist bislang unbekannt. Dass Hyperthermie neben der Sumoylierung auch einen Einfluss auf Phophorylierung und/oder Acetylierung hat, ist durchaus vorstellbar, wurde aber bislang nicht untersucht.

Zusammengefasst konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass die durch Zytostatika induzierte PARylierung im selben Ausmaß wie durch pharmakologische PARP-Inhibitoren gehemmt wird. Diese Hemmung der Parylierung hängt nicht an einer veränderten Proteinexprssion (Abb. 16) oder einem ATP-Verlust (Abb. 17).

Dass die Hemmung von PARP auf die Effizienz von DNA-Reparatur einen erheblichen Einfluss hat ist lange bekannt. Bereits 1985 wurde von Berger gezeigt, dass PARP-1-Hemmung eine verzögerte Reparatur von Bestrahlungs-induzierten Schäden zur Folge hat (Berger, 1985). Darüber hinaus führt die Hemmung von PARP-1 zu Zellzyklusstörungen und erhöhter genomischer Instabilität (Masutani et al., 1999; Schreiber et al., 1995). Auch für die Kombination von Cisplatin mit PARP-Inhibitoren konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der PARylierung zu einer

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Diskussion 92

erhöhten Persistenz der Cisplatin-Addukte in der DNA, also einer reduzierten Reparaturkapazität führt (Olaussen et al., 2013). Auch in anderen Arbeiten wurden mehrfach synergistische Effekte zwischen PARP-Inhibition und Cisplatin (Cheng et al., 2013; Michels et al., 2013) und Doxorubicin (Muñoz-Gámez et al., 2011; Natisha Magan, 2012; Yadav et al., 2014) in unterschiedlichen Zellsystemen gezeigt. In der vorliegenden Arbeit wurden analoge Ergenbnisse nun auch durch eine Hyperthermie-Behandlung erzielt. So kommt es durch Hyperthermie zu einer signifikanten Verzögerung der DNA-Strangbruchreparatur nach Doxorubicin- und einer längeren Persistenz von DNA-Platin-Addukten nach Cisplatinbehandlung. Darüber hinaus ist das klonale Wachstum bei Wärmebehandlung drastisch reduziert (Abb. 15). Kongruente Ergebnisse wurden von Fisher et al., ebenfalls im alkalischen Comet mit humanen Epithelzellen, durch RNA-Interferenz von PARP-1 gezeigt (Fisher et al., 2007). Diese nahezu identischen oder vergleichbaren Ergebnisse, die durch Hyperthermie oder PARP-Inhibition zustande kommen, untermauern weiter die These, dass Hyperthermie in erster Linie durch gehemmte PARylierung zu einer Effizienz-steigerung der Zytostatika-Wirkung beiträgt (Abb. 18). Die Hyperthermie vermittelte Hemmung der PARylierung könnte ein interessanter Ansatzpunkt für Therapien sein, da in vielen Reparaturwegen eine Beteiligung von PARP für eine effiziente Reparatur essentiell ist.

Hyperthermie steigert die Zytotoxizität nur von Zytostatika, die eine PARylierung 4.6.1induzieren

Wenn die Hypothese zutrifft, dass Hyperthermie vorwiegend durch Hemmung von PARP zu einer Zytotoxizität-Steigerung von Chemotherapie beiträgt, dann sollte konsequenterweise Hyperthermie auch nur zusammen mit solchen Zytostatika synergistisch sein, die eine PARylierung induzieren. Um dieser Frage nachzugehen, wurden in dieser Arbeit neben Cisplatin und Doxorubicin, auch andere, bereits in der Klinik für die HIPEC verwendeten Zytostatika analysiert, nämlich Oxaliplatin, 5-FU und Paclitaxel. Eindeutig zeigte sich, dass Hyperthermie neben Cisplatin und Doxorubicin nur mit Oxaliplatin eine gesteigerte Zytotoxizität vermitteln kann, nicht aber zusammen mit 5-FU oder Paclitaxel (Abb. 19). Analog wie bei Cisplatin oder Doxorubicin konnte auch für Oxaliplatin die erhöhte Zytotoxizität gleichermaßen durch Hyperthermie wie auch durch pharmakologische PARP-Inhibitoren erreicht werden (Abb. 20). Im Gegensatz dazu konnte weder durch Hyperthermie noch durch selektive PARP-Hemmung eine gesteigerte Wirkung von 5-FU oder Paclitaxel erzielt werden. (Abb. 20). Dies konnte darauf zurückgeführt werden, dass es im Gegensatz zu Cisplatin, Oxaliplatin und Doxorubicin nach Behandlung mit 5-FU oder Paclitaxel zu keiner PARylierung kommt (Abb. 21). Diese Daten deuten darauf hin, dass nur Zytostatika, die eine PARylierung induzieren, von der Hyperthermie-Applikation profitieren. Kongruent dazu konnten auch in anderen Arbeiten in der Mehrheit keine zusätzliche Wirkung durch Hyperthermie zusammen mit Paclitaxel bzw. 5-FU beschrieben werden (Bouquet et al., 2009, 2011; Huehls et al., 2011; Mohamed et al., 2003).

5-FU und Paclitaxel haben völlig andere Wirkmechanismen als Platin-haltige Zytostatika oder Doxorubicin. 5-FU wird insbesondere zur Therapie metastasierter kolorektaler Karzinome eingesetzt. Zunächst wird es zu seinem aktiven Metaboliten, Fluorodeoxyuridinmonophosphat

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Diskussion 93

(FdUMP) metabolisiert, welches dann die Thymidilatsynthase (TS) hemmt. Diese bedingt die Hemmung der Pyrimidin- und damit der DNA-Synthese.

Darüber hinaus kann FdUMP aber auch in der RNA eingebaut die Proteinsynthese stören. 5-FU wird entweder mittels einer Bolusapplikation oder einer kontinuierliche Infusion verabreicht. Dies führt wahrscheinlich zu den unterschiedlichen molekularen Wirkungs-weisen von 5-FU. So konnte gezeigt werden, dass die Bolusgabe überwiegend zum Einbau in die RNA führt, während die Infusion zu einer überwiegenden Hemmung der DNA-Synthese und der TS führt (Huehls et al., 2011). Dies könnte erklären, warum eine Kurzzeitbehandlung, wie sie bei der HIPEC durchgeführt wird von der Hyperthermie nicht profitiert. Paclitaxel bindet β-Tubulin, unterbindet somit den Abbau der Mikrotubuli und hemmt damit die Mitose. Hier gibt es keine Hinweise einer Beteiligung von PARP. Eine Ribosylierung ist also auch nicht zu erwarten.

In vorhergehenden Arbeiten wurde eine Wirkungsverstärkung von Oxaliplatin (McPherson et al., 2014; Mohamed et al., 2003; Rietbroek et al., 1997; Tentori and Graziani, 2005; Zhang et al., 2012), Cisplatin (Hettinga et al., 1994, 1997; Muenyi et al., 2011; Oršolić and Car, 2014; Rietbroek et al., 1997), Doxorubicin (Jacquet et al., 1998; Mariano et al., 2015; Rossi et al., 2003), Carboplatin (Cohen et al., 1989; Groen et al., 1995; Hay et al., 2009; Karginova et al., 2015; Kusumoto et al., 1995), Mitomycin C (Caria et al., 1997; van der Heijden et al., 2004, 2005; Rath-Wolfson et al., 2003) sowie für Apaziquone, einem chemischen Analog von Mitomycin C (van der Heijden et al., 2005) durch Hyperthermie bzw. PARP-Inhibition beschrieben. Von all diesen Substanzen ist bekannt, dass sie Schäden induzieren, deren Prozessierung zur Induktion von globaler PAR führt.

Neben 5-FU und Paclitaxel wird Etoposid, ein Topoisomerase II-Inhibitor ebenfalls durch Hyperthermie nicht in seiner Zytotoxizität gesteigert (Cohen et al., 1989). So findet man für Etoposid ebenfalls keine Daten in der Literatur, die auf eine Wirkungssteigerung durch PARP-Inhibition hindeuten. Demzufolge könnte die PARylierung als molekularer Marker genutzt werden, um Zytostatika auf eine mögliche Hyperthermie-vermittelte Wirkungssteigerung zu testen. Dies wäre insbesondere im Rahmen der HIPEC bei der Behandlung von peritoneal metastasierten Tumoren eine Möglichkeit sehr gezielt potente Chemotherapeutika auszuwählen.

4.7 Die verzögerte DNA-Strangbruchreparatur- und Addukteliminierung führt zu vermehrten DSB, die über das NHEJ repariert werden

PARP ist an einigen Stellen mit der DNA-Reparatur assoziiert. So ist PARP sowohl bei der Erkennung wie auch bei der Reparatur von Cisplatin- bzw. Doxorubicin-induzierten DNA-Schäden beteiligt. In dieser Arbeit konnten unter hyperthermen-Bedingungen eine verzögerte DNA-Strangbruchreparatur nach Doxorubicin-, genauso wie eine verlangsamte Addukteliminierung nach Cisplatin-Gabe identifiziert werden (Abb. 13 & 18). Damit einhergehend konnte ein reduziertes Langzeitüberleben unter hyperthermen-Bedingungen aufgrund einer Hyperthermie-vermittelten Hemmung der PARylierung gezeigt werden (Abb. 20). Unreparierte SSB, wie auch eine verminderte NER können zu lethalen DSB führen (Bryant et al., 2009a).

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Diskussion 94

Diese führt zu genomischer Instabilität, da verlorenen Informationen nicht durch den komplemen-tären Strang rekonstruiert werden können.

Zur Analyse der DSB wurde neben γH2AX, ein typischer DSB-Marker auch P-53BP1 analysiert. P-53BP1 fördert die Reparatur über das NHEJ, indem es die DNA-Endresektion, ein essentieller Vorgang der HR, unterbindet (Chapman et al., 2012; Symington and Gautier, 2011). Abbildung 22 zeigt die Induktion der Foci-Formierung nach Schädigung durch Cisplatin bzw. Doxorubicin. Die Foci-Formierung je Kern, wie auch der Anteil positiver Zellen wird signifikant durch die Hyperthermie-Behandlung wie auch durch die pharmakologische PARP-Inhibition vermehrt (Abb. 22). Interessanterweise konnten vergleichbare Ergebnisse in primären Tumorzellen innerhalb ihres natürlichen Gewebeverbands nachgewiesen werden (Abb. 24), so dass nicht von unspezifischen Zelllinienphänomenen ausgegangen werden kann.

Neben diesen beiden DNA-DSB Marker, wurde in dieser Arbeit auch die Foci-Formierung von RAD51 analysiert (Abb. 25). Ergebnisse dieser vorliegenden Arbeit zeigen keine Hyperthermie-vermittelte kompromittierte Induktion der RAD51-Foci oder Veränderung der Proteinmenge nach Zytostatika (Abb. 25). Wenn man nun aber die signifikant vermehrte Induktion der P-53BP1-Foci bei Hyperthermer- , bzw. pharmakologischer PARP-Inhibition betrachtet (Abb. 23) und die unveränderte Anzahl der RAD51-Foci lässt sich vermuten, dass die vermehrten DSB eher vermittelt über das NHEJ repariert werden. Bezüglich RAD51 und Hyperthermie wurde kürzlich gezeigt, dass es nach Bestrahlung bei 42°C zu einer Dissoziation von RAD51- und BRCA-2-Foci und damit verbunden zu einer Hemmung der HR kommt (Krawczyk et al., 2011). Diese Autoren zeigen darüber hinaus eine Degradation von BRCA2 nach 75 minütiger Inkubation bei 42,5 °C. Jedoch handelt es sich bei der Bestrahlung um eine andere Art von DNA-Schäden, wodurch sich eventuell die Diskrepanz mit den in vorliegender Arbeit gemachten Beobachtungen erklären lässt.

Während die HR ausschließlich in der S-Phase ablaufen kann, handelt es sich bei der NHEJ um ein Zellzyklusphasen-unabhängiges System. Anders als bei der HR, die homologe Sequenzen zur Reparatur nutzt, werden bei dem NHEJ einfache Splice-Mechanismen herangezogen. Dement-sprechend geht das NHEJ mit Deletionen, Insertionen und Translokationen einher (Moynahan et al., 2001; Pierce et al., 2001). Zusammenfassend lässt sich vermuten, dass neben der kompromittierten DNA-Reparaturkapazität nach Hemmung der PARylierung durch Hyperthermie eine DNA-Reparatur vermehrt über das NHEJ vermittelt wird. Hierbei entstehen wesentlich mehr Fehler bei der Reparatur, weshalb möglicherweise das Langzeitüberleben reduziert wird.

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die induzierten DSB ausschließlich in replikativen Zellen detektiert werden können (Abb. 26). Auch die durch Hyperthermie bzw. PARP-Inhibitoren verursachten zusätzlichen Strangbrüche sind ausschließlich in Geminin-positiven Zellen detek-tierbar. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es vermittelt durch die Hemmung der PARylierung durch Hyperthermie zu einer Beeinträchtigung der Replikation kommen könnte.

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Diskussion 95

4.8 Chemotherapie induzierte Blockaden der Replikation werden durch Hyperthermie und PARP-Inhibition verhindert

Eine Reihe von Chemotherapeutika wirken durch Hemmung der Replikationsmaschinerie (Hoeijmakers, 2001). So wurde dies beispielsweise auch für Cisplatin als typisches Querver-netzendes Zytostatika beschrieben (Rajski and Williams, 1998). Cisplatin führt zu 90% zu Intrastrang- und zu 10% zu Interstrangvernetzungen, den sogennanten Interstrandcrosslinks (ICL) (Reed, 1998). Die ICL sind sehr toxische Läsionen, da sie durch die Vernetzung der Doppelhelix die Trennung dieser verhindern und somit zu einer Hemmung der Transkription und Replikation führen (Räschle et al., 2008). So sind schon zwischen 200 und 500 ICL im Genom lethal (Lawley and Phillips, 1996). Ebenso wurde für Doxorubicin neben der Funktion als Topoisomerase-II-Hemmer (Capranico et al., 1990; Cummings et al., 1991) auch eine Formaldehyd-vermittelte Bildung von DNA-Addukten gezeigt (Forrest et al., 2012; Spencer et al., 2008; Taatjes et al., 1997). In normalen Zellen ist Formaldehyd in geringen Konzentrationen vorhanden, diese sind in einigen Tumoren wesentlich erhöht, wodurch die Anzahl der durch Doxorubicin induzierten Addukte steigt (Kato et al., 2000, 2001).

Neben diesen Zytostatika, die auf die Replikation wirken, konnten bereits in frühen Studien Replikationsbeeinträchtigungen sowohl durch Hyperthermie, als auch durch PARP beschrieben werden (Spiro et al., 1983; Velichko et al., 2013).

So wurde in dieser Arbeit die Wirkung von Hyperthermie, bzw. PARP-Inhibition mit Cisplatin und Doxorubicin untersucht. Eine sehr gute Methode, um die Replikation zu untersuchen ist der DNA-Fiber-Assay. Dieser ermöglicht die Visualisierung der Replikation auf Nukleotidebene.

Hierdurch konnten Replikationsblockaden, sowie deutlich verminderte Progressionen der Replika-tionsgabeln nach Cisplatin und Doxorubicin gezeigt werden (Abb. 29 & 30).

Erstmals konnte durch die Hyperthermie-vermittelte Hemmung der PARylierung gezeigt werden, dass diese verminderte Progression oder die Replikationsblockaden durch die DNA-Schädigung nach Cisplatin bzw. Doxorubicin aufgehoben werden können (Abb. 29 & 30). So konnten Chromatinfasern gezeigt werden, die beinahe mit den Kontrollen vergleichbar waren. Gleicherweise wurde die Hemmung der Replikationsprogression, wie sie nach einer alleinigen Behandlung mit Cisplatin, bzw. Doxorubicin gezeigt wurden, wieder aufgehoben.

Betrachtet man nur die Anzahl der ausschließlich IdU-haltigen, bzw. CldU-haltigen Chromatin-fasern, so wird die Anzahl der abgebrochenen Fasern nach Cisplatin und Doxorubicin signifikant reduziert. Darüber hinauswird die durch alleinige Behandlung mit Cisplatin oder Doxorubicin beinahe komplett unterbundene Neuiniitiation der Replikation durch zusätzliche Hyperthermie bzw. pharmakologischer PARP-Inhibition wieder restauriert (Abb. 30). Die signifikant erhöhte Anzahl der ausschließlich IdU-markierten-Fasern nach Cisplatin, bzw. Doxorubicin zeigt, dass die Effekte auf die Progression der Replikation in Abbildung 29 höchstwahrscheinlich deutlich stärker sind. Denn in diese Auswertung, wurden die Fasern, welche ausschließlich IdU- markiert sind, nicht einbezogen. Anhand dieser Ergebnisse lässt sich folgern, dass die durch Doxorubicin bzw. Cisplatin induzierten Schäden zu einer Blockade der Replikationsgabel führen, die jedoch bei Hyperthermie nicht stattfinden kann.

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Diskussion 96

Insgesamt handelt es sich bei diesen hier gezeigten Ergebnissen nicht um zell-linienspezifische Phänomene. Vielmehr konnte analoge Ergebnisse auch für primäre Tumorzellen von PC-Patienten gezeigt werden (Abb. 32).

Da sowohl durch Cisplatin, wie auch durch Doxorubicin vergleichbare Effekte auf die Replikation gefunden werden konnte, lässt sich vermuten, dass die Effekte von Doxorubicin ebenfalls aufgrund der Crosslinks und weniger durch die Hemmung der Topoisomerse II zustande kommen. Insbesondere da Etoposid, ebenfalls ein Topoisomerase-II-Inhibitor durch Hyperthermie nicht in der Zytotoxizität verstärkt wird (Cohen et al., 1989). Bilardi et al., vermuten gar, dass die Doxorubicin-Wirkung hauptsächlich durch die Crosslinks hervorgerufen wird (Bilardi et al., 2012). In diesem Zusammenhang konnte die Reparatur dieser Doxorubicin-induzierten Crosslinks analog zu den Cisplatin-Addukten über die NER und HR gezeigt werden (Spencer et al., 2008). Die Doxorubicin-DNA-Addukte wirken jedoch durch die quervernetzten DNA-Addukte, auf der einen Seite durch kovalente Bindung und auf der anderen durch Wasserstoffbrücken verbunden, eher wie Interstrangvernetzungen (ICL) (Forrest et al., 2012), wie sie auch durch Cisplatin-DNA-Adukkte induziert werden (Reed, 1998).

Die DNA-Reparatur an einem ICL erfolgt über die Aktivierung des Fanconi-Anämie-Signalweges (FA) (Garcia-Higuera et al., 2001; Smogorzewska et al., 2007). Die Erkennung des ICL erfolgt durch FANCM, einige Nukleotide bevor die Replikationsgabel auf einen ICL trifft (Niedernhofer, 2007; Vinciguerra and D’Andrea, 2009). Es konnte gezeigt werden, dass die Replikation verlangsamt und blockiert wird, bevor die Replika-tionsgabel auf einen DSB (Doksani et al., 2009) oder einen ICL trifft (Räschle et al., 2008). Im Laufe der Reparatur erfolgt die Rekrutierung des FA-Core-Komplexes und der Monoubiquiti-nierung von FANCD2-FANCI, wodurch die Replikationsgabel stabilisiert wird. Anschließend werden Nukleasen und Polymerasen zur Reparatur rekrutiert. Schlussendlich initiiert und reguliert der BRCA1-und BRCA2-Komplex die HR (Deans and West, 2011). Hier, wie auch während der HR ist die kontrollierte Wiederaufnahme der Replikation wichtig für die effektive Reparatur der Läsion. Innerhalb dieser Prozesse konnte eine essentielle Rolle von PARP-1 beschrieben werden (Berti et al., 2013; Bryant et al., 2009b). PARP-1 ist eine Schlüssel-komponente der BER, SSBR, DSBR, NER und stabilisiert und kontrolliert das korrekte Wiederauf-nehmen der Replikation während der HR (Bryant et al., 2009b).

In diesem Zusammenhang zeigte eine neuere Arbeit für Camptothecin, einem Topoisomerase I-Inhibitor, eine essentielle Rolle für PARP-1 während der Replikation (Ray Chaudhuri et al., 2012). Diese Autoren beschreiben eine reduzierte Camptothecin-induzierte Umkehrung der Replikations-gabel, sowie eine verminderte Induktion von DSB durch PARP (Ray Chaudhuri et al., 2012), die in Art und Ausmaß mit den in vorliegender Arbeit gemachen Beobachtungen nach Cisplatin- und Doxorubicin-Behandlung erstaunlich gut übereinstimmt. In diesem Zusammenhang lässt sich nun auch die erhöhte Sensitivität von Topoisomerase-I-Giften nach PARP-1-Knockout (Chatterjee et al., 1989), oder PARP-Inhibitoren in-vitro erklären (Bowman et al., 2001; Delaney et al., 2000; Miura et al., 2012; Smith et al., 2005). Diese Erhöhte Zytotoxizität von Topoisomerse-I-Inhibitoren nach PARP-Inhibition konnte auf eine Hemmung der DNA-Reparatur zurückgeführt werden (Bowman et al., 2001; Smith et al., 2005). Dies ist wiederum übereinstimmend mit den Beobachtungen in vorliegender Arbeit bezüglich Cisplatin und Doxorubicin. So konnte auch hier

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Diskussion 97

gezeigt werden, dass die DNA-Reparatur-Kapazität von Cisplatin- oder Doxorubicin-induzierten Schäden bei Hyperthermie signifikant reduziert wird (Abb 18).

Die Rolle von PARP bezüglich der Hemmung von Topoisomerse-I bei der Replikation konnte von Berti et al., konkretisiert werden. PARP-1 verhindert eine frühzeitige, unkontrollierte Wiederauf-nahme der durch Camptothecin blockierten Replikation, indem die Helikase RecQ1 durch PARP-1 gehemmt wird und eine Reparatur des Schadens erfolgen kann (Berti et al., 2013). Die Hemmung von PARP führt zur verfrühten, unkontrollierten Wiederaufnahme der Replikation und damit einhergehend zu DSB (Berti et al., 2013).

Analog könnte PARP auch bei der Cisplatin bzw. Doxorubicin-induzieren Blockade der Replikation über die Hemmung einer Helikase eingreifen. Eine Interaktionen zwischen RecQ-Helikasen und dem FA-Signalweg wurde bereits gezeigt (Pichierri et al., 2004). So wäre es denkbar, dass die durch Cisplatin, bzw. Doxorubicin induzierten Replikationsblockaden und die verlangsamte Progression der Replikation durch eine PARP-vermittelte Hemmung RecQ und der damit verbundenen Stabilisierung des Reparaturkomplexes mittels HR repariert werden können. Tatsächlich zeigen die vorliegenden Ergebnisse, dass die DNA-Strangbrüche bei 37°C nach 8h nahezu komplett repariert werden können (Abb. 12). Im Falle einer Hyperthermie-Behandlung und der damit verbunden der Hemmung der PARylierung kann die durch Zytostatika induzierte Replikationsblockade nicht bis zur Reparatur aufrecht erhalten werden, wodurch es dann zwangsläufig zu einer Akkumulation der DNA-Schäden kommen könnte. So kommt es durch Hemmung von PARP nach Hyperthermie oder pharmakologischer Inhibition weder zu einem Zusammenbruch noch zu einer verlangsamten Replikation nach Doxorubicin- oder Cisplatingabe (Abb. 29). Demnach wäre es denkbar, dass hier die Helikase RecQ1 ungehindert und unabhängig der DNA-Schäden zu einem Weiterlaufen der Replikationsgabel führt.

Neben dieser Funktion von PARP, zeigte kürzlich eine Studie, dass PARP-1 auch für die Rekrutierung von MRE11 an die Stellen der Replikationsblockaden eine wichtige Rolle spielt (Bryant et al., 2009b). MRE11 hat zentrale Funktionen bei der Prozessierung der Replikations-blockaden, sowie durch die Rekrutierung von RPA auch bei der anschließenden Reparatur durch HR. Dies könnte zu einer fehlerhaften oder ganz ausbleibenden DNA-Reparatur führen, was dann in einer erhöhten genomischen Instabilität und letztlich einem reduzierten Langzeitüberleben resultiert.

Es konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Hyperthermie zu einer Hemmung der PARylierung führt. PARylierung ist nicht nur Bestanteil der DNA-Reparatur sondern spielt auch eine zentrale Rolle bei der Replikation zur Stabilisierung der Replikationsgabel. Deshalb werden wahrscheinlich insbesondere Crosslink-induzierende Agenzien durch Hyperthermie gesteigert. Diese These unterstützend konnten durch die hypertherme Behandlung mit Crosslink-induzier-enden Alkylanzien eine gesteigerte Zytotoxizitäten gezeigt werden. So zeigte beispielsweise eine Studie, dass die zytotoxizität von Melphalan im Vergleich zu der von Oxaliplatin stärker durch Hyperthermie gesteigert werden kann (Urano and Ling, 2002). Melphalan induziert eine wesentlich höhere Anzahl der Crosslinks als Oxaliplatin. Klinische Studien zeigen ebenfalls, dass die Behandlung mit hyperthermer Chemoperfusionen zur Behandlung von Melanomen und Sarkomen mit Melphalan am effizientesten sind (Lehti et al., 1986; Olieman et al., 1998).

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Ausblick 98

5 Ausblick

Bis dato existieren keine klinischen Studien, die einen eindeutigen Benefit der erhöhten Temperatur bei der IP-Chemotherapie belegen, sodass der Stellenwert der Hyperthermie, die bekanntermaßen mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden ist, bislang nicht geklärt wurde. Weitgehend unverstanden ist auch, welche Temperaturen für eine Zytotoxizitäts-steigerung der Chemotherapie wirklich notwendig sind, so wurde die HIPEC bislang in einem sehr variablen Temperaturbereich von 39°C bis 47°C durchgeführt. In vorliegender Arbeit konnte nun erstmals ein Schwellenwert von mindestens 40°C identifiziert werden, ab dem es nicht nur in-vitro zu einer signifikanten Steigerung der Chemotherapiewirkung kommt. Vielmehr zeigen auch Patienten, bei denen diese Temperatur an zwei intra-abdominalen Bereichen während der HIPEC-Prozedur erreicht wurde einen signifikanten Überlebensvorteil. Diese Ergebnisse ermöglichen es nun, den Temperaturbereich bei der HIPEC sehr viel enger und exakter zu wählen, wodurch das Nebenwirkungsspektrum deutlich besser kontrollierbar werden sollte. Auch der in dieser Arbeit erstmals gezeigte Befund, dass ausschließlich solche Substanzen zusammen mit Hyperthermie synergistisch wirken, die eine Poly-(ADP-Ribosyl)ierung induzieren, ist von großem klinischen Interesse. So ist es nun möglich, sehr viel gezielter geeignete Chemotherapeutika für die HIPEC-Anwendung auszuwählen. Die Hyperthermie-vermittelte Hemmung der Poly-(ADP-Ribosyl)ierung, die in dieser Arbeit als zentraler Mechanismus für die Steigerung der Zytotoxizität identifiziert wurde, ermöglicht erstmals auch die Identifikation alternativer Behandlungsstrategien, welche die mit erheblichen Nebenwirkungen behaftete hyper-therme Therapie ablösen könnte. Denkbar wäre nämlich die Durchführung einer normothermen IP-Chemotherapie zusammen mit systemischer PARP-Inhibitorbehandlung. Dieser Ansatz würde nicht nur das Nebenwirkungsspektrum deutlich reduzieren, er würde es darüber hinaus ermöglichen, die Chemoperfusion nicht nur einmalig zu applizieren, wie dies bei der HIPEC üblich ist, sondern wiederholt in Abständen von einigen Tagen. Aufgrund der Tatsache, dass bei dieser Therapie nur replikative Zellen erreicht werden, sollte eine wiederholte Behandlung eine deutliche Verbesserung des Ansprechens mit sich bringen.

In diesem Zusammenhang sollte in weiterführenden Arbeiten dringend geklärt werden, inwieweit die freien Tumorzellen, vor allem aber auch die kleinen Tumorabsiedlungen auf den inneren Organen im Bauchraum, tatsächlich Proliferations-aktiv sind und damit überhaupt durch diese Therapieform erreicht werden können .

Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen auch auf einen Switch der DSB-Reparatur von HR zur fehlerbehafteten NHEJ bei Kombination von PARP-Hemmung und Chemotherapie hin. Diese Verschiebung der Reparaturmechanismen, die letztlich ja sehr folgenreiche Konsequenzen nach sich ziehen, sollten sicherlich auch in weitergehenden Arbeiten durch Ko-Färbungen und Koloka-lisationsuntersuchungen von γH2AX, P-53BP1 und RAD51 weiter im Detail untersucht werden. Die beobachteten DSB sind höchstwahrscheinlich sekundäre Schäden der Replikation. So wäre es weiterhin interessant genauer zu klären, ob Zytostatika, die in erster Linie Replikationsschäden verursachen, wirklich von einer PARP-Hemmung besonders gut profitieren. Die Kombination von PARP-Hemmung mit Topotecan, welches einseitige DSB induziert, oder mit Hochdosis-Wasserstoffperoxid, durch das zweiseitige DSB entstehen, sollte sowohl bezüglich Langzeit-

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Ausblick 99

wirkung als auch molekular mittels DNA-Fiber-Assay analysiert werden. Ebenso könnte die Effizienz der PARP-Hemmung durch Mitomycin-C als hauptsächlich Intrastrang-vernetzendes-Zytostatika untersucht und mit der von PARP-Inhibition plus Cisplatin verglichen werden. Der Einsatz eines dritten Nukleotidanaloga im DNA-Fiber-Assays könnte die Frage bezüglich der weiteren Progression der Replikationsgabel nach der Zytostatika-induzierten Replikationsblockade beantworten.

Die in dieser Arbeit gezeigte Hemmung der PARylierung nach hyperthermen Zytostatika-Behandlungen ist mit großer Wahrscheinlichkeit nicht auf eine Degradation oder vollständigen Inaktivierung von PARP durch Hitze zurückzuführen. Vielmehr könnte die Bindeaffinität von PARP an verschiedenen DNA-Strukturen durch Hitze verändert werden. So konnte bereits eine posttranslationale Modifikation von PARP-1 durch Hitze gezeigt werden. In diesem Zusammen-hang stellt sich die generelle Frage nach den funktionellen Konsequenzen der wahrscheinlich zahllosen posttranslationalen Modifikationen von PARP. Strukturen, die durchaus sehr attraktive Targets für sehr zielgerichtete pharmakologische Modifikationen darstellen könnten.

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Yadav, L., Khan, S., Shekh, K., and Jena, G.B. (2014). Influence of 3-aminobenzamide, an inhibitor of poly(ADP-ribose)polymerase, in the evaluation of the genotoxicity of doxorubicin, cyclophosphamide and zidovudine in female mice. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen 770, 6–15.

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Eigene Veröffentlichungen 115

7 Eigene Veröffentlichungen

Originalarbeiten Lea Schaaf, Heiko van der Kuip, Waltraud Zopf, Marina Münch, Thomas E. Mürdter, Klaus-Peter Thon, Wolfgang Steurer, Walter E Aulitzky, ChristophUlmer. A temperature of 40°C appears to be a critical threshold for potentiating cytotoxic chemotherapy in vitro and in peritoneal carcinomatosis patients undergoing HIPEC. submitted Lea Schaaf, , Christoph Ulmer, Thomas E. Mürdter, Matthias Schwab, Walter E Aulitzky, Heiko van der Kuip. Hyperthermia acts synergistic with chemotherapy by inhibition of PARP-1 and circumvention of stalled replication. In preparation

Abstracts

L Schaaf , H van der Kuip , T Mürdter , J Schmid , W Steurer , WE Aulitzky , C Ulmer. Wirkung der in vivo erreichten Temperatur bei der HIPEC auf intrazelluläre Zytostatika-Akkumulation und Zytotoxizität. Z Gastroenterol 2014; 52 - KC156 DOI: 10.1055/s-0034-1386458

C Ulmer, L Schaaf , W Zopf , W Steurer. In-vitro/ex-vivo HIPEC-Modelle zur Therapieeffizienz-prüfung. Z Gastroenterol 2013; 51 - K359 DOI: 10.1055/s-0033-1353009

L Schaaf, W Zopf, W Steurer, WE Aulitzky, C Ulmer. Die notwendige Temperatur von 40°C zur Steigerung der Effektivität in vitro wird bei den meisten Patienten während HIPEC erreicht. Oncology Research and Treatment 2014

L Schaaf, H van der Kuip, TE Mürdter, W Steurer, C Ulmer, WE Aulitzky. Effects of hyperthermia on PARP-dependent DNA repair and survival of colon and ovarian carci-noma cells upon pulse treatment with cisplatin and doxorubicin. Oncology Research and Treatment 2014

L Schaaf, H van der Kuip, TE Muerdter, WE Aulitzky, C Ulmer. Hyperthermia potentiates cisplatin and doxorubicin effects by inhibition of PARP-dependent DNA repair. European Journal of cancer 2014/50

L Schaaf, H van der Kuip, TE Mürdter, C Ulmer, WE Aulitzky. Effects of hyperthermia on DNA repair capacity and long term survival in ovarian and colon carcinoma cells In Proceedings: AACR Annual Meeting 2014; April 5-9, 2014; San Diego, CA. Abstract no. 3787

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Eigene Veröffentlichungen 116

W Aulitzky; L Schaaf; C Ulmer; T Mürdter; H van der Kuip

Hyperthermia inhibits PARP-dependent DNA repair and thereby potentiates long-term effects of cisplatin and doxorubicin on cell survival. Keyston Symposia. Genomic Instability and DNA Repair 1.3.15-6.3.15 British Columbia Abstract no. 1108

Lea Schaaf, Heiko van der Kuip, Thomas E Muerdter, Walter E Aulitzky, Matthias Schwab, Christoph Ulmer. Hyperthermia enhances cisplatin and doxorubicin cytotoxicity by inhibition of PARP. DGPT 10.-12.3.15 Kiel

L. Schaaf, T. Leibold, M. Münch, W. Zopf, W. Steurer, WE Aulitzky, H van der Kuip, TE Mürdter, C. Ulmer. HIPEC for treatment of peritoneal carcinomatosis: 40°C is the critical threshold temperature for potentiating chemotherapy efficacy in vitro and in vivo. In Proceedings: AACR Annual Meeting 2015; April 18-22, 2015; , PA. Abstract no. 2574

Lea Schaaf, Christoph Ulmer, Wolfgang Steurer, Thomas E. Mürdter, Walter E. Aulitzky, Heiko van der Kuip. Short-term treatment with either hyperthermia or PARP inhibitor acts synergistically with the same subset of chemotherapeutics. In Proceedings: AACR Annual Meeting 2015; April 18-22, 2015; , PA. Abstract no. 3630

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8 Danksagung

Herrn Prof. Dr. Walter Aulitzky danke ich für seine Kraft zu motivieren und die vielen wertvollen Anregungen und Diskussionen. Herrn Prof. Blum danke ich für seine Bereitschaft, die Betreuung der Arbeit von Seiten der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universiätt Hohenheim zu übernehmen. Herrn Prof. Dr. Schwab danke ich für die Möglichkeit, diese Arbeit an seinem Institut anfertigen zu dürfen und seine Unterstützung in allen Belangen. Herrn Dr. Ulmer danke ich für sein Engagement und sein stetes Bestreben am Fortgang der Arbeit. Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Heiko van der Kuip für die herrvoragende Betreuung und den regelmäßigen konstruktiven und inspirierenden Austausch. Herrn Dr. Thomas Mürdter danke ich für die motivierenden Gespräche und Hilfe. Weiter danke ich allen Mitarbeitern des Instituts sowie des Robert Bosch Krankenhauses für das angenehme Arbeitsklima und die stete Hilfsbereitschaft. Besondere Dank gilt hierbei der gesamten AG Aulitzky und Dr. Jens Schmid, sowie der chirurgischen Abteilung des RBK. Nicht zuletzt danke ich meiner Familie für die stete Unterstützung