.j .,1:. -,..- . :~~~:;-::...' c". ".. _:~~:,;.:;c.:~".'~",",):~

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Una epidemia de geminivirus transmitidos principalmente un exceso de los cuatro desoxinucle6tidos trifosfatos,par moscas blancas esta atacando algunos cultivos agricolas con 10 cual se produce la replicaci6n selectiva delcon consecuencias nefastas para la economia, la sociedad y segmento de ADN de interes. Este proceso se repiteel media ambiente en Costa Ricao unas 25-30 veces 0 ciclos, 10 cual lama unas cuantas

0 . . . . horas. EI resultado es un segmento de A D N viralEn este trabaJo se reVlsan las prmclpales tecnologlas para I ' fi d . d 106 ( hn° . . . . . 0 amp 1 lca 0 aproXlma amente veces Le Inger

el estudlo de los gemmlvlrus, as! como las hlp6tesls actuales I. 1993) D b o d I .d d d o blb .I 06 d I . I . 06 et a 0' . e loa a gran canu a e varia es

so re: taxonomla y evo UCI n e os mlsmos, a organlzaci n 0 I d I 0 6 I PCR 0

0 0 mvo ucra as en a reacci n e es una tecmcadel genom a y sus funcloneso Tamblen se presentan los O

bi b o I' d I. . sensl e y un tam 10 en a guno e sus e ementos

resultados mas recientes sabre la produccl6n de plantas d bl I l o fi 0 0 o' o' pue e provocar pro emas en a amp I Icacl6nreslstentes mediante la mgemer!a geneuca. (Ausubel et aI.., 1992)0

1. TECNOLOGiAS PARA ESTUDIAR LOS Algunos de esos factores son:

GEMINIVIRUS - Pureza de los reactivos: es el parametro masLas tecnolog!as basadas en la manipulaci6n de los acidos importante cuando se amplifican muestras

nucleicos ban sido un paso importante para la detecci6n de raraso Para la mayoria de las amplificaciones,los geminivirus , aqui se describiran la tecnica de PCR y la con s610 tener reactivos de alta calidad y evitarHibridaci6n Molecular. la contaminaci6n de la enzirna, es suficiente

para obtener un buen resultado. Aun en1.1 Reaccion en cadena de la polimerasa PCR condiciones minirnas, estos agentes qu!micos

son suficientes para arruinar un PCR parKary Mullis y colaboradores desarrollaron el PCR inactivaci6n de la Taq polirnerasao

como un proceso que puede ser utilizado para generar gran - Imprimadores: un irnprimador 6ptimo deberiacantidad de capias a partir de ADN gen6mico (Ausubel hibridizar eficientemente con la secuencia deet al.., 1992). EI procedimiento initial anadia una alicuota interes y no hibridizar con otras secuenciasfresca del fragmento Klenow de la ADN polimerasa 1 de presentes en la muestra. Par esa raz6n,Eo col.i durante carla cicio, debido a que dicha enzima era muchas veces se sintetizan imprimadoresinactivada durante el subsiguiente paso de especificos para un experirnento particular.desnaturalizaci6n (Ausubel et aI.., 1992). La incorporaci6n - Muestras: la muestra se puede obtenerde la ADN polimerasa termoestable de Thermus aquaticus actualmente par media de tecnicas rapidas y

;7: (conocida como Taq polimerasa) elimin6 ese problema y simples a partir de tejidos particulares. Unfacilit6 la automatizaci6n del cicio de tratamiento termico cuidado especial que se debe tener presentedel procesoo Dos 0ligonucle6tidos son sintetizados, carla es la existencia de contaminantes presentesuno complementario a una pequefta secuencia en una en el ADN que pueden disminuir la eficienciabanda de la muestra del ADN deseadoo Estos del PCR. Estos incluyen urea, el detergente0ligonucle6tidos son utilizados como imprimadores para SDS y acetato de sodio, entre otros.la replicaci6n in vitro de ADN (Lehninger et aI.., 1993), y Extracciones organic as adicionales,son colocados en los extremos de la secuencia que se precipitaciones con etanol y/o purificaci6n enquiere amplificar. EI ADN que contiene el segmento geles de poliacrilamida pueden serdeseado se calienta para provocar la desnaturalizaci6n de beneficiosos para los resultados. Entre lasla doble helice y separarla en sus dos bandas. Luego es ventajas que la Taq polimerasa se encuentranenfriado junto con un exceso de los imprimadores su capacidad se soportar el continuo

sintetizados; par ultimo, se anade la Taq polimerasa y

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-- -- -,c~.,,-".. ".,."~ ~ "'.,.,..c c_;_?,""-:' ,~~~,-

Los Geminivirus

. . utilizar para analisis con enzimas de restricci6n

calentamiento-enfriarnlento inherente al proceso(RFLP) h . b . d . 6 . . 6 d ADN. . I n aCI n y secuenClaCI n e .

de PCR y su habilidad de smtetlzar ADN a '

temperaturas altas, 10 cual reduce la probabilidad . .. . ,de ocurrencia de uniones err6neas de 1.2 HlbrldlZaclon molecularimprimadores con la muestra y las estructuras Las tecnicas de hibridaci6n de acidos nucleicossecundarias remanentes. No obstante, hay que ha sido una herrarnienta muy util para el diagn6sticotener claro que la enzima no es indefmid~e~te de geminivirus,(Czosnek et a/.., 1988, Gilbertson et a/..,resistente al calor y, para asegurar su efi~len~la, 1991 b). Cuando una soluci6n acuosa de ADN esno se debe incluir pas~s. de desnaturallza~16n calentada a 100°C 0 es expuesta a un pH muy alto, losmas alIa de los estnctame.nte necesan.os. pares de bases complementarios son separados y laAlgunos protocolos recomlendan a~ad~rla doble helice se disocia en sus dos bandas simples. Estedespues ~el pr~er paso de desna~rahzacI6n. proceso se conoce como desnaturalizaci6n del ADN yQtra pr~pledad lmportante es su ~aJa tasa d.e er- por muchos ailos se crey6 que era un proceso irrevers-for (estlInada en tan s610 2 x 10 nucle6tldos/ ible. Sin embargo, en 1961, se descubri6 que bandascicIo). No se debe agre~ar excesos ~e dNTPs simples de ADN pueden regenerar dobles helices si semas alIa de la concentracl6n estableclda p~r los mantenian par un periodoprolongado a 65°C, A esteprotocolos, pues .a altas conce~tracl.ones proceso contrario se Ie denomin6 renaturalizaci6n 0disminuyen la cantldad de magnesia ~CtIVO y hibridizaci6n de ADN (Alberts et a/., 1994). En lasaumentan la tasa de error de la Taq pohmerasa. reacciones de hibridizaci6n existeD dos factoresCada paso del cicIo requiere un tiempo minimo limitantes: La frecuencia de c~lisiones aleatorias entrepara que el proceso. sea efectivo. Entre ?Ien.or bandas y laastringenciadelmedio (Alberts eta/., 1994).sea el tiempo .reque~ldo, mayor sera la eficle~cla. La astringencia esta detenninada por la cantidad de salEs una reac~16n ummolec~l~ que por si mls~a presente y la temperatura a la cual se encuentra el medio.es muy raplda. La especlficldad d~ ~a.tecmca A mayor temperatura y menor concentraci6n de sal,del PCR se basa en el uso de mlc~adores mayor es la astringencia.0ligonucle6tidos que son complementarios alasregio?es que li~itan a la sec~encia de ADN q~e 1.3 Hibridizaci6n en alta astringenciase quI ere arnphficar. La tecmca de PCR necesltapequefias cantidades de muestras vegetales que En este tipo de condiciones, las dos bandas quepueden ser frescas, congeladas 0 secas. EI se aparean para fonnar la doble hellce 10 haran s610 simetoda de PCR se ha utilizado para la detecci6n sus secuencias de nucle6tidos son casi perfectarnentey la detenninaci6n de variab,ilidad genetica de complementarias. La enonne especificidad de estavirus de plantas incluyendo luteovirus, potivirus reacci6n pennite localizar cualquier secuencia simpley geminivirus transmitidos por saltahojas que banda de nucle6tidos por medio de sondas marcadasinfectan plantas monocotilid6neas (Rybicki & por metodos radioactivos 0 quimicos. Sondas de esteHughes, 1990), asi como geminivirus tipo son arnpliarnente usadas para detectar los acidostransmitidos par mosca blanca tales como los nucleicos de geminivirus especificos.virus asociados al mosaico dorado del frijolBGMV (Gilbertson eta/.., 1991c) y e.l ~YL~V 1.4 Hibridizacion en baja astringencia(Navot eta/.., 1992). Durante la multlphcacl6nvirallos geminivirus produceD naturalmente una Este tipo de hibridizaci6n permite la uni6n demolecula intennedia circular de ADN doble bandas que difieren en distintos porcentajes en subanda, que se utiliza in vitro como molde para complementaridad, fen6meno que nunca sucederia sila arnplificaci6n por PCR. Secuencias virales se realizara en alta astringencia (Alberts et a/., 1994).altarnente conservadas dentro de los diferentes Una de sus aplicaciones mas importantes 10 constituyegeminivirus se pueden identificar utilizando el estudio de carnbios en las secuencias de nucle6tidosiniciadores degenerados para el PCR (Rojas et en un gen y asi detenninar los distintos procesosa/.., 1993). Estosiniciadoresdegeneradossehan evolutivos que ban llevado a la formaci6n de ese gen.usado para arnplificar fragmentos de ADN viral Si se realiza para distintos geminivrus se puedeproveniente de geminivirus que infectan tomate, confeccionar un diagrama evol~tivo de los ~enesfrijol, yl,lca, melones, chiles y malezas en todo estudiados y de su origen por mutaclones y aberraclonesel mundo. Una vez que se hall producido por estructurales con el tiempo y su influencia en laPCR fragmentos de ADN, estos se pueden divergencia de los grupos de virus.

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r Pilar Ramirez

2. TAXONOMiA Y EVOLUCION DE LOS dentro de carla uno de los tres linajes mayores de los

I GEMINIVRUS dicotogeminivirus, de acuerdo con la filogenia derivadai de la secuencia de aminoacidos de las proteinas asociadas

Segun el Comite International de Taxonomia de Virus a la replicaci6n (AL I). Los motivos de secuencia repetidos(ICTV), los geminivirus se subdivideD en 3 subgrupos difie~en en secuencia aun entre virus estrechamentebasados en su insecto vector, fango de hospederos, y relaclonados y se ban encontrado muy cerca de la supuestaestructllra del genoma (Tabla 1). El subgrupo I incluye vi- caja TAT A del gen AL 1 en todos los dicotogeminivirus.rus con genom a monopartita que son transmitidos por salta Motivos analogos fueron identificados en loshojas a plantas monocotiled6neas. El virus tipo de este monocotogeminivirus pero con un ordenamiento diferentegrupo es el MSV. Los virus transmitidos por saltahojas ya que las secuencias repetidas forman parte de la estructllrapero a plantas dicotiled6neas se agrupan dentro del en horquilla esencial para la replicaci6n de todos lossubgrupo II y el BCTV es el virus tipo de este grupo. Los miembros de la familia viral (ArgUello-Astorga, 1994).virus que pertenecen al subgrupo III tienen genom as Estos autores proponen que las secuencias repetidas sonbipartitas (excepto algunos aislamientos del TYLCV y son los sitios de uni6n especificos para las proteinas asociadastransmitidos por moscas blancas a plantas dicotiled6neas; a la replicaci6n de los geminivirus y demuestran que lael BGMV es el virus tipo de este subgrupo. El ICTV acept6 hip6tesis esta de acuerdo con los datos disponibles.

que el grupo de los geminivirus se transformara en la fa-milia Geminiviridae que comprende los 3 generos llamados Enfermedades descritas como "tomato leaf curl" (TLC)subgrupo I, subgrupo II, subgrupo III (Mayo & Martelli, y "tomato yellow leaf curl" (TYLC) se presentan en el1993) Fig I. tr6pico y el subtr6pi~0 desde America Central, basta la

regi6n mediterranea, Africa, Asia y Australia (Navot et al.,1991; Cohen & Antignus, 1994; Mehtaetal. 1994b). Estasenfermedades causan perdidas importantes en "elrendimiento del cultivo del tom ate y su severidad haaumentado en los ultimos at\os. Son causadas porgeminivirus transmitidos por moscas blancas conocidos enla literatura como "whitefly-transmitted geminivirus"(WTGs), sin embargo los genomas de los diferentesaislamientos difieren tanto en su complejidad como en susecuencia de nucleotidos. Los aislamientos de virus deTailandia y el norte de la India tienen genomas bipartitas(A D N-A, A D N-B), mientras que los aislamientos deIsrael, Cerdet\a y Australia, tienen un genoma monopartitaque parece al A D N-A. Las secuencias de nucle6tidos deestos diferentes aislamientos son muy diferentes entre sf.Los WTGs aislados de plantas de tomate de diferentesregiones geograficas muestran que tienen diferentes perfilesde epitopos, mientras que los que provienen de la misma

'.

regi6n geograficamuestran perfiles semejantes. Los autoresdeterminaron la secuencia de nucle6tidos de la moleculade A D N (equivalente al A D N-A de otros WTG) del"tomato leaf curl virus" aislado del sur de la India(ITmLCV) y los genes de la cubierta proteica de "tomato

Figllra 1. Mapa del genom a de los virus tipo de los diferentes yellow leaf curl virus" aislados de Nigeria y de dos regionessubgrupos de geminivirus: VI/AVI codifican para la proteina de de Arabia Saudita. Cuando se compar6 la secuencia decubierta, CI/ACI/ALI codifican para factores relacionados con la nucle6tidos del A D N-A del ITmLCV con las secuenciasreplicaci6n, BVI/BRI y BC1/BLI se requieren para el movimiento vi- equivalentes de los aislamientos de virus del norte de laTal. ICR regi6n intercistr6nica; CR la regi6n cornun que es identica . . .entre los componentes A y B del subgrupo III, Lazarowitz, 1992. India, se demostr6 que hay muchas dlferenclas entre los

dos aislamientos a nivel de A D N; sin embargo la secuenciaSe hizo un analisis estructllral y filogenetico de la regi6n de aminoacidos deducida, muestra que las proteinas de

intergenica de 22 geminivirus que infectan dicotiled6neas cubierta son muy semejantes. Comparando entonces las(dicotogeminivirus) y ocho que infectan monocotiled6neas proteinas de cubierta de 22 WTGs indica que existeD tres(monocotogeminivirus). El analisis permiti6 la diferentes ram as que no se relacionan por la especie deidentificaci6n de motivos de secuencia repetidos de ocho a planta hospedera y se divideD en: (1) las Americas, (2)dote nucle6tidos de largo, cuya organizaci6n (el numero, Africa y el Medio Oriente, y (3) Asia y Australia. Estosla orientaci6n y el espaciamiento) es altamente conservada resultados sugieren que la proteina decubierta de los WTGs

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Los Geminivirus

evolucion6 pOT caminos diferentes en esas tres regiones geminivirus, pero su secuencia es similar a log miembrosprincipales y que se adaptaron libremente a nuevos del subgrupo I. Padidam et al., 1995, proponen considerarhospederos en carla regi6n. POT 10 tanto log aislamientos de lag secuencias de nucle6tidos de log geminivirus como unvirus que causan enfermedades similares en log diferentes criterio import ante para su clasificaci6n y ademascontinentes no estan relacionados y entonces se pueden concluyen que el Tango de hospederos no se correlacionareconocer como especies separadas (Hong & Harrison, con lag secuencias. Este grupo propone entonces una nueva1995). estructura taxon6mica para la familia Geminiviridae segt'm

una hip6tesis evolutiva que presentan en su trabajo y queActualmente se conoce la secuencia completa de se puede resumir como en la Figura 2. Segt'm Padidam et

nucle6tidos de pOT 10 menos 36 diferentes especies de al., 1995, es posible que un geminivirus ancestral infectarageminivirus de la familia Geminiviridae (Tabla 1). Se ban monocotiled6neas, tuviera un genom a de componentehecho estudios de la variabilidad molecular de estos virus simple, es decir monopartita y fuera transmitido pOTusando la tecnica de PCR y la hibridaci6n de acidos saltahojas, 10 que podria explicar la alta variabilidad denucleicos. Con log datos acumulados es evidente que hay secuencia dentro de log virus del subgrupo I. El TYDV, esnuevos geminivirus que no se pueden clasificar en log un miembro del subgrupo I, adquiri6 mas tarde la habilidadsubgrupos I, II Y III. Muchos virus aislados de tomate en para infectar dicotiled6neas. Cambios similares puedendiferentes pafses tiene el mismo nombre TYLCV y esto se habeT facilitado al virus ancestral adquirir la capacidad depodria interpretar como que son diferentes razas de un seT transmitido pOT moscas blancas. Esto sugiere que logmismo virus. Sin embargo, algunos aislamientos de TYLCV virus con dog componentes evolucionaron mas tarde en latienen secuencias semejantes a aquellos geminivirus que escala evolutiva. El segundo componente que esta presenteinfectan a otros hospederos, asf, el TYLCV de Israel y de tambien en algunos geminivi.~s transmitidos pOT moscasCerdefta (Khey-Pour et al., 1991) no tienen el componente blanc as del Viejo Mundo y en todos log del Nuevo Mundo,B del genoma. El TYLCV de Tailandia tiene log dog debe habeT contribuido a aumentar el movimientodel vi-componentes, A y B, pero no requiere este ultimo para su rug dentro de la planta y a una eficiente transmisi6n pOT laginfecci6n. Un geminivirus recientemente aislado de una moscas blancas. El BCTV parece habeT evolucionado deplanta dicotiled6nea TYDV, es transmitido pOT salta hojas un virus monopartita del subgrupo III, pero adquiriendo lapOT 10 que stria un candidato para el subgrupo II de log proteina de la cubierta de un miembro del subgrupo I.

Familia: Gem;n;v;ridae

" . A . h .-;-:-:---' ~ ~i B . .. .Sub,amilla: tpa agelrunlvlr nae e.agemlrnvumae! ~ T ""-~-""",-,-",

Gencro Monogeminivirus Intergeminivirus Archeogemi"ivirus Neogem;n;virus

Transmitido par Transmitido par T, , "mitido par mosca Transmilido par moscasaltahojas saltahojas blal1ca blanca

[nfecta [nfecla dicotilcdoneas Infecta dicoliledoneas en [nfccta dicotiledoneas ~nmonocotiledoneas 0 el Viejo Mundo el Nuevo Mundodicotiledoneas

Genoma de componente Genoma de componente Genoma de uno 0 dos Genoma de dossimple simple componenles componentes

Especie tipo: MSV BCTV ACMV BGMV

Especies CSMV, DSV, MiSV, ICMV, MYMV, AbMV, BDMV,miembros PSV, SSV, Y WDV ToLCV(Au}, BGMV(Bz}, BGMV(Pr},

ToLCV(ln}, TYLCV(ls), PHV, PYMV, SLCV,TYLCVrSa).v TGMV.tl"MoV

Figura 2. Estructura taxon6mica propuesta para la familia Geminiviridae, Padidam et al., 1995

lOX Congreso Naciona/ Agronomico / III Congreso de .Fitopat%gia 1996

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Pilar Ramirez

Tabla I. Secuencias de geminivirus comparsdas, Padidam et al., 1995

Nombre del eminivirus Abreviaci6nSubgrupo 1 .Transmitido por saltahojas, infects monocotiledoneasChloris Striate mosaic virus, Australian isolate CSMVDigitaria streak virus, Vanuatu isolate DSVMaize streak virus, Kenyan isolate MSV-(Ke)Maize streak virus, Nigerian isolate MSV-(Ni)Maize streak virus, South African isolate MSV -(Sa)Miscanthus streak virus, Japanese isolate MiSVPanicum streak virus, Kenyan isolate PSVSugarcane streak virus, Natal isolate SSVWheat dwarf virus, Czechoslovakian isolate WDV-(CJI)Wheat dwarf virus, Swedish isolate WDV-(Sw)Transmitido por saltahojas, infects dicotiledoneasTobacco yellow dwarf virus, Californian isolate TYDVSubgrupo 11Transmitido por saltahojas, infects dicotiledoneasBeet curly top virus, Californian isolate BCTVSubgrupo 111Transmitido por mosca blanca, infects dicotiledoneas, aislamientos del Nuevo MundoAbutilon mosaic virus, West Indian isolate AbMVBead dwarf mosaic virus, Colombian isolate BDMVBean golden mosaic virus, Brazilian isolate BGMV-(Bz)Bean golden mosaic virus, Dominican isolate BGMV -(Dr)Bean golden mosaic virus, Guatemalan isolate BGMV-(Ga)Bean golden mosaic virus, Puerto Rican isolate BGMV-(Pr)Pepper huasteco virus, Mexican isolate PHVPotato yellow mosaic virus, Venezuelan isolate PYMVSquash leaf curl virus, Californian isolate SLCVTomato golden mosaic virus TGMVTomato mottle virus, Florida isolate TMoVTransmitidos por mosca blanca, infects dicotiledonas, aislamientos del Viejo MundoAfrican cassava mosaic virus, Kenyan isolate ACMV-(Ke)African cassava mosaic virus, Nigerian isolate ACMV-(Ni)Indian cassava mosaic virus, Indian isolate ICMVMungbean yellow mosaic virus, Thailand isolate MYMVTomato leaf curl virus, Australian isolate ToLCV-(Au)Tomato leaf curl virus, Indian isolate I ToLCV-(Inl)Tomato leaf curl virus, Indian isolate 2 ToLCV-(In2)Tomato yellow leaf curl virus, Egyptian isolate TYLCV -(Eg)Tomato yellow leaf curl virus, Israeli isolate TYLCV-(Is)Tomato yellow leaf curl virus, Sardinian isolate TYLCV-(Sr)Tomato yellow leaf curl virus, Sicilian isolate TYLCV-(Si)Tomato yellow leaf curl virus, Thailand isolate I TYLCV-(ThI)Tomato yellow leaf curl virus, Thailand isolate 2 TYLCV -(Th2)

3. ORGANIZACION DEL GENOMA Y replica usando moleculas intermediarias de A D N dobleFUN CION banda dentro de las celulas vegetales infectadas, La forma

del A D N viral doble banda se ensambla en nucleosomasPara disenar medidas de control por ingenieria y se transcribe dentro del nucleo de la planta infectada. La

genetic a es indispensable conocer la organizaci6n del replicaci6n y la transcripci6n de los geminivirus estagenoma de los geminivirus, las proteinas codificadas por mediada por un numero pequeno de proteinas codificadaslos diferentes genes virales, sin embargo los autores no por el virus que funcionan junto con las enzimas de la plantase haD puesto de acuerdo sobre la nomenclatura a utilizar, (Fontes et ai" 1 994a),A continuaci6n se presenta una serie de evidenciasexperimentales usando diferentes geminivirus asi como Los geminivirus que infectan plantas dicotiled6neas ylas hip6tesis mas aceptadas para explicar la replicaci6n son transmitidos por B, tabaci generalmente tienen eldel genoma viral mediante el circulo rodante, la genom a bipartito, constituido por dos moleculas de ADNdiseminaci6n dentro de la planta de los geminivirus y la simple banda circular (ADN-A y ADN-B) (Davies yfunci6n de la proteina de cubierta en la transmisi6n viral. Stanley, 1989). El genoma de los geminivirus bipartitos

L ~ , . ~ ' I ' d . d tiene una organizaci6n gen6mica comun con cuatro genesos gemmlvlrus son una laml la e ViruS e

I A D N ' I b d en la molecula ADN-A (componente A) llamados ALl,p antas cuyo genoma es un Simp e an a que se

X Congreso Nacional Agronomico 1111 Congreso de Fitopatologia 1996 II

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Los Geminivirus

AL2, AL3 Y ARI 0 ACl, AC2, AC3 Y A VI los virus bipartitas. Mutantes de C2 y C3 de BCTVrespectivamente y dos genes en la molecula ADN-B demostraron teller funciones similares a AC2 y AC3(componente};i) llamados BLl, BRI (Lazarowitz, 1992) (Hormudzi & Bisaro, 1995).. La secuencia de nucle6tidos de la regi6n comun sin em- . . . ..bargo, es diferente para los diferentes geminivirus, excepto 3.1 ~epbcaclon de ADN viral mediante elpor la secuencia que constituye el tallo del lazo clrculo rodante(Lazarowitz, 1992) Fig. 1. En la mayoria de los Este metodo de repll.cacl'6n I t .l . I. ..

b " . 0 U 1 lzan a gunosgemIlllvlrus IpartItoS se requleren ambas moleculas ADN virales Yfactores de fertil. d db t . I ~ADN A ADN B . d . I . ti . . 1 a ac enanos, e J.ago

- y. -. para III UCIr a.Ill eccl6n (GIlbertson et FX174, los plasmidos de las bacterias Gram-positivos

aJ., 1991 a, HamIlton et aJ., 1983, Stanley, 1983). y bacterias Gram-negativo asi como los parvovirus, En

La producci6n de clones virales infecciosos ha este mecanismo, la sintesis de ADN inicia con un cortepermitido a los investigadores cambiar ciertas secuencias especifico en el Origen de Replicaci6n (OR) en unade ADN de dichos clones produciendo mutantes y asi banda especifica (banda +) del circulo parental doble 0estudiar las funciones del ADN gen6mico viral. El ADN- duplex. El extremo 5' es entonces desplazado del du-A codifica para todas las funciones necesarias para la plex, permitiendo que la A D N polimerasa III afiadamultiplicaci6n viral (Elmer et aJ., 1988; Hanley-Bowdoin deoxiribonucle6tidos al -OH 3' libre. Conforme laet aJ., 1990; Rogers et aJ., 1986) y la encapsidaci6n del replicaci6n continua, el extremo 5' de la bandaADN viral (Sunter et aJ., 1987). El producto del gen AL 1 desplazada es halada bacia afuera, produciendo una colaes la unica proteina viral requerida para la multiplica:c"iOit libre de tamafio creciente, la cual pronto es cubiertaviral y esta proteina se une a la regi6n comun (Fontes et por las proteinas enlazadas al ADN simple banda. EsteaJ., 1992; Lazarowitz, 1992). Se piensa que esta uni6n proceso es llamado circulo rodante debido a que elcorta el ADN viral e inicia lamultiplicaci6n viral mediante desenrollamiento del ADN simple banda esel mecanismo del circulo rodante (Stenger et aJ., 1991). acompafiado de la rotaci6n de la molecula doble bandaLa capside proteica del BCTV se ha relacionado con la sobre su eje. La fuerza activa que mantiene eltransmisi6n por el insecto (Briddon et aJ., 1989). Se ha desenrollamiento de la cola 5' probablemente nodemostrado la asociaci6n de la molecula de ADN-A con provenga de las reacciones de polimerizaci6n quela modulaci6n de las concentraciones de la capside proteica ocurren en el extremo 3' sino del movimiento del(Etessami et aJ., 1991; SuDler et aJ., 1990) y la expresi6n complejo Pol III- primosoma 0 replisoma propulsadode los sintomas (Morris et aJ., 1992). El ADN-B codifica por sus helicasas. La elongaci6n a veces continua bastapara las funciones asociadas con el movimiento viral producir colas del mismo largo que el circulo original(Revington et aJ., 1989; Nouery et aJ., 1994). (Fig. 3).

El BCTV es el unico representante del subgrupo II delos geminivirus y su genoma codifica para cuatro protein as c.'gin

llamadas C 1, C2, C3 Y C4 que muestran diversos grados Q~ ~~'e'nde homologia con las proteinas ACl, AC2, AC3 Y AC4 + "'ond RopP'O,I;n

de l~s. ~eminivirus que s~n bipartitas. ~n ~odos los God/o; , - "-ond ~gemIlllvlrus, ACI es requendo para la repllcacl6n segun. ~Cd?' el mecanismo del circulo rodante. En el caso del TGMV, Rf

AC2 transactiva a la proteina de cubierta y al gen BRI;parece ser adema~ un regulador de la transcripci6n que 8 RF 0 RopP'O'ein

controla la expresl6n de los genes tempranos y los genestardios. Un mutante de AC2 es capaz de replicarse pero

)incap~ de infectar p~antas, pro~ab!emente por la falta de 8 :~.~N~'Y"" expresl6n de la proteIlla de mOVlmlento BRI. La proteina

AC3 aumenta los niveles de replicaci6n del A D N viral y ~un mutante de AC3 tiene de 5 a 50 veces menos A D N ~ ~( \ \viral dentro de la planta, ademas produce sintomasatenuados y tardios. En BCTV se asumi6 que las proteinas ~yn~: 0C 1, C2, C3 y C4 deberian teller funciones similares a las -E---~~<.ACl, AC2, AC3 y AC4, Y los analisis mutacionales ~:; indicaron que la proteina Cl de BCTV al igual que la

ACI es esencial para la replicaci6n del A D N viral. Sin Single" ",and

embargo, evidencias recientes sugieren que el C4 de BCTVes determinante de la sintomatologia y juega un papel mas Figura 3. Modelo hipotEtico de la replication de geminivirusimportante en la patogenesis viral que su hom610go en mediante el circulo rodante

12 X Congreso Nacional Agron6mico / III Congreso de Fitopatologia 1996

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Pilar Ramirez

Tres lineas independientes de evidencias Hanson et al., 1995, proponen que la proteina

muestran que los geminivirus reproduceD su genoma AC1(~L1)puedeestarasociadaavariasfuncionesconcircular de A D N simple banda por medio del la repllcaci6n circular: (1) dirigiendo el complejo demecanismo del circulo rodante analogo al descrito replicaci6n al origen de la replicaci6n, (2)anteriormente. Primero, la secuencia de nucle6tidos del desenrrollando la plantilla de replicaci6n como si AC 1genom a del BCTV generado por heterodimeros fuera una helicasa, (3) rompiendo el A D N para iniciarrecombinantes estao de acuerdo con la replicaci6n por la replicaci6n. del circulo rodante, (4) separar losel circulo rodante que inicia-termina la sintesis de la genomas repllcados dentro de unidades circulares

~ banda positiva del A D N dentro de la secuencia de la mon6meras y asi producir una progenie viral como sihorquilla. Esta hip6tesis es apoyada por los estudios AC1 fuera una nucleasa y/o ligasa. El AC1 es el unicocon el ACMV. Segundo, la forma intracelular que se encuadre de lectur~ necesario para la replicaci6n. Elacumula durante la infecci6n con ACMV corresponde producto de ex~resl6n de este gen se conoce como laa un intermediario de replicaci6n de los circulos proteina AC1 e mcluye una secuencia 0 motivo de uni6n

fti rodantes. Tercero, las proteinas AL 1 de los geminivirus NTP caracteristica comun a 13 geminivirus incluyendo~~.:i~' contienen ~es motivos 0 secuencias de aminoacidos que el BGMV -GA. ~os autore.s analizaron los fenotipos~,-.':"c estao relaclonados con los motivos encontrados en las cuando se produclan mutaclones en el motivo de uni6n," :" proteinas iniciadoras de la replicaci6n de dos familias N!P usand? u~ rapido y sensible ensayo de PCR que

de plasmidos bacterianos. Estas proteinas introduceD mlde la repllcacl6n de los geminivirus. Esta metodologiaun corte en una secuencia especifica de la banda positiva rue desarrollada para estos estudios. La replicaci6n enpara iniciar-terminar la replicaci6n por el circulo celulas de tabaco y la infecci6n en frijole'3 fueronrodante. La proteina AL 1 puede servir para la misma bloqueadas con algunas de las mutaciones producidas,funci6n en la replicaci6n de los geminivirus (Fontes et 10 que demuestra que el motivo de uni6n NTP de laal., 1994a). proteina AC1 es indispensable para la replicaci6n de

los geminivirus (Hanson et al., 1995).

El TGMV es un miembro de los geminivirustransmitidos pOT moscas blancas constituido pOT dos .l:Ie.yraud-Nitsc.hke et a!., 1995, proponen que loscomponentes cuyo genom a comprende dos circulos A gemmlvlrus son un sistema slJDple y unico para estudiary B de 2.6 kb. El TGMV -A Y el TGMV -B estan la replicaci6n del AD N Y las interacciones virus-plantaorganizados de maDera similar, con una regi6n : ellos usan las polimerasas del hospedero para replicarintergenica que incluye mas 0 menos 200 pares de bases su A D N Y s6lo una proteina viral es indispensable, la regi6n comUn (CR) que es altamente conservada para la replicaci6n viral. Esta proteina Rep de 41 kDaentre los dos componentes. El TGMV-A codifica para e~ta c~dificada por el gen viral AC1 en los geminivirustodas las proteinas requeridas para la replicaci6n viral blpartltas 0 C 1 en los virus monopartitas. Esta proteinael TGMV-B que no puede replicarse en la ausencia d; actila en cis sobre una regi6n intergenica que incluyeTGMV-A codifica para las proteinas relacionadas con los 200 nucle6tidos que son identicos entre un par de :el movimiento viral dentro de las plantas infectadas. genom as bipartitas, 10 que se conoce como Regi6nAnalisis mutacionales de los seis encuadres de lectura Comun. La regi6n intergenica de todos los geminivirus ~

del TGMV -A demostraron que los genes AL2 y AL3 c~ntien: una.secuencia altamente conservada, repetidacodifican para proteinas involucradas en la replicaci6n. e mvertl~a rica en GC capaz de formar una estructuraEl gen AL 1 codificala unica proteina esencial, mientras en horq~llla. Ese lazo es de 10-13 nucleotidos del largoque el gen AL3 codifica para una proteina que aumenta ~ue C?ntlene una secuencia de 9 nucle6tidos (nonamero)los niveles de acumulaci6n del A D N viral. Los mvarlable TAATATTAC. Recientemente se demostr6geminivirus que infectan dicotiled6neas muestran una por analisis geneticos y bioquimicos que esa sequenciafuerte conservaci6n de la secuencia de aminoacidos de es el origen de la sintesis del A D N viral 0 replicaci6nlas proteinas AL 1. Aunque no se conoce exactamente viral. La proteina Rep de los geminivirus inicia lala funci6n de la proteina AL I, esta proteina muestra replicaci6n en circulos rodantes por el corte dentro deluna identidad de secuencia limitada con las nonamero generando la secuencia TAATAATTendonucleasas sitio-especificas que funcionan en la AC. La proteina entonces se une covalentemen~l! &1iniciaci6n de la replicaci6n por el circulo rodante, que grupo fosfa~o 5' y al grupo 3' hidroxilo del imprimadores el mecanismo que utilizan los geminivirus para d~ la Si?tesls del A D N viral. se propone la siguientemultiplicarse. Recientemente Fontes, E. P. B. , et. al. ~lp6tesls: una vez que el A D N viral ha sido cortado es1994, demostraron que la proteina AL I del TGL V se lIberado en una reacci6n de transferencia catalizada porune especificamente a un fragmento de 52 pares de bases la protein a Rep entre la extremidad 5' fija y el nonameroen la regi6n comun (Fontes et aI., 1994b). de la banda de A D N sintetizada por una reacci6n de

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~IIIII.I- ;,~-. - .;-~;-,:

Los Geminivirus

transesterificaci6n del hidroxilo 3' de la timina 7 Los genomas A y B de los geminivirus solamentedel nonamero. La proteina Rep de los geminivirus son infecciosos en plantas cuando ambos son derivadosadem as de intervenir en la replicaci6n reconoce las del mismo geminivirus. Estudios hechos con el SqLCVsecuencias doble banda de la regi6n intergenica y y TGMV rebelaron la incompatibilidad entre los dosreprime la transcripci6n de su propio gene. Esta proteina componentes. En este estudio los autores demostrarontambien activa la expresi6n de promotor del gen de la que el TGMV y un virus estrechamente relacionadocubierta proteica en los geminivirus de las plantas como es el BGMV tambien mostraron una especifidadmonocotiled6neas. Para atribuir las diversas actividades estricta entre el componente A y B. Usando este sistemade la proteina Rep de los geminivirus a diferentes ellos examinaron la funci6n de la proteina AL 1 Yregiones de esa proteina, los autores expresaron una sugieren que el origen de replicaci6n de los geminivirusproteina de 30 kDa usando el gen C1 del WDV y una consiste de pOT 10 menos tres m6dulos funcionalesproteina de 24 kDa, usando un gen modificado para la (Fontes et al., 1994b).protein a Rep del TYLCV que es un geminivirusmonopartita que infecta monocotiled6neas. Para ambas 3.3 Diseminacion de los Geminivirus dentroproteinas se analiz6 in vitro la capacidad de coTtar y de la plantaademas se compar6 con la actividad de proteinas Repcompletas. Los autores muestran que el dominio amino Dentro de los factores que determinan el Tangoterminal de la proteina Rep es suficiente para coTtar y de hospederos de un virus esta su habilidad parapegar en el A D N del origen de la replicaci6n viral. replicarse y diseminarse en una planta hospedera

especifica. En los virus de plantas, las mutaciones queLaufs et al., 1995, describieron el uso del TYLCV afectan el Tango de hospedero demuestran que en

para estudiar el modo de acci6n de la proteina Rep de muchos casos afectaron los genes que codifican lasgeminivirus. Ellos purificaron la proteina Rep de proteinas de movimiento viral, en la literatura "viralTYLCV expresada en Escherichia coli, la que cataliz6 movement proteins" (MPs). Los estudios geneticosel corte y uni6n en el origen de replicaci6n del A D N sugieren que las MPs son esenciales para la infecci6n,viral in vitro. pero no para la replicaci6n ni la encapsidaci6n del vi-

rus. Las MPs facilitan el movimiento del virus celula a3.2 Compatibilidad entre los compo- celula y/o el movimien!o sistemico del.v~s a traves

de la planta. Los estudlos moleculares Indican que laDentes A y B MPs se pueden unir a acidos nucleicos y que se localizan

en Iii pared celular y en la membrana plasmatica dondeA continuaci6n se revisan dos ejemplos que incrementan la talla de los poros plasmodesmales entre

ilustran la estricta especificidad entre los componentes las celulas adyacentes. Los modelos hipoteticos sugierenA y B de los geminivirus bipartitas. que las MPs actlian como chaperonas del transporte del

genom a viral celula a celula, sin embargo debe seTLas razas Logan y CFH del geminivirus BCTV determinado el mecanismo pOT el cuallas MPs cumplen

poseen factores de replicaci6n del A D N cis y trans, esa funci6n, ademas de permitir que el genoma viralque son especificos y no son funcionalmente entre en el sistema vascular. El aislamiento de mutantesintercambiables. Los autores demostraron que la de MPs sugiere que existen interacciones especificasespecifidad del factor cis esta contenida comp.letamente entre estas y proteinas de la planta hospedera. El SqLCVdentro de un fragmento de 82 a 97 bp que mcluye la es un geminivirus bipartita que se encuentra restringidomayor parte del origen de replicaci6n del A D N viral. en el floema de la planta que infecta. El componente BLos autores tambien demostraron que el factor trans viral del SqLCV codifica para dos MPs, BRI Y BLl,esta localizatlo dentro de los aminoacidos del 3 al 89 con funciones diferentes segun estudios recientes. Lade la proteina de replicaci6n C I del BCTV. Los ensayos proteina BL 1 se localiza en la pared celular y en lade replicaci6n indicaron que cuando se usaron genomas membrana plasmatica igual que la MP de los virus ARNde BCTV quimericos que contenian de manera como el TMV, sin embargo con una diferencia, la MPsreciproca intercambiada los factores cis y trans de Lo- del SqLCV es incapaz de unirse a los acidos nucleicos.gaD y CFH solo se obtenia replicaci6n si los elementos Un estudio reciente con el geminivirus BDMV sugiereeran derivados de la misma raza. Dos genom as que al igual que las MPs de los virus ARN, afecta elreciprocamente quimericos con factores cis y trans tamailode los poros plasmodesmales. La proteina BR1heter610gos eran incapaces de replicarse. Estos del SqLCV se une a moleculas de A D N simple bandaresultados indican que las razas Logan y CFH de los y se localiza en el nucleo de las celulas del parenquimageminivirus del BCTV son agentes virales diferentes del floema y en las celulas compafteras en plantasaunque ambos producen la misma sintomatologia en la infectadas. Basado en estos descubrimiento se sugiri6remolacha (Choi & Stenger, 1995).

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que las protefnas BL I Y BRI tenian funciones diferentes 4. RESISTEN CIA MEDIANTEpero que act6an de maDera coordinada para facilitar e! INGIENERIA GENETICAmovimiento del genoma viral. Los autores proponenque BR1 es una protefna de transporte nuclear que A continuaci6n se describen tres ejemplos que utilizanmueve al genoma viral A D N simple banda (sb), bacia estrategias y geminivirus diferentes, a saber el gen AC2adentro y bacia afuera del nucleo, y que la funci6n de en "antisense" del TGMV, la protefna de cubierta dellaprotefnaBLI enlamembranaplasmaticayen lapared TLCV y los A D Ns subgen6micos del ACMV.consiste en faci!itar el movimiento del complejo BRI - El mejoramiento genetico del tom ate para obtener

A D N sb bacia las celulas adyacentes del floema y resistencia a enfermedades ha consistido en introducir alh~cia e~ tejido vascular para el mov~miento de l~ga tomate cultivado genes de resistencia descubiertos endls~cla. Las protefnas BL~ y BR1 tlene una funcl6n especies de tomate silvestre. Recientemente el potencialmuy lInportante para determmar el Tango de hospederos de la ingenieria genetic a para producir plantas resistentesde SqLCV (Ingham et al., 1995). a virus ha sido confirmado pOT diferentes trabajos. Plantas

de tabaco de Nicotiana benthamiana transformadas con. En contraste c~n. l?s vi~s A~, la protefn~ de el gene involucrado en replicaci6n viral AC2 del TGMV

cublerta de los gemmlvlTUs blpartltos no se requlere en la orientaci6n "antisense" ha demostrado buenos nivelesp~a la infecci6n sistemica, 10 que indica que el A D N de resistencia con TGMV (Day et al., 1991). Plantas deviral de.snudo puede moverse de celula a c.e1ula y a g~an tabaco transformadas con A D N subgen6mico del A Ddistancla dentro d~ la planta. El A D N viral se replica N-B del ACMV desarrollaron sfntomas menos severos que~entro. del nucleo y en algun ~u.n~o del proceso de la las plantas no transformadas cuando se enfrentaron almfeccl6n el A D N de los gemmlvlrus debe moverse a ACMV (Stanley et al., 1990). La protecci6n usando latrave~ de la membrana nucl~ar y d.e lo~ plasmod~smos. protefna de cubierta que ha sido muy exitosa en variosNouelry et .al., 1994, estudlaron In VI~O la funcl6n de virus ARN no parecia serlo en geminivirus, sin embargolas .p~otemas BL 1 Y BR 1, relacl~nadas co~ el en el estudio hecho pOT Kunik et al.., 1994, demostraronmovlmlen~o ~ara 1.0 cual ~xpr~saron dlchas protemas que plantas transformadas con la protefna de cubierta delen EscherIchIa colz y las mlcromyectaron en las celulas TYLCV son resistentes al virus cuando se someten avegetales. Ellos demostraron que la ~rotefna BL 1 del inoculaci6n mediada pOT moscas blancas. El experimentoBDMV se mueve de celula a celula mcrementando el consisti6 en tomar el gen de la cubierta proteica delTYLCVtamaiio de !o~ plasmodesmos del mes6filo, ayudando y ponerlo bajo el control transcriptional del promotor 35sasi al movlInl~nt? de una molecula de A D N doble del virus del mosaico de la coliflor y clonar luego en unban~a. El movlmlent~ de A D N dobl: banda y de ~ D plasmido derivado del plasmido Ti de Agrobacterium yN simple banda bacia afuera del nucleo es poslble transformar plantas de un hibrido interespecifico de tomategracias a la.acci6~ de la p~oteina B~l. Estos resultados Lycopersicon esculentum XL. Pennellii (F1) que era sen-proveen evldencla expenmental dlrecta del transporte sible a la enfermedad TYLCV. Cuando las plantasintercelular de macromoleculas dentro de la planta. transgenicas que expresaban el gen de la cubierta proteica,

fueron inoculadas con TYLCV, usando moscas blancas3.4 La transmision viral y la proteina de que se habian alimentado en plantas infectadas con

cubierta TYLCV, las plantas transgenicas respondieron mostrandoEl A DN A d I BGMV d ' fi I . sfntomas tardios y recuperandose de la enfermedad.- e co I Ica as protemas para

la replicaci6n viral y la protefna -de cubierta. Para Antignus & Cohen, 1994, hicieron el siguientedeterminar la funci6n de la capside proteica del BGMV experimento: un A D N simple banda extraido del TYLCVen la infecci6n sistemica y en la transmisi6n pOT moscas originalmente descrito, sirvi6 como plantilla para la sfntesisblancas, se introdujeron tres mutaciones en el gen de la in vitro de una forma A D N doble banda. Analisis concaps ide proteica del BGMV. Los tres mutantes diferentes enzimas de restricci6n produjo fragmentos deprodujeron infecciones sistemicas cuando se co- un peso molecular aproximado de 5.6 kb, dos veces elinoculaban con el DNA-B dentro de Phaseolus vulgaris tamafio del genoma viral. Basado en los analisis deusando una pistola para particulas que funciona como restricci6n y en los anal is is pOT hibridaci6n sugiere que elun acelerador de particulas pOT descarga electrica. Los TYLCV descrito en el cultivo estaba constituido pOT dosmutantes no son transmisibles pOT savia y no se pudo poblaciones de A D N viral que tenian pequefias diferenciasdetectar la capside proteica del BGMV cuando las en secuencias. La agroinoculaci6n del hospedero con unaplantas se infectaron con los mutantes. Ninguno de los poblaci6n de A D N viral clonado del TYLCV result6 enmutantes rue transmitido pOT las moscas blancas (Azzam una infecci6n sistemica pero con sfntomas mucho masetal., 1994). leves que los inducidos pOT el virus nativo. Analizando

los datos de secuencia de ambas poblaciones virales, la

organizaci6n

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Los Geminivirus --

del genoma del cIon leve, fue la misma que la descrita dic~ la exclusi6n de las otras formas de A D N subgen6micoanteriormente para un aislamiento israeli, sin embargo, la (Fnschmuth & Stanley, 1994).secuencia de nucle6tidos de la regi6n no codificante ,intergenica, la supuesta replicasa, y el encuadre de lectura 5. EPIDEMIOLOGIAabierto C4, tienen solo el 78, 87, y 76 % de homologiarespectivamente cuando se compara con el aislamiento del A continuaci6n se describe la transmisi6n por lasTYLCV israelita severo descrito anteriormente moscas blancas del TLCV egipcio y el reporte de una

. epidemia de BGMV en el sur de la Florida.Un miembro particular del grupo del VIruS del BCTV ,se considera el pat6geno transmitido por insecto mas La mosca blanca del camote, Bemisia tabaciimportante en la remolacha y se cree que ~s el agente c~usal (Gennadius) es una de las pestes mas importantes de losde la enfermedad "curly top" en una variedad de cultIvos. Estados Unidos del Medio Oriente y de muchas regiones

. ,La epidemiologia compleja de esta enfermedad se atribuye tropicales y subtropicales. Un nuevo biotipo de moscaa un amplio fango de hospederos que involucran cerca de blanca, el biotipo B llamado tambien mosca blanca de lacuarenta familias de dicotiled6neas y numerosas razas que hoja plateada ha causado dafios en los cultivos porcomponen la poblaci6n viral. El genom a del BCTV alimentaci6n directa y por transmisi6n de virus de plantas.comprende un unico A D N circular 10 que contrasta con la Recientemente el biotipo B de B. tabaci se estableci6 en elmayoria de geminivirus que infectan plantas dicotiled6neas, sur de los Estados Unidos y ha sido identificado tambiencuyo virus tipo es el ACMV que tiene un genoma bipartJta en Italia, en el sur de Francia, en Portugal y Grecia. LaAD N -A y AD N -B (Fig. 2). La organizaci6n del geno~a habilidad del biotipo B para transmitir geminivirus esdel BCTV es similar a la del A~MV -A aunque.los a.n~IISIS importante para la producci6n agricola. El conocimientogeneticos revelan adem as que tIene caracteristIcas umcas, del. modo de transmisi6n de los virus de planta a planta por10 que explica la ausencia del componente B. Ademas del el insecto vector es fundamental, tanto para entender laA D N gen6mico se observan A D Ns subgen6micos que epidemiologia viral como para disefiar estrategias dese produceD naturalmente en la yuca infectada con ACMV manejo. Estudios previos de la transmisi6n del TYLCVy que pueden ser mantenidos en Nicotiana benthamiana. usaron tecnicas de detecci6n viral basadas en la hibridaci6nEn esta planta tambien se produceD A D Ns subgen6micos de los acidos nucleicos. Mehta et al., 1994a, demostraroncuando se infecta con TGMV y PYMV 10 que parece indicar que para la transmisi6n de un aislamiento de TYLCVque la producci6n de subgen6micos es un hecho co~un en egipcio era necesario solamente un adulto por planta, perolos geminivirus bipartitas. Los A D Ns ~ubgen6mIcos de que la eficiencia de la transmisi6n se increment6 cuatrOACMV y TGMV integran una poblacI6n de mutantes veces cuando el numero de adultos se aument6 a cinco pordefectivos estrechamente relacionados que se ~erivan planta. B. tabaci transmiti6 el TYLCV despues de ununicamente del A D N -B Y pos~en una talla de la mIta.d d~l periodo de adquisici6n minimode quince minutos y la tasaAD N gen6mico. Cuando se reIntroduce dentro de Nlcotl- de transmisi6n se increment6 cuando los periodos deana benthamiana los dos c~mpone~tes g~n6~icos del adquisici6n se alargaban basta alcanzar un maximo las 24ACMV, los A D Ns subgen6mIcos de diCho VIruS mterfieren horas. El periodo de inoculaci6n minimo fue de quincecon la proliferaci6n viral produciendo una reducci6n en el minutos, pero la tasa de transmisi6n se increment6 cuandonUmero de plantas infectadas, atraso en el desar:rol.lo de los los periodos de inoculaci6n se hacian mas largos alcanzandosintomas, atenuaci6n de los sintomas, 10 que sIgmfica que un maximo alas doce horas de periodo de inoculaci6n. Lalos subgen6micos se comportaron como moleculas de A D cantidad de TYLCV en B. tabaci despues de un periodo deN defectivas bloqueadoras, en ingles '.'defectiv~ interfer- adquisici6n de doce horas se increment6 alcanzando uning DNA" (DI-DNA). Estas observaciones sugieren que pico alas 108 horas, y permaneciendo estable de 132 alos DI-DNA pueden ser explotados para proteger las plantas 180 horas despues del periodo de adquisici6n, estos datoscontra enfermedades causadas por geminivirus bipartitas. indican que la multiplicaci6n de virus dentro del vectorPlantas de Nicotiana benthamiana transformadas con un seria la explicaci6n mas sencilla para el incrementopedazo repetido de AD N subgen6mico, sigue siendo sus- continuo de la cantidad de TYLCV dentro del vector.ceptible a la infecci6n pero produce una mejora en lasintomatologia cuando se agro-inocula con BCTV. Las BGMV es uno de los obstaculos mas serios para laplantas transgenicas contienen unicamente dell 0 al 30% producci6n de frijol para las tierras bajas de America Latina.de la cantidad del A D N viral detectado en las plantas No habia sido reportado como econ6micamente importantecontrol no transformadas que ademas muestran s.intomas en la Florida, aunque era prevalente en islas caribeftasseveros. La mejora en la sintomatologia esta asociada con cercanas como Cuba, Jamaica, Republica Dominicana yla movilizaci6n de los A D N subgen6micos a partir de la Haiti, y Puerto Rico. La distribuci6n de BGMV se haplantilla integrada y su amplificaci6~ es aproxim.ada a.un repandido continuamente desde que se describi6 latercio de la cantidad total de A D N vIral. La amplI~cacI~n enfermedad por primera vez. Se ha repandido en variasde subgen6micos especificos en plantas transgemcas m- regiones de America Latina, como Honduras y el noreste

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d B '1 donde era desconocido anteriormente Y se ha cientificos que estan diseiiando lag medidas de control, coneraSl, '.. Ih ' .

Elconvertido en la principal enfermedad de frijol en menos el conoclml~nto y as erramlentas.necesarlas. proyectode una estaci6n. Una vez instalada, la enfermedad ha sido usa lag tecmc~s del A D N recombl~~n~e, tales como PCR,d'f'cl de controlar 0 eliminar. Las medidas de control para el clonaJe molecular de gemmlvlrus. Los clones se1 1 1 . . fi .,'

II bincluyen el uso sistemico de insecticidas 0 la regulaci6n secue.nclan y esta. m ormaclon Slrv~ para evar a ca 0del cicIo de la plantaci6n y la producci6n de hospederas estu~los fil.ogenetlcos. Se usan tar:n~I~n como sondag paraaltemativas de mosca blanca. Anteriormente un geminivirus el dl~gn6stlco molec~lar d~ ge~mlvl.rus 10 que a .su vezcon sintomas similares a log del BGMV, en un frijol perm~te efectuar estudlos epld~mloI6glcos, evaluacl6n demecanicamente inoculado, Phaseolus vulgaris L. cv. practlcas culturales y evaluacl6n de germoplasma.

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