30
I. ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE - organisme cu organizare structurală simplă, în general unicelulare - sunt formate din membrană celulară şi citoplasmă - n u prezintă nucleu şi nici organite intracelulare - multe celule procariote prezintă la exteriorul membranei un perete celular rigid, cu rol protector - genomul celulelor procariote este reprezentat de un singur cromozom, o moleculă de ADN de mari dimensiuni, de formă circulară. Forma foarte compactă a cromozomului rezultă prin suprarăsuciri şi supraspiralizări ale moleculei de ADN. - celulele procariote conţin adeseori şi una sau mai multe Fig.1 – Reprezentarea unei celule procariote

I. ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

  • Upload
    kenda

  • View
    256

  • Download
    7

Embed Size (px)

DESCRIPTION

I. ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE. organisme cu organizare structurală simplă, în general unicelulare sunt formate din membrană celulară şi citoplasmă n u prezintă nucleu şi nici organite intracelulare - PowerPoint PPT Presentation

Citation preview

Page 1: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

I. ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

- organisme cu organizare structurală simplă, în general unicelulare

- sunt formate din membrană celulară şi citoplasmă

- nu prezintă nucleu şi nici organite intracelulare

- multe celule procariote prezintă la exteriorul membranei un perete celular rigid, cu rol protector

- genomul celulelor procariote este reprezentat de un singur cromozom, o moleculă de ADN de mari dimensiuni, de formă circulară. Forma foarte compactă a cromozomului rezultă prin suprarăsuciri şi supraspiralizări ale moleculei de ADN.

- celulele procariote conţin adeseori şi una sau mai multe molecule circulare de ADN de dimensiuni mici, denumite plasmide, care se replică independent de cromozomul celulei gazdă.

Fig.1 – Reprezentarea unei celule procariote

Page 2: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

Celulele eucariote sunt mult mai mari decât cele procariote şi au o organizare mult mai complexă.

Sunt formate din membrana plasmatică şi citoplasmă în care se află organitele intracelulare şi nucleul.

Forma şi deplasarea celulelor eucariote este controlată de o reţea complexă de proteine fibroase care alcătuiesc citoscheletul.

Cea mai mare parte a materialului genetic se află în nucleu, care este înconjurat de o membrană dublă (anvelopa nucleară) ce prezintă numeroşi pori care permit transportul moleculelor spre/dinspre citosol.

Fig.2. - Reprezentarea schematică a unei celule eucariote

Page 3: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

- in celulele eucariote ADN se găseşte în nucleu fiind organizat în mai mulţi cromozomi (46 la om). - impachetarea ADN se face sub forma unei structuri nucleoproteice complexe denumită cromatină. - 50 % din masa totală a cromatinei este

reprezentată de proteine. Majoritatea proteinelor din cromatină sunt histone.

- histonele sunt proteine mici cu masa moleculară cuprinsă între 10-20 KDa. Aproximativ 30% din secvenţa histonelor este reprezentată de aminoacizi bazici, respectiv de lizină şi arginină. Prin intermediul aminoacizilor bazici histonele interacţionează foarte puternic cu molecula de ADN care are sarcină negativă, formând cromatina. Există cinci clase de histone: H2A, H2B, H3, H4 şi H1.

Fig .3.- Reprezentarea modului de dispunere a ADN bicatenar în jurul octamerilor histonici

La eucariote, genele conţin secvenţe de ADN denumite exoni (expressed regions) şi introni (intervening sequences). Eliminarea intronilor are loc prin procesul de splicing al ARN mesager. Numai informaţia genetică de la nivelul exonilor se regăseşte sub formă de aminoacizi în secvenţa proteinei codificată de gena respectivă. Discontinuitatea genelor este o trăsătură caracteristică organismelor superioare.

Page 4: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

Sinteza proteinelor are loc la nivelul ribozomilor liberi din citoplasmă sau la nivelul ribozomilor asociaţi cu membrana reticulului endoplasmatic.

Reticulul endoplasmatic are numeroase funcţii printre care se numără sinteza şi transferul lipidelor spre diferite organite, homeostazia calciului, biogeneza organitelor, plierea proteinelor şi controlul calitativ. Adiţia covalentă a zaharurilor la nivelul lanţurilor polipeptidice în curs de sinteză reprezintă una dintre cele mai importante funcţii ale reticulului endoplasmatic.

Lizozomii sunt organite mici care înmuguresc din complexul Golgi. La nivelul lor are loc degradarea unor compuşi intra- şi extracelulari. Aceste organite conţin numeroase enzime digestive care sunt responsabile de degradarea proteinelor, a acizilor nucleici, a lipidelor şi a carbohidraţilor.

Peroxizomii sunt organite la nivelul cărora se desfăşoară diverse procese metabolice cum ar fi oxidarea acizilor graşi şi detoxifierea celulelor de peroxidul de hidrogen.

Mitocondriile sintetizează ATP care este utilizat în diverse reacţii vitale pentru celulă. Aceste organite conţin ADN mitocondrial, un duplex circular cu masă moleculară mică, capabil de renaturare, care codifică proteine mitocondriale. Setul de gene din ADN mitocondrial nu este identic la toate organismele.

Page 5: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

II. FLUXUL GENETIC INFORMATIONAL

Acizii nucleici (ADN şi ARN) sunt macromolecule informaţionale care permit stocarea, transmiterea şi exprimarea mesajului genetic.

În 1950 Francis Crick a sugerat existenţa unui flux informaţional unidirecţional între ADN, ARN şi proteine. Această idee a devenit dogma centrală a biologiei moleculare.

Conform acestei dogme, atât în celulele procariote cât şi în celulele eucariote, ADN este transcris într-o moleculă de ARN mesager, apoi mesajul genetic este tradus conform codului genetic într-o secvenţă de aminoacizi corespunzătoare unui lanţ polipeptidic.

De-a lungul timpului s-a constatat că acest lucru nu este respectat întotdeauna (de ex. retrovirusurile sintetizează ADN pe matriţă ARN prin procesul de reverstranscriere).

Fig.4. - Fluxul informaţiei genetice

La procariote procesele de replicare, transcriere şi translaţie au loc în citoplasmă. Transcrierea şi translaţia se desfăşoară simultan.

În celulele eucariote, procesele de replicare şi transcriere au loc în nucleu. Biosinteza proteinelor are loc la nivelul ribozomilor din citoplasmă.

Page 6: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

III. STRUCTURA ADN

Acizii nucleici sunt formaţi din catene polinucleotidice realizate prin stabilirea de legături covalente între nucleotide. Prin hidroliza acizilor nucleici în mediu acid se formează baze azotate, pentoze şi acid fosforic.

♦ Bazele azotate care intră în compoziţia acizilor nucleici pot fi baze purinice (adenina, guanina) sau baze pirimidinice (uracil, timină, citozină).

ADN conţine timină, iar ARN conţine uracil.

♦ Pentozele se găsesc sub formă ciclică, β-furanozică.

ADN conţine D2-deoxiriboză, iar ARN conţine D2-riboză.

Nucleozidele sunt compuşi care rezultă prin stabilirea unor legături N-glicozidice între gruparea semiacetalică a pentozei şi atomul de azot din poziţia 9 al unei baze purinice sau din poziţia 1 al unei baze pirimidinice.Nucleotidele sunt esteri fosforici ai nucleozidelor la gruparea hidroxil de la atomul de carbon din poziţia 5' sau 3' din pentoză. Acizii nucleici conţin nucleozid-5-fosfaţi.

Fig.7. - Structura nucleozidelor

Fig.8.- Structura deoxinucleotidelor

Page 7: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

Fig.9. – Structura unei catene de ADN

Fig.10. - Formele A, B şi Z ale ADN

Watson şi Crick au elaborat un model tridimensional al macromoleculei de ADN: două catene polideoxiribonucleotidice antiparalele se răsucesc elicoidal şi în acelaşi sens în jurul unui ax comun formând o elice dublă cu orientare dreaptă. Inelele glucidice conectate prin legături fosfodiesterice constituie scheletul extern al dublului helix, în timp ce bazele azotate cu caracter hidrofob sunt orientate spre interior şi perpendicular pe axa helixului.

ADN poate să adopte mai multe conformaţii: - conformaţia B (descoperită de Watson şi Crick) reprezentată de o

elice dublă cu orientare spre dreapta, cu pasul de 3,6 nm, care cuprinde 10 perechi de baze azotate la nivelul unei spire;

- conformaţia A, elice dublă cu orientare dreaptă, mult mai compactă, în care pasul elicei este de 2,8 nm şi numărul de baze de la nivelul unei spire este de 11;

- conformaţia Z (zig-zag) corespunzătoare unei elice cu orientare spre stânga, numărul de baze de la nivelul unei spire este de 12, iar pasul elicei este de 4,56 nm.

Page 8: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

IV. REPLICAREA ADN

Procesul de biosinteză a ADN se numeşte replicare. În timpul procesului de replicare are loc desfacerea duplexului de ADN parental şi

sinteza unor catene complementare cu fiecare dintre cele două catene parentale, în final obţinându-se două molecule identice de ADN. Sinteza ADN se desfăşoară sub acţiunea ADN polimerazei şi începe de la nivelul unui primer ARN sintetizat sub acţiunea primazei. Replicarea începe la nivelul unor regiuni specifice de ADN denumite ORI ( origine de replicare).

Procesul de "templating" este procesul în care nucleotidele de pe o catenă de ADN sunt ”copiate” într-o secvenţă complementară de ADN sau ARN. Acest proces presupune recunoaşterea fiecărei nucleotide de pe ADN template (matriţă) de către o polimerază care va adăuga nucleotide complementare, nepolimerizate, la lanţul polinucleotidic în curs de sinteză.

Replicarea ADN este un proces semiconservativ. În urma acestui proces vor rezulta două molecule de ADN identice, fiecare conţinând o catenă nou-sintetizată şi o catenă parentală.

Replicarea ADN este un proces semidiscontinuu. Sinteza catenei complementare cu catena 3’–5’ se face continuu, în direcţia 5’→3’. Sinteza catenei complementare cu catena 5’→3’ se face discontinuu, dar tot în direcţia 5’→3’. Acest fapt a fost evidenţiat prin experimente făcute cu timidină radioactivă care a fost adăugată în timpul replicării cromozomului bacterian doar pentru câteva secunde, astfel încât numai porţiunile de ADN recent sintetizate să fie evidenţiate. S-a observat astfel existenţa mai multor secvenţe de ADN alcătuite din 1000-2000 de nucleotide (fragmente Okazaki) sintetizate numai în direcţia 5’→3’ pe una dintre catenele de ADN (3’→5’).

Page 9: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

Fig.11.- Iniţierea procesului de replicare la nivelul secvenţei ORI

Fig.12.- Replicarea ADN este un proces semidiscontinuu

Page 10: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

Dintre proteinele implicate în replicarea ADN enumerăm:I. ADN primaza catalizează reacţia de formare a primerului ARN de la nivelul căruia va începe sinteza ADN sub acţiunea ADN polimerazei. Punctul de plecare pentru sinteza fragmentelor Okazaki sunt primerii ARN. Ulterior primerii ARN vor fi îndepărtaţi şi înlocuiţi cu fragmente corespunzătoare de ADN ce vor fi reunite sub acţiunea ADN ligazei.II. Helicazele sunt proteine care se “deplasează” rapid de-a lungul moleculei de ADN separând cele două catene ale dublului helix. Pentru aceasta utilizează energia eliberată în reacţia de hidroliză a ATP.III. Topoizomerazele sunt nucleaze reversibile care se adaugă covalent la o grupare fosfat din ADN prin ruperea unei legături fosfodiesterice dintre două nucleotide adiacente. Reacţia este reversibilă. Aceste proteine desfac dublul helix de ADN înaintea complexului de proteine care realizează replicarea.IV. Proteinele de stabilizare a ADN monocatenar (proteinele SSB, single stranded binding protein) se leagă la catena de ADN expusă fără a “masca” bazele azotate care rămân astfel disponibile pentru templating. Aceste proteine stabilizează secvenţele de ADN monocatenar, prevenind formarea legăturilor de hidrogen între nucleotidele complementare şi apariţia unor structuri bicatenare în formă de “ac de păr” (hairpin), a căror apariţie ar împiedica sinteza ADN. V. ADN polimeraza adaugă dNTP-uri succesiv, la capătul 3' al unei molecule de ARN primer (10-20 de nucleotide) sintetizat de ADN primază. Reacţia decurge prin atacul

Page 11: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

nucleofil al grupării –OH de la capătul 3' al moleculei primer asupra unei molecule de dNTP aliniată în ordinea dictată de secvenţa ADN template monocatenar cu care formează legături de hidrogen. Reacţia duce la formarea unei legături fosfodiesterice şi elongarea catenei nou-sintetizate în direcţia 5'→3'. ADN polimeraza nu poate iniţia sinteza de novo a unei catene de ADN. Această enzimă are acţiune autocorectoare 3’-5’ (proofreading) îndepărtând nucleotidele greşit încorporate în catena în curs de sinteză. Acest lucru permite conservarea informaţiei genetice. Factorul de eroare pentru încorporarea greşită a unei nucleotide într-o catenă de ADN nou sintetizată este de 1/10 9 baze.VI. ADN ligaza reuneşte fragmente de ADN rezultate în urma replicării. Catalizează formarea unei legături fosfodiesterice între gruparea hidroxil de la capătul 3' al unui fragment de ADN şi gruparea 5' monofosfat a altuia. Enzima necesită prezenţa unui donor al unui rest de acid adenilic (ATP la eucariote) care se fixează la capătul 5' monofosfat al fragmentului de ADN. Prin atacul nucleofil al grupării –OH din capătul 3' al celuilalt fragment se va produce reunirea celor două fragmente de ADN.

Page 12: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

Procesul de replicare la procariote cuprinde trei etape:A.Iniţierea procesului de replicare se face la nivelul originii de

replicare oriC care conţine un situs de legare pentru o proteină iniţiator Dna A. Această proteină leagă ATP şi formează un complex macromolecular format din 30-40 de molecule în jurul căruia se va înfăşura o secvenţă a cromozomului bacterian care conţine regiunea oriC. Această etapă facilitează desfacerea unei regiuni bogate în resturi de A şi T la nivelul căreia se va leaga o altă proteină, Dna B, o helicază care va utiliza energia ATP pentru a desface dublul helix de ADN. Renaturarea ADN este prevenită de către proteinele de stabilizare a ADN monocatenar. ADN primaza va sintetiza un primer ARN de la nivelul căruia va începe sinteza unei noi catene de ADN. Replicarea va decurge apoi bidirecţional.

B.Elongarea are loc sub acţiunea ARN polimerazei III. Această polimerază este un dimer care conduce procesul de sinteză a ADN pe ambele catene parentale, ceea ce asigură desfăşurarea procesului de replicare cu aceeaşi viteză pe ambele catene. Procesul de sinteză a ADN va fi finalizat sub acţiunea ADN polimerazei I. Această enzimă are activitate polimerazică 5'→3', activitate exonucleazică 5'→3' şi activitate autocorectoare exonucleazică 3'→5'. După îndepărtarea primerilor ARN, enzima va desăvârşi sinteza între fragmentele Okazaki . ADN ligaza I va reuni fragmentele de ADN prin legături fosfodiesterice. În E. coli această enzimă utilizează NAD+ drept cofactor.

C.Terminarea procesului de replicare are loc într-o regiune opusă regiunii originii de replicare, prin intermediul unor secvenţe la nivelul cărora se leagă o proteină Tus care inhibă helicaza DnaB şi împiedică deplasarea complexului de replicare.

După finalizarea replicării are loc separarea cromozomilor sub acţiunea topoizomerazei. Fig.13. - Replicarea cromozomului bacterian

IV.1.Procesul de replicarea la procariote

Page 13: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

IV.2.Procesul de replicarea la eucariote

Replicarea la eucariote decurge cu o viteză de aproximativ 50 pb/sec. In aceste condiţii, replicarea unei molecule de ADN cromozomial ar dura aproximativ 30 de zile in celulele mamaliene. Insa iniţierea replicării are loc simultan, la nivelul unor clustere formate din 20-50 de repliconi, în momente foarte bine definite ale fazei de sinteză S, din ciclul celular.

Replicarea ADN are loc în mai multe etape, în funcţie de accesibilitatea factorilor de iniţiere la nivelul diferitelor regiuni de ADN. Replicarea ADN de la nivelul centromerelor şi telomerelor are loc în ultima etapă a fazei S.

Replicarea ADN la eucariote are loc o singură dată în decursul unui ciclu celular datorită prezenţei unor enzime denumite ADN metilaza, care metilează resturile de C din secvenţele 5'– CG –3' De la nivelul secvenţei de ADN nou-sintetizat, marcând astfel regiunile de ADN care au fost replicate.

Page 14: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

Acizii ribonucleici au funcţii şi structuri diferite în celulă :A. ARN mesager (ARNm) este sintetizat în nucleu pe baza informaţiei genetice din ADN prin

procesul de transcriere. Este o moleculă monocatenară liniară, de lungime variabilă. Succesiunea tripletelor de nucleotide (codoni) din ARNm va dicta succesiunea aminoacizilor dintr-un lanţ polipeptidic.

B. ARN de transport (ARNt) este reprezentat de molecule mici, în care raportul A + G / U + C are o valoare apropiată de 1. ARNt nuclear (nu şi cel mitocondrial) are o conformaţie în formă de “frunză de trifoi” cu patru zone de perechi complementare şi trei necomplementare expulzate în formă de buclă. La capătul 5' cele mai multe molecule de ARNt au acid guanilic. La capătul 3' prezintă secvenţa CCA.

ARNt conţine anticodonii (regiuni complementare cu codonii din ARNm). Încorporarea aminoacizilor în lanţul polipeptidic în curs de sinteză are loc pe baza recunoaşterii codon-anticodon care va duce la stabilirea unor legături de hidrogen între bazele complementare din codon şi anticodon)

C. ARN ribozomal (ARNr) – este reprezentat de molecule flexibile şi deformabile de ARN care conţin zone bicatenare care alternează cu zone monocatenare. Acest tip de ARN se găseşte în ribozomi (complexe catalitice la nivelul cărora are loc biosinteza proteinelor).

ARNr are funcţii catalitice. Termenul de ”ribozim” desemnează o moleculă de ARN care catalizează o reacţie chimică. Majoritatea acestor molecule catalizează un proces de clivare proprie, dar s-a observat că au un rol important şi în activitatea aminotransferazică a ribozomilor. Inainte de descoperirea funcţiilor catalitice ale ARNr se considera că proteinele sunt singurele molecule biologice care au funcţii catalitice. Pentru descoperirea activităţii catalitice a ARNr Thomas R. Cech si Sidney Altman au luat premiul Nobel in 1989.

D. ARN nuclear de mici dimensiuni (ARNsn) conţine un procent mare de uridină. Intră în structura unor ribonucleoproteine snRNP (U1-U6) care intervin în excizia intronilor din ARNm transcript primar.

V. ACIZII RIBONUCLEICI

Page 15: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

VI. TRANSCRIEREA

Sinteza ARN mesager se face pe baza informaţiei specificată de o secvenţă de ADN, prin procesul de transcriere. ARN mesager conţine informaţia necesară pentru sinteza unui lanţ polipeptidic. Sinteza ARN se face în direcţia 5'→3' şi este catalizată de către ARN polimerază.

Există numeroase diferenţe între sinteza ADN şi ARN:• ARN este sintetizat din ribonucleozid trifosfaţi, iar ADN din deoxiribonucleozid

trifosfaţi;• ARN conţine uracil, iar ADN conţine timină;• sinteza ARN nu presupune existenţa unui primer. ARN polimeraza poate iniţia sinteza

de novo a unei molecule de ARN dar nu are acţiune autocorectoare. Astfel, creşte rata erorilor de încorporare greşită a nucleotidelor (1/104) care este în general tolerabilă;

• sinteza ARN este foarte selectivă, numai anumite regiuni ale genomului fiind transcrise.

La procariote, procesul de transcriere are loc în citoplasmă. Transcrierea şi translaţia se fac simultan. La eucariote procesul de transcriere este mult mai complex: după sinteza ARN transcript primar în nucleu, acesta suferă o serie de modificări (splicing, 5' capping, 3'-poliadenilare) care vor duce la formarea ARN mesager matur care va fi exportat în citoplasmă unde va avea loc translaţia la nivelul ribozomilor .

La nivelul ADN există anumite secvenţe denumite secvenţe enhancers care nu au activitate de promotor, dar stimulează transcrierea anumitor gene chiar şi de la o distanţă de mai multe mii de perechi de baze de situsul de start.

Page 16: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE
Page 17: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

Etapele procesului de transcriere sunt următoarele:A. Iniţierea sintezei catenei de ARN are loc de la nivelul situsului de start prin formarea

primei legături fosfodiesterice între două NTP-uri de către ARN polimerază. ARN polimeraza se leagă la capătul 5' al unei gene într-o regiune specifică denumită promotor. Promotorul la procariote este format din două regiuni foarte bine conservate alcătuite fiecare din câte şase nucleotide –casetele – 35 (TTGACA) şi – 10 (TATAAT) – (situate la 35 de nucleotide, respectiv 10 nucleotide înaintea situsului de start (reprezentat de nucleotidele de la nivelul cărora începe transcrierea propriu-zisă).Promotorul orientează ARN polimeraza într-o anumită direcţie şi determină astfel care dintre cele două catene de ADN va servi ca template (catena antisens, negativă) pentru sinteza ARN. Cealaltă catenă de ADN se numeşte catenă codificatoare (sens, pozitivă) şi are aceeaşi secvenţă ca ARNm nou sintetizat cu excepţia faptului că ARN conţine uracil, iar ADN conţine timină.

La eucariote secvenţa TATA este localizată în poziţia – 25. Majoritatea acestor secvenţe TATA sunt incadrate de secvenţe bogate în GC. Secvenţa CAAT este situată cu aproximativ 110 nucleotide în faţa situsului de start.

Secvenţa TATA are rol cheie în asamblarea complexului de transcriere. ARN polimeraza “alunecă” de-a lungul duplexului de ADN până când întâlneşte regiunea – 35 unde formează un complex cu ADN bicatenar denumit complex închis. Polimeraza alunecă apoi în direcţia 3' până în regiunea – 10 unde începe desfacerea duplexului de ADN ceea ce are drept rezultat formarea unui complex deschis (regiunea TATA fiind bogată în A=T facilitează desfacerea ADN bicatenar). Astfel, are loc expunerea bazelor de pe catena template care vor stabili legături de hidrogen cu NTP nepolimerizate complementare (A=U, G=C).

Page 18: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

Fig.14. – Procesul de transcriere începe la nivelul situsului de start

La eucariote secvenţa TATA este localizată în poziţia – 25. Majoritatea acestor secvenţe TATA sunt flancate de secvenţe bogate în GC. Secvenţa CAAT este situată cu aproximativ 110 nucleotide în faţa situsului de start.Secvenţa TATA are rol cheie în asamblarea complexului de transcriere. ARN polimeraza “alunecă” de-a lungul duplexului de ADN până când întâlneşte regiunea – 35 unde formează un complex cu ADN bicatenar denumit complex închis. Polimeraza alunecă apoi în direcţia 3' până în regiunea – 10 unde începe desfacerea duplexului de ADN ceea ce are drept rezultat formarea unui complex deschis (regiunea TATA fiind bogată în A=T facilitează desfacerea ADN bicatenar). Astfel, are loc expunerea bazelor de pe catena template care vor stabili legături de hidrogen cu NTP nepolimerizate complementare (A=U, G=C).

Page 19: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

II. Sinteza ARNm are loc în direcţia 5'→3' până in momentul in care ARN polimeraza întâlneşte o a doua secvenţă specială – secvenţa stop – la nivelul căreia polimeraza se opreşte eliberând atât cele două catene de ADN cât şi catena de ARN nou sintetizată. Helixul ADN-ARN este format din aproximativ 12 perechi de baze. Dublul helix de ADN se reface permanent după ce o regiune este transcrisă.

III.Finalizarea procesului de transcriere se poate face prin două tipuri de mecanisme. Primul tip de mechanism este Rho-dependent şi necesită prezenţa unui factor proteic specific Rho care finalizează procesul de transcriere la nivelul unui situs specific. Proteina ρ se deplasează unidirecţional către bucla de transcriere şi desface în prezenţa ATP helixul ADN-ARN.

Al doilea mecanism este independent de proteina Rho şi implică existenţa unei secvenţe palindromice care formează o structură în formă de "hairpin" ("ac de păr") bogată în G şi C. ARN polimeraza nu mai poate să continue procesul de transcriere şi se va desprinde din complex. Hibridul ADN-ARN va disocia.

Fig.15. – Finalizarea procesului de transcriere sub acţiunea proteinei ρ

Fig.16. –Finalizarea procesului de transcriere prin sinteza unui fragment de ARNm bogat în G şi C care

formează o structură secundară bogată în G şi C

Page 20: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

MODIFICĂRILE ARNm LA EUCARIOTE

ΩProcesul de splicing al ARNmGenele conţin secvenţe codificatoare

– denumite exoni (expressed regions) şi secvenţe care nu se exprimă în secvenţa polipeptidului denumite introni (intervening sequences).

Prin procesul de splicing are loc eliminarea intronilor din ARNm şi reunirea exonilor cu formarea unei molecule de ARNm matur.

Uneori apar erori de splicing ceea ce va avea ca rezultat sinteza unor proteine mutante. Redăm în figura de mai jos două dintre mecanismele care duc la apariţia acestor erori.

Fig.17. - Procesele de splicing (A – normal, B,C-erori de splicing)

Page 21: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

ARN mesager matur este format din regiunile 5' cap, 5' UTR (untranslated region), regiunea codificatoare, regiunea 3' UTR si porţiunea poliadenilată. Regiunea codificatoare este formată din codoni care sunt decodificaţi în timpul procesului de translaţie. Regiunea codificatoare începe cu codonul start şi se termină cu codonul stop.

Fig.18. - Structura ARN mesager matur la eucariote

STRUCTURA ARNm LA EUCARIOTE

Page 22: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

Modificarea capătului 5' al ARNm (mRNA capping)

Această modificare asigură stabilitatea ARN mesager în timpul procesului de translaţie, regiunea modificată fiind foarte rezistentă la atacul exonucleazelor. Enzimele necesare acestui proces formează un complex cu ARN polimeraza II înaintea începerii procesului de transcriere. Modificarea începe imediat după ce are loc sinteza capătului 5' al transcriptului primar.

Fig. 19. - Structura capătului 5' al ARN mesager la eucariote

Regiunea 5' UTR este implicată în reglarea exportului nuclear al ARNm, protejează ARN mesager impotriva degradării, promovează translaţia şi promovează excizia intronilor aflaţi în imediata vecinătate a regiunii 5'. Rolul regiunii 5' UTR în procesul de splicing nu este foarte bine cunoscut, dar se presupune că această regiune formează o structură în formă secundară în formă de buclă şi are un rol important în reacţia cu spliceozomul care e responsabil de excizia intronilor.

Page 23: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

Regiunea 3' UTR conţine un semnal pentru poliadenilare de tipul AAUAAA care mediază clivarea transcriptului la aproximativ 30 de baze în faţa acestui semnal, proces urmat de adăugarea a 200-300 de resturi de A. Regiunea poliadenilică are un rol important în protecţia ARN împotriva degradării. În regiunea 3' UTR pot fi localizate aşa numitele elemente SECIS care direcţionează ribozomii să translateze codonul UGA ca selenocisteină.

Poliadenilarea ARNm

Fig. 19. - Poliadenilarea ARNm

Page 24: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

Reverstranscrierea reprezintă procesul de sinteză a ADN utilizând ca template o moleculă de ARN. Procesul se desfăşoară sub acţiunea unei enzime denumită reverstranscriptază care este o ADN polimerază ARN dependentă. Enzima are şi acţiune ribonucleazică hidrolizând ARN din hibridul ADN-ARN.

Retrovirusurile sunt virusuri ARN al căror genom este reprezentat de o moleculă de ARN monocatenar. O particulă virală conţine două copii ale catenei pozitive de ARN. ARN serveşte ca template pentru reverstranscriere în citoplasma celulei infectate.

Procesul este catalizat de o reverstranscriptază virală şi are drept rezultat apariţia unei molecule de ADN bicatenar. Această moleculă de ADN va fi transportată în nucleul celulei gazdă şi se va integra în genomul acesteia, ceea ce va duce la formarea provirusului. Transcrierea are loc sub acţiunea ARN polimerazei II celulare. Acest transcript ARN va fi atât ARN mesager cât şi ARN genomic ce va fi împachetat în virionii nou-sintetizaţi.

VII. REVERSTRANSCRIEREA

Fig.20. - Mecanismul de integrare al retrovirusurilor în genomul celulei gazdă

Page 25: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

VIII. SINTEZA SI STRUCTURA PROTEINELOR

Sinteza proteinelor (translaţia) are loc în citoplasmă, la nivelul ribozomilor. Ribozomii sunt complexe ribonucleoproteice alcătuite din două subunităţi, o subunitate ribozomală mare şi o subunitate ribozomală mică.

Fig.21. - Structura ribozomilor

Subunitatea ribozomală mare catalizează formarea legăturilor peptidice. Ribozomii prezintă patru situsuri de legare pentru ARN (un situs de legare a ARNm, situsul A la care se leagă aminoacil – ARNt, situsul P pentru peptidil – ARNt, situsul E – la nivelul căruia se leagă ARNt după încorporarea aminoacidului corespunzător în catena polipeptidului în curs de sinteză).

Page 26: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

Sinteza proteinelor se desfăşoară în mai multe etape:A. Iniţierea translaţiei presupune intervenţia unor factori de iniţiere (de ex. eIF2) care au rol atât în poziţionarea moleculelor aminoacil – ARNt la nivelul situsurilor A şi P, cât şi în prevenirea asocierii premature a subunităţilor ribozomale. În această etapă situsul P leagă o moleculă de aminoacil – ARNtmet (aminoacidul iniţiator la eucariote este metionina). După legarea următorului aminoacid legat de ARNt corespunzător la nivelul situsului A, conform informaţiei din ARNm, va avea loc formarea primei legături peptidice.B.Elongarea lanţului polipeptidic reprezintă adăugarea succesivă a aminoacizilor în lanţul polipeptidic în curs de sinteză. Această etapă necesită prezenţa factorilor de elongare (EF-TU la procariote, EF-I la eucariote). Aceşti factori leagă atât ARNt cât şi aminoacidul corespunzător. Catalizază hidroliza GTP la GDP după cuplarea codon-anticodon, astfel încât apare o mică pauză între cuplarea codon-anticodon şi elongarea lanţului polipeptidic ceea ce permite unei molecule aminoacil-ARNt incorect încorporate să se desprindă de pe ribozom. În acest fel se asigură fidelitatea procesului de biosinteză a proteinelor.Pentru a fi încorporat într-un lanţ polipeptidic un aminoacid va fi ataşat la o moleculă de ARNt. Ataşarea aminoacidului la o moleculă de ARNt se face în două etape prin:- interacţia aminoacidului cu ATP şi generarea aminoacil adenilatului - interacţia aminoacil adenilatului cu ARNt corespunzător sub acţiunea Aminoacil ARNt sintetazei cu formarea aminoacil-ARNt

Page 27: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

Elongarea unui lanţ polipeptidic are loc în trei etape:1) – molecula de aminoacil-ARNt se leagă la situsul A pe baza recunoaşterii codon-anticodon2) – gruparea carbonil terminală liberă a lanţului polipeptidic din peptidil-ARNt de la nivelul situsului P formează o legătură peptidică cu aminoacidul legat de ARNt corespunzător de la nivelul situsului A. Această reacţie este catalizată de PEPTIDILTRANSFERAZĂ.3) – are loc translocarea noului peptidil-ARNt din situsul A în situsul P şi ribozomul alunecă cu 3 nucleotide pe ARNm. Situsul A eliberat poate să accepte o nouă moleculă aa-ARNt.

Fig.22. - Activarea aminoacizilor

C. Terminarea sintezei proteice are loc în momentul în care ribozomul întâlneşte unul dintre codonii stop (UAA, UAG, UGA). Sub influenţa factorilor de eliberare peptidiltransferaza catalizează adiţia unei molecule de apă în locul unui aminoacid la peptidil-ARNt. Prin această reacţie este eliberat lanţul polipeptidic în citoplasmă. Ribozomul va elibera apoi molecula ARNm care va fi degradată în citoplasmă. Ulterior ribozomul disociază în cele 2 subunităţi componente care se pot asambla pe o alta moleculă de ARNm pentru a începe sinteza altei proteine.

Page 28: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

Fig.23. - Sinteza proteinelor

Page 29: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

Codul genetic reprezintă corespondenţa între secvenţa codonilor şi secvenţa celor 20 de aminoacizi care participă la formarea lanţurilor polipeptidice.

Datorită faptului că există 64 (43 ) de triplete diferite (codoni) care ar putea să codifice cei 20 de aminoacizi se spune despre codul genetic că este degenerat. De fapt, 18 din cei 20 de aminoacizi sunt specificaţi de mai multi codoni.

Codonii care specifică acelaşi aminoacid se numesc codoni sinonimi. In general, codonii sinonimi diferă numai prin nucleotida din poziţia a treia.

Metionina şi triptofanul sunt aminoacizi specificaţi de câte un singur codon.

Multă vreme s-a crezut că acest cod genetic este universal, fiind acelaşi la toate organismele. In 1980 s-a descoperit că mitocondriile utilizează un cod genetic care diferă puţin de codul universal.

IX.CODUL GENETIC

Fig.24.- Codul genetic

Page 30: I.  ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE SI EUCARIOTE

Activitatea genelor este foarte bine reglată. Operonii sunt unităţi alcătuite din gene reglatoare, situsuri de control (promotorul,

operatorul) şi gene structurale. Vom descrie în continuare operonul lac. Celulele de E. coli pot să utilizeze lactoza ca sursă de

carbon. Prezenţa lactozei în mediul de cultura induce o creştere accentuată a nivelului de expresie a trei proteine: galactozid permeaza care e implicată în transportul lactozei prin membrana celulei bacteriene, tiogalactozid transacetilaza care catalizează transferul unei grupări acetil din Ac-CoA la gruparea -OH de la C6 din galactozid şi β-galactozidaza care hidrolizează lactoza la glucoză şi galactoză.

Diverse studii au arătat că expresia celor 3 enzime este controlată de un element comun gena reglatoare i. Gena i codifică o proteină reglatoare denumită represor, care interacţionează specific cu o secvenţă de ADN denumită operator care se găseşte înaintea genelor structurale. Legarea represorului la operator previne transcrierea genelor structurale.

Fig.25. - Operonul lac

Inductorii sunt molecule care leagă represorul previnenind astfel interacţia acestuia cu operatorul. Sub acţiunea unui inductor, genele structurale (z, y, a) vor fi transcrise rezultând o moleculă de ARNm ce conţine informaţia cu privire la sinteza β-galactozidazei, permeazei şi transacetilazei. Pentru E. Coli inductorul fiziologic este alolactoza. Există însă şi inductori sintetici care nu sunt metabolizaţi. Un astfel de exemplu este IPTG (izopropiltiogalactozid).

CONTROLUL EXPRESIEI GENELOR LA PK