I parametri NMR

Il chemical shift

Accoppiamento scalare

La intensità dei segnali

Il rilassamento

Costanti di accoppiamento

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare

2J

3J

3J

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare

13C 1H

Accoppiamento scalare

13C 1H

Accoppiamento scalare

1H 13C

S I

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare omonucleare

3J HNH2J HH

Accoppiamento scalare

2J

3J

3J

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare

Sistemi di spin A2X3

Combinando insieme accoppiamenti diversi

Sistema AMX

Sistema AMX

Sistemi di spin A2X3

Combinando insieme accoppiamenti diversi

Costante di accoppiamento scalareAccoppiamento scalare

2 spin sono accoppiati per effetto di una interazione elettronica, ovvero per effetto di un legame chimicoQuesti effetto è generalmente osservabile per nuclei che distano fino a 3 legami sigma.Il fenomeno dell’accoppiamento scalare si esprime attrvaerso una constante di accoppiamento JEs HN-H 3J = 3-10 Hz

LA costante di accoppiamento scalare ha come effetto la formazione di un doppietto.Ovvero ogni spin non appare come un singolo picco ma come un doppietto, le cui componenti sono separate in Hertz, dalla costante di accoppiamento

3-10 Hz

Accoppiamento scalare e rilassamento T2

La larghezza di riga di un segnale NMR dipende dalle proprietà di rilassamento T2.

In prima approssimazione, il T2 dipende a sua volta dalle dimensione della molecola studiata.Piu’ la molecola è grande, piu’ il T2 è corto e piu’ i segnali sono larghi

In una proteina, la larghezza di riga di un Hn o di un Ha è tipicamente maggiore di 10 Hz, ovvero della separazione del doppietto.In queste condizioni, l’accoppiamento scalare non da luogo a doppietti osservabili

3-10 Hz

15 HzMW ca. 5000

20-35 HzMW. 10-20000

N

N

Importante

3J dipendono dall’angolo

diedro

INFORMAZIONE

STRUTTURALE IMPORTANTE

PER RISOLVERE LE STRUTTURE

3JHNH= Acos2 + B cos +C

Costanti di accoppiamento in sistemi uniformemente arricchiti

in 13C ed in 15N

Costanti di accoppiamento 3J

Razionale

Le costanti di accoppiamento scalare sono, da un punto di vista quantitativo, dipendenti dall’angolo diedro sotteso tra i quattro atomi coinvolti

C CH

H

StrategiaLa misura quantitativa di una costante d’accoppiamento 3J fornisce informazioni sul valore dell’angolo diedro coinvolto, ovverosia fornisce una informazione strutturale diretta

ESEMPIO:3JHnHa 3-6 Hz in eliche 9-12 Hz in foglietti

Costanti di accoppiamento

The scheme of 1J scalar couplings

Rilassamento

T1 and T2

T2 describes the time evolution of magnetization in the xy plane, where

acquisition takes place.It can be observed directly in the FID

(linewidth)

T1 describes the time evolution of magnetization in the z axis. This can only be observed if a final 90° pulse is

applied to rotate the magnetization from the z axis to the xy plane.

The intensity of the overall magnetization on the z axis is

related to the overall energy of the system . i.e. the populations of

ground and excited states

The intensity of the magnetization on the xy axis is related to the rate of dephasing

of the magnetization.

x

-y

z

B0

A Pulse x

E E

B1

x

-y

z

B0

A Pulse x

B1

x

-y

z

B0

A Pulse x

B1

x

-y

z

B0

A Pulse x

B1

x

-y

z

B0

A Pulse x

B1

x

-y

z

B0

A Pulse x

E E

x

-y

z

B0

A Pulse x

x

-y

z

B0

A Pulse x

x

-y

z

B0

A Pulse x

x

-y

z

B0

A Pulse x

x

-y

z

B0

A Pulse

E E

RilassamentoIl sistema reagisce alla perturbazione applicata per tornare all’equilibrio

Rilassamento T1

La constante di velocità con cui la magnetizzazione ritorna all’equilibrio

T1 T1 describes the time evolution of

magnetization in the z axis.

Related to the overall energy of the system

The populations of ground and excited states

x

-y

z

B0

A Pulse x

E E

B1

x

-y

z

B0

A Pulse x

B1

x

-y

z

B0

A Pulse x

B1

x

-y

z

B0

A Pulse x

x

-y

z

B0

A Pulse x

receiver

x

-y

z

B0

A Pulse x

receiver

x

-y

z

B0

A Pulse x

receiver

x

-y

z

B0

A Pulse x

receiver

x

-y

z

B0

A Pulse x

receiver

x

-y

z

B0

A Pulse x

RilassamentoIl sistema reagisce alla perturbazione applicata per tornare all’equilibrio

Rilassamento T2

La constante di velocità con cui la magnetizzazione scompare dal piano xy

My=exp(-t/T2)

T2 T2 describes the time evolution of magnetization in the XY

plane.

In addition to the exchange of energy with the environment, nuclei exchange energy one with another. This does NOT

affect the energy of the system but contributes to relaxation

It can be observed directly in the FID (linewidth)

T2 is alwayes shorter or equal to T1.

zz

yyxx

zz

yyxx

zz

yyxx

MM

BB11

90°90° tt

II

II

tt

2Tt

e

)(2

1I

The NMR spectrum The NMR spectrum

The Fourier Transform of The Fourier Transform of the the FIDFID provides the provides the NMR NMR spectrumspectrum

II 11

½ F½ Fmaxmax(())

12 T

FIDFID

SpectruSpectrumm

2Tt

II e)tisint(cos)t(f

22

2I1

2

T)(1T)(F

Da ricordare• La larghezza di riga di un segnale dipende dal valore del

tempo di rilassamento T2. Tanto piu’ T2 é lungo, ovvero tanto piu’ il sistema impiega tempo per tornare allo stato di equilibrio, tanto piu’ la riga NMR é stretta.

• Una riga stretta permette al segnale di essere osservato con maggiore accuratezza

• INOLTRE……

Da ricordare• Se un segnale ha un T2 molto

piccolo, sarà impossibile osservare gli accoppiamenti scalari perché il sistema rilassa “durante” la osservazione dell ‘effetto.

I Meccanismi di rilassamento

Campi Magnetici OscillantiCampi Magnetici Oscillanti

Anisotropia dello Anisotropia dello Spostamento Chimico Spostamento Chimico ((CSACSA))

Velocità di Rilassamento Velocità di Rilassamento 1515N N in Calbindin Din Calbindin D9K9K

0 10 20 30 40 50 60 700.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

R1 (

s-1)

Residue Number

Moti in Scala ns-ps del Moti in Scala ns-ps del Citocromo bCitocromo b55 (Fe (Fe3+3+))

Aumenta Aumenta MobilitàMobilità

Moti in Scala ns-ps del Moti in Scala ns-ps del Citocromo bCitocromo b55 (Fe (Fe2+2+))

Aumenta Aumenta MobilitàMobilità

I parametri NMR

Il chemical shiftLa intensità dei segnaliAccoppiamento ScalareIl rilassamentoAccoppiamento Dipolare

Accoppiamento scalare

Accoppiamento dipolare

Accoppiamento Dipolare

BB00

II

JJ

rr

Accoppiamento DipolareDue spin vicini nello spazio, interagiscono in misura inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza. Questo effetto è anche chiamato effetto NOE (Effetto Overhauser nucleare).

BB00

II

JJ

rr

6IJ

cIJ r

Accoppiamento DipolareDue spin vicini nello spazio, interagiscono in misura inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza. Questo effetto è anche chiamato effetto NOE (Effetto Overhauser nucleare).

BB00

II

JJ

rr

6IJ

cIJ r

Per effetto della dipendenza dalla sesta potenza, si tratta di un effetto che è molto importante quando i due spin sono vicini e che diventa trascurabile quando la distanza aumenta.

Accoppiamento DipolareDue spin vicini nello spazio, interagiscono in misura inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza. Questo effetto è anche chiamato effetto NOE (Effetto Overhauser nucleare).

BB00

II

JJ

rr

6IJ

cIJ r

L’importanza di questo accoppiamento è enorme, perché se io riesco a misurare questo effetto, ottengo una informazione quantitativa sulla distanza.

Accoppiamento dipolareA differenza dell’accoppiamento scalare, l’accoppiamento dipolare altera la popolazione dei livelli del sistema e non i valori di energia

Da un punto di vista fisico, é l’accoppiamento tra due “magneti” che

sono vicino nello spazio

Accoppiamento dipolare

Reference experiment

Saturation of signal S

Accoppiamento dipolareL’accoppiamento dipolare si ha tra due spin che sono vicini nello spazio

Si tratta della interazione tra due dipoli magnetici, tra i quali, quando essi sono vicini nello spazio, si ha uno scambio di energia

L’entità dell’effetto dipende dal campo magnetico e dalle dimensioni della molecola. Nel caso di spin 1H, l’accoppiamento dipolare si trasferisce per spin che si trovano a distanze inferiori ai 5 A.

NON si osservano doppietti

L’accoppiamento dipolare da luogo ad un trasferimento di magnetizzazione da uno spin all’altro. Questo effetto va sotto il nome di effetto NOE

Nuclear Overhauser Effect

Perturbo A Aumenta la intensità di B

Accoppiamento dipolare

L’accoppiamento dipolare è “indipendente dall’accoppiamento scalare2 spin possono essere accoppiati :-Scalarmente E dipolarmente se sono vicini nello spazio e legati da legami chimici-scalarmente ma non dipolarmente se sono legati da legami chimici ma non vicini nello spazio-dipolarmente ma non scalarmente se sono spazialmente vicini ma non legati da legamei chimici

Pensate a degli esempi, per favore

L’effetto NOE è osservabile in un esperimento NMR bidimensionale , detto NOESY(in realtà si puo’ anche osservare in esperimenti monodimensionle (1D NOE) di cui pero’ non parleremo

Accoppiamento scalare ed accoppiamento dipolare

L’accoppiamento scalare è l’accoppiamento tra spin nucleari che avviene tra atomi che sono legati da legami chimici (THROUGH BOND)E’ l’accoppiamento tra spin determinato dagli orbitali molecolari, ovvero le energie dei livelli di spin nucleari sono interdipendentiPorta alla formazione di doppietti e multipletti. Puo’ essere sfruttato per trasferire magnetizzazione da uno spin ad un altro, sfruttando il trasferimento atraverso legami chimici

L’accoppiamento dipolare è l’accoppiamento tra spin nucleari che avviene tra atomi che sono vicini nella spazio (THROUGH SPACE)E’ l’accoppiamento tra due dipoli magnetici che sono vicini tra di loroPuo’ essere sfruttato per trasferire magnetizzazione da uno spin ad un altro, in funzione della loro prossimità spaziale

Through space AND throuhg bonds

Through space

Through bond

Ricapitolando

Cosa sappiamo sulle informazioni ottenibili via NMR che possono darci

informazioni strutturali