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Università degli Studi di Torino Corso di Laurea Specialistica in Biotecnologie Molecolari
Corso di Immunologia Molecolare
Alessia Bachmann
I recettori per IL-10 e IL-9
A.A. 2006/2007
Recettoreper l’ Interleuchina 10
Espressione di IL-10R• Tessuti non ematopoietici
• Milza, timo e PBMC alti livelli
poco
Cellule dendritiche
• Altre cellule: oligodendrociti epidermiche
Thomson AW and Lotzze MT, The Cytokine Handbook, 1:603 Fourth Edition (2003)
macrofagi
linfociti T e B
neutrofilimonociti
cellule NK
Caratterizzazione di IL10-R• cDNA di IL-10R1 murino isolato da linee di macrofagi e mast cell mIL-10R1 mRNA codifica per un polipeptide di ~110 KDa
• cDNA di IL-10R1 umano isolato da library di cellule di linfoma hIL-10R1 mRNA codifica per una proteina di 90-110 KDa
• le sequenze aminoacidiche murine e umane sono identiche per il 60% e simili per il 73%
• IL-10R umano è specie-specifico; IL-10R murino lega sia IL-10 di topo sia di uomo
• IL-10R2 inizialmente clonato come recettore orfano; nel 1997 si scoprì che era la seconda catena essenziale nel complesso IL-10R
Donnelly RP et al, The expanded family of class II cytokines that share the IL-10 receptor-2 (IL-10R2) chain, J Leukoc Biol, 76: 314, 2004
Thomson AW and Lotzze MT, The Cytokine Handbook, 1:603, Fourth Edition (2003)
Struttura di IL-10R• Appartiene alla classe II della famiglia dei recettori per le citochine
• E’ un eterodimero composto da due catene molto simili tra loro: IL-10R1 e IL-10R2, quest’ultima è condivisa con recettori per altre citochine
Pletnev S et al, BMC Struct Biol, A model of the ternary complex of interleukin-10 with its soluble receptors, 28: 10, 2005
Donnelly RP et al, The expanded family of class II cytokines that share the IL-10 receptor-2 (IL-10R2) chain, J Leukoc Biol, 76: 314, 2004
•Entrambe hanno un dominio extracellulare di 200aa, un’elica transmembrana di 20aa e un dominio intracellulare che contiene 322aa (IL-10R1) o 62aa (IL-10R2)
IL-10R1 ha costanti di legame nanomolari per IL-10
IL-10R2 ha poca affinità per l’IL-10; stabilisce invece un legame migliore con il complesso binario IL-10/IL-10R1
..Premesse..
..Conseguenze..
Yoon SI et al, Conformational changes mediate IL-10R2 binding to IL-10 and assembly of the signaling complex, J Biol Chem, 2006 Sep 18; [Epub ahead of print]
Zdanov A, Structural features of the interleukin-10 family of cytokines, Curr Pharm Des,10: 3873, 2004
E’ stato dimostrato:
Si è potuto invece studiare e cristallizzare il complesso IL-10/sIL-10R1
E’ difficile, se non impossibile, ottenere un complesso ternario IL-10/IL-10R1/IL-10R2 stabile capace di cristallizzare
Zdanov A, Structural features of the interleukin-10 family of cytokines, Curr Pharm Des,10: 3873, 2004
Pletnev S et al, BMC Struct Biol, A model of the ternary complex of interleukin-10 with its soluble receptors, 28: 10, 2005
Studio dei recettori solubili
Pletnev S et al, BMC Struct Biol, A model of the ternary complex of interleukin-10 with its soluble receptors, 28: 10, 2005
Struttura del complesso IL-10/sIL-10R1/sIL-10R2
Molecola caratterizzata da una duplice simmetria nella quale ogni dominio di IL-10 è legato a 2 catene di recettore
In soluzione la stechiometria del complesso è 2IL-10:2sIL-10R1:2sIL-10R2
E’ stato dimostrato con la tecnica FRET (fluorescence resonance energy transfer), potente strumento per determinare se due molecole interagiscono nelle cellule vive, che:
• le catene IL-10R2, costitutivamente espresse, sono associate in membrana nel complesso recettoriale dell’ IL-10
• IL-10R1 e IL-10R2 sono pre-assemblate nella membrana cellulare anche in assenza del ligando IL-10
Krause CD et al, Interactions among the components of the interleukin-10 receptor complex, Biochem Biophys Res Commun, 340:377, 2006
L’interazione tra IL-10R1 e IL-10R2 è comunque relativamente debole: la cellula è così sensibile simultaneamente a molti ligandi i cui recettori utilizzano la catena IL-10R2
Interazioni tra le catene recettoriali
Attraverso studi di mutagenesi, di legame e di cristallografia è stato dimostrato che:
Poiché IL-10R1 e IL-10R2 sono associati in membrana, IL-10R2 regolerebbe la rapida attivazione o inattivazione del segnale indotto dall’ IL-10
Nel complesso IL-10/IL-10R1 il recettore media un cambiamento conformazionale su IL-10 che permette il legame produttivo di IL-10R2
Yoon SI et al, Conformational changes mediate IL-10R2 binding to IL-10 and assembly of the signaling complex, J Biol Chem, 2006 Sep 18; [Epub ahead of print]
Assemblaggio del complesso ternario
E’ confermato il meccanismo sequenziale di assemblaggio del complesso recettoriale
Trasduzione del segnale
Kotenko SV and Langer JA, Full house: 12 receptors for 27 cytokines, Int Immunopharmacol, 4: 593, 2004
JAK1 e Tyk2 sono costitutivamente legati rispettivamente a IL-10R1 e IL-10R2
Attivazione di JAK1 e Tyk2 che fosforilano le Tyr 427 e 477 di IL-10R1
Queste stesse tirosine fosforilate di IL-10R1 reclutano STAT 3
Dimeri di STAT3-P traslocano nel nucleo dove si legano alla Gamma-activated sequence (GAS)
Murray PJ, Understanding and exploiting the endogenous interleukin-10/STAT3-mediated anti-inflammatory response, Curr Opin Pharmacol, 6: 379, 2006
L’ IL-10 può:
• ridurre selettivamente l’espressione di set di geni
• bloccare l’espressione di geni attraverso un meccanismo generale (blocco FT o induzione RNasi)
Azione anti-infiammatoria
~15-20% dei geni indotti dal LPS
Murray PJ, Understanding and exploiting the endogenous interleukin-10/STAT3-mediated anti-inflammatory response, Curr Opin Pharmacol, 6: 379, 2006
…Come i patogeni sfruttano il pathway di IL-10…
… ci sono ancora tante domande …
Quali sono precisamente i geni regolati dall’ IL-10 che mediano l’AIR?
Come fanno i prodotti dei geni attivati da IL-10 a regolare così tanti target infiammatori?
Molte citochine attivano STAT3, ma solo IL-10 sembra attivare il pathway dell’AIR. Qual è la differenza tra IL-10 e le altre citochine che attivano anch’esse STAT3?
La regolazione della risposta anti-infiammatoria da parte di IL-10 avviene solo nei macrofagi e nelle cellule dendritiche o è più diffusa?
Come si può sfruttare il pathway endogeno anti-infiammatorio per curare l’infiammazione cronica e acuta in diverse malattie?
Murray PJ, Understanding and exploiting the endogenous interleukin-10/STAT3-mediated anti-inflammatory response, Curr Opin Pharmacol, 6: 379, 2006
Recettoreper l’ Interleuchina 9
Caratterizzazione di IL9-R• IL-9R murino, scoperto nel 1990, è un polipeptide di 468 aa
• IL-9R umano è una proteina di 522 aa con il 53% d’identità con la molecola presente nel topo
Thomson AW and Lotzze MT, The Cytokine Handbook, 1:347, Fourth Edition (2003)
• Nell’uomo, invece, ci sono almeno 4 pseudogeni con ~90% di omologia con il gene di IL-9R, il quale è localizzato nella regione subtelomerica dei cromosomi X e Y
• Nel topo, il gene per IL9-R è presente in singola copia ed è composto da 9 esoni e 8 introni
• Sono stati identificati mRNAs di IL9-R che non hanno la sequenza codificante per i domini transmembrana e citoplasmatici, risultato di uno splicing alternativo; è un evento raro
Li X, The common gammac-cytokines and transplantation tolerance, Cell Mol Immunol, 1:167, 2004
• E’ un recettore eterodimerico composto da una catena specifica α e dalla catena γ, che è condivisa con recettori per altre interleuchine (IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, IL-21)
Struttura di IL-9R
• IL-9Rα appartiene alla superfamiglia dei recettori per l’ematopoietina di tipo I caratterizzati dalla mancanza di attività tirosin-chinasica
• IL-9Rα lega IL-9 con alta affinità ma non è capace di mediare da sola il segnale
Knoops L and Renauld JC, IL-9 and its receptor: from signal transduction to tumorigenesis, Growth Factors, 22:207, 2004
Trasduzione del segnale
Knoops L and Renauld JC, IL-9 and its receptor: from signal transduction to tumorigenesis, Growth Factors, 22:207, 2004
• In seguito al legame dell’ IL-9, si attivano le JAK che fosforilano IL-9Rα attivando così i pathway di segnalazione
• JAK1 e JAK3 sono costitutivamente legate rispettivamente a IL-9Rα e γc
• le JAK si legano a una regione ricca in prolina chiamata BOX1
1) STAT
Knoops L and Renauld JC, IL-9 and its receptor: from signal transduction to tumorigenesis, Growth Factors, 22:207, 2004
Per l’attivazione di STAT sono necessarie due regioni nel dominio citoplasmatico di IL-9Rα:
- Il BOX1(ricco in prolina) al quale si associa JAK1
- La tyr 407 che, una volta fosforilata, recluta i fattori STAT-1, -3 e -5
Le molecole di STAT-P dimerizzano e migrano nel nucleo, dove regolano l’espressione di geni target
2) IRS e PI3 Kinase
Knoops L and Renauld JC, IL-9 and its receptor: from signal transduction to tumorigenesis, Growth Factors, 22:207, 2004
Le proteine IRS-1 e IRS-2 (insulin receptor substrate) contengono i domini:
- PTB (protein tyrosine binding)
- PH (pleckstrin homology)
- e siti per la fosforilazione di tyr e ser/thr
In seguito alla fosforilazione delle tirosine, le IRS reclutano proteine segnale contenenti il dominio SH2, come p85 (subunità regolatoria della PI3K), Grb-2 e PLCγ
3) MAP kinases
Knoops L and Renauld JC, IL-9 and its receptor: from signal transduction to tumorigenesis, Growth Factors, 22:207, 2004
In realtà non si conosce ancora la proteina scaffold che unisce IL-9R alla cascata delle MAPK
Il legame di IL-9 induce il reclutamento e la fosforilazione della proteina adattatrice SHC, la quale lega cosi Grb2
Grb2 porta poi in membrana lo scambiatore SOS, che attiva RAS, quindi RAF, MEK…..
Down-regolazione del segnale
Degradazione di IL-9R attraverso il pathway ubiquitina-proteosoma
Knoops L and Renauld JC, IL-9 and its receptor: from signal transduction to tumorigenesis, Growth Factors, 22:207, 2004
Attivazione di fosfatasi
L’IL-9 stessa induce l’espressione di 3 membri della famiglia dei soppressori SOCS: cytokine-inducible SH2-containing
protein (CIS), SOCS2 e SOCS3
Dalla crescita dipendente da IL-9 alla proliferazione tumorale autonoma: 2 modelli sperimentali
Knoops L and Renauld JC, IL-9 and its receptor: from signal transduction to tumorigenesis, Growth Factors, 22:207, 2004
A: Dopo settimane di coltura, da cellule responsive all’IL-9 si possono ottenere cellule-T indipendenti dalle citochine altamente tumorigeniche in vivo
B: Cellule dipendenti da IL-9 trasfettate con IL-9R mutato (senza la tyr 407), possono, anche se con minor frequenza, dare origine a cellule tumorali indipendenti dalle citochine
• Thomson AW and Lotzze MT, The Cytokine Handbook, Fourth Edition (2003)
• Pletnev S et al, A model of the ternary complex of interleukin-10 with its soluble receptors, BMC Struct Biol, 28:10, 2005
• Donnelly RP et al, The expanded family of class II cytokines that share the IL-10 receptor-2 (IL-10R2) chain, J Leukoc Biol, 76:314, 2004
• Yoon SI et al, Conformational changes mediate IL-10R2 binding to IL-10 and assembly of the signaling complex, J Biol Chem, 2006 Sep 18; [Epub ahead of print]
• Zdanov A, Structural features of the interleukin-10 family of cytokines, Curr Pharm Des,10:3873, 2004
• Krause CD et al, Interactions among the components of the interleukin-10 receptor complex, Biochem Biophys Res Commun, 340:377, 2006
• Renauld JC, Class II cytokine receptors and their ligands: key antiviral and inflammatory modulators, Nat Rev Immunol, 3:667, 2003
• Williams LM et al, Interleukin-10 suppression of myeloid cell activation--a continuing puzzle, Immunology, 113:281, 2004
• Kotenko SV and Langer JA, Full house: 12 receptors for 27 cytokines, Int Immunopharmacol, 4:593, 2004
• Murray PJ, Understanding and exploiting the endogenous interleukin-10/STAT3-mediated anti-inflammatory response, Curr Opin Pharmacol, 6:379, 2006
• Li X, The common gammac-cytokines and transplantation tolerance, Cell Mol Immunol, 1:167, 2004
• Knoops L and Renauld JC, IL-9 and its receptor: from signal transduction to tumorigenesis, Growth Factors, 22:207, 2004
Bibliografia