UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Danilo G. Penić

Identifikacija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz

peglane kobasice

MASTER RAD

Niš, 2018.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Identifikacija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz

peglane kobasice

MASTER RAD

Kandidat: Mentor:

Danilo Penić Prof. dr Nataša Joković

Niš, 2018.

UNIVERSITY OF NIS

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

Identification of lactic acid bacteria isolated from

“peglana” sausage

MASTER THESIS

Candidate:

Mentor:

Danilo Penić

PhD Nataša Joković

Niš, 2018.

Zahvalnica

Svojoj mentorki, dr Nataši Joković, izražavam najdublju zahvalnost za svu

pomoć, vođstvo i beskrajno strpljenje koje mi je pružila tokom studijsko-

istraživačkog rada. Ovaj master rad ne bi bio finalizovan da nije bilo Vaše vere

u moje ideje i mogućnosti.

Takođe, zahvaljujem se i dr Zorici Stojanović-Radić, kao i asistentu Nikoli

Stankoviću, na pruženoj podršci i nesebičnoj pomoći pri radu.

Hvala mojim roditeljima. Pored toga što ste mi pružili primer, ukazivali ste mi

beskonačno poverenje tokom čitavog ovog procesa.

Očevima mojih roditelja, koji su, iako više nisu sa mnom, uvek bili moja

najvatrenija publika i neprekidni podstrek, pored poštovanja, dugujem i večitu

zahvalnost.

Hvala svima.

Biografija

Ime i prezime:

Danilo Penić

Datum roĎenja:

23. 03. 1993.

Mesto roĎenja:

Pirot

Osnovna škola:

,, 8 septembar “ Pirot (2000 – 2008)

Srednja škola:

Gimnazija ,, Gimnazija

Pirot (2008 – 2012)

Pirot “

Fakultet:

Prirodno-matematički fakultet u Nišu,

departman za biologiju i ekologiju

(2012 – 2018)

Osnovne akademske studije:

smer biologija (2012 – 2015)

Master akademske studije:

smer biologija (2015 – 2018)

Sažetak

Pirotska peglana kobasica je vrsta fermentisanih kobasica koja se proizvodi tradicionalnim

postupkom na teritoriji opštine Pirot. Pripada grupi suvo fermentisanih kobasica i proizvodi

se od goveĎeg, ovčjeg i kozijeg mesa. U cilju utvrĎivanja promene mikroflore bakterija

mlečne kiseline tokom 60 dana zrenja peglane kobasice, analizirana su 2 uzorka peglanih

kobasica u različitim fazama zrenja, kao i nadev od kojih su kobasice proizvedene. Dobijeni

izolati su fenotipskim testovima okarakterisani i podeljeni u različite grupe. OdreĎeni broj

izolata iz svake fenotipske grupe je dalje identifikovan molekularnim metodama, rep-PCR

metodom sa (GTG)5 prajmerom i sekvenciranem DNK. Iz analiziranih uzoraka izolovano je

58 izolata bakterija mlečne kiseline i dva izolata koja pripadaju rodu Staphylococcus. Izolati

bakterija mlečne kiseline svrstani su u 6 grupa na osnovu fenotipskih testova. Molekularnom

identifikacijom izolati su identifikovani do nivoa vrsta Lactobacillus sakei, Lactobacillus

curvatus, Carnobacterium maltaromaticum, Carnobacterum divergens, Weissella viridescens

i Leuconostoc mesenteroides. Izolati identifikovani kao Lactobacillus sakei izolovani su iz

svih analiziranih uzoraka i predstavljaju dominantnu mikrofloru peglanih kobasica.

Ključne reči: pirotska peglana kobasica, bakterije mlečne kiseline, molekularna identifikacija

Abstract

“Peglana” sausage is a type of fermented sausage produced by the traditional process in the

territory of the municipality of Pirot. It belongs to a group of dry fermented sausages and it is

produced from beef, sheep and goat meat. In order to determine the change in lactic acid

microflora in “peglana” sausage during 60 days of fermentation, two samples of fermented

sausages in different stages of ripening were analyzed, as well as mixture of meat and spices

of which sausages were produced. The obtained isolates were phenotypically tested and

divided into different groups. The isolates from each phenotypic group were further identified

with molecular methods, a rep-PCR method with (GTG)5 primer and DNA sequencing. Fifty

eight isolates of lactic acid bacteria and two isolates belonging to the genus Staphylococcus

were isolated from the analyzed samples. Isolates of lactic acid bacteria were classified into 6

groups based on phenotypic tests. The isolates were identified as Lactobacillus sakei,

Lactobacillus curvatus, Carnobacterium maltaromaticum, Carnobacterum divergens,

Weissella viridescens and Leuconostoc mesenteroides by molecular methods. Lactobacillus

sake isolates were isolated from all the analyzed samples and represent the dominant

microflora of fermented sausages.

Key words: “Peglana” sausage, lactic acid bacteria, molecular identification

Sadržaj

1. UVOD .................................................................................................................................... 1

1.1 Fermentisana hrana ....................................................................................................... 2

1.2 Fermentisane kobasice ................................................................................................... 3

1.3 Podela kobasica ............................................................................................................... 8

1.4. Peglana kobasica ............................................................................................................ 9

1.5 Mikroflora kobasica ..................................................................................................... 11

2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA .............................................................................................. 14

3. MATERIJAL I METODE ................................................................................................ 15

3.1. Materijal ....................................................................................................................... 15

3.1.1. Uzorci...................................................................................................................... 15

3.1.2. Medijumi za gajenje mikroorganizama .............................................................. 15

3.2. Metode .......................................................................................................................... 16

3.2.1. Izolacija bakterija mlečne kiseline....................................................................... 16

3.2.2. Fenotipska karakterizacija izolata ...................................................................... 16

3.2.3. Molekularna identifikacija izolata ....................................................................... 17

3.2.4. Tehnološka karakterizacija izolata ..................................................................... 17

4. REZULTATI I DISKUSIJA ............................................................................................. 19

4.1. Ukupan broj bakterija ................................................................................................ 19

4.1.1. Fenotipska identifikacija izolata .......................................................................... 20

4.2. Molekularna identifikacija izolata ............................................................................. 21

4.3. Mikroflora analiziranih uzoraka ............................................................................... 24

5. ZAKLJUČCI ...................................................................................................................... 26

6. LITERATURA ................................................................................................................... 27

1

1. UVOD

Fermentacija biljnih i ţivotinjskih sirovina postojala je pre prvih pisanih istorijskih

zapisa. Sama svrha fermentacije je da poboljša organoleptička svojstva hrane i poveća joj

nutritivnu vrednost, a samim tim i da spreči razvijanje patogenih mikroorganizama i

mikroorganizama koji dovode do kvarenja hrane. Fermentisana hrana je funkcionalnija jer je

moguće duţe je odrţati bez rashlaĎivanja (Hesseltine i Wang, 1980). MeĎu hranom od

fermentisanog mesa izuzetnu tradiciju imaju kobasice. Prvi podaci o kobasicama zabeleţeni

su na sumerskom tlu, današnji juţni Irak, 3000 p.n.e. Dosta kasnije nailazimo na podatke da

su u kineskom carstvu pravili kobasice od kozijeg i ovčjeg mesa. Na evropskom tlu kobasice

su, takoĎe, bile popularne meĎu drevnim Grcima i Rimljanima, čak je Homer napisao jednu

komediju pod nazivom "Kobasica" (Lucke, 1974).

Prema Pravilniku o kvalitetu usitnjenog mesa, poluproizvoda od mesa i proizvoda od

mesa (Sl. glasnik RS, broj 31/2012), fermentisаne kobаsice su proizvodi dobijeni od mesа

domаćih pаpkаrа i kopitаrа prve i druge kаtegorije, mesа ţivine prve kаtegorije i mesа

divljаči, mаsnog tkivа i dodаtаkа, koji se posle punjenjа u omotаče konzervišu postupcimа

fermentаcije i sušenjа, odnosno zrenjem, sа ili bez dimljenjа. Dodаci zа fermentisаne

kobаsice mogu dа budu kuhinjskа so, zаčini, ekstrаkti zаčinа, аditivi, аrome dimа, šećeri i

stаrter kulture, а zа fermentisаne kobаsice koje se u promet stаvljаju kаo funkcionаlnа hrаnа i

dijetnа vlаknа, inulin, omegа-3 mаsne kiseline i uljа bogаtа ovim kiselinаmа, fitosteroli,

prirodni аntioksidаnsi, vitаmini i minerаlne mаterije.

Danas na trţištu postoji čitav spektar različitih fermentisanih kobasica kao posledica

različitih recepata, sirovina i začina. Glavni faktori koji dovode do proizvodnje specifično

profilisanih kobasica sa jedinstvenim organoleptičkim svojstvima i fizičko-hemijskim

karakteristikama su praksa i tehnike fermentacije. Fermentacija kobasica je mikrobiološki

proces gde su mikroorganizmi, prevashodno bakterije mlečne kiseline, odgovorni za

transformaciju početne sirovine. Balkan, zemlje koje su juţnije sa umerenom klimom i

mediteranska područja, plodno su tlo za proizvodnju fermentisanih kobasica koje imaju pH

od 5,3-6,2 i malu količinu vlage u sebi (Talon, Leroi, i Lebert, 2007). Na tlu naše zemlje,

preteţno u ravničarskim krajevima, proizvode se "sirove-osušene" kobasice uţeg dijametra

(npr. Sremska kobasica) i šireg dijametra (npr. kulen). U brdovitom i planinskom delu naše

zemlje proizvode se fermentisane kobasice od goveĎeg mesa uskog dijametra pod nazivom

"sudţuk" i peglane kobasice. MeĎu ovim kobasicam izuzetno interesantna je peglana

kobasica koja se proizvodi od više vrsta mesa.

2

Peglana kobasica je fermentisana suva kobasica koja se proizvodi u jugoistočnoj

Srbiji, tačnije u Pirotu. Kako se peglana kobasica proizvodi tradicionalnim postupkom u

kućnoj radinosti, krajnji proizvod nije standardizovanog kvaliteta. Ovaj vrhunski specijalitet

je napravljen od najkvalitetnijeg mesa domaćih ţivotinja sa dodatkom prirodnih začina. Ceo

proizvodni proces moţe da traje i do 60 dana.

Trajne fermentisane kobasice zauzimaju značajno mesto u gastronomskoj kulturi

Srbije, osim karakterističnog mirisa i ukusa, glavna osobina im je da imaju produţeni rok

trajanja. Ovakve kobasice se pripremaju po posebnoj recepturi u tradicionalno domaćoj

radinosti čime dobijaju na vrednosti. Budući da je potraţnja za hranom koja nosi oznaku

autentično ili tradicionalno evidentno povećana, peglana kobasica moţe da se uvrsti kao

lokalno ili regionalno kulturološko nasleĎe.

Različiti izvori sirovine, uslovi proizvodnje, sezonski karakter i različiti izbor

dodataka začina često rezultiraju različitim organoleptičkim i mikrobiološkim neujednačenim

sastavom i kvalitetom finalnog proizvoda. Zbog načina proizvodnje u kome se ne koriste

starter kulture, organoleptička svojstva i mikrobiološka stabilnost spontano fermentisanih

kobasica zavise od metaboličke aktivnosti prirodno prisutnih grupa bakterija mlečne kiseline

(BMK).

1.1 Fermentisana hrana

Fermentisana hrana predstavlja tip hrane u kojoj rastom mikroorganizama i njhovim

metaboličkim delovanjem dolazi do konverzije organskih jedinjenja iz supstrata u produkte

metabolizma. Kod većine fermentisane hrane proces fermentacije vrše mikroorganizmi

svojim rastom i metaboličkim delovanjem dok je reĎe da se u supstrat dodaje organska

kiselina ili neki enzim (sveţi sir, kobasica). Tokom konzumiranja fermentisane hrane

unosimo ţive i mrtve mikroorganizme, njihove primarne i sekundarne metabolite i ostatak

supstrata koji nije iskorišćen.

Osnovne karakteristike fermentisane hrane su: kvalitetnija organoleptička svojstva,

konzervacija i povećana nutritivna vrednost.

Konzerviranje fermentisane hrane se dešava usled sinteze organskih kiselina i

antimikrobnih supstanci koje sprečavaju rast različitih patogena i drugih vrsta

mikroorganizama. Povećana koncentracija organskih kiselina ima inhibitorni efekat i na rast

samih producenata. Pored organskih kiselina mikroorganizmi mogu da sintetišu CO2, H2O2,

diacetil, etanol i mnogo drugih antimikrobnih jedinjenja poput bakteriocina koju su

proteinske prirode (Bacus, 1986; Demeier, 1982). Suština same konzervacije hrane je duţi

rok trajanja i veća bezbednost od patogena.

3

Povećanje nutritivne vrednosti se ogleda prilikom konverzije supstrata u organske

molekule koji imaju veću nutritivnu vrednost u odnosu na supstrat. Najbolji primer je

konverzija laktoze iz presnog mleka u mlečnu kiselinu kada dobijamo jogurt ili kiselo mleko.

U poslednje vreme, povećanje nutritivne vrednosti fermentisanih proizvoda povezano je sa

proizvodnjom funkcionalne i probiotske hrane. Funkcionalna hrana sadrţi hranljive sastojke

dok probiotska hrana sadrţi ţive mikroorganizme koji imaju pozitivan efekat na zdravlje

ljudi. Uglavnom su to jedinjenja koja imaju antioksidativna svojstva i mogu smanjiti rizik od

pojave kancera i srčanih oboljenja.

1.2 Fermentisane kobasice

Fermentаcijа je postupаk konzervisаnjа proizvodа, uz učešće mikroorgаnizаmа, pri

čemu se menjаju vrednost pH, miris, ukus i druge osobine proizvodа (Sl. glasnik RS, broj

31/2012). Pored fermentacije, sušenje, dimljenje i soljenje su najstariji vidovi kozervisanja

hrane a i samih proizvoda od mesa. Fermentisane kobasice se mogu naći na trţištu kao:

fermentisane suve kobasice, fermentisane polusuve kobasice i fermentisane kobasice za

mazanje. Fermentisana suva kobasica je proizvod koji u trenutku kada je spreman za

konzumiranje ima minimalni procenat vlage. Proces sušenja je na niskim temperaturama i

formira izuzetnu, pikantnu i prijatnu aromu sa čvrstom konzistencijom.

Raznovrsnost fermentisanih kobasica zavisi od klime, regiona-zemlje, začina, nasleĎa

i kulture. Sastav nadeva je raznolik čak i za proizvode sa istim imenom. Temperatura vlaţnost

i vreme sušenja su parametri kojima se kontroliše kvalitet finalnog proizvoda. Tradicionalne

kobasice sa Balkana i Mediterana konzervišu se samo sušenjem, dok se kobasice iz centralne

i severne Evrope dime (Toldrá i sar., 2004; Latorre-Moratalla i sar., 2008). Sve fermentisane

kobasice se proizvode u zimskom periodu godine a poznatiji proizvodi iz Srbije su: peglana

kobasica, sudţuk, sremska kobasica, njeguška kobasica i kulen.

Meso ili skeletni mišići na kojima se nalazi vezivno tkivo sa nervima i limfnim

sudovima i masno tkivo su najvaţniji sastojci većine kobasica. Od kvaliteta i karakteristika

mesa i masnog tkiva zavisi i kvalitet samih kobasica. Ove sirovine moraju da potiču od

zdravih ţivotinja koje su imale kako adekvatni premortalni tretman (ishranu, drţanje,

transport, odmor pre klanja) tako i postmortalni tretman (Rede i Petrović, 1997; Petrović i

sar., 2007). Kao rezultat u biohemijskim procesima u mišiću post mortem nastaje meso

različitog kvaliteta. Postoji normalno CČN (crveno ruţičasto, čvrsto, nevodljivo), BMV

(bledo, meko, vodljivo) i TČS (tamno, čvrsto i suvo) meso. BMV meso se razvija kada se

postmortalna glikoliza obavlja brzo i na viskoj temperaturi, dok TČS meso je iz mišića gde

nema dovoljno glikogena za normalanu glikolizu pa dovodi do pada pH vrednosti na 5,4-5,8

4

(Rede i Petrović, 1997). Korišćenje BMV mesa u proizvodnji fermentisanih kobasica dovodi

do problema zbog denaturacije proteina što narušava razvijanje adekvatne boje i teksture

tokom sušenja. TČS meso takoĎe nije poţeljno za proizvodnju kobasica zbog visoke

vrednosti pH koja pogoduje rastu patogena i zbog posedovanja velikog stepena vezivanja

vode. Samo CČN meso je adekvatno za pravljenje fermentisanih kobasica.

Tradicionalna proizvodnja kobasica zahteva odabir grla koja su dobro uhranjena i čije

meso sadrţi veću količinu suve materije i miglobina te imaju intezivnu crvenu boju i čvrstu

teksturu. Za izradu nadeva treba dobro ohladititi meso i masno tkivo koje mora biti čvrsto i

zrnaste konzistencije. Ukoliko ţelimo postići lep presek kobasice pre ustinjavanja i mlevenja

meso i masno tkivo treba smrznuti. Nikako se ne koristi masno tkivo i meso koje je dugo

stajalo zamurznuto jer dolazi do oksidativnih promena koje veoma utiču prvenstveno na miris

finalnog proizvoda, ali i na ukus. U Španiji, Francuskoj, MaĎarskoj i Italiji fermentisane

kobasice uglavnom su od svinjskog mesa i masnog tkiva dok Nemačka svoje fermentisane

kobasice pravi uz dodatak 30 % goveĎeg mesa. U Srbiji i Turskoj proizvodi se sudţuk od

goveĎeg mesa a moţe da se doda i kozije ili ovčje meso sa udelom od 10 %. Izuzetak je

peglana kobasica koja se pravi od goveĎeg, ovčjeg i kozijeg mesa u odnosu 50%, 30%, 20%

uz minimalnu količinu masnog tkiva.

Finalni kvalitet fermentisanih kobasica ne zavisi samo od komponenti nadeva već i od

dodataka koje je teško podeliti a najbitniji su: kuhinjska so, nitrati, nitriti, šećeri i začinska

paprika.

Natrijum hlorid (NaCl), odnosno kuhinjska so, se koristi za pojačavanje ukusa i

konzervisanje hrane od davnina. Kuhinjska so se u nadev dodaje u količini 2-3% što povoljno

utiče na ukus kobasica, ali i na fizičko-hemijske i mikrobiološke procese tokom sušenja i

zrenja. Sama kuhinjska so smanjuje aktivnost vode i time selektivno inhibira rast gram

negativnih bakterija, a ne utiče na rast laktobacila, kvasaca i ostalih mikroba koji učestvuju u

sazrevanju kobasica. Negativan uticaj kuhinjske soli ogleda se u neadekvatnoj boji proizvoda

zbog ubrzane oksidacije hema u miglobinu, tako da proizvod dobija mrko zelenu do sivu

boju, ali pojačava konzistenciju nadeva gde so reaguje sa miofilamentima iz proteina (Čavlek,

1993).

Nitrati (natrijumove – E 251 i kalijumove soli E 252) koji se dodaju kobasicama

prelaze u nitrite pod uticajem enzima bakterija (Lactobacillus, Staphylococcus, Micrococcus)

i enzima tkiva.

Nitriti (natrijumove – E 250 i kalijumove soli E 249) sa redukovanim nitratima deluju

na mioglobin i stvaraju karakterističnu crvenu boju kobasica. Pored boje imaju i

bakteriocidno dejstvo, daju punoću ukusa i mirisa (Rahelić i sar., 1980; Honikel, 2008).

Formiranje boje nastaje tako što se azot monoksid (NO) u obliku soli vezuje za hem u

5

porfirinskom prstenu mioglobina (Rahelić i sar., 1980; Freixanet, 2007; Honikel, 2008;

Vuković, 2012). Maksimalna količina nitrita je 0,6 %, sve preko toga je toksično i proizvod

postaje suviše slan. Fermentacija je moguća i samo uz korišćenje kuhinjske soli, naročito pri

tradicionalnoj proizvodnji.

Šećeri se dodaju kao hrana mikroorginizmima koji ih fermentišu do organskih kiselina

čime se doprinosi zrenju nadeva i na direktan način utiče se na pad pH vrednosti. Koriste se

monosaharidi, disaharaidi i polisaharidi. Proste šećere BMK lakše razlaţu čime pH mnogo

brţe opada i fermentacija je brţa dok sloţeniji šećeri se koriste kod duţih fermentacija

(Petrović, 2012). U nadev se dodaje 0,4 do 0,8% šećera. UtvrĎeno je da 1% šećera sniţava

jednu jedinicu pH (Čavlek, 1993). Kako bi ispratili tok fermentacije, treba dobro promotriti i

usaglasiti vrstu i količinu šećera i adekvatnu starter kulturu. Tokom razlaganja šećer direktno

utiče na pH, pa ako je sporo razlaganje, duţe vreme će se odrţati niska pH koja nepovoljno

deluje na nepoţeljne mikroorganizme. Ukoliko su razgradnja i fermentacija brze, to se moţe

odraziti na konzistenciju i aromu same kobasice. Najčešće korišćeni šećeri su: laktoza,

saharoza, glukoza, dekstroza, skrob, sorbitol, kukuruzni sirup. Pored šećera, za sniţavanje pH

koristi se i aditiv glukono-delta-lakton (GDL) (E575). Ovaj ugljeni hidrat se rastvara u vodi iz

mesa i brzo sniţava pH, doprinosi stvaranju boje i inhibira patogene. GDL podjednako

sniţava pH u svim delovima nadeva tako da se formira ujednačena boja u svim delovima

kobasice. Uglavnom se koristi za kobasice koje fermentišu na višim temperaturama jer lako

hidroliše na višim temperaturama. Upotreba GDL nije ograničena ali moţe nepovoljno da

stvori kiseo ukus i miris proizvoda kod suvih fermentisanih proizvoda kao što je kulen zbog

prevelikog sniţavanja pH što dovodi do inhibicije rasta mikrokoka koje su vaţne za zrenje

zbog redukcije vodonik peroksida i nitrata.

Askorbinska kiselina (vitamin C-E 300) i eritrobinska kiselina (E 315) se koriste kako

bi poboljšali redukujuće uslove za prelaz nitrata u nitrite i utiču na stabilnost crvenog

pigmenta nastalog u reakciji NO i mioglobina. Najznačajnije delovanje ovih aditiva je

vezivanje kiseonika, čime sprečavaju oksidaciju i stvaranje peroksid radikala. Prema

Pravilniku o prehrambenim aditivima (Sl. glasnik RS, broj 63/2013) upotreba askorbinske

kiseline (E-300) u proizvodnji fermentisanih suvih kobasica je dozvoljena.

Začini predstavljaju osnovne dodatke u pravljanju fermentisanih suvih kobasica.

Zasluţni su za karakterističan miris, ukus i boju fermentisanih kobasica (Petrović, 2012). U

začine moţemo ubrojiti aromatične delove začinskih biljaka kao što su: list (ruzmarin, lovor,

origano), lukovica (beli i crni luk), plod (biber, paprika) i seme (kim, slačica, bosiljak) (Sl.

glasnik RS, broj 72/2014). Začini i začinsko bilje mogu da se koriste u prirodnom obliku,

sitnjeni, sušeni u prahu ili ekstrahovanjem aromatičnih sastojaka. Sam sastav začina moţe da

bude kompleksan ali uvek postoji jedan dominantan sastojak. Hemijska jedinjenja koja se

6

nalaze u začinim su: estri, terepeni, alkoholi, ulja, alkaloidi, smole, fenoli, organske kiseline i

sumporna jedinjenja (Savić i Popović, 2008). U proizvodnji kobasica začini se dodaju zbog

antioksidativnog delovanja i stimulativnog efekta fermentacije. Najčešće korišćeni začini su:

crvena mlevena začinska paprika (ljuta i slatka), beli luk, crni i beli biber, kim, muskatni

orah, karanfilić, cimet, bosiljak, karadamon, slačica, majčina dušica i Ďumbir. Uglavnom se

dodaju kao mešavine do 1%, dok crvena paprika, biber i beli luk idu u većoj količini do 2-3

% (Petrović i sar., 2007; Vuković i sar., 2011b; Petrović i sar., 2011a).

Začinska paprika se na tradicionalni način dobija branjem zrelih crvenih plodova

paprike koje se niţu na vence i suše na vazduhu. Sa suve paprike odvaja se peteljka i tako

cele se melju sa semenom. U industrijskoj proizvodnji, odvaja se seme i ţilice u kojima ima

najviše alkaloida kapsaicina. Pored nitrata, na boju fermentisanih kobasica veliki uticaj imaju

pigmenti iz paprike, mešavina karotenoida (karoteni i ksantofili). Pored boje u paprici se

nalazi i askorbinska kiselina koja ima antioksidativno delovanje, ali i rutin iz koga nastaje

vitamin P. U paprici se nalazi šećer u količini od 10-15 %, koji je direktno redukujući.

Ljute vrste paprika poseduju mešavinu od 6 izomera ljutih materija. Glavne materije

koje daju ljutinu paprikama su: kapsaicin, nordihidrokapsaicin, homodihidrokapsaicin i

dihidrokapsaicin, a norkapsaicin i homokapsaicin se nalaze samo u tragovima. Kapsaicin koji

je najzastupljeniji i vodeća supstanca za ukus ljutine u plodovim paprike varira od 0,15% do

0,5 %.

Pored ovih navedenih dodaka u industriji se koriste u mnogo manjoj meri i supstance

kao što su: arome, kiseline, boje, inulin, omega-3 masne kiseline, vitamini mineralne

materije, dijetna vlakna i slično (Vignolo i sar., 2010; Vuković, 2012).

Priprema nadeva sastoji se iz usitnjavanja ohlaĎenih delova mesa i masnog tkiva na

niskim temperaturama kako bi se izbeglo otpadanje masnog tkiva. Svi noţevi i mašine za

mlevenje mesa trebalo bi da budu izuzetno oštri. Ukoliko su noţevi i mašine tupe, gnječe

meso i tkiva i time otapaju masti koje se razmazuju po površini mesa. Ovako otopljene masti

oteţavaju difuziju soli i homogenizaciju nadeva i tokom punjenja nakupljaju se ispod

omotača i oteţavaju sušenje (Toldrá, 2002; Vignolo i sar., 2010; Vuković, 2012; Petrović,

2012). Kada se adekvatno usitni meso i masno tkivo dodaje se kuhinjska so, nitrati, nitriti,

aditivi, šećeri, začini, starter kulture i sve zajedno se meša mešalicom dok se smesa ne

homogenizuje.

Kada se fermentisane kobasice proizvode tradicionalo, nadev se ostavlja neko vreme

na hladnom mestu kako bi se ohladio. U industrijskoj proizvodnji mešanje nadeva se vrši pod

vakuumom. Vakuum je bitam kako bi nadev imao što manje dodira sa spoljnim vazduhom.Pri

punjenju creva, takoĎe se koristi vakuum kako bi se odstranio vazduh iz creva. Kada dospe

vazduh, ili kada se crevo puni bez vakuuma, teţe je obezbediti uslove za fermentaciju i zrenje

7

kobasica, a i tokom sušenja gde je bilo vazduha postoji velika verovatnoća da će doći do

pucanja creva. Optimalna temperatura nadeva u ovakvim vakuumskim ulovima je −3°C do

0°C (Petrović i sar., 2007).

Prilikom izrade fermentisanih kobasica mogu se koristiti prirodni i veštački omotači

koji će svojim fizičko-hemijskim karakteristikama zadovoljiti čvrstinu, elastičnost i

propustljivost za dim i pare. Ako se koriste prirodna creva, moraju biti očišćena od masti

kako bi se izbeglo da uţegnu tokom zrenja kobasice. Ako su creva soljena prvo ih treba

isprati, a ako su prethodno bila sušena treba ih omekšati u mlakoj vodi kako bi kolagen

nabubrio. Postoji više vrsta veštačkih omotača najrazličitijeg dijametra koji mogu biti na bazi

pamuka i svile, kolagena, biljnih vlakana i impregnirana kolagenom (huki-omotač). Veštački

omotači imaju prednost jer im je dijametar ujednačen i higijenski su besprekorni. Ovako

pripremljene kobasice prvo se podvezuju a zatim se podvrgavaju dimljenju, sušenju ili bilo

kom drugom vidu tehnološkog postupka u kom se dešava zrenje kobasice (Petrović i sar.,

2007).

Dimljenje kobasica i proizvoda od mesa je najstarija tehnologija konzervisanja. Danas

se industrijski dim dobija nepotpunim izgaranjem drveta i drvnog otpada kao što su piljevina i

iverje (Feiner, 2006). Dimljenje predstavlja proces prodiranja isparljivih jedinjenja nastalih

termalnom razgradnjom drveta u kobasice i mesne preraĎevine sa ciljem povećanja njihovog

odrţanja (Šimko, 2002). Dejstvo dima je površinsko, tako da se dimljenje koristi sa drugim

postupcima konzervisanja, kao što je salamurenje, soljenje, sušenje i toplotna obrada. Prema

opštim odredbama Pravilnika (Sl. Glasnik RS, Broj 31/2012) dimljenje podrazumeva

postupak konzervisanja dimom ili aromom dima na odgovarajućoj temperaturi a to je 25°C-

hladno dimljenje, do 60°C- toplo dimljenje i na temperaturi preko 60°C- vruće dimljenje.

Fermentisane suve kobasice se dime po hladnom postupku od 12 °C do 25°C na samom

početku dok ima vlage u nadevu kako bi isparljiva jedinjenja iz dima lakše difundovala.

Ovakav tretman imaju suve fermentisane kobasice severnoevropskog tipa, što nije slučaj sa

mediteranskim i balkanskim fermentisanim kobasicama.

Pored dimljenja, sušenje je ključna operacija tokom proizvodnje fermentisanih

kobasica jer predstavlja najbitniji postupak konzervisanja koji odreĎuje kvalitet i odrţivost

proizvoda. Tokom sušenja najbitnija stvar je da se smanjuje vlaga i vrednost aw u nadevu što

smanjuje aktivnost enzima i daje čvrstinu nadevu. Nakon podvezivanja i ceĎenja, kobasice se

suše, kada na površini omotača (prirodnog ili veštačkog) dolazi do faznog prelaska vode u

vodenu paru. Ovako formirana vodena para lako se oslobaĎa sa granične površine u okolni

vazduh pod uticajem razlika parcijalnog pritiska. Opisani fenomen naziva se spoljašnja

difuzija i on dovodi do stvaranje gradijenta koncentracije vlage od centra ka površini

kobasica. Kako se suši periferni sloj, tako spontano sistem (kobasica) ide ka izjednačavanju

8

koncetracije vode u svim slojevima, i započinje unutrašnji transport vlage. Tokom sušenja

istovremeno se odvijaju procesi fermentacije i zrenja, koji predstavljaju skup sloţenih

biohemijskih procesa i promena čijim nastankom se sirovi nadev transformiše u dugotrajan,

stabilan i bezbedan proizvod optimalne nutritivne vrednosti i senzornog kvaliteta, bogate

arome, definisane teksture i stabilne boje (Demeyer, 2004).

1.3 Podela kobasica

Duga tradicija proizvodnje fermentisanih kobasica na koju su uticali običaji, navike

ljudi kao i sloţenost sastava i same tehnologije proizvodnje dovele su do neverovatne

raznovrsnosti. Sama raznovrsnost kobasica uslovila je i podele po različitim osnovama. Kada

ţelimo da podelimo fermentisane kobasice moramo da uzmemo u obzir višestruke kriterijume

kao što su: sadrţaj vode, sastav proizvoda po pitanju mesa i ostalih sastojaka, stepen

usitnjenosti, promer i vrsta omotača, odnos sirovina, kao i tehnološka obrada tokom

fermentacije i sušenja (Hammes, Haller i Ganzle, 2008; Incze, 2004; Lucke, 2000). Podelu

moţemo postaviti i na osnovu rasta plesni na površini proizvoda ili primene postupaka

dimljenja.

Najozbiljniji kriterijum podele fermentisanih kobasica je sadrţaj vode jer utiče na

cenu, kvalitet i mikrobiološku bezbednost samog proizvoda (Toldra, 2002; Lucke 2000). Po

pravilniku o kvalitetu mesa (Sl. glasnik RS, broj 31/2012) sadrţaj vode u fermentisanim

suvim kobasicama moţe biti do 30 % vlage dok ostali proizvodi kao što su polusuve,

delimično suve i kobasice za mazanje imaju znatno veću količinu vlage od 40% do 50%.

Pored ukupnog sadrţaja vode prate se i drugi parametri vezani za vodu kao što je aktivnost

vode (water activity aw), odnos vode i belančevina (MPR- moisture protein ratio) i gubitak

mase. Aktivnost vode aw predstavlja jedinicu kojom se iskazuje udeo vode u datoj sredini

koja je slobodna i raspoloţiva mikroorganizmima. Na osnovu ove fizičke veličine

fermentisane kobasice delimo na: suve kobasice aw ispod 0,9, polusuve kobasice čiji aw iznosi

od 0,9 - 0,95 i fermentisane kobasice za mazanje čiji aw iznosi od 0,94 - 0,96 (Lucke, 2000).

Tehnologijom proizvodnje suve fermentisane kobasice izgube 30% do 45% od svoje

početne mase, dok kod polusuvih je manje od 18% do 20 %, a kod kobasica za mazanje

gubitak od početne mase je minimalan, oko 10%.

9

Tabela 1 Podela fermentisanih kobasica prema Pravilniku o kvalitetu usitnjenog mesa,

poluproizvoda od mesa i proizvoda od mesa (Sl.glasnik RS, broj 31/2012)

Grupa Podrgrupa Naziv/vrsta

Fermentisane kobasice

Fermentisane suve kobasice

Peglana kobasica

Kulen

Sudţuk

Sremska kobasica

Njeguška kobasica

Čajna kobasica

Zimska salama

Fermentisane polusuve kobasice

Panonska kobasica

Peperoni

Srodni proizvodi*

Fermentisane kobasice za

mazanje

Čajni namaz

Srodni proizvodi*

*Naziv odreĎuje proizvoĎač

1.4. Peglana kobasica

U našoj drţavi postoji veliki broj fermentisanih kobasica koje se proizvode, ali samo

mali broj poseduje posebna svojstva i kvalitete koji su rezultat ljudskih, prirodnih i

regionalnih faktora. Jedan od takvih proizvoda je suva fermentisana peglana kobasica koja je

deo gastronomskog nasleĎa Stare planine i seoskih domaćinstava u opštini Pirot.

Tradicija proizvodnje peglane kobasice seţe daleko u prošlost, a prvi pisani

dokumenti se javljaju na prostoru Stare planine u doba Osmanskog carstva. Kako su se u to

vreme menjale navike i kulturno nasleĎe okupiranih Srba na tom prostoru, tako je i uticaj sa

istoka učinio da se u većoj meri gaje papkari i kopitari. Kao rezultat mešanja istočne kulture i

tradicionalne proizvodnje u seoskim domaćinstvima, na obroncima Stare planine nastala je

peglana kobasica koja je na austrougarske dvorove dospela krajem 18. Veka.

Osnovna sirovina za izradu fermentisanih suvih kobasica kao što je peglana je CČN

(crveno ruţičasto, čvrsto, nevodljivo) meso domaćih kopitara i papkara. Za ovu vrstu

kobasica koristi se meso ekstra kvaliteta (podslabina, file) i meso prve kategorije (but i

plećka). Uglavnom su to skeletni mišići sa kojih je uklonjeno masno tkivo, vezivno tkivo i

ţile. Za izradu kobasice najčešće se korite komadi kozijeg, ovčijeg i junećeg mesa, odnosno

“posne“ vrste mesa. Nije retkost da pored ove tri vrste mesa bude prisutno magareće i

konjsko meso. Nikada se ne koristi svinjsko meso jer se brzo kvari, masno je i ne spada u

posna mesa.

10

Otkošteno meso bez loja i ostalih primesa predstavlja osnovnu sirovinu za

pripremanje nadeva. Tako dobijeno i sreĎeno kvalitetno meso treba dobro ohladiti do tačke

mrţnjenja. Nekada se peglana kobasica pravila tako što se meso noţevima sitno seckalo, a

danas se koriste mašine za mlevenje. Meso treba biti mleveno na većem promeru rešetke

kako bi kasnije kobasica imala lep presek. Ovako usitnjeno meso spremno je za mešanje sa

dodacima kao što su začini. Univerzalni recept za peglanu kobasicu ne postoji, pa su

varijacije moguće od porodice do porodice. Veština proizvodnje tradicionalnog proizvoda

prenosi se sa koleno na koleno. Od dodataka uglavnom se koristi začinsko bilje koje moţe da

se naĎe na tlu Stare planine i u pirotskom okrugu.

Glavni začini su beli luk, začinska crvena mlevena ljuta i slatka paprika. Pored

glavnih začina koriste se: crni i beli biber, muskatni oraščić i majčina dušica. Kada se svi

dodaci u odgovarajućim količinama dodaju u masu usitnjenog mišićnog tkiva, pristupa se

tradicionalnom načinu ručnog mešanja. Mešanje se vrši prebacivanjem nadeva sa jedne

gomile na drugu dok se ne postigne uniformna raspodela začinskih dodataka unutar nadeva.

Kobasica se pravi samo u odreĎenom delu godine, krajem novembra i početkom

decembra, kada su klimatski uslovi u Pirotu najoptimalniji za sušenje kobasice. To znači da

ova kobasica ima sezonski karater. Pripremljen nadev za kobasicu mora biti autentično ljut,

jer specifičnost samog ukusa leţi u ljutini. Homogena smeša nadeva puni se u omotače tj.

creva koja su prirodnog porekla, najčešće ovčja ili juneća. Omotač ili crevo mora biti

prethodno dobro očišćeno od masnoća i higijenski spremno za ljudsku ishranu. Creva se

dobro očiste i usole kako ne bi uţegla. Ovako konzervisana creva, kada nadev bude spreman,

stavljaju se u mlaku vodu kako bi dobila na elastičnosti i čvrstini.

Ako je nadev spreman, sa svim dodacima, prelazi se na punjenje creva koja ne smeju

da sadrţe vazduh tokom punjenja. Kada se smesa dodaje u omotač, punjenje mora da bude

tvrdo kako bi se postigli adekvatni uslovi za fermetaciju peglane kobasice i istisnuo vazduh.

Napunjene kobasice podvezuju se u obliku slova U i tako pripremljene se prvo ocede

i spremaju za sušenje. Jedini postupak konzervisanja ovog tipa fermentisanih kobasica je

sušenje. Period sušenja moţe da traje do 60 dana na temperaturi u rasponu od -5°C do 5°C.

Tokom sušenja poţeljno je da temperatura bude u navedenom opsegu, jer ukoliko

temperatura padne mnogo ispod -5°C kobasica se ledi, stvaraju se kristali leda koji se šire i

mogu da pocepaju omotač tj. prirodno crevo. Temperature znatno veće od 5°C dovode do

kvarenje mesa i stvaranja preduslova za razvijanje patogenih mikroorganizama.

Da bi se pospešilo sušenje kobasica, nekada su se podvrgavale peglanju drvenom

oklagijom, dok danas se peglaju staklenom flašom čime se povećava granična površina preko

koje se odaje vlaga u vidu vodene pare. Zbog razlike u parcijalnom pritisku vodena para sa

površine kobasice odlazi u okolni vazduh. Dakle, radi se o veoma sloţenom fenomenu, pa se

11

čitav proces migracije vlage u mesu pojednostavljeno smatra molekulskom difuzijom (Babić

i Babić, 2000; Petrović, 2012; Ikonić, 2013). Zbog samog načina pripreme, kobasica je dobila

naziv peglana kobasica. Sveţe kobasice peglaju se češće, i do dva puta dnevno. Kako proces

sušenja i fermentacije odmiče, peglana kobasica zadobija oblik potkovice i karakterističan

miris i tvrdoću. Kobasice se peglaju do poslednjeg dana zrenja.

Peglana kobasica se suši na hladnom vazduhu (promaji), okačena na letvice i tokom

peglanja letvice se rotiraju po principu odozdo naviše. Ukoliko doĎe do pucanja ili oštećenja

creva na kobasici, ovakvi primerci se uklanjaju iz dalje proizvodnje. Kobasica je zrela i

spremna za konzumaciju kada nadev dobije adekvatnu boju mahagonije a tekstura bude

konzistentna. Na poprečnom preseku uočava se bordo boja, koja potiče od začinske paprike i

komadića suvog fermentisanog mesa. Ukus peglane kobasice je autentičan, naglašenog

inteziteta, pikantno ljut, sa blagom notom belog luka i crvene mlevene začinske paprike.

Peglana kobasica u gastronomskom svetu zauzima izuzetnu poziciju, kao visoko

kvalitetni delikatesni proizvod koji se servira kao hladno predjelo sa tvrdim prevrelim

kaloričnim sirevima ili orašastim plodovima. Uglavnom se servira uz aperitive voćnog

porekla kao kanapeji ili apetisani (Montagné, 1961). Kanapeji sa peglanom kobasicom su

mali sendviči od jednog zalogaja koji predstavljaju sendvič od presnog hleba, kajmaka,

livadskog meda i same kobasice. Kada su u pitanju apetisani (zagrisci), onda se peglana

kobasica sluţi uz polutvrde punomasne sireve i koštunjavo voće kao što su: badem, lešnik,

kikiriki, pistaći i pinjoli.

1.5 Mikroflora kobasica

Prvo tumačenje procesa fermentacije kao posledice biohemijske aktivnosti

mikroorganizama dao je Paster u XIX veku (Joksimović, 1978). Fermentacija u nadevu

kobasica oslanja se na enzime mišićnog tkiva i enzime prisutnih vrsta mikroorganizama što

daje veliku varijabilnost proizvoda, ukusa i kvaliteta. Savremena proizvodnja u industriji

mesa teţi da fermentacija bude brţa, precizna i jednostvna pa dodaci kao što su starter kulture

koriste se za sniţavanje pH vrednosti nadeva. To se čini dodavanjem aditiva ili fermentacijom

šećera. Fermentacija je mikrobiološki proces razlaganja šećera do organskih kiselina za koji

su odgovorne bakterije mlečne kiseline (BMK): Lactobacillus, Streptococcus i Pediococcus,

a pored njih i kvasci koji su prirodna mikroflora u mesu (Petrović, 2012).

Starter kulture mogu biti jedan ili više sojeva mikroorganizama koji ispoljavaju

ţeljenu metaboličku aktivnost. Koriste se za ubrzavanje fermentacije, povećanje kvaliteta

proizvoda, sprečavanje rasta patogenih mikroorganizama i poboljšavanja organoleptičkih

svojstava proizvoda od mesa. Starter kulture se izoluju iz proizvoda koji se proizvode

tradicionalnim načinom proizvodnje. Mikrobne populacije iz tradicionalnih proizvoda

12

prilagoĎene su na specifučne uslove koji vladaju u njima. Proizvodnja uz korišćenje starter

kultura ima za cilj ukusniji, bezbedniji i sigurniji proizvod.

Korišćenje starter kulture u proizvodnji fermentisanih kobasica istovremeno doprinosi

i zdrastvenoj bezbednosti proizvoda. Fermenacijom BMK izlučuju se metaboliti kao što su

organske kiseline (mlečna, mravlja, sirćetna i dr.) ugljen dioksid, diacetil, bakteriocini,

vodonik peroksid i dr. Dosta ovih metabolita negativno utiče na zrenje kobasica, ali su zato

odlični inhibitori nepoţeljne mikroflore (Martinović i sar., 2006). Značajno je napomenuti i

zaštitnu ulogu koja se ogleda u antioksidativnom i antimikrobnom delovanju. Antioksidativno

deluju mikrokoke, koje pomoću enzima katalaze razlaţu vodonik peroksid. Antimikrobni

efekat ostvaruju laktobacili i pediokoke pomoću bakteriocina, koji deluje antagonistički na

neke patogene bakterije, kao što su Listeria monocytogenes i patogene vrste streptokoka, kao

i stvaranjem mlečne kiseline i smanjenjem vrednosti pH (Lembeck, 2009).

Prilikom pripreme fermentisanih kobasica u domaćoj radinosti, dolazi do mikrobne

kontaminacije koja zavisi od sirovina, dodataka koji se koriste i (ne)higijenskog pristupa

tokom proizvodnje. Usled promena fizičko-hemijskih procesa u fazama zrenja kobasica

(sniţavanje pH, aktivnost vode i povećanje količine soli) nastaju uslovi za razvijanje posebne

mikroflore (acidofili, halofili i osmofili) i potiskivanje drugih mikroorganizama (Zdolec,

2007). Različite regije sveta imaju različite vrste fermentisanih kobasica koje se razlikuju po

tehnološkim karakteristikama pa zbog toga se razlikuju mikroorganizmi u nadevu.

Istraţivanja prirodne autohtone mikroflore fermentisanih kobasica usmenerena su na praćenje

promene populacija mikroorganizama u različitim fazama zrenja. Poznato je da su

najaktivnije BMK iz porodice Lactobacillaceae. Pored BMK, stabilne populacije imaju i

plesni i enterokoke.

Istraţivanjem mikroflore prirodno fermentisanih kobasica utvrĎeno je da su BMK i

koagulaza-negativne koke (KNK) najznačajnije grupe odgovorne za fermentaciju i zrenje

kobasica. Najzastupljenije vrste bakterija mlečne kiseline, izolovane iz tradicionalnih

proizvoda, su Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum i

Lactobacillus pentosus dok se u SAD zbog više temperature fermentacije češće izoluju

Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilactici i Pediococcus pentosaceus. Kod grupe

koagulaza - negativnih koka preovladavaju Staphylococcus xylosus, Staphylococcus carnosus

i Kocuria varians (Ammor и Mayo, 2007). Pediokoke (Pediococcus pentosaceus i

Pediococcus acidilactici) i enterokoke su takoĎe često izolovane iz tradicionalnih

fermentisanih kobasica. Navedene vrste bakterija pokazale su značajan doprinos u

proizvodnji visokokvalitetnih tradiconalnih kobasica, tako da su uvrštene u komercijalne

starter kulture. Odabir adekvatnih sojeva je krucijalan, zbog sastava nadeva i tehnoloških

postupaka tokom izvoĎenja fermentacije, jer uslovi koji vladaju ograničavaju podjednaku

13

dominantost svakog mikroorganizma ponaosob. Kao posledica moguće je da dominantni

sojevi bakterija ujednače karakteristike većine industriskih fermentisanih proizvoda, čime se

gubi autentičnost proizvoda (Danilović, 2012; Janković, 2013).

Dugogodišnja istraţivanja tradicionalnih fermentisanih proizvoda i industrijska

proizvodnja fermentisanih kobasica dovela je do otkrića tri generacije starter kultura. Prvu

generaciju čine Lactobacillus plantarum i Pediococcus pentosaceus koji su izolovani iz

fermentisane hrane biljnog porekla. One brzo zakišeljavaju sadrţaj ali nisu prilagoĎene

ekosistemu mesa pa omogućavaju noramalan rast drugih heterofermentativnih BMK. Druga

generacija je izolovana iz mesa. Lactobacillus sakei i Lactobacillus curvatus imaju veoma

dobru prilagoĎenost na uslove sredine koji preovladavaju tokom zrenja kobasice i vremenom

su zamenile prvu generaciju starter kultura. Treća generacija se razvija, a koriste se sojevi

koji imaju izraţena nutritivna, bakteriocidna i probiotička svojstva. Mikroorganizmi treće

generacije zovu se još i funkcionalne strater kulture (Hugas и Monfort, 1997).

Pored starter kultura koje se dodaju u nadev postoje starter kulture plesni koje se

apliciraju prskanjem na spoljnu površinu kobasica. To su sojevi koji ne sintetišu antibiotike i

toksine i mogu da rastu na niţim temperaturama uz prisustvo nitratnih i nitritnih soli i

povećanog sadrţaja mlečne kiseline. Uglavnom su to bele ili ţućkaste kolonije koje se

javljaju tokom faze sušenja i doprinose stvaranju intezivnog mirisa. Sojevi sa adekvatnim

osobinama su Penicillium nalgiovense, Penicillium chrysogenum, Penicillium gladiole i

Penicillium camemberti (Bruna. и сар, 2003). U komercijalnim starter kulturama za

industrijsku prizvodnju fermentisanih kobasica mogu da budu i kvasci Debaryomyces

hansenii (Candida famata), samostalno ili odvojeno. Starter kulture plasni i kvasaca nanose

se potapanjem kobasica ili se kvasac dodaje u nadev (Feiner, 2006, Lucke, 2000).

14

2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA

Peglana kobasica, koja predstavlja autohtoni proizvod u Srbiji, pripada grupi suvih

fermenentisanih kobasica. Tokom zrenja domaćih fermentisanih kobasica, BMK imaju

najvaţiju ulogu jer svojim rastom i metabolizmom usmeravaju fermentaciju i direktno utiču

na organoleptička svojstva proizvoda. S obzirom na to da do sada nije okarakterisana

mikroflora peglanih kobasica, ciljevi ovog rada su sledeći:

1) izolacija BMK iz nadeva za pravljenje kobasice i dva uzorka peglane kobasice

koja je proizvedena na tradicionalan način,

2) fenotipska karakterizacija BMK izolata,

3) molekularna identifikacija BMK izolata,

4) tehnološka karakterizacija selektovanih izolata BMK.

15

3. MATERIJAL I METODE

3.1. Materijal

3.1.1. Uzorci

Peglana kobasica je izraĎena po tradicionalnom postupku u kućnoj radinosti. Za

izradu nadeva korišćeno je juneće, ovčje i kozje meso u odnosu 50%:25%:25%. Pojedinačno

meso zadovoljavalo je fizičko – hemijske parametre CČN mesa. Meso je pre usitnjavanja

ohlaĎeno do tačke smrzavanja i usitnjeno na mehaničkoj vodenici za meso.

Usitnjenom mesu dodata je kuhinjska so (2%), crvena ljuta začinska paprika (2%) i

beli luk (1%). Nadev je klasičinim ručnim mešanjem, sa gomile na gomilu, tretiran do

homogenizacije dodataka sa mesom. Pripremljen nadev je čuvan na hladnom mestu, dok je

za to vreme omotač ili prirodno ovčje crevo, prethodno adekvatno spremljeno i usoljeno,

razmekšano u toploj vodi. Spremljenim nadevom punjeno je ovčje crevo uţeg promera.

Dobijene kobasice podvezane su kanapom i sušene na hladnom vazduhu narednih 60 dana.

Uzorci su uzeti iz nadeva pre punjenja kobasice (uzorak N), na polovini fermentacije

(uzorak PK) i na samom kraju iz finalnog proizvoda (uzorak PF).

3.1.2. Medijumi za gajenje mikroorganizama

Za odreĎivanje ukupnog broja bakterija korišćen je Hranljivi agar (Torlak, Srbija),

dok je ukupan broj kvasaca odreĎivan na Saburo dekstroznom agru (Torlak, Srbija). M17 i

MRS podloge (Torlak, Srbija) korišćene su za izolaciju u gajenje BMK izolata.

Za odreĎivanje fenotipskih karakteristika BMK izolata koriščene su sledeće podloge:

eskulin bujon (Torlak, Srbija), arginin bujon i MRS bujon sa 6,5% NaCl.

Arginin bujon sadrţi sledeće sastojke: 5g/l triptofan, 3g/l L-arginin, 0.5g/l glukoza i 2

g/l K2HPO4.

Za odreĎivanje tehnoloških karakteristika BMK izolata korišćeme su sledeće podloge:

rekonstruisani MRS agar uz dodatak (saharoze, glukoze i fruktoue), mlečni citratni agar,

mlečni agar i tributirin agar (Merck).

Za ispitivanje sinteze egzopolisaharida pravljen je rekonstruisani MRS agar koji

sadrţi sledeće sastojke: 10 g/l pepton, 5 g/l ekstrakt kvasca, 10 g/l mesni ekstrakt, 20 g/l

saharoza, 2 g/l K2HPO4, 5 g/l natrijum acetat, 0.2 g/l MgSO4, 0.05 g/l MnSO4 x H2O, 1.08 g/l

TWEEN-80, 2 g/l amonijum citrate, 15 g/l Agar-agar i 1 l destilovane vode.

16

Mlečni citratni agar sadrţi 10 g obranog mleka u prahu, hidrolizat kazeinat 2,5 g,

glukozu 5 g, Agar-agar 18 g, destilovane vode 1 l.

Mlečni agar sadrţi 1 g obranog mleka u prahu, 5 g peptona, 3 g ekstrakta kvasca, 15 g

Agar-agar i 1 l destilovane vode.

3.2. Metode

3.2.1. Izolacija bakterija mlečne kiseline

Uzorci nadeva i peglanih kobasica (10 g) su aseptično preneti u 90 ml natrijum citrata

i homogenizovani u trajanju od 30 minuta na sobnoj temperaturi. Izolovanje BMK raĎeno je

metodom sukcesivnog razreĎenja. Ukupan broj bakterija, kvasaca i BMK odreĎen je

brojanjem izraslih kolonija nakon inkubacije ploča sa hranljivim agrom, Saburo dekstroznim

agrom, MRS i M17 agrom. Za rast BMK u ploče je nalivan još jedan sloj iste podloge kako bi

se postigli mikroareofilni uslovi. Obeleţene ploče su inkubirane na temperaturi od 30 °C u

trajanju od 48 h.

Nakon inkubacije izdvojeno je po 20 kolonija sa ploča u kojima su se nalazile MRS i

M17 podloga. Prečišćavanje izolovanih bakterija izvršeno je standardnom metodom

iscrpljivanja eze. Izvršena je i preliminarna identifikacija izolata bojenjem po Gramu i testom

na katalazu. Čistoća svakog izolata proverena je mikrosposkim posmatranjem gde je praćen

oblik ćelija. Kada su dobijeni čisti izolati, bakterijske kulture su čuvane u mikrotubama sa

tečnim podlogama (MRS i M17 bujon) uz dodatak glicerola na temperaturi od - 20 °C.

3.2.2. Fenotipska karakterizacija izolata

Grampozitivni i katalaza-negativni izolati su podvrgnuti daljem ispitivanju na

osnovu intefikacionih šema za rodove Enterococcus, Lаctococcus, Lаctobаcillus i

Leuconostoc (Bergy`s Manuel, 1986).

Primenjeni su sledeći testovi za fenotipsku karakterizaciju:

Produkcija CО2

Sposobnost hidrolize arginina

Sposobnost hidrolize eskulina

Rast u bujonu sa 6,5 % NaCl

Rast u bujonu na 45°C

Testiranje produkcije CO2 iz glukoze raĎeno je u MRS bujonu sa Durham-ovim

cevčicama. Ukoliko dolazi do produkcije CO2 jasno se vidi nakupljeni gas u cevčicama.

17

Za testiranje sposobnosti hidrolize arginina korišćen je arginin bujon, dok je za

sposobnost hidrolize eskulina korišćen eskulin bujon. Nakon inkubacije izolata u arginin

bujonu dodato je nokoliko kapi fenil crvenog. Pojava crvene boje označava pozitivnu

reakciju, a pojava ţute boje označava negativnu reakciju.

Za testiranje sposobnosti hidrolize eskulina korišćen je eskulin bujon. Nakon

inkubacije izolata u eskulin bujonu dodato je nekoliko kapi 2 % rastvora FeCl3. Pojava crnog

taloga označava pozitivnu, a odsustvo taloga negativnu reakciju.

Rast u medijumu sa 6,5 % NaCl praćen je u MRS bujonu i zamućenje ove podloge

nakon inkubacije bilo je potvrda rasta odgovarajućeg izolata.

Rast u bujonu na 45°C lako je uočljiv kao zamućenje, nakon inkubacije

odgovarajućeg izolata na temperature od 45°C.

3.2.3. Molekularna identifikacija izolata

Identifikacija izolata BMK izvršena je na Institutu za molekularnu genetiku i

genetičko inţenjerstvo (IMGGI) u Beogradu, do nivoa vrste. Ekstrakcija ukupne DNK iz

čistih kultura BMK, umnoţavanje njihovih DNK fragnemata PCR reakcijom sa (GTG)5-

prajmerom, elktroforeza, priprema DNK uzoraka za sekvenciranje i sekvenciranje

umnoţenih fragmenata raĎeno je po već opisanoj metodi (Nikolić sa sar., 2008).

3.2.4. Tehnološka karakterizacija izolata

Tehnološka karakterizacija izolata je izvršena u cilju potencijalnog korišćenja sojeva u

starter kulturama za proizvodnju fermentisanih kobasica. Za karakterizaciju BMK izvršeni su

sledeći testovi:

Rast na mlečno citratnom agru

Rast na mlečnom agru

Rats na tributirin agru

Rast i produkcija egzopolisaharida na glukozi, fruktozi i saharozi

Sposobnost korišćenja citrata raĎena je na citratnom agru. Tamno plave kolonije

ukazuju da odgovarajući soj moţe da koristi citrate (Kempler and McKay, 1980)

Mlecni agar je korišćen da bi se ispitala proteolitička aktivnost datih sojeva. Praćen je

rast na podlozi i sposobnost vršenja proteolize kazeina do rastvorljivih nitratnih jedinjenja.

Tributirin agar je korišćen kako bi se ispitala lipolitička aktivnost datih sojeva. Praćen

je rast na podlozi i sposobnost vršenja lipolize.

18

Sposobnost sinteze egzopolisaharida praćen je na rekonstruisanom MRS agru sa

dodatkom šećera (glukoze, fruktoze i saharoze). Egzopolisaharidi se javljaju u vidu providne

kapsule iznad formiranih kolonija.

19

4. REZULTATI I DISKUSIJA

4.1. Ukupan broj bakterija

Kako bi se utvrdio ukupan broj aerobnih bakterija i bakterija mlečne kiseline u nadevu

za pravljenje kobasica i uzorcima peglane krobasice, nakon 30 i 60 dana fermentacije, uzorci

su zasejavani na različite podloge. Hranljivi agar je korišćen za odreĎivanje ukupnog broja

bakterija, dok su MRS i M17 podloge korišćene za rast BMK. Rezultati su prikazani na slici

1. U nadevu, odnosno mesu sa začinima, ukupan broj bakterija na hranljivom agaru je bio

nešto veći u odnosu na detektovan broj bakterijskih ćelija na MRS i M17 podlozi koje su

selektivne za BMK. Tokom praćenog perioda fermentacije, broj kolonija raste na svim

podlogama do 30. dana fermentacije, a zatim lagano opada. Najveći broj bakterija zabeleţen

je na MRS podlozi nakon 30. dana fermentacije (8,04 logN/ml) i mada kasnije broj

bakterijskih kolonija na ovoj podlozi opada, on je najveći i nakon 60 dana fermentacije. S

obzirom da je MRS podloga selektivna za rast laktobacila, verovatno je broj laktobacila

znatno veći u odnosu na druge grupe bakterija. Broj kolonija na hranljivom agaru i M17

podlozi je pribliţno isti u uzorcima peglane kobasice starim 30 i 60 dana. Ovaj rezultat

ukazuje da je broj laktokoka, streptokoka i enterokoka za čiji rast je M17 podloga selektivna,

verovatno mali u uzorcima.

Slika 1. Broj kolonija aerobnih bakterija (HA) i bakterija mlečne kiseline (MRS, M17) tokom

fermentacije peglane kobasice

20

4.1.1. Fenotipska identifikacija izolata

Iz uzorka nadeva (N) i dva uzorka peglanih kobasica (nakon 30 dana zrenja-PK i 60

dana zrenja-PF) izolovano je 60 izolata. MeĎu ovim izolatima, dva su bila Gram pozitivna i

katalaza pozitivna. Svi ostali izolati bili su Gram pozitivni i katalaza negativni tako da su

preliminarno identifikovani kao predstavnici BMK. Na osnovu morfološke i fenotipske

karakterizacije, BMK izolati su svrstani u 6 grupa (Tabela2).

Tabela 2 Grupisanje BMK izolata na osnovu fenotipskih karakteristika

Grupe Oblik ćelija Produkcija

CO2

Rast

na

45oC

Rast na

6,5%

NaCl

Hidroliza

arginina

Hidroliza

eskulina

Broj

izolata u

grupi

I Bacili različite

morfologije

- - - +/- v 33

II Bacili sa

zakrivljenim

krajevima

- - - - v 9

III Kokobacili - - - + + 2

IV Kokobacili - + + - - 2

V Bacili + - + - +/- 7

VI Ovalne ćelije u

parovima

+ - - +/- - 5

- Negativan rezultat; + Pozitivan rezultat; +/- Slabije pozitivan rezultat; v Varijabilni rezultati

Najveći broj izolata je svrstan u prve dve grupe homofermentativnih bacila koji su se

meĎusobno razlikovali po mogućnosti sinteze amonijaka. Prva grupa ovih bacila, u kojoj se

nalazi 33 izolata, posedovala je sposobnost hidrolize arginina do amonijaka, dok izolati iz

druge grupe nisu imali ovu sposobnost. U okviru prve grupe, izolati su se meĎusobno

razlikovali po sposobnosti hidrolize eskulina. U dve grupe homofermentativnih izolata (III i

IV) svrstani su izolati koji su po morfologiji bili kokobacili (Tabela 2). Ove dve grupe izolata

su se razlikovale po svim ostalim fenotipskim karakteristikama. Heterofermentativni bacili

svrstani su u grupu V, dok su heterofermentativni izolati sa ovalnim ćelijama u grupi VI.

Dva izolata koja su bila Gram i katalaza pozitivna, po morfologiji su koke koje nakon

deobe formiraju specifične grupacija ćelija u obliku grozdova, tako da su identifikovane kao

pripadnici roda Staphylococcus.

21

4.2. Molekularna identifikacija izolata

Za molekularnu identifikaciju izolata, iz svake prikazane fenotipske grupe, izabran je

odreĎen broj izolata. Izabrani izolati su grupisani na osnovu rep-PCR metode, molekularnog

fingerprintinga uz korišćenje (GTG)5 prajmera. Slike DNK otisaka izolata prikazane su na

slici 2.

Slika 2. (GTG)5 DNK profili izolata *brojevi na slici označavaju broj izolata na gelu

Za dalju molekularnu identifikaciju izolata putem sekvenciranja, izabrani su izolati na

osnovu različitih (GTG)5 DNK profila. U tabeli 3 prikazani su rezultati sekvenciranja kao i

identifikacija ostalih izolata za koje je raĎen rep-PCR.

Tabela 3. Identifikacija izolata na osnovu rep-PCR metode i sekvenciranja

Ime soja Vrsta na osnovu sekvence gena koji kodira 16S rRNK

1. PK-1 Lactobacillus sakei strain MFPC16D14-01 16S ribosomal RNA gene,

partial sequence

2. PK-3

Carnobacterium divergens strain NBRC 15683 16S ribosomal RNA

gene, partial sequence

3. PK-5 Lactobacillus curvatus strain 24-3 16S ribosomal RNA gene, partial

sequence

4. PK-6a Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum partial 16S rRNA

gene, strain qz-534

22

9. PK-14

Uncultured bacterium clone BVESI3B63 16S ribosomal RNA gene,

partial sequence Lactobacillus curvatus strain

B515 16S ribosomal RNA gene, partial sequence

Lactobacillus sp. K4-4 gene for 16S ribosomal RNA, partial sequence

10. PK-15 Na osnovu GTG profila utvrĎena identičnost sa sojem pod rednim

brojem 4.

11. PK-16 Na osnovu GTG profila utvrĎena identičnost sa sojem pod rednim

brojem 4.

14. PK-21 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides gene for 16S

ribosomal RNA, partial sequence, strain: JCM 11043

16. M-8 Weissella viridescens partial 16S rRNA gene, strain R-53536, isolate

H1-3

17. PK-4 Na osnovu GTG profila utvrĎena identičnost sa sojem pod rednim

brojem 9.

19. PK-17 Lactobacillus sakei strain 25 16S ribosomal RNA gene, partial

sequence

20. PK-18 Na osnovu GTG profila utvrĎena identičnost sa sojem pod rednim

brojem 19.

24. M-18 Na osnovu GTG profila utvrĎena identičnost sa sojem pod rednim

brojem 16.

27. M-1 Na osnovu GTG profila utvrĎena identičnost sa sojem pod rednim

brojem 16.

28. M-7 Weissella viridescens strain H 16S ribosomal RNA gene, partial

sequence

30. M-9 Na osnovu GTG profila utvrĎena identičnost sa sojem pod rednim

brojem 28.

33. M-15 Lactobacillus sakei strain MFPC16D14-01 16S ribosomal RNA gene,

partial sequence

23

35. M-2

Carnobacterium maltaromaticum strain S_S_MRS_4 16S ribosomal

RNA gene, partial sequence Uncultured

Vagococcus sp. partial 16S rRNA gene, isolate 18T_13897

36. M-4

Uncultured bacterium clone GON3h11 16S ribosomal RNA gene,

partial sequence

Weissella viridescens gene for 16S ribosomal RNA, partial sequence,

strain: JCM 1064

37. M-14 Lactobacillus sakei gene for 16S ribosomal RNA, partial sequence,

strain: qz1215

39. M-13 Na osnovu GTG profila utvrĎena identičnost sa sojem pod rednim

brojem 37.

48. PF-4

Uncultured bacterium clone bat_aaj07e04 16S ribosomal RNA gene,

partial sequence

Lactobacillus sakei gene for 16S rRNA, partial sequence, strain:

NRIC 1609

54. PF-17b Na osnovu GTG profila utvrĎena identičnost sa sojem pod rednim

brojem 9.

55. PF-18

Lactobacillus sakei strain M1-1 16S ribosomal RNA gene, partial

sequence

Uncultured bacterium clone bat_aaj06d09 16S ribosomal RNA gene,

partial sequence

56. PF-19

Uncultured bacterium clone bat_aaj06d09 16S ribosomal RNA gene,

partial sequence

Lactobacillus sakei strain MFPC16D14-01 16S ribosomal RNA gene,

partial sequence

58. PF-10 Lactobacillus sakei strain MFPC16D14-01 16S ribosomal RNA gene,

partial sequence

Rezultati dobijeni molekularnom identifikacijom izolata, rep-PCR metodom i

sekvenciranjem, podudarali su se sa grupisanjem izolata na osnovu fenotipskih karakteristika.

Tako su izolati iz I fenotipske grupe identifikovani kao Lactobacillus sakei, dok su izolati iz

druge grupe identifikovani kao Lactobacillus curvatus. Kokobacili iz fenotipske grupe III I

24

IV identifikovan su kao predstavnici roda Carnobacterium i to Carnobacterium

maltaromaticum i Carnobacterum divergens. Heterofermentativni bacili (V grupa) pripadaju

vrsti Weissella viridescens, dok su heterofermentativne kokoidne BMK identifikovane kao

Leuconostoc mesenteroides.

4.3. Mikroflora analiziranih uzoraka

Identifikacija izolata molekularnim metodama, kao i fenotipska karakterizacija,

omogućili su karakterizaciju mikroflore u analiziranim uzorcima. Na slici 3 prikazana je

učestalost zastupljenosti različitih vrsta BMK u uzorcima.

Slika 3. Učestalost zastupljenosti različitih vrsta BMK u uzorcima

Najveći broj različitih vrsta BMK detektovan je u uzorku nadeva od koga su pravljene

peglane kobasice. Najdominantnije vrste BMK u ovom uzorku bile su Weissella viridescens

(39% izolata) i Lactobacillus sakei (33% izolata). Izolati identifikovani kao Carnobacterium

maltaromaticum i Carnobacterum divergens izolovani su u manjem procentu (17% i 11%).

Mikroflora koja se nalazi u nadevu za pravljenje kobasica potiče od mesa, začina, spoljašnje

sredine i opreme koja se koristi pri proizvodnji. Weissella viridescens, Carnobacterium

maltaromaticum i Carnobacterum divergens su vrste BMK koje se često izoluju iz sirovog

mesa a čija uloga u daljoj fermentaciji mesa još uvek nije u potpunosti razjašnjena (Abriouel i

sar., 2015; Alibi i sar., 2016). Uglavnom se ove vrste BMK smatraju kontaminentima u mesu

i mesnim preraĎevinama i naglašava se njihov negativan uticaj na kvalitet mesa usled

heterofermentativnog metabolizma i formiranja sluzi. Lactobacillus sakei je bakterija koja se

često izoluje iz različitih vrsta mesa i predstavlja početnu starter kulturu za fermentciju

tradicionalnih fermentisanih proizvoda od mesa (Doulgeraki i sar., 2012).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

N PK PF

Učesta

lost iz

ola

cije

(%

)

Uzorci

Carnobacterium divergens

Carnobacterium maltaromaticum

Weissella viridescens

Leuconostoc mesenteroides

Lactobacillus curvatus

Lactobacillus sakei

25

Lactobacillus sakei je dominantna vrsta i u uzorcima kobasica PK i PF. U uzorku

kobasica nakon 30 dana zrenja (PK), Lactobacillus sakei izolovan je sa učestalošću od 46%.

Iz ovog uzorka izolovani su i izolati identifikovani kaao Lactobacillus curvatus (32% izolata)

i Leuconostoc mesenteroides (22% izolata). Nakon 60 dana zrenja, iz uzorku peglanih

kobasica izolovane su samo dve vrste, Lactobacillus sakei (95%) i Lactobacillus curvatus

(5%). Laktobacili koji predstavljaju dominantnu mikrofloru peglanih kobasica izolovani su iz

drugih vrsta suvih fermentisanih kobasica koje se proizvode u Srbiji. Iz Sremskog i Lemičkog

kulena izolovane su vrste Lactobacillus brevis, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus

salivarisu, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum i

Lactobacillus fermentum kao i predstavnici rodova Leuconostoc i Lactococcus (Vasilev i sar.,

2015). U jednom drugom istraţivanju, iz Petrovačke kobasice izolovane su vrste

Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus

pentosaceus, Enterococcus casseliflavus i Enterococcus durans. (Milicevic i sar., 2014).

Pri proizvodnji kobasica, osnovna uloga laktobacila je sinteza različitih organskih

kiselina, naročito mlečne kiseline što dovodi do smanjenja pH vrednosti nadeva koji

fermentiše. Ovakva promene pH vrednosti dovodi do različitih hemijskih, fizičkih i

mikrobioloških procesa koji inhibiraju rast neţeljenih mikroorganizama ali omogućavaju

razvoj ukusa, arome, boje i teksture kobasica (Maksimović i sar., 2015).

26

5. ZAKLJUČCI

Na osnovu prikazanih rezultata mogu se doneti sledeći zaključci:

1) iz dva uzorka peglanih kobasica i nadeva za pravljenje kobasica, izolovano je 58

BMK izolata i dva izolata koja pripadaju rodu Staphylococcus,

2) BMK izolati su svrstani u 6 grupa na osnovu fenotipskih testova,

3) Molekularnom identifikacijom izolati su identifikovani do nivoa vrsta Lactobacillus

sakei, Lactobacillus curvatus, Carnobacterium maltaromaticum, Carnobacterum

divergens, Weissella viridescens i Leuconostoc mesenteroides,

4) Izolati identifikovani kao Lactobacillus sakei izolovani su iz svih analiziranih uzoraka

i predstavljaju dominantnu mikrofloru peglanih kobasica.

27

6. LITERATURA

Agapi I. Doulgerakia , Danilo Ercolini, Francesco Villani, George-John E. (2012). Nychas

Spoilage microbiota associated to the storage of raw meat in different conditions International

Journal of Food Microbiology 157 (2012) 130–141

Ammor, S. M., Mayo, B. (2007). Selection criteria for lactic acid bacteria to be used as

functional starter cultures in dry sausage production: An update. Meat Science 76, 138–146.

Babić, Lj., Babić, M. (2000). Sušenje i skladištenje, Poljoprivredni fakultet, Novi Sad.

Bacus, J. N. (1986). Fermented meat and poultry products. In A. M. D. Pearson (Ed.),

Advances in meat and poultry microbiology (pp. 123–164). London: Macmillan.

Bergy`s Manuаl of Systematic Bacteriology (2004) Edited by Garrity, G.M., Bell, J.A. and

Lilburn, T.G. Springer, New York-Berlin-Heidelberg, Second Edition, p.199.

Bruna, J. M., Hierroa, E. M., Hoz, L., Mottram, D. S., Fernandez, M. Ordonez, J. A. (2003)

Changes in selected biochemical and sensory parameters as affected by the superficial

inoculation of Penicillium camemberti on dry fermented sausages. International Journal of

Food Microbiology 85, 111 –125.

Čavlek, B. (2002). Boja mesa i mesnih preraĎevina. Meso-prvi hrvatski časopis o mesu, 4, 16,

23-30.

Čavlek, B., Mavračić, Z. (1993). Utjecaj dodataka na zrenje kobasica. Prehrambeno-

tehnološka i biotehnološka revija, 31, 1, 57-62.

Danilović, B. (2012). Promena populacije bakterija mlečne kiseline u toku zrenja Petrovačke

kobasice (Petrovská klobása). Doktorska disertacija, Tehnološki fakultet u Leskovcu,

Univerzitet u Nišu.

Dellaglio, S., Casiraghi, E., Pompei, C. (1996). Chemical, physical and sensory attributes for

the characterization of an Italian dry-cured sausages. Meat Science, 42, 25-32.

Feiner, G. (2006). Meat products handbook. Practical science and technology. CRC Press,

Boca Raton, Boston, New York, Washington, DC.

Freixanet, L. (2007). Additives and ingredients in the manufacture of whole muscle cooked

meat products. Girona, Spain. Available: www.metalquimia.com

Hammes, W., Haller, D., Ganzle, M. (2008) Fermented meat. In E. Farnworth (Ed.),

Handbook of fermented functional foods. New York: CRC Press

Hesseltine, C. W., Wang, H. L. (1980). The importance of traditional fermented foods.

Bioscience, 30, 402–404.

Honikel, K. O. (2008). The use and control of nitrate and nitrite for the processing of meat

products. Meat Science, 78, 1 – 2, 68 – 76.

Hugas, M., Monfort, J. M. (1997) Bacterial starter cultures for meat fermentation. Food

Chemistry 59,547-554.

28

Ikonić, P. (2013). Razvoj procesa sušenja i zrenja tradicionalne fermentisane kobasice

(Petrovská klobása) u kontrolisanim uslovima. Doktorska disertacija, Tehnološki fakultet,

Novi Sad.

Incze, K. (2004) Sausages, types of. In C. Devine, Dikeman (Eds), Encyclopedia of meat

sciences. Oxford, UK: Elsevier.

Janković, V. (2013). Promene parametara zdravstvene ispravnosti Petrovačke kobasice tokom

proizvodnje u tradicionalnim i kontrolisanim uslovima. Doktorska disertacija, Tehnološki

fakultet, Novi Sad.

Joksimović, J. (1978). Tehnologija suvomesnatih proizvoda i kobasica. Poljoprivredni fakultet

univerziteta u Beogradu, Zemun.

Kempler, M.G. and McKay L.L. (1981) Biochemistry and Genetics of Citrate Utilization in

Streptococcus lactis ssp. diacetylactis, Journal of Dairy Science, 64: 1527-1539.

Lembeck, L. G. (2009). Untersuchungen zur Produktionsqalität traditionellhandwerklich

hergestellter Rohwürste unter Berücksichtigung von Listeria monocytogenes, Inaugural-

Dissertation, Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde der Justus-Liebig-Univerität

Giessen.

Lucke, F.K. (2000) Fermented meats. In Lund, B. M., Baird-Parker, T. C. Gould,G. W.

(Eds.) The Microbiological safety and quality of food. Gaithersburg, USA: Aspen Publishers,

Inc.

Lucke, F. K. (1974). Fermented sausages. In B. J. B.Wood (Ed.), Microbiology of fermented

foods (pp. 41–49). London: Applied Science Publishers.

Lücke, F. K. (2000) Utilization of microbes to process and preserve meat. Meat Science 56,

105-115.

Lucke, F.K. (2000) Fermented meats. In Lund, B. M., Baird-Parker, T. C. Gould,G. W.

(Eds.) The Microbiological safety and quality of food. Gaithersburg, USA: Aspen Publishers,

Inc. Martinović, A., Vesković Moračanin, S. (2006). Primena starter kultura u industriji mesa.

Tehnologija mesa, 47, 5-6, 216-230.

Maksimović Ţ., Hulak N., Vuko M., Kovačević V., Kos I., Mrkonjić M. (2015). Lactic acid

bacteria in traditional dry sausage production (No 6), 575-580

Milicevic B., Danilovic B., Dolec N., Kozachinski L., Dobranic V., Savic D. (2014).

Microbiota of the fermented sausages: influence to product quality and safety Bulgarian

Journal of Agricultural Science, 20 (No 5), 1061-1078

Montagné, P., Turgeon C., Fround N. (1961). Larousse gastronomique: the encyclopedia of

food, wine and cookery.New York, Crown Publishers. The English translation of the 1938

edition

Nikolić, M., Terzić-Vidojević, A., Jovčic, B., Begović, J., Golić, N. and Topisirović, Lj.

(2008) Characterization of lactic acid bacteria isolated from Bukuljac, a homemade goat`s

milk cheese, International Journal of Food Microbiology, 122: 162-170.

29

Petrović, Lј., Dţinić, N., Tomović, V., Lazić, V., Jokanović, M., Tasić, T., Ikonić, P., Šojić,

B., Savatić, S., Krkić, N. (2011b). Nova tehnologija pakovanja Petrovačke kobasice, Tehničko

rešenje.

Petrović, Lj. (2012). Neautorizovana predavanja (PP prezentacija): Tehnologija proizvodnje i

prerade mesa. Tehnološki fakultet, Novi Sad.

Petrović, Lj., Dţinić, N., Ikonić, P., Tasić, T., Tomović, V. (2011a). Quality and safety

standardization of traditional fermented sausages. Tehnologija mesa, 2, 234-244.

Petrović, Lj., Dţinić, N., Tomović, V., Ikonić, P., Tasić, T. (2007). Tehnološki Elaborat o

načinu proizvodnje i specifičnim karakteristikama proizvoda Petrovská klobása (Petrovačka

kobasica). Rešenje o registraciji oznake geografskog porekla Petrovská klobása (Petrovačka

kobasica) kao IMENA POREKLA za suvomesnati proizvod-fermentisanu kobasicu, broj:

9652/06 Г-03/06, 21. 05. 2007. godine, Republika Srbija, Zavod za intelektualnu svojinu.

Pravilnik o kvalitetu usitnjenog mesa, poluproizvoda od mesa i proizvoda od mesa. Sl. glasnik

RS, br. 31/2012.

Pravilnik o kvalitetu začina, ekstrakata začina i mešavina začina. Sl. glasnik RS, br. 72/2014.

Pravilnik o prehrambenim aditivima. Sl. glasnik RS, br. 63/2013.

Petrović, Lj., Ikonić, P., Jokanović, M., Dţinić, N., Tomović, V., Tasić, T. (2009). Uticaj

kavaliteta crvene začinske paprike na boju Petrovske klobáse-tradicionalne fermentisane suve

kobasice, Zbornik kratkih sadrţaja, MeĎunarodno 55. savetovanje industrije mesa, Tara, 62.

Petrović, Lj., Tasić, T. (2012). Organska i tradicionalna proizvodnja i prerada mesa. Organska

prerada, Urednici Carić, M., Babović, J. (st. 91-114). Fakultet za ekonomiju i inţenjerski

menadţment, Novi Sad, Srbija.

Rahelić, S., Joksimović, J., Bučar, F. (1980). Tehnologija prerade mesa. Tehnološki fakultet,

Novi Sad.

Rede, R., Petrović, Lj. (1997). Tehnologija mesa i nauka o mesu. Tehnološki fakultet, Novi

Sad.

Sana A, Asma F, Jalel B. (2016) Implication of Corynebacterium species in food’s

contamination 416. Journal of Coastal Life Medicine; 4(5): 416-419

Savić, M., Popović, V. (2008). Svojstva, proizvodnja i promet začina. Institut za ekonomiku

poljoprivrede Beograd, Beograd, 1-3.

Šimko, P. (2002). Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in smoked meat

products and smoke flavouring food additives. Journal of Chromatography B, 770, 3–18.

Talon, R., Leroy, S., Lebert, I. (2007). Microbial ecosystems of traditional fermented meat

products: The importance of indigenous starters. Meat Science, 77, 55–62.

Toldra F. (2002) Dry-cured meat products. Food and Nutrition Press, Inc. Trumbull, USA

30

Vasilev D., Aleksić B., Tarbuk A., Dimitrijević M., Karabasil N., Vasiljević N. (2015).

Identification of Lactic Acid Bacteria Isolated from Serbian Traditional Fermented Sausages

Sremski and Lemeski Kulen Procedia Food Science Volume 5, 300-303

Vuković I., Saičić S., Vasilev D. (2011b). Prilog poznavanju vaţnijih parametara kvaliteta

tradicionalnog (domaćeg) kulena. Tehnologija mesa, 1, 134–140.

Vignolo, G., Fontana, C. Fadda, S. (2010). Semidry and Dry Fermented Sausages. In:

Handbook of meat processing, edited by F. Toldrá (pp. 379-398). Ames, Iowa, USA:

Blackwell Publishing.

Vuković, I. (2012). Osnove tehnologije mesa. Četvrto izdanje, Veterinarska komora Srbije,

Beograd.

Zdolec, N. (2007): Uticaj zaštitnih kultura i bakteriocina na sigurnost i kvalitet fermentiranih

kobasica. Doktorska disertacija. Veterinarski fakultet Univerzitet u Zagrebu.

Прилог 5/1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Данило Пенић

Ментор, МН: Наташа Јоковић

Наслов рада, НР: Идентификација бактерија млечне киселине

изолованих из пеглане кобасице Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2018.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

30 стр. ; 3 слике, 3 табела

Научна област, НО: биологија

Научна дисциплина, НД: Микробиологија хране

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: пиротска пеглана кобасица, бактерије млечне киселине, молекуларна индетификација

УДК 673.05+547.472.3]:637.524

Чува се, ЧУ: библиотека Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: Пиротска пеглана кобасица је врста ферментисаних кобасица која се производи

традиционалним поступком на територији општине Пирот. Припада групи суво ферментисаних кобасца и производи се од говеђег, овчјег и козијег меса. У цилју утврђиванја промене микрофлоре бактерија млечне киселине током 60 дана зрења пеглане кобасице, анализирана су 2 узорка пегланих кобасица у различитим фазама зрења, као и надев од којих су кобасице произведене. Добијени изолати су фенотипским тестовима окарактерисани и подељени у различите групе. Одређен број изолата из сваке фенотипске групе је даље индетификован молекуларним методама, реп-ПЦР методом са (ГТГ) прајмером и секвенциранем ДНК. Из анализираних узоррака изоловано је 58 изолата бактерија млечне киселине и два изолата која припадају роду Staphylococcus. Изолати бактерија млечне киселине сврстани су у 6 група на основу фенотипских тестова.

Датум прихватања теме, ДП: 08.10.2018. Датум одбране, ДО:

30.10.2018. Чланови комисије, КО: Председник: дp Татјана Михаjилов-Крстев

Члан: дp Зорица Стојановић-Радић

Члан, ментор: дp Наташа Јоковић

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: university degree thesis

Author, AU: Danilo Penić

Mentor, MN: Nataša Joković

Title, TI: Identification of lactic acid bacteria isolated from

“peglana” sausa

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2018

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

30 p. ; 3 pictures, 3 tables

Scientific field, SF: biology

Scientific discipline, SD: food microbiology

Subject/Key words, S/KW: “peglana” sausage, lactic acid bacteria, molecular identification

UC 673.05+547.472.3]:637.524

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: “Peglana” sausage is a type of fermented sausage produced by the traditional process in the territory of the municipality of Pirot. It belongs to a group of dry fermented sausages and it is produced from beef, sheep and goat meat.In order to determine the change in lactic acid microflora in “peglana” sausage during 60 days of fermentation, two samples of fermented sausages in different stages of ripening were analyzed, as well as mixture of meat and spices of which sausages were produced. The obtained isolates were phenotypically tested and divided into different groups. The isolates from each phenotypic group were further identified with molecular methods, a rep-PCR method with (GTG)5 primer and DNA sequencing.Fifty eight isolates of lactic acid bacteria and two isolates belonging to the genus Staphylococcus were isolated from the analyzed samples. Isolates of lactic acid bacteria were classified into 6 groups based on phenotypic tests.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 08.10.2018.

Defended on, DE: 30.10.2018.

Defended Board, DB: President: PhD Tatjana Mihaliov-Krstev

Member: PhD Zorica Stojanović-Radić

Member, Mentor: PhD Nataša Joković