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I

UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

MAESTRÍA EN INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS

Identificación de Arbovirus circulantes en una cohorte

de pacientes con síndrome febril en el municipio de Villa

del Rosario, Norte de Santander

MARLEN YELITZA CARRILLO HERNÁNDEZ

Proyecto de Maestría presentado al Programa de Maestría en Investigación en Enfermedades Infecciosas de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad, como parte de los requisitos para la obtención del título de Magíster en Investigación en Enfermedades Infecciosas.

BUCARAMANGA

II

MARLEN YELITZA CARRILLO HERNÁNDEZ

Identificación de Arbovirus circulantes en una cohorte

de pacientes con síndrome febril en el municipio de Villa

del Rosario, Norte de Santander

Tutor: Dra. Marlen Martínez Gutiérrez B.Sc. M.Sc. Ph.D.

Co-Tutor: Dr. Julián Ruiz Sáenz MV. M.Sc. Ph.D

BUCARAMANGA 2016

III

______________________________________

Marlen Martínez Gutiérrez B.Sc. M.Sc. Ph.D.

IV

A mi madre, por ser mi ejemplo, mi motor y la luz de mi vida.

A mi padre, a quien siempre le conté mis sueños, ahora aunque no estés aquí, cada triunfo siempre estará dedicado a ti.

V

AGRADECIMIENTOS

A mi tutora, Dra. Marlen Martínez Gutiérrez y co-tutor, Dr. Julián Ruiz Saenz por creer en mí, brindarme su experiencia, enseñarme y siempre estar presente en la ejecución de esta investigación.

A la E.S.E hospital Jorge Cristo Sahium por permitir llevar a cabo este estudio en

su institución, darnos apoyo con el personal del laboratorio clínico, en especial la coordinadora del laboratorio Lucy Amparo Jaimes y la auxiliar de laboratorio Martha Collantes.

A la coordinadora del laboratorio E.S.E hospital Jorge Cristo Sahium, Lucy Jaimes

por su cordialidad y amabilidad. Ayudarnos con gestiones para cumplir con los requisitos exigidos por la subgerencia de servicios en salud del hospital.

Al profesor Sergio Yebrail por sus consejos y apoyarme en los procedimientos que

se realizaron en el laboratorio de investigaciones biomédicas y biotecnológicas (LIBB), Universidad de Santander (UDES Bucaramanga).

A la sede de investigación universitaria (SIU) y Programa de Estudio y Control de

Enfermedades Tropicales (PECET) de la Universidad de Antioquia por prestarnos sus instalaciones y equipos

Al profesor Wbeimar Aguilar del Área de inmunovirología de la SIU de la

Universidad de Antioquia por su ayuda en los procedimientos que se realizaron para la q-PCR

A mi madre, familia y pareja por estar pendientes de mí, brindarme su apoyo moral

y amor incondicional.

http://fundacionudea.com/v2/?page_id=457


VI

LISTA DE FIGURAS Figura 1. Localización geográfica del lugar de muestreo………………….….…..…….29 Figura 2. Distribución temporal de la infección por DENV, CHIKV y ZIKV………......31 Figura 3. Serotipificación de DENV por PCR multiplex convencional……....…………32 Figura 4. Identificación por PCR convencional de CHIKV…………………...………..32 Figura 5. Identificación por PCR en tiempo real de ZIKV……………………………....33 Figura 6. Análisis filogenético de la cepa DENV-1 circulante en Villa del Rosario………………………..........................................................................................35 Figura 7. Análisis filogenético de cepas de DENV-2 circulantes en Villa del Rosario……………………………………………………………..…………..……....36 Figura 8. Análisis filogenético de la cepa DENV-3 circulante en Villa del Rosario....………………………………………………………………………..……... 37 Figura 9. Análisis filogenético de cepas de CHIKV circulantes en Villa del Rosario..………………………………………………………………………………....38

VII

LISTA DE TABLAS Tabla 1. Equipos de laboratorio…………………………….........………………..…....21 Tabla 2. Primers específicos utilizados en la PCR convencional de DENV……..….....25 Tabla 3. Primers específicos utilizados en la PCR de serotipificación………………...26 Tabla 4. Primers específicos utilizados en la PCR CHIKV…..……………………......26 Tabla 5. Primers específicos utilizados en la qPCR de ZIKV……………………........27 Tabla 6. Distribución por sexo y edad de los pacientes positivos y negativos a los arbovirus evaluados………..………………………………………………..…….….....30 Tabla 7. Prevalencia, tasa de ataque y distribución por sexo y edad de los pacientes positivos a DENV, CHIKV y ZIKV……………………………….………..…….…....33 Tabla 8. Prevalencia, tasa de ataque y distribución por sexo y edad de los pacientes con co-infecciones…………………………………………………………..…………….....39

VIII

LISTA DE ABREVIATURAS ADN: Acido desoxirribonucleico ADNc: ADN complementario o ADN copia ARN: Ácido ribonucleico Bip: Molécula GRP78 C: Cápside CDC: Centers for Disease Control and Prevention CHIKV: Virus del Chikungunya CT: Cycle threshold d.C: Antes de cristo D.E: Desviación estándar D.G: Dengue Grave DCSA: Dengue con signos de alarma DC-SIGN: Dendritic cell-specific Intracellular adhesión molecule Grabbing Nonintering DENV: Virus Dengue dNTP: Desoxinucleótido DSSA: Dengue sin signos de alarma dTTP: timidina trifosfato dUTP: difosfatasa dUTP E.S.E: Empresa social del estado E: envoltura ECSA: Genotipo CHIKV del Este, Centro, Sur de África EPS: Entidad promotora de salud FRET: transferencia de energía de resonancia fluorescente IC: Intervalo de confianza INF-tipoI: Interferón tipo I INS: Instituto nacional de salud IPS: Institución prestadora de salud Kb: Kilo base KDa: Kilo Dalton M.W: Marcador de peso molecular M: Membrana NS: No estructurales NTPasa: nucleósido trifosfatasa O.P.S: Organización panamericana de la salud ORF: Open reading frame (Marco abierto de lectura) Pb: par de bases nitrogenadas pCHIK-CIR: reumatismo inflamatorio crónico post-CHIK PCR: Reacción en cadena de la polimerasa Pr: peptido Pr

IX

pr-M: precursor de Membrana qPCR: Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa RdRps: ARN polimerasa dependiente de ARN RRV: Virus del río Ross RT: Transcriptasa inversa RT-PCR: Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa SCD: síndrome de choque SFM: Sistema fagocítico mononuclear SGB: síndrome de Guillain-Barré SINV: Virus Sindbis UTR: untranslated región WAF: Genotipo CHIKV África Occidental ZIKV: Virus Zika

X

TABLA DE CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 1

1.1 DENGUE ............................................................................................... …… 1 1.1.2 Agente etiologico, DENV..........................................................................2 1.1.2 Ciclo de replicación viral .......................................................................... 4 1.1.3 Patogénesis ................................................................................................ 5 1.1.4 Manifestaciones clínicas del Dengue ........................................................ 6

1.2. FIEBRE DEL CHIKUNGUNYA ................................................................... 7 1.2.1 Agente etiologico, CHIKV.........................................................................8 1.2.2 Ciclo de replicación viral........................................................................... 9 1.2.3 Patogénesis..................................................................................................9 1.2.4 Manifestaciones clinicas de la fiebre del Chikungunya........................ ...10

1.3. FIEBRE ZIKA .............................................................................................. 10 1.3.1. Agente etiologico, ZIKV ........................................................................ 12 1.3.2. Ciclo de replicación viral ....................................................................... 13

1.3.3 Patogénesis .............................................................................................. 13 1.3.4 Manifestaciones clínicas de la fiebre del Zika ........................................ 13

1.4. CO-INFECCIONES ...................................................................................... 14 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION………………...16 3. OBJETIVOS ........................................................................................................ 18

3.1 Objetivo general ......................................................................................... 18 3.2 Objetivos especificos ................................................................................. 18

4. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................ 19 4.1. MATÉRIALES ............................................................................................. 19

4.1.1 Kit de extracción de ARN. ...................................................................... 19 4.1.2. Kit de sintesis de cDNA ......................................................................... 19 4.1.3. Master Mix ............................................................................................. 20 4.1.4.Taqman .................................................................................................... 20 4.1.5 Otros materiales ..................................................................................... 20 4.1.6. Equipos ................................................................................................... 21

4.2. MÉTODOS ................................................................................................... 22 4.2.1 Recolección de muestras ......................................................................... 22 4.2.1.1 Diseño del estudio ................................................................................ 22 4.2.1.2 Población y tamaño de la muestra ........................................................ 23 4.2.1.3 Criterios de inclusión ........................................................................... 23 4.2.1.4 Confidencialidad .................................................................................. 23 4.2.1.5 Toma de muestras sanguineas .............................................................. 24 4.2.2 Aislamiento de ARN de las muestras de suero ....................................... 24 4.2.3 Sintesis de cDNA .................................................................................... 25 4.2.4 Identificación molecular DENV ............................................................. 25

XI

4.2.4.1 Serotipificación DENV ........................................................................ 25 4.2.5 Identificación molecular CHIKV ............................................................ 26 4.2.6 Identificación molecular ZIKV ............................................................... 27 4.2.7 Secuenciación .......................................................................................... 27 4.2.8 Construcción de arboles filogenéticos .................................................... 27 3.2.9 Análisis de datos ..................................................................................... 28

5. RESULTADOS .................................................................................................... 29 5.1 DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA COHORTE ......................................... 29 5.2 DISTRIBUCIÓN TEMPORAL DE LA INFECCIÓN POR DENV, CHIKV y ZIKV .................................................................................................................... 27 5.3 CO-CIRCULACIÓN DE DENV, CHIKV Y ZIKV ...................................... 31

5.3.1 DENV ...................................................................................................... 31 5.3.2 CHIKV .................................................................................................... 32 5.3.3 ZIKV ....................................................................................................... 33

5.4 GENOTIPIFICACIÓN DE VIRUS CO-CIRCULANTES ............................ 34 5.4 CO-INFECCIONES ....................................................................................... 38

6. DISCUSIÓN ........................................................................................................ 41 7. CONCLUSIONES ............................................................................................... 45 8. RECOMENDACIONES………………………………………………………... 46 9.REFERENCIAS .................................................................................................... 47 ANEXOS ................................................................................................................. 54

XII

RESUMEN

Virus Dengue (DENV), el Virus del Chikungunya (CHIKV) y el Virus Zika

(ZIKV) son trasmitidos por el mismo vector, lo que resulta en la co-circulación de estos tres virus en las mismas regiones geográficas, aumentando la posibilidad de co-infecciones. El objetivo de este estudio fue identificar las cepas circulantes y calcular la prevalencia de co-infecciones en el municipio Villa del Rosario (Norte de Santander). Para lograr esto, con previo aval de bioética y consentimiento informado, se recolectaron muestras de suero de pacientes que presentaban fiebre menor de 7 días y con diagnóstico clínico compatible con alguna de estas tres enfermedades virales. Se extrajo el ARN de los sueros, posteriormente se realizó la retrotranscripción (RT) para obtener el cDNA, el cual fue utilizado como plantilla para la identificación de DENV y CHIKV (por PCR convencional) y ZIKV (por Real Time PCR). Las muestras positivas para DENV fueron serotipificadas y algunas muestras positivas para DENV y CHIKV fueron secuenciadas. Los resultados demostraron que 82 pacientes fueron positivos para uno o más virus: 33 (21.02%) para DENV, 47 (29.94%) para CHIKV y 29 (18.47%) para ZIKV. Adicionalmente, se encontró co-infección entre ellos: la prevalencia de co-infección DENV/CHIKV, DENV/ZIKV y CHIKV/ZIKV fue del 7.64%, 6.37% y 5.10%, con tasas de ataque de 14.90, 12.42 y 9.93 casos por cada 100.000 habitantes, respectivamente. Por otro lado, se encontraron tres pacientes co-infectados con los tres virus (prevalencia del 1.91%) con una tasa de ataque de 4.96 casos por 100.000 habitantes. Este estudio demuestra la simultánea co-circulación de DENV, CHIKV y ZIKV y sus co-infecciones en la región nororiente de Colombia.

XIII

ABSTRACT Dengue virus (DENV), Chikungunya virus (CHIKV) and Zika virus (ZIKV) are transmitted by the same vector, resulting in the co-circulation of these three viruses in the same geographic regions, increasing the possibility of co-infections. The objective of this study was to identify circulating strains and estimate the prevalence of co-infections in the municipality of Villa del Rosario (Norte de Santander). To achieve this, prior endorsement of bioethics and informed consent, serum samples from patients with fever less than 7 days and with clinical diagnosis compatible with any of these three viral diseases were collected. RNA was extracted from sera subsequently reverse transcription (RT) was performed to obtain cDNA, which was used as a template for identifying DENV and CHIKV (conventional PCR) and ZIKV (real-time PCR). DENV-positive samples were serotyped, and some of those positive for DENV and CHIKV were sequenced. The results showed that eighty-two patients were positive for one or more viruses: 33 (21.02%) for DENV, 47 (29.94%) for CHIKV and 29 (18.47%) for ZIKV. In addition, co-infection among them was found: the prevalence of DENV/CHIKV, DENV/ZIKV, and CHIKV/ZIKV co-infection was 7.64%, 6.37%, and 5.10%, with attack rates of 14.90, 12.42, and 9.93 cases per 100,000 inhabitants, respectively. Furthermore, three patients were found to be co-infected with all three viruses (prevalence of 1.91%), with an attack rate of 4.96 cases per 100,000 inhabitants. Our results demonstrate the simultaneous co-circulation of DENV, CHIKV, ZIKV and their co-infections in the northeastern region of Colombia.

Introducción

1

1. INTRODUCCIÓN

Los virus transmitidos por artrópodos se denominan Arbovirus. Tanto el DENV, el CHIKV y el ZIKV, son transmitidos por mosquitos del género Aedes y causan enfermedades agudas caracterizadas principalmente por fiebre y artralgias. La presencia de estos tres virus en las mismas regiones geográficas facilita la presencia de dos o más infecciones de estos virus en un mismo paciente (co-infecciones).

1.1. DENGUE

El Dengue es una enfermedad que se conoce desde hace siglos. Los primeros síntomas compatibles con Dengue se narran en una enciclopedia médica china en 992 d.C y hay evidencia de epidemias que parecían Dengue en 1635 y 1699 en las Antillas y Centroamérica (Gubler, 2006). Una gran epidemia ocurrió en Filadelfia en 1780 y otras zonas en los EE.UU, pero en esa época el DENV ya tenía una distribución global en los trópicos, con epidemias esporádicas de largos intervalos. Como resultado, la mayoría de las regiones tropicales tenían sólo uno o dos virus circulantes, por ello el Dengue no era un importante problema de salud pública (Islam et al., 2015).

La Segunda Guerra Mundial fue la que desencadenó la actual pandemia de

Dengue (Gubler, 2011) ya que esta fue una de las principales enfermedades que afectó a las fuerzas japonesas y aliadas. La expansión de la enfermedad se produjo cuando las tropas comenzaron a dispersarse por sus países (Wilder-Smith & Gubler, 2008). El fin de la guerra trajo un aumento en el crecimiento económico en muchos países del sudeste asiático y un rápido aumento poblacional provocado la extensión de la transmisión del Dengue, la hiperendemicidad y la aparición de las formas graves del Dengue, en países como Filipinas, Tailandia, Singapur, Malasia y Vietnam, e Indonesia y Myanmar. Para la década de 1980, el Dengue grave se había convertido en la principal causa de hospitalización y muerte en los niños de muchos países del sudeste Asiático (Gubler, 2011).

Las epidemias de Dengue parecían estar bajo control en América Central y del Sur, además con las campañas de control de la Fiebre Amarilla iniciadas por la Organización Panamericana de la Salud (OPS), la trasmisión del Dengue estaba restringida (Shepard, Coudeville, Halasa, Zambrano, & Dayan, 2011). El período de calma en las Américas se terminó en 1970 cuando el programa de control de Fiebre Amarilla se terminó, entonces el vector (Aedes aegypti) comenzó a re-infestar a los países tropicales de la región. La expansión geográfica de la epidemia de Dengue desde el sudeste asiático a finales del siglo XX en América, introdujo el DENV-1 en 1977, seguido en 1981 el DENV-2 y DENV -4, y en 1994 el DENV -3 (Gubler, 2011). Con la hiperendemicidad desarrollada, el Dengue afecta actualmente la mayor parte de América (Gubler, 2011) .

Introducción

2

En Colombia, el Dengue es endémico en zonas por debajo de los 1.800 metros sobre el nivel del mar, por eso gran parte de la población está en riesgo (Díaz, Martínez, & Villar, 2006). Durante el periodo 1978-2010, en el país se registró oficialmente un acumulado de 1’020.637 casos de Dengue, representando un promedio anual de 30.928 casos (Padilla, Rojas, & Gómez, 2012).

El instituto nacional de salud (INS) notificó en la semana epidemiológica 34 de

2015, 61,451 casos de dengue, los cuales 60,663 correspondieron a Dengue y 788 a Dengue grave (DG) (República de Colombia, 2015b). Hasta finales de septiembre del 2016, se han notificado 88,980 casos probables de Dengue, 904 casos corresponden a DG y los departamentos más afectados son Valle del Cauca, Antioquia, Santander, Tolima, Cundinamarca, Huila, Risaralda, Quibdó, Norte de Santander, Meta y Boyacá.

1.1.1. Agente Etiológico DENV

El DENV pertenece a la familia Flaviviridae, género flavivirus. Es un virus de forma icosaédrica, de 50 nm de diámetro, formado por una membrana lipídica obtenida de las células del huésped. Su genoma viral consiste en una única hebra de ARN de sentido positivo de aproximadamente 11 Kb, que se transcribe en un marco abierto de lectura (ORF), que está flanqueado por dos regiones no traducidas 5'-UTR y 3'-UTR, de aproximadamente 95-135 y 114-650 nucleótidos, necesarias para la replicación y traducción eficiente (Yu, Nomaguchi, Padmanabhan, & Markoff, 2008). El ORF codifica un polipéptido, que contiene tres proteínas estructurales (cápside [C], precursor de Membrana [prM], y proteína de envoltura [E]) que harán parte de la partícula viral y siete proteínas no estructurales (NS1 NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5), que se expresan sólo en la célula infectada e intervienen en ensamblaje y replicación del ARN (Bäck & Lundkvist, 2013a; Velandia & Castellanos, 2011).

La proteína C es la primera proteína viral sintetizada durante la traducción, pesa

11 KDa y posee 120 aminoácidos, con alto contenido de lisina y arginina que representan el 25%, lo que la hace altamente básica e influya en su interacción con el ARN (Lindenbach & Rice, 2003). Dentro de sus funciones es proteger y rodear el ARN, interactuar con la proteína pr-M y E para favorecer y completar el ensamblaje (Caglioti et al., 2013).

La proteína pr-M pesa 26 KDa y posee 166 aminoácidos. Su función es participar

en el proceso de maduración de la partícula viral. De ahí que durante el proceso de maduración, sufre una proteólisis donde se libera el polipéptido N-terminal 'Pr' (residuos 1-91) y la proteína M madura que contiene el ectodominio (residuos 92-130) y la región transmembrana C-terminal (residuos 131-166)(Catteau et al., 2003).

La proteína E pesa 50 KDa y posee 395 aminoácidos. Tiene funciones como la

capacidad de formar homodímeros en el virus maduro o heterodímeros con la proteína pr-

Introducción

3

M en el virión inmaduro. También participa en la adsorción, porque es el primer punto de contacto con la célula huésped. Así mismo, estimula la respuesta inmune e induce la producción de anticuerpos neutralizadores, es decir, es el principal inmunógeno del virus (Caglioti et al., 2013). Por esa razón la proteína E, es la responsable de la clasificación del virus en cuatro serotipos (DENV-1 a DENV-4).

La proteína no estructural NS1 pesa 46 KDa y posee 352 aminoácidos que incluye

12 residuos de cisteína altamente conservada en los flavivirus. Se puede hallar soluble en el citoplasma y en el espacio extracelular, jugando un papel importante en la modulación del sistema inmune innato. También modula eventos tempranos en la replicación del RNA viral, porque co-localiza el complejo de replicación viral e interactúa con la proteína NS4B. Al igual que la proteína E es un blanco importante de la inmunidad humoral (Falconar, 2007).

La proteína NS2 está constituida por NS2A (22 KDa) y NS2B (14 KDa), son

proteínas hidrofóbicas que se unen a la membrana del retículo endoplasmático durante la replicación viral. La proteína NS2A participa en complejo de replicación viral que funciona en el ensamblaje del virión y antagoniza la respuesta inmune del huésped, mientras la proteína NS2B forma un complejo estable con la proteína NS3 funcionado como co-factor de la serina proteasa, es decir regula la actividad catalítica de la proteasa NS3 (Clyde, Kyle, & Harris, 2006).

La proteína NS3 pesa 68 KDa, posee de 618-623 aminoácidos. Es trifuncional

porque presenta actividad de serina proteasa (con NS2B como cofactor), RNA helicasa y las actividades de nucleótidos trifosfatasa (NTPasa), funciones primordiales en la replicación viral (Staples & Fischer, 2014)

La proteína NS4 se deriva de las proteínas NS4A (16KDa) y NS4B (27 KDa).

Contienen dominios transmembrana que se asocian con la membrana del retículo endoplasmático. NS4A induce reordenamiento de membrana y la NS4B bloquea las rutas de señalización del INF-tipo I (Muñoz-Jordán, Sánchez-Burgos, Laurent-Rolle, & García-Sastre, 2003).

La proteína NS5 pesa 104 KDa, presenta 900 aminoácidos y es la proteína más

conservada con 67% de identidad de secuencia entre los cuatro serotipos DENV. Es una enzima bifuncional ya que el extremo N-terminal posee actividad enzimática de metiltransferasa y guanidiltransferasa, responsables del capping y la metilación del extremo 5´ del ARN genómico(Egloff, Benarroch, Selisko, Romette, & Canard, 2002), mientras que, en el extremo C-terminal se ubica el dominio de ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRps), para cumplir su función utiliza NS1 y NS2B como co-factores virales(Nomaguchi, Ackermann, Yon, You, & Padmanbhan, 2003)

Dentro de los cuatro serotipos conocidos por sus propiedades antigénicas, la

acumulación de la diversidad genética en los últimos siglos ha dado lugar a distancias genéticas entre serotipos. La comparación de las secuencias genómicas de diferentes cepas

Introducción

4

en el mundo ha permitido establecer la variación genética intra-serotipo y la aparición de diferentes genotipos (grupos monofiléticos) (Usme-Ciro, Méndez, Laiton, & Páez, 2014). Hasta la fecha hay tres genotipos para DENV-1 (I, II, y III) pero algunos autores incluyen dos genotipos más (IV y V); seis genotipos para DENV-2 (Americano, Asiático/Americano, Asiático I, Asiático II y Selvático), cuatro genotipos para DENV-3 (I, II, III, IV), pero algunos autores incluyen el genotipo V; y 4 genotipos para DENV-4 (I, II, III y Selvático) (Áñez, 2007).

A pesar de la intensa microevolución de DENV, la distribución mundial de los

genotipos DENV se ha mantenido estable a través del tiempo con sólo algunos cambios importantes. Aunque los virus que pertenecen a un determinado genotipo pueden ser reportados en otros lugares distantes, se consideran con frecuencia casos importados) (Usme-Ciro et al., 2014). En Colombia, los genotipos que circulan para DENV-1, el más frecuente es el genotipo V linaje 1 y 2; para DENV-2, el genotipo americano-asiático; para DENV-3, el genotipos III; y para DENV-4, el genotipo corresponde a cepas de Indonesia, Tahití, el Caribe y América Central y del Sur (Villar, Rojas, Besada-Lombana, & Sarti, 2015).

1.1.2. Ciclo de replicación viral

El primer paso para el ciclo de replicación viral es la adsorción, donde interaccionan la partícula viral (proteína E) y el receptor celular presente en su superficie, paso que es mediado por balsas lipídicas (lipid rafts) de la membrana plasmática (Lee, Lin, Liao, & Lin, 2008).

Luego ocurre la penetración, donde el DENV se internaliza en vesículas revestidas

de clatrina (endocitosis dependiente de clatrina) (Acosta, Castilla, & Damonte, 2009). El pH ácido en el interior del endosoma induce un cambio conformacional (de dímero a trímero) de la proteína E viral, permitiendo la exposición del péptido de fusión viral y la unión de la membrana viral y vesicular, liberando la nucleocápside que se desensambla y suelta el genoma en el citoplasma, cerca al retículo endoplasmático (Acosta et al., 2009).

Al entrar en el retículo endoplasmático rugoso, el RNA viral se traduce y el virus

pasa de traducción a la síntesis de una hebra negativa intermediaria, que sirve como molde para la cadena positiva de ARN viral, que se utilizará para formar más copias del genoma (hebras de sentido positivo) (Bäck & Lundkvist, 2013b). Las sucesivas rondas de traducción producen altos niveles de proteínas virales que junto con el ARN viral, se ensamblan en viriones (Clyde et al., 2006).

Para el ensamblaje del virión, la proteína C se une con nuevo el ARN viral (las

copias de hebras de sentido positivo) en la cara citosólica de la membrana del retículo endoplasmático. Posteriormente, el virus adquiere la membrana lipídica que contiene la proteína E y pr-M (Souza, da Silva Almeida, & Boscardin, 2016). El virión viaja a un

Introducción

5

compartimiento de la red Trans Golgi a través de la vía secretoria de la célula y en este compartimiento, la furina proteasa divide la proteina prM: en Pr soluble y M. Tras su liberación al medio extracelular por gemación, el péptido Pr se descompone en el pH neutro, y el virus maduro es capaz de unirse a nueva célula (I.-M. Yu et al., 2008). Finalmente, el virus sale de la célula por gemación.

1.1.3. Patogénesis El papel del tropismo celular y tisular de DENV tiene un impacto importante en el

resultado de las infecciones de DENV, pero la ausencia de un modelo animal apropiado de la enfermedad, dificulta la comprensión del tropismo. El DENV infecta las células del sistema fagocítico mononuclear (SFM) (macrófagos, monocitos y células dendríticas), y puede replicarse en los leucocitos de sangre periférica, ganglios linfáticos, bazo, hígado, corazón, riñones, pulmones, timo, estómago y probablemente el cerebro (Singhi, Kissoon, & Bansal, 2007).

Las células dendríticas de Langerhans y los queratinocitos que se encuentran en

la piel, son las primeras que se infectan con las partículas virales, tras la picadura de un mosquito infectado (Limon‐Flores et al., 2005). Los receptores células dendríticas son la lectina de unión DC-SIGN (Dendritic cell-specific Intracellular adhesión molecule Grabbing Nonintering), la integrina αѵß3 y la molecula GRP78 (BiP) (del Ángel, 2006). Las células infectadas luego migran desde el sitio de la infección a los ganglios linfáticos, donde se reclutan monocitos y macrófagos, que se convierten en blancos de infección, en consecuencia, la infección por el virus se amplifica y se difunde a través del sistema linfático (Martina, Koraka, & Osterhaus, 2009).

La infección del DENV provoca reordenamientos en las membranas celulares del

huésped, también un balance en la activación de las vías celulares y la inducción del metabolismo lipídico, es decir que DENV puede controlar la muerte celular que es ocasionada por el estrés en el retículo endoplasmático (Umareddy et al., 2007). Igualmente, DENV una vez dentro es detectado por receptores presentes en el compartimiento endosomal o el citoplasma de la célula y se activa un estado antiviral celular. Sin embargo, DENV ha desarrollado mecanismos que permiten la evasión, pero las células dendríticas se convierten en reservorios del virus y puede distribuirlos a otros tejidos durante la migración (Boonnak et al., 2008).

Durante infecciones secundarias con DENV heterólogos, las altas concentraciones

de la inmunoglobulina G específica de DENV formará un complejo con el virus que se adhiere, que es captado por las células mononucleares. Después de la infección, las células mononucleares predominantemente mueren por apoptosis, mientras que las células dendríticas infectadas o presentes son estimuladas para producir la mayor parte de los mediadores inflamatorios y hemostáticos que están implicados en las respuestas del huésped (Martina, Koraka, & Osterhaus, 2009).

Introducción

6

1.1.4. Manifestaciones Clínicas del Dengue

Después de la picadura de los mosquitos hembra Ae. aegypti o Ae. albopictus infectadas con DENV, el período de incubación es de aproximadamente 4 a 10 días, los síntomas comienzan abruptamente y la enfermedad pasa por tres fases: febril, crítica y de recuperación. En la fase febril aparecerán repentinamente la fiebre acompañada de dolor de cabeza frontal y dolor retroorbital, seguido de síntomas como erupción cutánea, vomito, artralgias y mialgias. Los pacientes que mejoran después de la caída de la fiebre se consideran casos de Dengue sin signos de alarma (DSSA) (Colombia., 2010). Al final de la fase febril, algunos pacientes pueden evolucionar a la fase crítica donde las manifestaciones hemorrágicas leves como epistaxis, gingivorragia, sangrado transvaginal en mujeres en edad fértil se pueden observar. Estos se deben a cambios en la permeabilidad vascular y por lo general dura de 24 a 48 horas, siendo autolimitados en los pacientes sin un gran aumento de la permeabilidad capilar, mientras que aquellos con mayor permeabilidad capilar pueden empeorar como resultado de la pérdida de volumen plasmático y llegar a presentar signos de alarma, esto se denomina dengue con signos de alarma (DCSA).

Por lo anterior, la extravasación severa de plasma (evento fisiopatológico importante en la determinación de la gravedad de la enfermedad que conduce a síndrome de choque (SCD)) la acumulación de líquidos con dificultad respiratoria, las hemorragias severas y daño grave de órganos (Rodriguez-Roche & Gould, 2013), hacen que sea muy importante diferenciar el dengue de otras enfermedades febriles ya que el dengue puede conducir a shock e insuficiencia multi-sistémica y la muerte, cuadro clínico conocido como dengue grave (DG) (anteriormente Dengue hemorrágico), forma severa de la enfermedad que se produce en hasta un 5% de los casos. También existen las formas clínicas poco frecuentes que resultan de la afectación de un órgano o sistema (encefalopatía, miocardiopatía, hepatopatía, insuficiencia renal aguda) las cuales también se asocian a mortalidad (Colombia., 2010).

Los mecanismos que conducen al dengue grave no son claros y ha sido objeto de estudio desde hace décadas. Las posibles explicaciones son de tipo inmune: la primera es cuando un paciente sufre una segunda infección con otro serotipo diferente al de la primera infección; y la segunda son los niños recién nacidos de madres que tenían anticuerpos primarios de DENV (Nimmannitya, Halstead, Cohen, & Margiotta, 1969), es decir, la infección secundaria puede producir bajos niveles de anticuerpos neutralizantes heterotípicos que reducen la gravedad de la enfermedad (Rodriguez-Roche & Gould, 2013), pero la inmunidad protectora frente a la infección por serotipos heterólogos es de corta duración, de ahí que la mayoría de veces que los anticuerpos heterólogos no neutralizantes forman complejos con los fagocitos mononucleares infectados, que conducen a su aumento y activación de monocitos y linfocitos T que secretan cantidades desproporcionadas de citocinas y otros mediadores químicos que actúan sobre el endotelio vascular, produciendo aumento en la permeabilidad vascular y extravasación(Faye et al., 2014; Saiz et al., 2016).

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El mecanismo exacto por el cual la replicación DENV se amplifica en las células

infectadas, está en estudio. Sin embargo, hay que tener en cuenta que factores de riesgo asociados al huésped tales como la edad, condiciones socioeconómicas, la etnia, la presencia de enfermedades crónicas (asma bronquial, la diabetes mellitus y la anemia de células falciformes) y características genéticas son también factores predisponentes para desarrollar DG (Rodriguez-Roche & Gould, 2013). También factores asociados al virus como la presencia de cepas, subtipos o genotipos más virulentos, es así que se ha postulado que DENV-4 y DENV-2 son más patogénicos que el DENV-3 y DENV-1(Duffy et al., 2009).

1.2. FIEBRE DE CHIKUNGUNYA

Los primero casos reportados de CHIKV datan de 1955 en 115 pacientes en Tanzania, donde describían a la fiebre de Chikungunya como una enfermedad "similar al Dengue" (S. K. Singh, & Unni, S. K., 2011). La palabra Chikungunya significa “aquel que se encorva” (describe la apariencia inclinada de las personas que padecen los fuertes dolores articulares) la cual proviene del grupo étnico Makonde que viven en el sudeste de Tanzania y el norte de Mozambique.

En el sudeste asiático (específicamente en Bangkok), en la década de 1960 se documentó el primer brote seguido por brotes menores que ocurrieron periódicamente en India, Malasia, Indonesia, Camboya, Vietnam, Myanmar, Pakistán y Tailandia. En el 2004, se presentó la gran epidemia en la costa de Kenya, que permitió que CHIKV se extendiera por África oriental, central y el Océano Índico, como las Comoras, el Gabón, Madagascar, las Maldivas, Mauricio, Seychelles, las islas Mayotte y La Reunión (Italia) (Hawman et al., 2013). Entre febrero y octubre de 2006, se infectaron más de 1,25 millones de personas en la India y Asia meridional (Hawman et al., 2013), esta rápida y asombrosa extensión geográfica del CHIKV, llevo a la transmisión autóctona en lugares tan lejanos como Italia.

En América, en el año 2006, en Estados Unidos se presentaron los primeros casos de CHIKV importados de áreas endémicas, tres años después en Guayana Francesa, Martinica, Guadalupe y Brasil (Pérez, Ramírez, Pérez, & Canela). Este mecanismo, permitió la transmisión del CHIKV a áreas con alto riesgo. Es así que el 2 de diciembre de 2013, se confirmó la transmisión autóctona de CHIKV en la Región de las Américas, con dos casos confirmados en la isla Saint Martin en el Caribe (Moya, Pimentel, & Puello, 2014). Para el año 2014, la O.P.S reportó en las Américas 8,651 casos y 113 muertes por CHIKV (M. d. s. y. p. s. República de Colombia, Instituto Nacional de Salud., 2014) y describió a República Dominicana como el país de Latinoamérica con el mayor número de casos, permitiendo que este virus se expandiera por las demás áreas de Centro América y América del sur (I. N. d. S. República de Colombia, 2014a).

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Las presentaciones atípicas y graves también se han estimado en 0.3% de los pacientes y son frecuentes en ancianos o con comorbilidades tales como enfermedades respiratorias o cardiovasculares e hipertensión, las mismas también pueden ocurrir en pacientes jóvenes sin otros factores de riesgo. La tasa de letalidad global reportada en los pacientes con CHIKV en las Américas ha variado entre 0,012% y 0,081%.

En Colombia, el 19 de julio de 2014 se confirmó el primer caso importado de

CHIKV, pero fue hasta en septiembre (en la semana epidemiológica 37) que se notificó el primer caso de Chikungunya autóctono proveniente del corregimiento San Joaquín, municipio de Mahates, departamento de Bolívar (I. N. d. S. República de Colombia, 2014a). Al finalizar el 2014, el Instituto Nacional de Salud (INS) reporto 96,687 casos de CHIVK (I. N. d. S. República de Colombia, 2014b) y en el registro acumulado del 2014-2015 se habían confirmado 72 muertes en el país para una letalidad de 0.0016% (72/ 456.226) (República de Colombia, 2015a), la mayoría de las muertes se registraron en Norte de Santander, Tolima, Cundinamarca, Huila, Atlántico, Cartagena, Sucre y Bolívar, 6 de estas muertes son en menores de 3 años y 7 casos de muerte tenían co-infección con DENV. Hasta finales de septiembre de 2016, se han notificado 18,891 casos probables de Chikungunya, siendo los departamentos más afectados Valle del Cauca, Santander, Tolima y Cundinamarca.

1.2.1. Agente Etiológico, CHIKV

El CHIKV es el agente causal de la fiebre de Chikungunya, cuyo síntoma principal es la poliartralgia severa aguda y/o crónica (OPS, 2011). El CHIKV pertenece a la familia Togaviridae, género alfavirus; tiene un genoma que está constituido por 11,8 kb de ARN (cadena sencilla y polaridad positiva), una cápside de 60-70nm de diámetro y una envoltura lipídica. El genoma contiene dos ORF que codifican para cuatro proteínas no estructurales (NSP1 a NSP4) y cinco proteínas estructurales (C, E3, E2, 6K, y E1) que contribuyen a la propagación del virus (Lum & Ng, 2015).

Las proteínas no estructurales, NSP1 y NSP3, helicasa (NSP2) y la polimerasa (NSP4), se unen y forman el complejo de replicación viral (Hallengärd et al., 2014). La proteína C está involucrada en la formación de la nucleocápside, y la unión al ARN genómico, siendo crucial en el ensamblaje y propagación del virus (Lum & Ng, 2015). Las proteínas estructurales, E1 y E2 están implicados en la unión y la entrada del virus en las células. La proteína 6K está implicada en el ensamblaje y la gemación del virus y la proteína E3 es importante en el transporte de las proteínas estructurales en el retículo endoplasmático (Tang, 2012)

Los aislamientos virales recolectados de diversas áreas geográficas indican que existen tres linajes con características genotípicas distintas. Estos son: el genotipo de África Occidental (WAF), el del Este, Centro, Sur de África (ECSA) y el genotipo asiático (Wu et al., 2013). El genotipo ECSA es el más complejo, consiste en tres subtipos: clado

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centroafricana, clado Este / Sur de África, y el clado Océano Índico, que consta de más cepas e incluye todos los aislados de CHIKV del 2005-2010.

En Colombia, el genotipo de las cepas de CHIKV de la epidemia del 2014-2015 pertenece al linaje asiático (Laiton-Donato et al., 2015; Mattar et al., 2015); Estudios filogenéticos han observado que las cepas colombianas de CHIKV carecen de mutaciones de adaptación para Ae. albopictus, además están estrechamente relacionadas con las cepas de las Islas Vírgenes, Santa Lucía, México, Puerto Rico y Brasil, en consonancia con una sola (Rodas et al., 2016).


Este ciclo de replicación es sumamente rápido, dura aproximadamente 4 horas. Después de la picadura de un mosquito infectado con partículas virales del CHIKV, la interacción con los receptores de célula huésped se logra mediante la proteína E2. Sin embargo, no se han reportado cuales receptores de superficie celular permiten la entrada.

Posteriormente penetra por endocitosis dependiente de clatrina. Dentro de los

endosomas, la reorganización conformacional del heterodímero sobre proteína E1-E2, favorecida por un pH bajo (acidificación), conduce a un estado inestable de E1, permitiendo la exposición del péptido de fusión viral y la unión de la membrana viral y vesicular libera la nucleocápside donde se desensambla y libera el genoma al citoplasma de la célula huésped. La traducción del RNA viral permite que se sinteticen las proteínas no estructurales del virus. Allí actúa una replicasa viral que genera copias del genoma viral y de RNA subgenómico que codifica para las proteínas estructurales (Thiberville et al., 2013). En último lugar, los componentes del virus son ensamblados en la nucleocápside, liberándose al medio extracelular por gemación para infectar otras células (Solignat, Gay, Higgs, Briant, & Devaux, 2009). Estas etapas finales del ciclo de replicación se han investigado muy poco y la mayoría de los supuestos son de otros modelos Alfavirus como el virus del río Ross (RRV) y Virus Sindbis (SINV).

1.2.3. Patogénesis

Cuando el mosquito infectado inocula CHIKV al huésped susceptible, los viriones entran en los capilares subcutáneos, comienza su replicación en macrófagos, fibroblastos y células endoteliales de la piel. Posteriormente, pasa a los nódulos linfáticos y luego al sistema circulatorio hasta alcanzar los órganos diana: hígado, músculos, articulaciones y cerebro (Caglioti et al., 2013). En los músculos y articulaciones, la replicación viral y la marcada infiltración de células mononucleares incluidos macrófagos provocan intenso dolor y artritis.

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La infección por CHIKV parece inducir inmunidad protectora de larga duración, pero entre 3 y 28 % de las personas con anticuerpos para el virus tienen infecciones asintomáticas (Staples & Fischer, 2014).

1.2.4 Manifestaciones clínicas de la Fiebre del Chikungunya

Después de la picadura de los mosquitos hembra Ae. aegypti o Ae. albopictus infectadas con CHIKV, el período de incubación de la infección oscila entre 1 y 12 días, con un promedio de 3 a 7 días, la viremia dura entre 5 a 6 días (incluso hasta 10 días). Esta enfermedad es aguda, afecta tanto a hombres como mujeres, sin importar la edad (Colombia., 2014). Otras formas de transmisión incluyen las transfusiones sanguíneas y la transmisión vertical (madre a hijo), especialmente durante la última semana de gestación (Couderc & Lecuit, 2015; Wauquier et al., 2011).

La fiebre Chikungunya se caracteriza por la aparición repentina de fiebre de alto grado con escalofríos, cefalea, artralgias o artritis, mialgias, erupción macolupapular y dolor de espalda (Soumahoro et al., 2009). Sin embargo, la infección por CHIKV puede presentar complicaciones importantes a nivel articular y muscular como el llamado dolor o reumatismo inflamatorio crónico post-CHIK (pCHIK-CIR), que se caracteriza por manifestaciones persistentes (dolor principalmente articular y muscular y depresión) que podría alcanzar hasta 72 meses (Javelle et al., 2015); estimaciones previas han demostrado que casi el 48% de las personas afectadas podrian desarrollar- pCHIK-CIR (Rodríguez‐morales, Cardona‐ospina, Urbano‐Garzón, & Hurtado‐Zapata, 2016). También hay evidencia que vincula CHIKV con el desarrollo de la artritis no específica post-viral, artritis reumatoide y otras molestias musculoesqueléticas no inflamatorias que afectan la calidad de vida y dar lugar a una mayor pérdida económica directa e indirectamente (Yaseen, Simon, Deparis, & Marimoutou, 2014).

La infección por el CHIKV suele no ser fatal, pero manifestaciones clínicas atípicas con daño de órganos que pueden complicar la evolución del paciente, algunas formas graves incluyen complicaciones hepáticas, neurológicas y la muerte (Rajapakse, Rodrigo, & Rajapakse, 2010).

1.3. FIEBRE DE ZIKA

Este virus fue identificado por primera vez en 1947, a partir de monos Rhesus, los cuales pertenecían al programa de vigilancia de la fiebre amarilla selvática en el Bosque Zika en Uganda (Mattar & González, 2015). En 1948 se aisló el ZIKV en mosquitos Ae. africanus y en 1956 se encontró la transmisión en los mosquitos Ae. Aegypti. Posteriormente, el ZIKV fue aislado en humanos en estudios realizados entre 1968 y 1975 en Nigeria y por medio siglo causo infecciones esporádicas en países de África como

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Uganda, Tanzania, Egipto, República Centroafricana, Sierra Leona y Gabón, y en partes de Asia como India, Malasia, Filipinas, Tailandia, Vietnam e Indonesia, todos confirmados en su mayoría por métodos serológicos (Hayes, 2009).

En 2007, el primer brote de ZIKV fuera de África y Asia se reportó en la isla de Yap, Estados Federados de Micronesia y en octubre del 2013, el virus reapareció en la Polinesia francesa causando una gran epidemia entre el 2013-2014 (Campos, Bandeira, & Sardi, 2015). En el 2013, en Nueva Caledonia se encontraron casos importados desde Polinesia Francesa, pero en el 2014 se presentó un brote con más de 1.400 casos, expandiéndose también el ZIKV por las Islas Cook con más de 900 casos (Roth et al., 2014). En el brote de Polinesia Francesa se observó un aumento en la incidencia de complicaciones neurológicas, incluyendo 42 casos de síndrome de Guillain-Barré (SGB) (Oehler et al., 2014).

El primer caso autóctono de ZIKV en las Américas, se presentó en febrero de 2014,

en Isla de Pascua (Chile) y en mayo de 2015 la OPS confirmó en el noroeste de Brasil los primeros 16 casos de infecciones ZIKV (Mattar & González, 2015), en donde actualmente han sido confirmados en al menos 22 estados de Brasil. A pesar de que la propagación inicial fue lenta, una vez apareció en América del Sur, su propagación se ha acelerado, del manera que se han reportado millones de individuos infectados en 25 países (Barreto-Vieira et al., 2016).

En la actualidad la infección por ZIKV se ha centrado en las embarazadas debido

a lo reportado por el Ministerio de Salud de Brasil, en donde la infección con ZIKV durante la gestación se asoció con un incremento de recién nacidos con microcefalia (factor de aproximadamente 20 en los recién nacidos de la región noreste de Brasil) (Mlakar et al., 2016). A comienzos del 2016 en Brasil se notificaron 3,530 casos de microcefalia y/o anomalías del sistema nervioso central, de los cuales 1.326 fueron confirmados como sugestivos de infección congénita.

También se ha reportado un caso de una mujer embarazada que infectó con ZIKV

en el noreste de Brasil en el primer trimestre del embarazo y la autopsia del fetos post-morten, demostró genoma completo de ZIKV a partir del cerebro fetal (Mlakar et al., 2016).

En Colombia, la Secretaria de Salud departamental de Bolívar en septiembre de 2015, informó al INS sobre unos casos de síndrome febril de etiología desconocida en el municipio de Turbaco, lo cual hizo que el Instituto Nacional de Salud (INS) analizara mediante pruebas moleculares las muestras de suero recolectadas y después de su posterior verificación con el centro de referencia para el país, el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades en Atlanta (CDC), se pudo confirmar la introducción del ZIKV en el país (República de Colombia, 2015a). A partir de esta confirmación, la situación epidemiológica hasta la semana 29 de 2016 han sido de 101,145 casos de enfermedad por virus ZIKV, entre los notificados se encuentran 17,730 gestantes (17,7%) de las cuales 6,058 casos (3,42%) han sido confirmados por laboratorio (RT-PCR). En cuanto a los defectos congénitos de microcefalia, para la misma semana se reportaron 344

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casos de los cuales 22 han sido confirmados, 97 han sido descartados y 225 permanecen en estudio. Con respecto a los síndromes neurológicos se han reportado 608 casos de los cuales, 408 (67.1%) corresponden a SGB, siendo Norte de Santander el departamento que aporta el mayor número (República de Colombia, 2016).

1.3.1 Agente Etiológico, ZIKV

El ZIKV es un virus ARN que pertenece a la familia Flaviviridae y género Flavivirus. Tiene un genoma de ARN de cadena sencilla de sentido positivo, contiene 10.794 nucleótidos que codifican 3.419 aminoácidos (Pyke et al., 2013), contiene una región 5 'y 3' no traducida, que flanquean una región de codificación para sintetizas tres proteínas estructurales (cápside [C], pre-membrana [pr-M] y envoltura [E]), las cuales participan en el ensamblaje de los viriones y siete proteínas no estructurales (NS1, NS2a, NS2B, NS3,NS4A, NS4B y NS5) que intervienen en la replicación del ARN genómico y el ensamblaje.

La proteína C (105 aminoácidos) se une con el ARN genómico para conformar la

núcleocapside los viriones. La proteína E (505 aminoácidos) se une al receptor celular del virus y promueve la fusión de los viriones con las membranas endosomales de la célula huésped durante la entrada viral. Por otro lado, la proteína pr-M (187 aminoacidos) ayuda al plegamiento de la proteína E como una especie de acompañante y evita la fusión prematura de las partículas antes de ser liberado de la célula infectada; adicionalmente la división de prM promueve la maduración de las partículas virales.

Las funciones de las proteínas no estructurales del ZIKV, son inferidas de otros

flavivirus. La NS1 (352 aminoácidos) participa en la inmunomodulación, igualmente la NS2A (217 aminoácidos) regula la replicación del ARN viral y el acoplamiento. La NS2B (139 aminoácidos) actúa como un cofactor para la serina proteasa (NS3). La NS3 (19 aminoácidos) actúa como una helicasa, la NS4A (127 aminoácidos) y NS4B (255 aminoácidos) induce los reordenamientos de membrana asociados con la replicación y la NS5 (904 aminoácidos) es la ARN polimerasa dependiente del ARN viral, también muestra un dominio metiltransferasa necesario para cubrir el extremo 5 ' del ARN genómico viral (Baronti et al., 2014).

Filogenéticamente, el ZIKV está estrechamente relacionado con el virus

Spondweni, otros virus más cercanos son Ilheus, Rocío, y los virus de la encefalitis de San Luis (Hayes, 2009). A través de las relaciones filogenéticas entre las secuencias de los genes de la envoltura del ZIKV, hay dos linajes distinguidos: linaje africano y linaje asiático. Este último linaje es el que está propagándose por el continente americano, y está relacionado con cepas provenientes de la Polinesia Francesa. El análisis de los alineamientos de secuencias de nucleótidos y aminoácidos reveló que la pérdida potencial de un sitio de glicosilación en algunas de las cepas de virus, se pueden correlacionar con la historia del virus (Haddow et al., 2012).De acuerdo a lo relacionado con Colombia, los análisis filogenético de las cepas de ZIKV de la epidemia de 2015-2016 mostraron que pertenecen al linaje asiático y están relacionadas con las cepas aisladas durante el brote de

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2015 en Brasil (Adiga, 2016; Camacho, Paternina-Gomez, Blanco, Osorio, & Aliota, 2016).


Después de la picadura de un mosquito infectado con ZIKV, las partículas virales se unen a moléculas de unión de la superficie celular. Posteriormente se internalizan a través de endocitosis y debido al pH acido del endosoma, las glicoproteínas virales median la fusión de las membranas viral y celular, lo que permite el desmontaje del virión y la liberación del ARN viral en el citoplasma. El ARN viral se traduce en una poliproteína que se procesa mediante proteasas virales y celulares, las proteínas no estructurales virales replican el ARN del genoma. Múltiples rondas de traducción producen altos niveles de proteínas virales que junto con ARN viral se ensamblan en viriones. El ensamblaje y la maduración del ZIKV es similar a lo que se ha descrito para DENV. Es importante recalcar que habitualmente los flavivirus se replican en el citoplasma, pero se han encontrado antígenos de ZIKV dentro del núcleo celular (Buckley & Gould, 1988).

1.3.3. Patogénesis

Una vez es inoculada las partículas virales por el mosquito infectado, es capturado el virus por las células dendríticas, posteriormente se propaga por los ganglios linfáticos y al torrente sanguíneo, en donde terminan la replicación e infectan a los monocitos de manera similar a lo que ha sido descrito para DENV.

1.3.4. Manifestaciones clínicas de la Fiebre de ZIKA

Después de la picadura de los mosquitos hembra del genero Aedes infectadas con ZIKV, el período de incubación de la infección oscila entre de 3 a 12 días, comienza con dolor de cabeza, seguido de fiebre, erupción maculopapular, malestar general, conjuntivitis no purulenta, mialgias, artralgias, edema en miembros inferiores y menos frecuente el dolor retro orbital, anorexia, vómito, diarrea o dolor abdominal, los síntomas pueden durar de dos a siete días.

Alrededor de una de cada cinco personas pueden desarrollar la enfermedad con

manifestaciones clínicas moderadas y de acuerdo a las manifestaciones clínicas graves no son frecuentes (1:1000) comprenden alteraciones a nivel neurológico (meningoencefalitis y síndrome de Guillain Barré) y a nivel autoinmune púrpura trombocitopénica. También existen casos asociados entre las comorbilidades y la infección por ZIKV que pueden llevar a la muerte, como se registró en un caso clínico de una paciente de 15 años de edad con anemia de células falciformes que adquirió ZIKV y falleció sin ningún otra causa (Arzuza-Ortega et al., 2016).

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En este momento, la principal complicación es la microcefalia asociada a la

infección congénita por ZIKV (0,3 a 1,9 por cada 1.000 infecciones). Se han confirmado alteraciones de lesión cerebral fetal grave, restricción del crecimiento intrauterino acompañada de calcificaciones cerebrales, oligohidramnios, anhidramnios e incluso muerte fetal en el primer trimestre de embarazo cuyo riesgo estimado es de 1-13%, también la microcefalia puede ocurrir al sufrir por una infección por ZIKV en los últimos meses de embarazo y se ha asociado con un incremento en los resultados que amenazan la visión: lesiones perimaculares y anomalías del nervio óptico (Mlakar et al., 2016).

Respecto a otros tipos de transmisión de ZIKV, varios estudios han reportado el

riesgo de transmisión por transfusión sanguínea y contacto sexual (Díaz et al., 2006). El ZIKV se ha aislado en muestras provenientes de leche materna, líquido amniótico, placenta, orina y saliva (Bäck & Lundkvist, 2013b). Es importante resaltar el ZIKV ha sido mejor aislado en saliva y orina que en sangre (Martina et al., 2009) (Limon‐Flores et al., 2005).

1.4. CO-INFECCIONES

La circulación los tres virus (co-circulación) en una misma región conduce a co-infecciones en los seres humanos, más aún debido a la similitud de sus síntomas hace que la verdadera carga de las enfermedades sea en parte subestimada, esto coloca de relieve la necesidad de un diagnóstico diferencial del dengue en todo paciente con síndrome febril, en todas las regiones tropicales y subtropicales donde circulen en conjunto estos arbovirus.

Las co-infecciones de CHIKV/DENV no son desconocidas: En Tailandia, año

1962 el 2,6% (4) de los pacientes se encontraban co-infectados (DENV/CHIK), de un total de 150 pacientes que tenían diagnostico con fiebre de dengue o Chikungunya; en 1963 se detectaron 2,1% (3) co-infectados de 144 pacientes, y en 1964, 3,6% (12) co-infectados de 334 pacientes. Otros estudios en Asia, por ejemplo en la India se encontraron porcentajes de co-infección (CHIKV/ DENV) del 2,1% (7 co-infecciones/332 pacientes) y 2,7% (8 co-infecciones/294 pacientes) en 1964; 9,2% (6 co-infecciones/65 pacientes) en 2006; 2,1% (8 co-infecciones/387 pacientes) en 2007; 9,8% (5 co-infecciones/51 pacientes), 5,5% (4 co-infecciones /73 pacientes), 22,4% (68 co-infecciones/303 pacientes) en 2010; 9,5% (2 co-infecciones/21 pacientes), 13,2% (9 co-infecciones/68 pacientes) en 2011 (Usme-Ciro et al., 2014) (Usme-Ciro et al., 2014).

En África se encontraron porcentajes de co-infección de 26,3% (10 co-

infecciones/38 pacientes) en Madagascar, año 2006; 14,4% (63 co-infecciones/183) en Nigeria, año 2008; 4,3% (8 co-infecciones/93 pacientes) en Tanzania, año 2013. En América, en la isla de Saint Martin se encontró un porcentaje de co-infección de 2, 5% (16 co-infecciones /651 pacientes) (Usme-Ciro et al., 2014)

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Igualmente, hay reportes de un caso de co-infección (DENV/CHIKV) en Portugal, Sir Lanka y Singapur (Taraphdar, Sarkar, Mukhopadhyay, & Chatterjee, 2012). En un estudio realizado en Gabón, África central fueron identificados 37 casos de co-infección de CHIKV y DENV-2, entre abril de 2007 y agosto de 2010, estos resultados no encontraron evidencia de manifestaciones clínicas particulares entre los pacientes mono-infectados y co-infectados (Caron et al., 2012), aunque se cree que la co-infección con lleva a un riesgo de enfermedad clínica más grave, teniendo en cuenta que ambas infecciones tienen un fuerte componente inmunopatogénico, aun no es posible establecer si la co-infección puede afectar positiva o negativamente una u otra infección.

En Odisha y Maharashtra, en un estudio transversal realizado en el 2013, de los 96

pacientes infectados con Dengue, 44,8% (43) estaban co-infectados con CHIKV (Saswat et al., 2015). Actualmente en un estudio realizado en Nicaragua, 346 pacientes con sospecha de DENV, CHIKV, y ZIKV encontraron que el 12.4% estaban co-infectados con DENV/CHIKV (Waggoner et al., 2016).

Estudios recientes durante el brote de ZIKV en el 2014, en Nueva Caledonia,

informaron la presencia de co-infección con DENV/ZIKV en el suero de un menor de 14 años que viajo a Polinesia francesa donde DENV y ZIKV co-circulaban y en suero de una mujer de 38 años que no tenía ninguna historia de viaje. El primer caso fue una co-infección con DENV-3 y ZIKV , y la mujer cuyo caso fue de origen local fue co-infectado con DENV-1 y ZIKV (Dupont-Rouzeyrol et al., 2015). En otro estudio realizado en la región noreste de Brasil (Tuparetam) durante un brote de una enfermedad similar al dengue en abril de 2015, se estudiaron a 77 pacientes sospechosos de dengue a los que se les inició una investigación para identificar las etiologías virales (DENV, CHIKV, ZIKV), hallando solo 2 (2,6%) co-infecciones con DENV-1 y ZIKV , que no tuvieron efectos sinérgicos, es decir, ambos pacientes tuvieron un leve curso clínico y se recuperaron por completo sin la necesidad de una estancia en el hospital (Umareddy et al., 2007). El estudio realizado en Nicaragua encontró que 6 (1.7%) co-infecciones con DENV y ZIKV (Waggoner et al., 2016).

Un estudio realizado en Guayaquil, Ecuador se describieron tres co-infecciones de

CHIKV/ZIKV, con presentaciones clínicas variadas, siendo el último caso el de una mujer que ingreso con síndrome de Guillain-Barré y se le detectó CHIKV y ZIKV, en suero y líquido cefalorraquídeo (Solignat et al., 2009). Estudios como el de Nicaragua encontraron 16 (4.6%) co-infecciones con CHIKV/ ZIKV (Waggoner et al., 2016), pero un estudio más reciente en Bahía, Brasil de 15 pacientes con diagnóstico de infección por ZIKV se identificó 2 (13,3%) co-infectados con CHIKV (Sardi et al., 2016). Según lo anterior, la información disponible en el mundo es muy limitada respecto a co-infecciones entre DENV/ZIKV, CHIKV/ZIKV y DENV/CHIKV/ZIKV, pero se espera que con las diferentes investigaciones que se están realizando frente a los recientes brotes en América por CHIKV y ZIKV, la frecuencia de estas co-infecciones sea más alta.

Planteamiento del problema y justificación

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2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y

JUSTIFICACIÓN

El Dengue, la fiebre Chikungunya y la fiebre del Zika, son infecciones virales agudas, producidas por DENV, CHIKV y ZIKV, respectivamente, virus que son transmitidos por el mismo vector, lo que resulta en la circulación los tres virus (co-circulación) en las regiones donde se encuentra el vector (Caron et al., 2012). El Dengue existe en las Américas desde hace más de 200 años (cita), no obstante la campaña de erradicación del Aedes aegypti que hizo la Oficina Sanitaria Panamericana (OSP) en 1947 para prevenir la fiebre amarilla, consiguió desaparecer el DENV durante aproximadamente 20 años. Pero en la segunda mitad de 1971, el dengue reapareció en Colombia de forma explosiva con la epidemia de DENV-2 en la Costa Atlántica y a través de los años diferentes brotes determinaron que en nuestro país circulan los cuatro serotipos y que se producen ciclos epidémicos en casi todos los asentamientos ubicados por debajo de los 1.800 m.s.n.m (Díaz et al., 2006).

El CHIKV fue identificado alrededor de 1952 - 1953 en la epidemia de la franja

suroriental de Tanzania, describiendo a la fiebre de Chikungunya como similar al Dengue por la fiebre alta, artralgias y erupción cutánea (Staples, Breiman, & Powers, 2009). Algunos años después este virus causó numerosos brotes en países de África, Sudeste Asiático y en menos de 10 años, se había extendido por todo el Océano Índico, Pacífico y Caribe, causando millones de casos en más de 50 países (T. E. Morrison, 2014).

Desde la introducción en el 2013 del CHIKV a la región de las Américas, se

preveía que su llegada a nuestro país era inminente, sin embargo en el 2014 no se tuvieron las medidas de control suficientes, por lo que el CHIKV se convirtió en una epidemia de mayores proporciones. Por ello, al finalizar el 2014 habían más 96.687 casos notificados, distribuidos en 30 departamentos, siendo Norte de Santander (Cúcuta y su área metropolitana) el departamento que presento la mayor frecuencia de casos (I. N. d. S. República de Colombia, 2014b), tanto que se presentó una emergencia sanitaria, donde se desbordó la capacidad de atención en las salas de urgencias de la red hospitalaria.

El ZIKV fue identificado en 1947, en monos Rhesus del Bosque Zika en Uganda

(Mattar & González, 2015). Posteriormente, por medio siglo causo infecciones esporádicas en diferentes países del África y Asia (Hayes, 2009). En 2007, se reportó un brote en los Estados Federados de Micronesia y en octubre del 2013, el virus reapareció en la Polinesia francesa causando una gran epidemia entre el 2013-2014 (Campos et al., 2015). El primer caso autóctono de ZIKV en las Américas, se presentó en febrero de 2014, en Isla de Pascua (Chile) y en mayo de 2015 se confirmaron los primeros 16 casos de infecciones por ZIKV en el noroeste de Brasil (Mattar & González, 2015). A pesar de que la propagación inicial fue lenta, una vez apareció en América del Sur, se expandió del tal manera que ya se encuentra en 25 países, incluido Colombia (Barreto-Vieira et al., 2016). A pesar de la experiencia anterior de CHIKV en nuestro país, al finalizar el 2015

Planteamiento del problema y justificación

17

habían más 11.712 casos notificados como fiebre de Zika, siendo el mayor número de casos confirmados por clínica en la región Oriental con un total de 1.437 casos, procedentes especialmente de Norte de Santander.

La importancia actual de ZIKV radica en las complicaciones tales como las

alteraciones a nivel neurológico y la microcefalia asociada a la infección congénita, recientemente informadas en las epidemias de ZIKV en las islas del pacifico y Brasil, por tal motivo se ha insistido sobre la importancia del diagnóstico por laboratorio para ZIKV, sin embargo, en Colombia son pocas las instituciones que lo realizan y de ahí que los diagnósticos confirmados para ZIKV son menores a los diagnosticados por clínica.

También es primordial resaltar que el Dengue, la fiebre Chikungunya y la fiebre

del Zika en sus etapas iniciales presentan similares manifestaciones clínicas y el diagnóstico diferencial de estos síndromes febriles debería realizarse con técnicas serológicas o moleculares, siendo las moleculares las más recomendadas especialmente por los falsos positivos que para DENV y ZIKV, virus que pertenecen a la misma familia y género. Infortunadamente en Colombia, el diagnóstico que se realiza en la mayoría de los casos es por la clínica del paciente, esto siempre y cuando exista una transmisión autóctona comprobada del virus o municipios donde se halla declarado situación de brote (I. N. d. S. República de Colombia, 2014b). Teniendo en cuenta lo anterior, es difícil establecer un diagnostico por la sintomatología y más en zonas donde co-circulan los tres virus (Mardekian & Roberts, 2015). Esto con lleva a que en Colombia se puedan estar generando subregistros, más aún si existen co-infecciones.

Norte de Santander está ubicado en la zona nororiental del país, limita al norte y el

oriente con la Venezuela, al sur con los departamentos de Boyacá y Santander, al occidente con el Cesar. Tiene 40 municipios agrupados en 6 subregiones, 2 provincias y un área metropolitana. Su capital es la ciudad de Cúcuta, que aporta la mayor población, después están los municipios de Villa del Rosario y los Patios, ambos parte del Área metropolitana de Cúcuta, aportando aproximadamente el 60% de la población del departamento.

Por consiguiente es indispensable en esta región del país que ha sido tan afectada

por los arbovirus y donde pocas investigaciones se han realizado, desarrollar estudios moleculares para DENV, CHIKV y ZIKV en pacientes con enfermedades febriles, lo que llevará a un mejor diagnóstico, manejo clínico de los casos y generar estrategias efectivas que controlen otra epidemia inminente. Adicionalmente, es trascendental establecer la prevalencia de co-infecciones información que hasta el momento no está reportada en nuestro país.

Objetivos

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3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Determinar mediante métodos moleculares, la presencia de los virus de Chikungunya (CHIKV), Dengue (DENV) y Zika (ZIKV), en sueros de pacientes con síndrome febril del municipio de Villa del Rosario, Norte de Santander.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Identificar los serotipos circulantes de DENV

Identificar los genotipos circulantes de DENV

Identificar los genotipos circulantes de CHIKV

Identificar los genotipos circulantes de ZIKV

Determinar la frecuencia de co-infecciones DENV/CHIK, DENV/ZIKV, CHIKV/ZIKV y DENV/CHI

Materiales y Métodos

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4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1. MATERIALES

4.1.1. Kit de Extracción de ARN (Viral RNA Mini Kit ID: 52906, QIAamp).

La mayor dificultad en la extracción del ARN es evitar la contaminación con RNAsas, enzimas que no necesitan para su función cofactores.

La extracción del ARN con el ácido tiosanato de guanidin, método desarrollado

por Boom et al. (1990), separa los ácidos nucleicos con base en su alta afinidad para enlazarse en matrices de sílice. Algunas compañías se basan en este principio, utilizan matrices de sílice diseñadas para favorecer la unión de ARN.

El mini kit Viral RNA combina las propiedades de unión selectiva de una

membrana basada en sílice con la velocidad del microspin. La muestra se lisa primero por desnaturalizantes para desactivar RNasas y asegurar el aislamiento de ARN viral. Las condiciones de tamponamiento se ajustan para proporcionar unión óptima del ARN a la membrana QIAamp, y la muestra se carga en la columna de centrifugación QIAamp Mini. El ARN se une a la membrana, y los contaminantes se lavan de manera eficiente en dos etapas utilizando dos tampones de lavado diferentes. La membrana especial QIAamp garantiza la alta recuperación de ARN puro e intacto.

4.1.2. Kit síntesis de ADNc (RevertAid First Strand cDNA Synthesis #K1622 Kit,Thermo Scientific).

La técnica de transcriptasa inversa (RT) permite pasar el ARN en ADN

complementario (ADNc) a partir de la actividad de la enzima transcriptasa inversa o retrotranscriptasa.

El Kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis es un sistema completo para la

síntesis eficiente de la primera cadena de cDNA a partir de plantillas de ARN. El kit utiliza RevertAid transcriptasa inversa (RT), mantiene su actividad a 42-50 ° C y es adecuada para la síntesis de ADNc de hasta 13 kb. El inhibidor RiboLock RNase protege eficazmente plantillas de ARN de la degradación. Este kit también suministra cebadores de Random Hexamer que no requieren la presencia de la cola de poli (A).


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4.1.3. Master Mix (Maxima Hot Start Green PCR master Mix (2x) #K1062, Thermo Scientific®).

El Master Mix es una solución donde están incluidos reactivos necesarios para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de forma que sólo hay que añadir la muestra de ADN o cDNA y los primers. El Master Mix Thermo Scientific Maxima Hot Start Green PCR (2X) contiene Maxima Hot Start Taq ADN polimerasa, un tampón de PCR optimizado, Mg2 +, y dNTPs. La enzima Maxima Hot Start Taq ADN polimerasa es inactiva a temperatura ambiente, evitando la extensión no especifica de cebadores hibridados o dímeros de cebadores y proporcionando una mayor especificidad de la amplificación de ADN. La actividad funcional de la enzima se restaura durante una corta incubación de 4 minutos a 95 ° C. Este Master Mix se complementa con dos colorantes de rastreo y un reactivo de densidad que permite la carga directa de productos de PCR en un gel. Los colorantes del Master Mix no interfieren con el rendimiento de PCR y son compatibles con las aplicaciones posteriores tales como secuenciación de ADN, ligación y digestión de restricción.

4.1.4. Taqman (Taqman® Gene Expression Master Mix, ID: 4369016, Applied Biosystems).

La TaqMan son sondas de hidrólisis formadas por un fluoróforo unido

covalentemente al extremo 5' de un oligonucleótido, y un desactivador fluorescente (quencher) en el extremo 3'. Esta sonda pertenece a los métodos específicos utilizados para detectar los productos amplificados en la qPCR. Los métodos específicos consisten en transferir energía desde un reportero fluorescente a un aceptor o quencher, principio conocido como transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET).

La TaqMan está diseñada de manera que hibride con una región específica de ADN

que va a ser amplificada por un par de oligonucleótidos específicos. A medida que la Taq polimerasa sintetiza la cadena en sentido 3'-5', su la actividad exonucleasa 5'-3' hidroliza o degrada la sonda TaqMan ya hibridada al ADN. La hidrólisis de la sonda separa el reportero fluorescente, rompiendo así la proximidad entre éste y el quencher, permitiendo de esta manera la emisión de fluorescencia.

Kit Taqman® Gene Expression Master Mix es una solución lista para su uso, que

incluye AmpliTaq Gold® DNA polimerasa, UP (Ultra Pure) para la activación de arranque en caliente y mezcla de dNTPs con dTTP / dUTP y uracilo-ADN glicosilasa (UDG) para reducir la contaminación en la PCR, de forma que sólo hay que añadir ADN o ADNc y cebadores.

4.1. 5. Otros materiales

Tubo tapa roja sin anticoagulante (5 ml, IMPROVE).

https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Sonda_de_hidr%C3%B3lisis&action=edit&redlink=1

https://es.wikipedia.org/wiki/Fluor%C3%B3foro

https://es.wikipedia.org/wiki/Oligonucle%C3%B3tido

https://es.wikipedia.org/wiki/Quenching_(fluorescencia)


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Agujas calibre 21 (GX 1-1/4, BD Vacutainer Eclipse Etanol absoluto

Etanol 70%. Agente intercalarte de electroforesis (SYBR® Safe, Thermo Scientific®). Agarosa

Buffer TAE 50X

Marcador de peso molecular (O´GeneRuler 100 bp DNA Ladder #SM1143, Thermo Scientific®).

Controles positivos y negativos.

Se usaron controles positivos y negativos con el fin de evitar falsos positivos o negativos, garantizando la evaluación segura de los resultados de las PCR realizadas. Los controles positivos de Dengue fueron sobrenadantes de cultivos de DENV, igualmente el control positivo de Chikungunya fue sobrenadante de cultivo de CHIKV y los controles positivos para Zika, uno fue una muestra positiva previamente confirmada y los otros dos controles fueron sobrenadantes de cultivos de ZIKV, estos controles fueron suministrados por el Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales (PECET) de la Universidad de Antioquia. Como control negativo en todas las técnicas, se usó agua libre de nucleasas.

4.1.6. Equipos

Los equipos que fueron requeridos para el proyecto de investigación se describen a continuación (Tabla 1).

Tabla 1. Equipos de laboratorio

DESCRIPCIÓN ACTIVIDAD EN LA QUE SE REQUIRIÓ Termociclador (Proflex tm PCR System, Thermo Scientific® y MultiGene Gradient, Labnet)

Síntesis de cDNA Amplificación de cDNA para la detección de DENV, CHIKV y ZIKV

Termociclador qPCR (C1000 Thermal cycler, cfx96 Real time system, BIORAD)

Amplificación y cuantificación de cDNA para la detección de DENV y ZIKV

Cámara de electroforesis Visualización de los productos amplificados Transiluminador Visualización de los productos amplificados Fotodocumentador de geles (MiniBIS 16 mm, Bio Imaging Systems).

Visualización de los productos amplificados



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Vortex Homogenización Microspin (Centrífuga Mini Para 8 Tubos Eppendorf, Dragon Lab)

Sedimento y aislamiento de fraccionamiento celular

Microcentrifuga refrigerada (Prism R Micro Refrigerada Alta Velocidad, Labnet)

Sedimento y aislamiento de fraccionamiento celular

Micropipetas Tomar unidades precisas de volúmenes Espectofotómetro (Nanodrop 2000c UV-Vis spectrophotometer, Thermo Scientific®)

Medición de la concentración y la pureza del ARN

Balanza electronica Medición de la cantidad de agarosa necesaria para preparar los geles de electroforesis

Cámara de Flujo laminar Mantener la idoneidad de la muestra evitando contaminaciones

Nevera –20 ° C Preservación de reactivos, controles y las muestras de cDNA obtenidas. Preservación de los productos amplificados

Congelador -80 ° C Preservación de los ARN de controles y las muestras obtenidas

4.2. MÉTODOS

4.2.1. Recolección de muestras

Se recolectaron desde agosto de 2015 a Abril de 2016, muestras de suero obtenidas de pacientes que asistían a la ESE hospital Jorge Cristo Sahium, en el municipio Villa del Rosario, Norte de Santander.

4.2.2.1. Diseño del estudio

Este estudio es transversal y se realizó con muestras obtenidas en el municipio Villa del Rosario (Norte de Santander). Las muestras se recolectaron desde agosto de 2015 a Abril de 2016, de sueros obtenidos de pacientes que asistían a la ESE hospital Jorge Cristo Sahium. Este hospital es una institución prestadora de salud (IPS) de baja complejidad que ofrece servicios a los usuarios de las entidades promotoras de salud (EPS) subsidiadas y contributivas, a la población pobre y vulnerable del Municipio de Villa del Rosario, sus corregimientos y el área rural.


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4.2.2.2. Población y tamaño de la muestra

Teniendo en cuenta que son pocos los estudios que se han realizado en Norte de Santander y que este estudio es el primero en donde se determina la co-circulación de DENV, CHIKV y ZIKV, así mismo la prevalencia de co-infecciones; el tipo de muestreo realizado es por conveniencia, se seleccionó el municipio de Villa del Rosario ya que hace parte del área metropolitana de Cúcuta y es el tercer municipio con mayor población de departamento, igualmente es uno de los más afectados por las infecciones causadas por los arbovirus. La recolección de la muestra se realizó aproximadamente durante 9 meses con el fin de obtener un mayor número de muestras y una mejor representación de los virus que circulan actualmente en ese municipio

4.2.2.3. Criterios de inclusión

Los participantes en el estudio, fueron personas de cualquier edad con diagnóstico clínico de síndrome febril compatible con Dengue, Fiebre de Chikungunya o Fiebre de Zika, debían estar en etapa aguda de la enfermedad, es decir, fiebre no mayor a 7 días. El diagnóstico clínico fue realizado dado por personal médico que labora en la E.S.E Villa del Rosario. Las personas que cumplieron con estos criterios debían firmar el asentimiento o consentimiento informado y llenar un formato de recolección de datos, donde se les pregunto la edad, sexo, días de evolución de la fiebre y diagnósticos presuntivos anteriores de DENV y/o CHIKV (ANEXO B). Posteriormente se procedió a realizar la toma de muestra sanguínea.

4.2.2.4. Confidencialidad

A todos los participantes de estudio se les pidió autorización para participar en el proyecto, diligenciando un consentimiento o asentimiento informado (de acuerdo a la edad del participante) el cual fue aprobado por el comité de Bioética de la Universidad Cooperativa de Colombia (Sede Bucaramanga) y el Comité científico de la ESE Villa del Rosario. Todas las muestras y los datos se analizaron de forma anónima (ANEXO A).

El título del estudio identificado en los consentimientos y asentimientos es

“Identificación de co-infecciones por Virus Chikungunya/Virus Dengue en una cohorte de pacientes de Norte de Santander, Colombia” puesto que a mitad del 2015 en el país aún no habían casos de ZIKV, no se tenía como objetivo inicial identificar este virus, pero debido a la introducción de este virus al final del año y como existe un apartado de consentimiento extendido, se nos fue posible ampliar los objetivos y realizar los respectivos análisis.


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4.2.2.5. Toma de muestras sanguíneas

Se verificó que los elementos que se iban a utilizar estuvieran listos y que el paciente se encontrará cómodo, se marcó el tubo tapa roja sin anticoagulante de 5 ml (IMPROVE) correspondiente del paciente.

Se observó las dos extremidades superiores (brazos), para elegir el mejor sitio de

la punción y se colocó el torniquete con suficiente tensión. Se inspeccionó la vena que se iba a puncionar, preferiblemente la visible y fácilmente palpable. Se limpió la zona con alcohol al 70%, en un área de dos pulgadas y se utilizó agujas calibre 21 GX 1-1/4 (BD Vacutainer Eclipse). Se retiró el estuche protector de la aguja, de tal manera que el bisel estuviera hacia arriba, se colocó la aguja en dirección paralela, se perforó la piel, haciendo avanzar la aguja 0.5 cm a 1 cm en el tejido subcutáneo, para perforar la vena.

Se adicionaron 5 ml de sangre venosa del paciente en el tubo seco, el torniquete

permaneció colocado de 10 a 15 segundos, después de la punción se retiró a tiempo y se depositó y destruyó todo el material desechable en los recipientes destinados para cada uno de estos.

Terminada la punción se dejó los tubos en reposo de 10 a 20 minutos, en algunos casos se removió el coagulo con palillo, teniendo la precaución de no producir hemolisis. Se colocaron los tubos en la centrifuga, siendo balanceados (tubos del mismo calibre, teniendo la misma cantidad de muestra), para centrifugarlos 5 minutos a 2500 rpm. Se retiraron los tubos de la centrifuga colocándolos en una gradilla y con un dispensador plástico, se pasó el sobrenadante a un vial previamente marcado.

Esta muestra de suero colectada en el vial, se guardó en la nevera de -20 ° C del

laboratorio de la ESE Villa del Rosario, mientras era transportada para ser almacenada en ultracongelación en el laboratorio de investigaciones biomédicas y biotecnológicas (LIBB), Universidad de Santander (UDES), Bucaramanga. El transporte de las muestras se realizó en hielo seco, para garantizar la calidad del ARN.

4.2.2. Aislamiento de ARN de las muestras de suero

Las muestras de suero recolectadas, 10 minutos antes de realizar la extracción de ARN, se colocaron a temperatura ambiente. Una vez preparados los elementos que se iban a utilizar, se procedió a realizar la extracción utilizando el kit de Qiagen (QIAamp Viral RNA Mini Kit), siguiendo las instrucciones del fabricante (ANEXO C).

Se determinó la calidad y la cantidad de RNA mediante el análisis

espectrofotométrico en el Nanodrop 2000c UV-Vis spectrophotometer (Thermo Scientific®). Las alícuotas de RNA obtenidas se almacenaron a -80ºC hasta su uso.


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4.2.3. Síntesis de ADNc

La síntesis de cADN se realizó con el kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific®), siguiendo las instrucciones del fabricante (ANEXO D). El producto de reacción se almacenó a -20ºC hasta su uso.

4.2.4. Identificación molecular de DENV

Para la detección del DENV, se realizó una PCR convencional. Se utilizaron los cebadores que corresponde al gen de la proteína pre-Membrana (C-prM), propuestos por Lanciotti et al. (1992) (Lanciotti, Calisher, Gubler, Chang, & Vorndam, 1992) (Tabla 2).

Tabla 2. Primers específicos utilizados en la PCR convencional de DENV

NOMBRE SECUENCIA 5’ – 3’ ORIENTACION

mD1 TCA ATA TGC TGA AAC GCG AGA GAA ACC G FORWARD

D2 TTG CAC CAA CAG TCA ATG TCT TCA GG TTC REVERSE Para realizar la mezcla de la reacción, se usó Maxima Hot Start Green PCR Master

Mix (2x) (Thermo Scientific®), 0 µMol de cada cebador y 2 µl de ADNc de las muestras, para un volumen final de 50 µl. Las condiciones de la amplificación fueron: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 5 minutos; seguido por 35 ciclos a 95 ° C por 30 segundos, 55 ° C durante 45 segundos y 72 ° C durante 33 segundo, extensión final a 72°C por 10 minutos.

Los productos fueron visualizados en geles de agarosa al 1.5 % teñidos con

SYBR® Safe (Thermo Scientific®) y se examinaron bajo luz ultravioleta utilizando el fotodocumentador de geles MiniBIS (Bio Imaging Systems). El tamaño de los productos de PCR esperados fue de 511 pares de bases (pb).

4.2.4.1 Serotipificación de DENV

La serotipificación se realizó por PCR múltiplex. Para realizar la mezcla de la reacción se usó Maxima Hot Start Green PCR Master Mix (2x) (Thermo Scientific®), 10 µmol de cada cebador MD1, rTS1, mTS2, TS3 y rTS4, que corresponde al gen de la proteína pre-Membrana (C-prM), descritos por Chien-Jung et al. (2006) (Chien et al., 2006) (Tabla 3) y 2 µl de ADNc de las muestras, para un volumen final de 50 µl. Las condiciones de la amplificación fueron iguales a las descritas anteriormente en la PCR convencional para DENV.

http://jcm.asm.org/search?author1=Li-Jung+Chien&sortspec=date&submit=Submit


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Tabla 3. Primers específicos utilizados en la PCR de serotipificación

NOMBRE SECUENCIA 5’ – 3’ ORIENTACIÓN

mD1 TCA ATA TGC TGA AAC GCG AGA GAA ACC G FORWARD

rTS1 CCC GTA ACA CTT TGA TCG CT REVERSE

mTS2 CGC CAC AAG GGC CAT GAA CAG TTT REVERSE

TS3 TAA CAT CAT CAT GAG ACA GAG C REVERSE

rTS4 TTC TCC CGT TCA GGA TGT TC REVERSE Los productos fueron visualizados en geles de agarosa al 1.5 % teñidos con SYBR® Safe (Thermo Scientific®) y se examinaron bajo luz ultravioleta utilizando el fotodocumentador de geles MiniBIS (Bio Imaging Systems). El tamaño de los productos de PCR esperados fueron 208 pb para DENV-1, 119 pb para DENV-2, 288 pb para DENV-3 y 260pb para DENV-4.

4.2.5. Identificación molecular de CHIKV

Para la detección de CHIKV, se realizó una PCR convencional. Se utilizaron los cebadores que corresponde al gen que codifica para la proteína de envoltura (Env), propuestos por M.P Feffer et al. (2002) (Pfeffer, Linssen, Parker, & Kinney, 2002) (Tabla 4).

Tabla 4. Primers específicos utilizados en la PCR CHIKV


Chik-1 TAA TGC TGA ACT CGG GGA CC FORWARD

cChik-4 ACC TGC CAC ACC CAC CAT CGAC REVERSE

Para mezcla de reacción, se usó el Maxima Hot Start Green PCR master Mix (2x) (Thermo scientific), 10 µMol de cada cebador y 2 µl de ADNc de las muestras, para un volumen final de 50 µl. Las condiciones de la amplificación fueron: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 5 minutos; seguido por 35 ciclos a 94 ° C por 5 segundos, 64 ° C durante 45 segundos y 72 ° C durante 30 segundos, extensión final a 72°C por 10 minutos. Los productos fueron visualizados en geles de agarosa al 1.5 % teñidos con SYBR® Safe (Thermo Scientific®) y se examinaron bajo luz ultravioleta utilizando el fotodocumentador de geles MiniBIS (Bio Imaging Systems). El tamaño de los productos de PCR esperados fue de 427 pb.


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4.2.6. Identificación molecular de ZIKV

Para la detección de ZIKV, se realizó una qPCR utilizando Taqman® Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems). Se utlizó 5µMol de cada cebador ZIKV1086 y ZIKV1162c, 2.5µMol de la sonda ZIKV1107-FAM (Lanciotti et al., 2008) (tabla 5) y 2 µl de ADNc de las muestras, para un volumen final de 20 µl. Las condiciones de la amplificación fueron: 2 minutos a 50° C para la activación, 10 minutos a 95° C para una desnaturalización inicial, 45 ciclos a 95 ° C durante 15 segundos, 60 ° C durante 60 segundos.

Tabla 5. Primers específicos utilizados en la qPCR de ZIKV


ZIKV1086 CCG CTG CCC AAC ACA AG FORWARD

ZIKV1162c CCA CTA ACG TTC TTT TGC AGA CAT REVERSE

ZIKV1107-FAM AGC CTA CCT TGA CAA GCA GTC AGA CAC TCA A SONDA

4.2.7. Secuenciación

Los amplicones obtenidos de algunas de las muestras positivas para para DENV, CHIKV y ZIKV fueron purificados y secuenciados por Macrogen Inc. (Seoul, Korea) en un secuenciador ABI 3730xl automatizado.

4.2.8. Construcción de los arboles filogenéticos

Para identificar el origen de las cepas de DENV y CHIVK que circularon en la zona y el periodo de estudio, las secuencias obtenidas de las muestras fueron comparadas con diversas cepas prototipo de cada uno de estos virus mediante BLAST y la herramienta on-line Dengue, Zika & Chikungunya Viruses Typing Tool Version 0.9 – Alpha (available at www.bioafrica.net/software.php). Las secuencias fueron editadas usando el software Chromas 2.6 y posteriormente alineadas utilizando CLUSTAL W (Thompson, Higgins, & Gibson, 1994) con cepas previamente reportadas en el Genbank.

Los árboles filogenéticos fueron construidos usando el Software MEGA 7.0

(Kumar, Stecher, & Tamura, 2016), mediante el método Neighbour joining (Saitou & Nei, 1987) con un Bootstrap de 1000 réplicas.

http://www.bioafrica.net/software.php


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4.2.8. Análisis de datos

Los datos se digitaron en una base de datos en Excel y posteriormente se realizó un análisis descriptivo de las variables incluidas estimando las medidas de frecuencia, tendencia central y de dispersión para las variables cuantitativas y proporciones para las variables cualitativas. Las prevalencias se analizaron con el paquete WinEpi on line (available at http://www.winepi.net) y se presentaron como valor absoluto y su intervalo de confianza del 95% (IC95%). Las comparaciones entre grupos se realizaron utilizando pruebas para datos paramétricos o no paramétricos según correspondió según análisis de normalidad (Shapiro-Wilk normality test). Las proporciones fueron comparadas usando la prueba de Chi-cuadrado. Todos los análisis estadísticos fueron realizados usando el paquete Prism® 7.01 para Windows ™ (GraphPad Software, San Diego, CA). En todos los casos, un p value <0.05 fue considerado estadísticamente significativo.

Resultados

29

5. RESULTADOS

5.1 DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA COHORTE

Villa del Rosario es un municipio del departamento de Norte de Santander, que limita con Venezuela, pertenece al Área metropolitana de Cúcuta, con una población reportada en el 2011 de 80,433 habitantes (Fig. 1) y cuenta con un hospital público E.S.E Jorge Cristo Sahium, lugar donde desde agosto de 2015 hasta abril de 2016 se recolectaron 157 muestras de suero las cuales fueron evaluadas en el estudio.

Figura 1. Localización geográfica del lugar de muestreo. El área rosada denota el departamento de Norte de Santander, el área azul denota el municipio de Villa del Rosario. El mapa fue creado usando software DIVA-GIS versión 6.5.0 para Windows™

La edad media de los pacientes fue de 26,81 años (D.E ± 14,54 años), en relación

al género 103 (65,6%) fueron mujeres y 54 (34,39%) fueron hombres. Según los datos aportados por los pacientes en la encuesta epidemiológica: 8 (5,1%) personas afirmaron haber presentado DENV y 19 (12,1%) afirmaron haber presentado Chikungunya.

De las 157 muestras evaluadas, 82 (52.2%) resultaron positivos para uno o varios

de los arbovirus estudiados y 75 (47.8%) resultaron negativos. La edad media de los pacientes con resultados positivos fue de 22.6 años (D.E± 1.62 años) y de ellos 25 eran hombres (30.5%) y 57 eran mujeres (69.5%); los grupos etarios más afectados por una o varias de las arbovirosis evaluadas se encuentra los adultos entre 20 y 30 años (28.0%), la población infantil de menos de 10 años (26.8%) y la población juvenil de hasta 20 años de edad (19.5%), sin embargo los grupos menos afectados fueron los de adultos mayores de 30, 40 y 50 años. Finalmente, la edad media de los pacientes con resultados negativos

Resultados

30

fue de 19.91 años (D.E ± 1.69 años) y de ellos 29 eran hombres (38.7%) y 46 eran mujeres (61.3%) (Tabla 6).

Tabla 6. Distribución por sexo y edad de los pacientes positivos y negativos a los arbovirus evaluados

Arbovirus negativo (N=75)

Arbovirus positivo (N=82) P

Hombres % (N) 38.7 (29) 30.5 (25) 0.2812a Mujeres % (N) 61.3 (46) 69.5 (57) Edad, años (Media ± D.E) 19.91 ± 1.69 22.6 ± 1.62 0,245

Grupos etarios P 0 -10 33.3 (25) 26.8 (22) 0,647

11 – 20 25.3 (19) 19.5 (16) 0,267 21 – 30 21.3 (16) 28.0 (23) 0,380 31 – 40 8.0 (6) 11.0 (9) 0,641 41 – 50 6.7 (5) 7.3 (6) 0,006*

>50 5.3 (4) 7.3 (6) 0,953 * p<0.05 = Estadisticamente significativo (t-Student test)

a Chi-cuadrado (Χ2)

5.2 DISTRIBUCIÓN TEMPORAL DE LA INFECCIÓN

POR DENV, CHIKV Y ZIKV

Anteriormente se mencionó que las muestras se recolectaron en un periodo de 9 meses, siendo el periodo comprendido entre diciembre de 2015 y febrero de 2016 donde se reportaron el mayor número de casos (70.7%) (Fig. 2).

Para DENV, se evidenciaron dos picos uno menor comprendido entre los meses

de septiembre y octubre de 2015 (18.2% de los casos totales de dengue) y uno mayor comprendido entre los meses de diciembre de 2015 y febrero de 2016 (81.8% de los casos totales).

Para CHIKV, el comportamiento fue de un número de casos sostenido durante gran

parte del periodo evaluado (septiembre de 2015 a febrero de 2016) y finalmente, los primeros casos de ZIKV se confirmaron a partir de diciembre de 2015, y se conserva en un número de casos sostenido hasta el final del periodo evaluado.

Resultados

31

Figura 2. Distribución temporal de la infección por DENV, CHIKV y ZIKV. Se observa que el periodo comprendido entre diciembre de 2015 y Febrero de 2016 fue donde se reportó el mayor número de casos (70.7%).

5.3 CO-CIRCULACIÓN DE DENV, CHIKV Y ZIKV

5.3.1 DENV

La prevalencia de DENV en la población evaluada fue del 21.02% (33/157) (IC 95%: 14.65 - 27.39), con una tasa de ataque de 40.99 casos por cada 100.000 habitantes. El rango medio de edad de la población infectada fue 21.09 (D.E. ± 2.04); en relación al género el 72,72 % (24/33) fueron mujeres y 27.3% (9/33) hombres y el grupo etario más afectado se encuentra los adultos entre 20 y 30 años (33.3%) (Tabla 8). El resultado de la serotipificación por PCR multiplex (Fig. 3), demostró que el 90.9% (30/33) pertenecían a DENV-2, el 6.1% (2/33) a DENV-1 y 3.0% (1/33) a DENV-3.

Resultados

32

Figura 3. Serotipificación de DENV por PCR multiplex convencional. MW. Marcador de peso molecular (100pb). Lineas 1-2, 4, 6-9, muestras positivas para DENV-2 (119pb); línea 3, muestra positiva para DENV-1 (208pb); línea 5, muestra positiva para DENV-3 (288pb); línea 10, control negativo

5.3.2 CHIKV

La identificación de CHIKV fue realizada por PCR convencional como se explicó anteriormente (Fig.4). La prevalencia de CHIKV fue del 29.94% (47/157) (IC 95%: 22.77 – 37.10), con una tasa de ataque de 58.38 casos por cada 100.000 habitantes. La edad media de los pacientes fue 21.43 años (DE ±2.34); en relación al género el 59.57 % (28/47) fueron mujeres y 40.4% (19/47) hombres y el grupo etario más afectado se encuentra la población infantil de menos de 10 años (38.3 %) (Tabla 8).

Figura 4. Identificación por PCR convencional de CHIKV. MW. Marcador de peso molecular (100pb). Lineas 1, control negativo; linea 2, control positivo; líneas 3, 5, 7, 9 muestras negativas para CHIKV; líneas 4, 6, 8 y 10 muestras positivas para CHIKV (427pb).

Resultados

33

5.3.3 ZIKV

La identificación de ZIKV se realizó por PCR n tiempo real, como se explicó

anteriormente (Fig. 5). La prevalencia del ZIKV fue de 18.47% (29/157) (IC 95%: 12.40 – 24.54), con una tasa de ataque de 36.02 casos por cada 100.000 habitantes La edad media de los pacientes fue 29.72 años (D.E ± 2.09 años) y en relación al género el 86.20 % (25/29) fueron mujeres y 13.8% (4/29) hombres. El grupo etario más afectado se encuentra los adultos entre 20 y 30 años (37.9%) (Tabla 7)

Figura 5. Identificación por PCR en tiempo real de ZIKV. Imagen representativa de las unidades fluorescentes en relación a los ciclos realizados. Se observan muestras consideradas positivas con CT desde 29.09. Tambien se observan algunas muestras consideradas negativas (con CT mayores a 40.00) Tabla 7. Prevalencia, tasa de ataque y distribución por sexo y edad de los pacientes positivos a DENV, CHIKV y ZIKV

DENV (N=33) CHIKV (N=47) ZIKV (N=29) p

Masculino % (N) 27.3 (9) 40.4 (19) 13.8 (4) n/a Femenino % (N) 72.7 (24) 59.6 (28) 86.2 (25) n/a

Edad, años (Media ± D.E) 21.09 ± 2.04 21.43 ± 2.34 29.72 ± 2.09 * 0.0062a*

Grupo etarios 0 -10 24.2 (8) 38.3 (18) 0 (0) 0.2000b

11 – 20 24.2 (8) 14.9 (7) 20.7 (6) 0.3663a 21 – 30 33.3 (11) 19.1 (9) 37.9 (11) 0.6657a 31 – 40 12.1 (4) 10.6 (5) 24.1 (7) 0.8376a 41 – 50 3.0 (1) 10.6 (5) 6.9 (2) 0.5052c

> 50 3.0 (1) 6.4 (3) 10.3 (3) 0.3366c Diagnóstico confirmado

Prevalencia % (95% CI)

21.02 (14.65 - 27.39)

29.94 (22.77 - 37.10%)

18.47 (12.40 - 24.54) 0.4617d

Resultados

34

Tasa de ataque x 100,000 habitantes 40.99 x 105 58.38 x 105 36.02 x105 n/a

* p<0.05 = estadísticamente significativo a Kruskal-Wallis test b Unpaired t test c One-way ANOVA d Chi-cuadrado (Χ2)

5.3.4 Genotipificación de virus co-circulantes

Los análisis de las secuencias realizados mediante BLAST y la herramienta on-

line Dengue, Zika & Chikungunya Viruses Typing Tool permitieron confirmar la circulación de genotipo Asiático/Americano de DENV-2 con una homología del 99% con cepas de DENV-2 previamente reportadas en la región de Norte de Santander durante 2005 (GQ868556) (Fig.6). Para el caso del DENV-3, se evidenció la presencia del genotipo III (Fig.7) con una homología del 99% con cepas previamente reportadas para en la región norte de Venezuela en 2007 (FJ898474) para el DENV-1, se evidenció la circulación del genotipo V (Fig. 8) con una homología del 98% con cepas de DENV-1 reportadas en el Departamento de Santander en 2008 (GQ868570) y en el departamento de Sucre en 2009 (HM635907). La secuenciación de los amplicones del CHIKV permitió confirmar la presencia en Colombia del linaje Asiático (Fig.9) con un 99% de homología con diferencias secuencias de CHIKV previamente reportadas para Colombia (KX496989, KU518343), Haití (KX702402), Brasil (KU355832), México (KT247385) y otros países latinoamericanos y del Caribe.

Resultados

35

Figura 6. Análisis filogenético de la cepa DENV-2 circulante en Villa del Rosario. La historia evolutiva se dedujo usando el protocolo Neighbor-Joining para el gen de la proteína pr-M, usando un fragmento de 429 nucleótidos.

Resultados

36

Figura 7. El análisis filogenético de las cepas DENV-3 aisladas en Villa del Rosario. La historia evolutiva se dedujo usando el protocolo Neighbor-Joining para el gen de la proteína pr-M, usando un fragmento de 430 nucleótidos.

Resultados

37

Figura 8. Análisis filogenético de la cepa DENV-1 circulante en Villa del Rosario. La historia evolutiva se dedujo usando el protocolo Neighbor-Joining para el gen de la proteína pr-M, usando un fragmento de 431 nucleótidos.

Resultados

38

Figura 9. Análisis filogenético de cepas de CHIKV circulantes en Villa del Rosario. La historia evolutiva se dedujo usando el protocolo Neighbor-Joining para el gen de la proteína Envoltura, usando un fragmento de 326 nucleótidos.

5.4 CO-INFECCIONES

Aparte de la co-circulación de los tres arbovirus estudiados, se detectaron co-infecciones entre ellos: DENV/CHIK, DENV/ZIKV, CHIKV/ZIKV y DENV/CHIKV/ZIKV.

Resultados

39

La prevalencia de la co-infección DENV/CHIKV fue del 7.64% (IC 95% 3.49 –

11.80), con tasa de ataque de 14.90 casos por cada 100.000 habitantes, el rango medio de edad de los pacientes fue 23.17 (D.E ±4.57), de acuerdo al género tanto hombres como mujeres fueron afectados de igual manera y el grupo etario más afectado fue la población infantil de menos de 10 años (4/12) (33.3%).

La prevalencia de la co-infección de DENV/ZIKV fue del 6.37% (IC 95% 2.55 –

10.19), con tasa de ataque de 12.42 casos por cada 100.000 habitantes, el rango medio de edad de los pacientes fue 26.50 (D.E±2.35), de acuerdo al género la población más afectada fueron las mujeres (100%) y el grupo etario más afectado fue la población adulta de 21 a 30 años (5/10) (50.0%).

La prevalencia de la co-infección de CHIKV/ZIKV fue de 5.10 (IC 95% 1.66 –

8.54), con tasas de ataque de 9.93 casos por cada 100.000 habitantes, el rango medio de edad de los pacientes fue 30.13 (D.E±2.91), de acuerdo al género la población más afectada fueron las mujeres (87.5%) y el grupo etario más afectado fue la población adulta de 31 a 40 años (4/8) (50.0%).

Por otro lado, se encontraron tres pacientes co-infectados con los tres virus (prevalencia del 1.91%; IC 95% 0.00 – 4.05), con una tasa de ataque de 4.96 casos por 100.000 habitantes. El rango medio de edad el de los pacientes con triple infección fue 30.33 (D.E±4.18). De acuerdo al género la población más afectada fue la de mujeres (100%) (tabla 8) Tabla 8. Prevalencia, tasa de ataque y distribución por sexo y edad de los pacientes con co-infecciones

DENV/CHIKV (N=12)

DENV/ZIKV (N=10)

CHIKV/ZIKV (N=8)

DENV/CHIKV/ZIKV (N=3) p

Hombres% (N) 50.0 (6) 0 (0) 12.5 (1) 0 (0) n/a Mujeres% (N) 50.0 (6) 100 (10) 87.5 (7) 100 (3) n/a

Años, edad (mean ± EEM) 23.17 ± 4.57 26.50 ± 2.35 30.13 ± 2.91 30.33 ± 4.18 0.4915a

Grupos etarios 0 -10 33.3 (4) 0 (0) 0 (0) 0 (0) n/a

11 – 20 16.7 (2) 20.0 (2) 12.5 (1) 0 (0) 0.8764c 21 – 30 16.7 (2) 50.0 (5) 25.0 (2) 33.3 (1) 0.4749b 31 – 40 16.7 (2) 30.0 (3) 50.0 (4) 66.7 (2) 0.8788a 41 – 50 8.3 (1) 0 (0) 12.5 (1) 0 (0) n/a

>50 8.3 (1) 0 (0) 0 (0) 0 (0) n/a

Resultados

40

Diagnostico confirmado Prevalencia %

(95% CI) 7.64

(3.49 - 11.80) 6.37

(2.55 - 10.19) 5.10

(1.66 - 8.54) 1.91

(0.00 - 4.05) 0,2045c

Tasa de ataque x 100,000 habitantes

14.90 x 105 12.42 x 105 9.93 x 105 4.96 x105 n/a

* p<0.05 = estadisticamente significativo a Kruskal-Wallis test b One-way ANOVA c Chi-cuadrado (Χ2)

Discusión

41

6. DISCUSIÓN

Los resultados de este estudio, acerca de la simultánea co-circulación de DENV, CHIKV y ZIKV y sus co-infecciones claramente demuestran la crítica situación epidemiológica en la cual se encuentran las regiones tropicales y subtropicales de América y la necesidad de realizar diagnósticos diferenciales en los pacientes con síndrome febril agudo.

Villa del Rosario municipio donde se realizó este estudio, tiene una altitud de 440 m.s.n.m, hábitat ideal del mosquito vector (Ae. Aegypti) y donde también co-circula DENV, CHIKV y ZIKV. Los pacientes de esta región, que participaron en el estudio cumplían con el criterio básico de cuadro febril agudo por dengue (Temperatura ≥37.8°C por menos de 7 días, dolor articular, retroocular y/o extremidades, rash, hemorragia) (Javelle et al., 2015), sin embargo, solo el 52.2% de los pacientes fueron diagnosticados por técnicas moleculares para alguno de los tres arbovirus analizados, siendo CHIKV la más prevalente con un 29,93%, seguido por DENV con 21,01% y ZIKV un 18,47%.

Como se mencionó anteriormente, la prevalencia de DENV en la cohorte de

pacientes estudiados fue del 21.02%, con una tasa de ataque de 41 casos por cada 100.000 habitantes; no obstante investigaciones reportadas en el país indican que aproximadamente el 30% de los síndromes febriles es por DENV (Romero-Vega, Pacheco, la Hoz-Restrepo, & Díaz-Quijano, 2014), con una incidencia acumulada de casos que puede estar entre 36.5 y 268.7 casos/105 habitantes en diferentes regiones colombianas (Alvis-Guzman, Rodríguez-Barreto, & Mattar-Velilla, 2015; Villar et al., 2015). Esta disminución en la tasa de detección de DENV se puede explicar por la presencia y aumento en el número de casos de CHIKV y ZIKV, tal como ha sido reportado en la India, donde la prevalencia de DENV disminuyó con el aumento de los casos por CHIKV (Ramachandran, Das, Roy, Hada, & Mogha, 2016; P. Singh et al., 2012).

En Colombia los cuatro serotipos de DENV circulan desde hace más de 20 años

(Villar et al., 2015), en este estudio encontramos la circulación de los serotipos 1 -2 y 3 aunque con una mayor frecuencia el DENV-2 (90.9%). El análisis de las muestras positivas que se secuenciaron, se identificó que para el DENV-2, el genotipo el predominante fue Asiático/Americano, representativo también en la mayor parte de las cepas aisladas en Colombia (Villar et al., 2015). Para DENV-1, se identificó el genotipo V, resultado que concuerda con los últimos reportes en Norte de Santander (Clyde et al., 2006). Finalmente, para el DENV-3 se encontró el genotipo III, que desde su introducción en 2002 es predominante en Colombia (Gómez, Villabona-Arenas, Torres, Miranda-Esquivel, & Ocazionez, 2008).

El Instituto Nacional de Salud en el 2015, desde la semana epidemiológica 13 (29

marzo. al 04 abril) informó la disminución sostenida de casos por CHIKV hasta el mes de septiembre, donde el Ministerio de Salud declaró el fin de la epidemia de Chikungunya.

Discusión

42

Teniendo en cuenta lo anterior, el momento en el cual se realizó el muestreo ya se había declarado oficialmente el fin de la Epidemia, sin embargo la prevalencia obtenida de CHIKV fue de 29.94% y una tasa de ataque 58.38 casos/105 habitantes, cifra más alta que la tasa de ataque promedio establecida para Colombia durante el periodo epidémico 19.1 casos/105 habitantes (rango entre 4.5 y 283.1) (Cardona-Ospina, Villamil-Gómez, Jimenez-Canizales, Castañeda-Hernández, & Rodríguez-Morales, 2015). Esto demuestra que este virus se ha establecido como uno de los arbovirus de mayor importancia en el panel diagnóstico y posiblemente establece ciclos endémicos (Weaver, 2014).

Así mismo, es bien conocido que la mortalidad por CHIKV es menor que la

ocasionada por DENV (Wilder-Smith & Byass, 2016), pero las secuelas crónicas de la infección por CHIKV pueden tener mayor repercusión a largo plazo, llegando incluso a afectar al 25% de los pacientes infectados (Rodríguez‐morales, Cardona‐ospina, Urbano‐Garzón, & Hurtado‐Zapata, 2016), asociándose principalmente con “post-Chikungunya Chronic Inflammatory Rheumatism”, teniendo así un importante impacto sobre la calidad de vida futura de la población. Finalmente, el análisis de las muestras positivas de CHIKV que se secuenciaron, demostró la presencia del linaje Asiático, misma cepa que se ha reportado previamente en Colombia (Laiton-Donato et al., 2015; Mattar et al., 2015; Rodas et al., 2016).

La epidemia de ZIKV en el país comenzó en octubre del 2015 y los primeros casos

que se identificaron en este estudio fueron en el mes de Noviembre de 2015, encontrando al finalizar abril de 2016 una prevalencia de 18.47% y una tasa de ataque de 36 casos/105 habitantes, cifras menores a las reportadas para todo el departamento de Norte de Santander de 655 casos/105 habitantes (Pacheco et al., 2016). Pero es importante destacar que los datos oficiales representan el número total de pacientes diagnosticados por cuadro clínico y los resultados de este estudio son casos confirmados por laboratorio, que normalmente se presentan en menor número (Musso & Gubler, 2016).

Estas diferencias se deben a las dificultades del diagnóstico molecular de ZIKV

por las bajas cargas virales presentes en el suero de los pacientes (Naccache et al., 2016; Sardi et al., 2016) y estudios recientes indican que los índices de detección de ZIKV son más elevados en orina y saliva que en suero, concluyendo que la muestra de orina podría ser la ideal para identificar ZIKV (Mattar et al., 2015). En concordancia con lo reportado, en este estudio los “Cycle threshold” de amplificación de la qPCR fueron mayores a 29.09. Finalmente, se no realizó la secuenciación de las muestras positivas para ZIKV, porque este virus exigen una secuenciación más sensible y costosa y nuestro presupuesto era limitado; igualmente se debe resaltar que los primers de la PCR en tiempo real amplifican una región especifica del linaje Asiático/Caribe (Yaseen et al., 2014), se puede presumir que estas muestras pertenecen a este linaje, el cual ha sido el mismo reportado previamente en el país (Adiga, 2016; Camacho, Paternina-Gomez, Blanco, Osorio, & Aliota, 2016; Díaz-Quiñonez et al., 2016).

De acuerdo a las características sociodemográficas de este estudio, se encontró que

el género más afectado para estas tres arbovirosis son las mujeres, resultado posiblemente

Discusión

43

de prácticas socio-culturales que llevan a las mujeres a una mayor consulta médica o un mayor riesgo de exposición asociado a las conductas domésticas de las mujeres y el comportamiento domestico del Ae. Aegypti (A. C. Morrison, Zielinski-Gutierrez, Scott, & Rosenberg, 2008).

No obstante, en la actualidad, no es posible hablar de una susceptibilidad de

género, pero los resultados de este estudio están completamente de acuerdo con otros que muestran que la relación de casos entre mujeres/hombres generalmente está en una relación 2/1 o 3/1 tanto en infecciones por DENV, CHIKV o ZIKV. En Colombia esta relación ha sido previamente reportada en infecciones por DENV (Villar et al., 2015) durante el brote de CHIKV (Mattar et al., 2015) y recientemente para ZIKV (Pacheco et al., 2016), así como también a nivel internacional durante eventos endémicos para DENV (San Martín et al., 2010; Teixeira, Siqueira Jr, Ferreira, Bricks, & Joint, 2013), como epidémicos para CHIKV y ZIKV (Berger, 2016; Dirlikov, 2016).

De forma importante nuestro estudio también encontró una mayor frecuencia de

infección por el ZIKV entre las mujeres de 20-40 años, tal como ha sido reportado para el resto del país (Pacheco et al., 2016) y para otros países de la región durante el presente brote (Dirlikov, 2016). Teniendo en cuenta los posibles efectos adversos asociados con la infección por ZIKV durante el embarazo (Mlakar et al., 2016; Valentine, Marquez, & Pammi, 2016), es importante enfocar los esfuerzos de prevención a dicho grupo etario para disminuir los embarazos no deseados y aumentar la vigilancia de estos eventos adversos en mujeres embarazadas infectadas con ZIKV y en sus bebés (Organization & Organization, 2015).

Algunos casos de co-infecciones han sido reportados en Colombia, no obstante

esta investigación es el primer estudio transversal que demuestra las posibilidades de co-infección de estos tres arbovirus en Colombia, demostrando que aunque hay una aparente dominancia de la infección por CHIKV, los tres agentes co-circulan de forma simultánea en la región evaluada, tal como ha sido descrito en la India, donde se demostró la simultánea co-circulación en igual proporción de DENV, CHIKV y ZIKV durante 2010 (P. Singh et al., 2012) y posteriormente durante 2013 (Saswat et al., 2015).

En el mundo hay diferentes estudios de prevalencia de co-infección

DENV/CHIKV, especialmente investigadas en Asia y África, estas cifras varían desde muy bajas (2,8%) (Omarjee et al., 2014) hasta cifras mayores al 10% (Chahar et al., 2009a, 2009b; Saswat et al., 2015; Waggoner et al., 2016), lo cual concuerda con lo encontrado en esta investigación donde la prevalencia fue del 7,64%.

Por otro lado, son muy pocos los estudios que presentan la prevalencia de co-

infecciones DENV/ZIKV, en este estudio la prevalencia fue de 6.36%, cifra mayor a las reportadas en otras investigaciones como la de Pernambuco, Brasil con 2.6% (Umareddy et al., 2007) o en Nicaragua con 1.7% (Waggoner et al., 2016).

Discusión

44

De igual manera para la confección de CHIKV/ZIKV, actualmente existen muy pocos estudios de prevalencia. En este estudio la prevalencia fue de 5,09%, cifra menor a la reportada en Bahía, Brasil (13.3%) (Sardi et al., 2016), pero cercana a la reportada en Nicaragua (4.6%) (Waggoner et al., 2016).

Finalmente, la prevalencia de triple co-infección (DENV,CHIKV y ZIKV) fue de

1.9% , resultado que concuerda con la prevalencia recientemente reportada en Centroamérica (1.7%) (Waggoner et al., 2016). Es importante resaltar este estudio es el primero en reportar la prevalencia de triple co-infección en Suramérica. No obstante, ya en Colombia hay reportes de casos de triple infección por DENV, CHIKV y ZIKV como por ejemplo el caso de una mujer de Sincelejo de 33 años de edad, con síndrome febril y embarazada, con ecografías obstétricas normales y sin complicaciones (Villar et al., 2015).

La co-circulación y co-infección de estos arbovirus, recobra particular importancia

si se tiene en cuenta que enfermedades como el síndrome Guillain-Barré (SGB), el cual tiene un componente autoinmune desencadenado generalmente por un proceso infeccioso (Yuki & Hartung, 2012), se ha asociado a la infección por DENV (Soares et al., 2008), CHIKV (Villamil-Gómez, Silvera, Páez-Castellanos, & Rodriguez-Morales, 2016) y ZIKV (Arias et al., 2016) en nuestro país, lo que podría aumentar el riesgo de desarrollo de dicho síndrome aumentando las tasas de mortalidad y las complicaciones epidemiológicas. Por otro lado, es importante resaltar que recientes publicaciones, con evidencia clínica e histopatológica de pacientes co-infectados con DENV/CHIKV, demuestran que puede haber una la asociación entre la mortalidad y la co-infección por estos arbovirus (Mercado et al., 2016); y que tanto in vitro como In vivo se ha demostrado la potenciación dependiente de anticuerpos en pacientes con anticuerpos anti-DENV que adquieran la infección por ZIKV (Dejnirattisai et al., 2016; Priyamvada et al., 2016) o viceversa (Kawiecki & Christofferson, 2016).

Finalmente, teniendo presente el significado epidemiológico y clínico de la co-

circulación y las co-infecciones de DENV, CHIKV y ZIKV, nuestros resultados recalcan la dificultad del diagnóstico por clínica para estas arbovirosis, por lo que es necesario mejorar el diagnóstico diferencial y estudiar las posibles consecuencias en el desenlace clínico de estas enfermedades.

Conclusiones

45

7. CONCLUSIONES

En este trabajo solo el 52,22% de los síndromes febril agudos diagnosticados clínicamente como Dengue, Fiebre de Chikungunya o Zika, dieron positivos para alguno o varios de los tres arbovirus analizados. De igual forma se presenta la necesidad de mejorar el diagnóstico diferencial en estos pacientes, puesto que las manifestaciones clínicas producidas son muy parecidas.

De acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio, de los tres virus se observó una aparente dominancia de la infección por CHIKV, a pesar de ya haberse declarado el fin de la epidemia, lo que significa que posiblemente este virus establece ciclos endémicos y descarta la posibilidad de su desplazamiento en el departamento.

Se encontró la circulación de los serotipos DENV 1-2 y 3, siendo DENV -2 el de

mayor frecuencia (90.9%); respecto a los resultados de genotipos de estas cepas y la de CHIKV, esto concuerdan con los últimos reportes que hay en país sobre estos virus.

Finalmente, se establecieron las prevalencias de co-infecciones entre

DENV/CHIKV, DENV/ZIKV, CHIKV/ZIKV y triple co-infección DENV/CHIKV/ZIKV, por lo tanto, este es el primer estudio transversal en Colombia que demuestra la co-circulación y las posibilidades de co-infección.

Recomendaciones

46

8. RECOMENDACIONES El 47.8% de los síndromes febril agudos diagnosticados clínicamente como

Dengue, Fiebre de Chikungunya o Zika resultaron negativos, por lo que es primordial realizar en estos sueros otros estudios donde se identifiquen otros agentes causales sean virales, parasitarios o bacterianos de enfermedades infecciosas que se manifiestan como síndromes febril (malaria, fiebres de Mayaro y Oropuche, hantavirosis, encefalitis equina venezolana, influenza, rickettsiosis, leptospirosis, brucelosis, salmonelosis, etc.)

En las regiones donde la co-circulación de los tres agentes continúa, cobran gran relevancia para la salud pública estudiar la profundidad de las posibles consecuencias de las co-infecciones en el panorama epidemiológico, particularmente en el desenlace clínico; estudió que se podría realizar con esta cohorte de pacientes.

Dado que la mayoría de las regiones que actualmente sufren epidemias de ZIKV,

son endémicas para DENV y posiblemente para CHIKV, sería significativo realizar estudios enfocados en la co-infección en el vector.

De acuerdo a las características sociodemográficas de este estudio, se encontró que

el género más afectado fueron las mujeres, dato importante para salud pública puesto que serían una población importante en la que se puede realizar estrategias para el control de los arbovirus, para esto es elemental mostrar los resultados obtenidos tanto al hospital y la secretaria de salud del municipio.

Referencias

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9. REFERENCIAS Acosta, E. G., Castilla, V., & Damonte, E. B. (2009). Alternative infectious entry pathways for dengue virus

serotypes into mammalian cells. Cellular microbiology, 11(10), 1533-1549. Adiga, R. (2016). Phylogenetic analysis of the NS5 gene of Zika virus. Journal of Medical Virology, 88(10),

1821-1826. Alvis-Guzman, N., Rodríguez-Barreto, H., & Mattar-Velilla, S. (2015). Dengue in an area of the Colombian

Caribbean. Colombia Médica, 46(1), 3-7. Áñez, G. (2007). Evolución molecular del virus dengue: un área de investigación prioritaria. Investigación

Clínica, 48(3). Arias, A., Torres-Tobar, L., Hernández, G., Paipilla, D., Palacios, E., Torres, Y., . . . Castellanos, G. (2016).

Guillain-Barré syndrome in patients with a recent history of Zika in Cúcuta, Colombia, a descriptive case series of 19 patients from December 2015 to March 2016. Journal of Critical Care.

Arzuza-Ortega, L., Polo, A., Pérez-Tatis, G., López-García, H., Parra, E., Pardo-Herrera, L. C., . . . Rodríguez-Morales, A. J. (2016). Fatal sickle cell disease and Zika virus infection in girl from Colombia. Emerging infectious diseases, 22(5), 925.

Bäck, A. T., & Lundkvist, Å. (2013a). Dengue viruses–an overview. Infection ecology & epidemiology, 3. Bäck, A. T., & Lundkvist, Å. (2013b). Dengue viruses an overview. Infection ecology & epidemiology, 3. Baronti, C., Piorkowski, G., Charrel, R. N., Boubis, L., Leparc-Goffart, I., & de Lamballerie, X. (2014).

Complete coding sequence of Zika virus from a French Polynesia outbreak in 2013. Genome announcements, 2(3), e00500-00514.

Barreto-Vieira, D. F., Barth, O. M., Silva, M. A. N. d., Santos, C. C., Santos, A. d. S., & Filippis, A. M. B. d. (2016). Ultrastructure of Zika virus particles in cell cultures. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 111(8), 532-534.

Berger, S. (2016). Chikungunya and Zika: Global Status: 2016 Edition S. Berger (Ed.) (pp. 121). Boonnak, K., Slike, B. M., Burgess, T. H., Mason, R. M., Wu, S.-J., Sun, P., . . . Puthavathana, P. (2008).

Role of dendritic cells in antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. Journal of virology, 82(8), 3939-3951.

Buckley, A., & Gould, E. (1988). Detection of virus-specific antigen in the nuclei or nucleoli of cells infected with Zika or Langat virus. Journal of general virology, 69(8), 1913-1920.

Caglioti, C., Lalle, E., Castilletti, C., Carletti, F., Capobianchi, M. R., & Bordi, L. (2013). Chikungunya virus infection: an overview. New Microbiol, 36(3), 211-227.

Camacho, E., Paternina-Gomez, M., Blanco, P. J., Osorio, J. E., & Aliota, M. T. (2016). Detection of autochthonous Zika virus transmission in Sincelejo, Colombia. Emerging infectious diseases, 22(5), 927.

Campos, G. S., Bandeira, A. C., & Sardi, S. I. (2015). Zika virus outbreak, Bahia, Brazil. Emerging infectious diseases, 21(10), 1885.

Cardona-Ospina, J. A., Villamil-Gómez, W. E., Jimenez-Canizales, C. E., Castañeda-Hernández, D. M., & Rodríguez-Morales, A. J. (2015). Estimating the burden of disease and the economic cost attributable to chikungunya, Colombia, 2014. Transactions of The Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 109(12), 793-802.

Caron, M., Paupy, C., Grard, G., Becquart, P., Mombo, I., Nso, B. B., . . . Leroy, E. M. (2012). Recent introduction and rapid dissemination of Chikungunya virus and Dengue virus serotype 2 associated with human and mosquito coinfections in Gabon, central Africa. Clin Infect Dis, 55(6), e45-53. doi: 10.1093/cid/cis530

Catteau, A., Kalinina, O., Wagner, M.-C., Deubel, V., Courageot, M.-P., & Desprès, P. (2003). Dengue virus M protein contains a proapoptotic sequence referred to as ApoptoM. Journal of general virology, 84(10), 2781-2793.

Referencias

48

Clyde, K., Kyle, J. L., & Harris, E. (2006). Recent advances in deciphering viral and host determinants of dengue virus replication and pathogenesis. Journal of virology, 80(23), 11418-11431.

Colombia., R. d. (2010). Guía para la atención clínica integral del paciente con dengue. Bogotá, D.C. . Colombia., R. d. (2014). Plan nacional de respuesta frente a la introducción del virus chikungunya en

colombia. (9584606611). Bogotá, D.C: Guías de Impresión Ltda. Couderc, T., & Lecuit, M. (2015). Chikungunya virus pathogenesis: From bedside to bench. Antiviral

research, 121, 120-131. Chahar, H. S., Bharaj, P., Dar, L., Guleria, R., Kabra, S. K., & Broor, S. (2009a). Co-infections with

chikungunya virus and dengue virus in Delhi, India. Emerg Infect Dis, 15(7), 1077-1080. Chahar, H. S., Bharaj, P., Dar, L., Guleria, R., Kabra, S. K., & Broor, S. (2009b). Co-infections with

chikungunya virus and dengue virus in Delhi, India. Emerging infectious diseases, 15(7), 1077. Chien, L.-J., Liao, T.-L., Shu, P.-Y., Huang, J.-H., Gubler, D. J., & Chang, G.-J. J. (2006). Development of

real-time reverse transcriptase PCR assays to detect and serotype dengue viruses. J Clin Microbiol, 44(4), 1295-1304.

Dejnirattisai, W., Supasa, P., Wongwiwat, W., Rouvinski, A., Barba-Spaeth, G., Duangchinda, T., . . . Rey, F. A. (2016). Dengue virus sero-cross-reactivity drives antibody-dependent enhancement of infection with zika virus. Nature Immunology.

del Ángel, R. M. (2006). Entrada del virus del dengue: Moléculas que pueden modular la patogenia viral. Cinvestad, 25(31), 38-43.

Díaz-Quiñonez, J. A., Escobar-Escamilla, N., Wong-Arámbula, C., Vázquez-Pichardo, M., Torres-Longoria, B., López-Martínez, I., . . . Ramírez-González, J. E. (2016). Asian genotype Zika virus detected in traveler returning to Mexico from Colombia, October 2015. Emerging infectious diseases, 22(5), 937.

Díaz, F. A., Martínez, R. A., & Villar, L. A. (2006). Criterios clínicos para diagnosticar el dengue en los primeros días de enfermedad. Biomédica, 26(1), 22-30.

Dirlikov, E. (2016). Update: Ongoing Zika Virus Transmission—Puerto Rico, November 1, 2015–April 14, 2016. MMWR. Morbidity and mortality weekly report, 65.

Duffy, M. R., Chen, T.-H., Hancock, W. T., Powers, A. M., Kool, J. L., Lanciotti, R. S., . . . Dubray, C. (2009). Zika virus outbreak on Yap Island, federated states of Micronesia. New England Journal of Medicine, 360(24), 2536-2543.

Dupont-Rouzeyrol, M., O’Connor, O., Calvez, E., Daures, M., John, M., Grangeon, J.-P., & Gourinat, A.-C. (2015). Co-infection with Zika and Dengue Viruses in 2 Patients, New Caledonia, 2014. Emerging infectious diseases, 21(2), 381.

Egloff, M. P., Benarroch, D., Selisko, B., Romette, J. L., & Canard, B. (2002). An RNA cap (nucleoside‐2′‐O‐)‐methyltransferase in the flavivirus RNA polymerase NS5: crystal structure and functional characterization. The EMBO journal, 21(11), 2757-2768.

Falconar, A. K. (2007). Antibody responses are generated to immunodominant ELK/KLE-type motifs on the nonstructural-1 glycoprotein during live dengue virus infections in mice and humans: implications for diagnosis, pathogenesis, and vaccine design. Clinical and Vaccine Immunology, 14(5), 493-504.

Faye, O., Freire, C. C., Iamarino, A., Faye, O., de Oliveira, J. V. C., Diallo, M., & Zanotto, P. M. (2014). Molecular evolution of Zika virus during its emergence in the 20 th century. PLoS Negl Trop Dis, 8(1), e2636.

Gómez, S., Villabona-Arenas, C., Torres, F., Miranda-Esquivel, D., & Ocazionez, R. (2008). Dengue virus serotype-3 (genotype III) from Colombia: Perspective of its pathogenic potential. Dengue Bulletin, 32, 126-137.

Gubler, D. J. (2006). Dengue/dengue haemorrhagic fever: history and current status. Paper presented at the Novartis foundation symposium.

Gubler, D. J. (2011). Dengue, urbanization and globalization: the unholy trinity of the 21st century. Tropical medicine and health, 39(4 Suppl), 3.

Haddow, A. D., Schuh, A. J., Yasuda, C. Y., Kasper, M. R., Heang, V., Huy, R., . . . Weaver, S. C. (2012). Genetic characterization of Zika virus strains: geographic expansion of the Asian lineage. PLoS Negl Trop Dis, 6(2), e1477.

Referencias

49

Hallengärd, D., Kakoulidou, M., Lulla, A., Kümmerer, B. M., Johansson, D. X., Mutso, M., . . . Le Grand, R. (2014). Novel attenuated Chikungunya vaccine candidates elicit protective immunity in C57BL/6 mice. Journal of virology, 88(5), 2858-2866.

Hawman, D. W., Stoermer, K. A., Montgomery, S. A., Pal, P., Oko, L., Diamond, M. S., & Morrison, T. E. (2013). Chronic joint disease caused by persistent Chikungunya virus infection is controlled by the adaptive immune response. Journal of virology, 87(24), 13878-13888.

Hayes, E. B. (2009). Zika virus outside Africa. Emerging infectious diseases, 15(9), 1347. Islam, R., Salahuddin, M., Ayubi, M. S., Hossain, T., Majumder, A., Taylor-Robinson, A. W., & Mahmud-

Al-Rafat, A. (2015). Dengue epidemiology and pathogenesis: images of the future viewed through a mirror of the past. Virologica Sinica, 1-18.

Javelle, E., Ribera, A., Degasne, I., Gaüzère, B.-A., Marimoutou, C., & Simon, F. (2015). Specific management of post-chikungunya rheumatic disorders: a retrospective study of 159 cases in reunion island from 2006-2012. PLoS Negl Trop Dis, 9(3), e0003603.

Kawiecki, A. B., & Christofferson, R. C. (2016). Zika-induced antibody response enhances dengue serotype 2 replication in vitro. Journal of Infectious Diseases, jiw377.

Kumar, S., Stecher, G., & Tamura, K. (2016). MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular biology and evolution, msw054.

Laiton-Donato, K., Usme-Ciro, J. A., Rico, A., Pardo, L., Martínez, C., Salas, D., . . . Páez, A. (2015). Análisis filogenético del virus Chikungunya en Colombia: evidencia de selección purificadora sobre el gen E1. Biomédica, 36.

Lanciotti, R. S., Calisher, C. H., Gubler, D. J., Chang, G.-J., & Vorndam, A. V. (1992). Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 30(3), 545-551.

Lanciotti, R. S., Kosoy, O. L., Laven, J. J., Velez, J. O., Lambert, A. J., Johnson, A. J., . . . Duffy, M. R. (2008). Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis, 14(8), 1232-1239.

Lee, C.-J., Lin, H.-R., Liao, C.-L., & Lin, Y.-L. (2008). Cholesterol effectively blocks entry of flavivirus. Journal of virology, 82(13), 6470-6480.

Limon‐Flores, A. Y., Perez‐Tapia, M., Estrada‐Garcia, I., Vaughan, G., Escobar‐Gutierrez, A., Calderon‐Amador, J., . . . Flores‐Langarica, A. (2005). Dengue virus inoculation to human skin explants: an effective approach to assess in situ the early infection and the effects on cutaneous dendritic cells. International journal of experimental pathology, 86(5), 323-334.

Lindenbach, B. D., & Rice, C. M. (2003). Molecular biology of flaviviruses. Advances in virus research, 59, 23-61.

Lum, F.-M., & Ng, L. F. (2015). Cellular and molecular mechanisms of chikungunya pathogenesis. Antiviral research, 120, 165-174.

Mardekian, S. K., & Roberts, A. L. (2015). Diagnostic Options and Challenges for Dengue and Chikungunya Viruses. BioMed research international, 2015.

Martina, B. E., Koraka, P., & Osterhaus, A. D. (2009). Dengue virus pathogenesis: an integrated view. Clinical microbiology reviews, 22(4), 564-581.

Mattar, S., & González, M. (2015). Now is the time for the Zika virus. Revista MVZ Córdoba, 20(2), 4511-4512.

Mattar, S., Miranda, J., Pinzon, H., Tique, V., Bolanos, A., Aponte, J., . . . Contreras, H. (2015). Outbreak of Chikungunya virus in the north Caribbean area of Colombia: clinical presentation and phylogenetic analysis. The Journal of Infection in Developing Countries, 9(10), 1126-1132.

Mercado, M., Acosta-Reyes, J., Parra, E., Pardo, L., Rico, A., Campo, A., . . . Viasus, D. (2016). Clinical and histopathological features of fatal cases with dengue and chikungunya virus co-infection in Colombia, 2014 to 2015. Euro surveillance: bulletin Europeen sur les maladies transmissibles= European communicable disease bulletin, 21(22).

Mlakar, J., Korva, M., Tul, N., Popović, M., Poljšak-Prijatelj, M., Mraz, J., . . . Fabjan Vodušek, V. (2016). Zika virus associated with microcephaly. New England Journal of Medicine, 374(10), 951-958.

Morrison, A. C., Zielinski-Gutierrez, E., Scott, T. W., & Rosenberg, R. (2008). Defining challenges and proposing solutions for control of the virus vector Aedes aegypti. PLoS Med, 5(3), e68.

Morrison, T. E. (2014). Reemergence of chikungunya virus. Journal of virology, 88(20), 11644-11647.

Referencias

50

Moya, J., Pimentel, R., & Puello, J. (2014). Chikungunya: a challenge for the Dominican Republic's health services. Revista Panamericana de Salud Pública, 36(5), 331-335.

Muñoz-Jordán, J. L., Sánchez-Burgos, G. G., Laurent-Rolle, M., & García-Sastre, A. (2003). Inhibition of interferon signaling by dengue virus. Proceedings of the National Academy of Sciences, 100(24), 14333-14338.

Musso, D., & Gubler, D. J. (2016). Zika virus. Clinical microbiology reviews, 29(3), 487-524. Naccache, S., Theze, J., Sardi, S. I., Somasekar, S., Greninger, A. L., Bandeira, A. C., . . . Pybus, O. G.

(2016). Discovery of a persistent Zika virus lineage in Bahia, Brazil. bioRxiv, 049916. Nimmannitya, S., Halstead, S. B., Cohen, S. N., & Margiotta, M. R. (1969). Dengue and chikungunya virus

infection in man in Thailand, 1962-64. I. Observations on hospitalized patients with hemorrhagic fever. American journal of tropical medicine and hygiene, 18(6, Pt. 1), 954-971.

Nomaguchi, M., Ackermann, M., Yon, C., You, S., & Padmanbhan, R. (2003). De novo synthesis of negative-strand RNA by Dengue virus RNA-dependent RNA polymerase in vitro: nucleotide, primer, and template parameters. Journal of virology, 77(16), 8831-8842.

Oehler, E., Watrin, L., Larre, P., Leparc-Goffart, I., Lastere, S., Valour, F., . . . Ghawche, F. (2014). Zika virus infection complicated by Guillain-Barré syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveill, 19, 20720.

Omarjee, R., Prat, C., Flusin, O., Boucau, S., Tenebray, B., Merle, O., . . . Leparc-Goffart, I. (2014). Importance of case definition to monitor ongoing outbreak of chikungunya virus on a background of actively circulating dengue virus, St Martin, December 2013 to January 2014. Euro Surveill, 19(13), 20753.

OPS, C., & Preparación, O. M. S. (2011). Respuesta ante la eventual introducción del virus Chikungunya en las Américas. . Washington, DC.

Organization, P. A. H., & Organization, W. H. (2015). Epidemiological alert: neurological syndrome, congenital malformations, and Zika virus infection: implications for public health in the Americas. Retrieved August 8, 2016., from http://www.paho.org/hq/index.php?option=com_docman&task=doc_view&Itemid=270&gid=32405&lang=em

Pacheco, O., Beltrán, M., Nelson, C. A., Valencia, D., Tolosa, N., Farr, S. L., . . . Espinosa-Bode, A. (2016). Zika virus disease in Colombia—preliminary report. New England Journal of Medicine. doi: http://dx.doi.org/10.1056/NEJMoa1604037

Padilla, J. C., Rojas, D. P., & Gómez, R. S. (2012). Dengue en Colombia: epidemiología de la reemergencia a la hiperendemia: Guías de Impresión Ltda.

Pérez, S., Ramírez, A., Pérez, G., & Canela, L. Fiebre de Chikungunya: enfermedad infrecuente como emergencia médica en Cuba.

Pfeffer, M., Linssen, B., Parker, M., & Kinney, R. (2002). Specific Detection of Chikungunya Virus Using a RT‐PCR/Nested PCR Combination. Journal of Veterinary Medicine, Series B, 49(1), 49-54.

Priyamvada, L., Quicke, K. M., Hudson, W. H., Onlamoon, N., Sewatanon, J., Edupuganti, S., . . . Wilson, P. C. (2016). Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proceedings of the National Academy of Sciences, 201607931.

Pyke, A. T., Daly, M. T., Cameron, J. N., Moore, P. R., Taylor, C. T., Hewitson, G. R., . . . Gair, R. (2013). Imported Zika Virus Infection from the Cook Islands into Australia, 2014. PLoS currents, 6.

Rajapakse, S., Rodrigo, C., & Rajapakse, A. (2010). Atypical manifestations of chikungunya infection. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 104(2), 89-96.

Ramachandran, V., Das, S., Roy, P., Hada, V., & Mogha, N. S. (2016). Chikungunya: a reemerging infection spreading during 2010 dengue fever outbreak in National Capital Region of India. VirusDisease, 27(2), 183–186. doi: doi:10.1007/s13337-016-0314-z

República de Colombia, I. N. d. S. (2014a). El Informe Quincenal Epidemiológico Nacional (IQEN). (0022-1317).

República de Colombia, I. N. d. S. (2014b). Semana epidemiológica número 53 (28 dic. al 03 ene 2015). Bogota D.C.

República de Colombia, I. N. d. S. (2015a). Boletín Epidemiológico Semanal. Semana epidemiológica número 44 de 2015 (01 nov. - 07 nov.2015)

http://www.paho.org/hq/index.php?option=com_docman&task=doc_view&Itemid=270&gid=32405&lang=em

http://www.paho.org/hq/index.php?option=com_docman&task=doc_view&Itemid=270&gid=32405&lang=em

http://dx.doi.org/10.1056/NEJMoa1604037

Referencias

51

República de Colombia, I. N. d. S. (2015b). Semana epidemiológica número 34 de 2015 (23 ago. - 29 ago. 2015).

República de Colombia, I. N. d. S. (2016). Boletín epidemiológico semanal. Semana epidemiológica número 17 de 2016 ( 17 Julio - 23 Julio 2016).

República de Colombia, M. d. s. y. p. s., Instituto Nacional de Salud. (2014). Lineamientos de vigilancia en salud pública, entomológica y de laboratorio en transmisión autóctona del virus Chikungunya en Colombia fase II

(1567-1348). Bogotá, D.C. Rodas, J. D., Kautz, T., Camacho, E., Paternina, L., Guzmán, H., Díaz, F. J., . . . Weaver, S. C. (2016).

Genetic Characterization of Northwestern Colombian Chikungunya Virus Strains from the 2014–2015 Epidemic. The American journal of tropical medicine and hygiene, 16-0091.

Rodriguez-Roche, R., & Gould, E. A. (2013). Understanding the dengue viruses and progress towards their control. BioMed research international, 2013.

Rodríguez‐morales, A. J., Cardona‐ospina, J. A., Urbano‐Garzón, S. F., & Hurtado‐Zapata, J. S. (2016). Prevalence of post‐Chikungunya Chronic Inflammatory Rheumatism: A Systematic Review and Meta‐Analysis. Arthritis care & research.

Romero-Vega, L., Pacheco, O., la Hoz-Restrepo, F. d., & Díaz-Quijano, F. A. (2014). Evaluation of dengue fever reports during an epidemic, Colombia. Revista de saude publica, 48(6), 899-905.

Roth, A., Mercier, A., Lepers, C., Hoy, D., Duituturaga, S., Benyon, E., . . . Souarès, Y. (2014). Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections–an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012–2014. Euro Surveill, 19(1).

Saitou, N., & Nei, M. (1987). The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular biology and evolution, 4(4), 406-425.

Saiz, J.-C., Vázquez-Calvo, Á., Blázquez, A. B., Merino-Ramos, T., Escribano-Romero, E., & Martín-Acebes, M. A. (2016). Zika virus: the latest newcomer. Frontiers in microbiology, 7.

San Martín, J. L., Brathwaite, O., Zambrano, B., Solórzano, J. O., Bouckenooghe, A., Dayan, G. H., & Guzmán, M. G. (2010). The epidemiology of dengue in the Americas over the last three decades: a worrisome reality. The American journal of tropical medicine and hygiene, 82(1), 128-135.

Sardi, S., Somasekar, S., Naccache, S. N., Bandeira, A. C., Tauro, L. B., Campos, G. S., & Chiu, C. Y. (2016). Co-infections from Zika and chikungunya virus in Bahia, Brazil identified by metagenomic next-generation sequencing. Journal of Clinical Microbiology, JCM. 00877-00816.

Saswat, T., Kumar, A., Kumar, S., Mamidi, P., Muduli, S., Debata, N. K., . . . Chattopadhyay, S. (2015). High rates of co-infection of Dengue and Chikungunya virus in Odisha and Maharashtra, India during 2013. Infection, Genetics and Evolution, 35, 134-141.

Shepard, D. S., Coudeville, L., Halasa, Y. A., Zambrano, B., & Dayan, G. H. (2011). Economic impact of dengue illness in the Americas. The American journal of tropical medicine and hygiene, 84(2), 200-207.

Singh, P., Mittal, V., Rizvi, M., Chhabra, M., Sharma, P., Rawat, D., . . . Rai, A. (2012). The first dominant co-circulation of both dengue and chikungunya viruses during the post-monsoon period of 2010 in Delhi, India. Epidemiology and infection, 140(07), 1337-1342.

Singh, S. K., & Unni, S. K. (2011). Chikungunya virus: host pathogen interaction. Reviews in medical virology, 21(2), 78-88.

Singhi, S., Kissoon, N., & Bansal, A. (2007). Dengue and dengue hemorrhagic fever: management issues in an intensive care unit. Jornal de pediatria, 83(2), S22-S35.

Soares, C. N., Cabral-Castro, M., Oliveira, C., Faria, L. C., Peralta, J. M., Freitas, M. R. G. d., & Puccioni-Sohler, M. (2008). Oligosymptomatic dengue infection: a potential cause of Guillain Barré syndrome. Arquivos de Neuro-psiquiatria, 66(2A), 234-237.

Solignat, M., Gay, B., Higgs, S., Briant, L., & Devaux, C. (2009). Replication cycle of chikungunya: a re-emerging arbovirus. Virology, 393(2), 183-197.

Soumahoro, M.-K., Gérardin, P., Boëlle, P.-Y., Perrau, J., Fianu, A., Pouchot, J., . . . Hanslik, T. (2009). Impact of Chikungunya virus infection on health status and quality of life: a retrospective cohort study. PLoS One, 4(11), e7800.

Souza, H. F. S., da Silva Almeida, B., & Boscardin, S. B. (2016). Early dengue virus interactions: the role of dendritic cells during infection. Virus Research, 223, 88-98.

Referencias

52

Staples, J. E., Breiman, R. F., & Powers, A. M. (2009). Chikungunya fever: an epidemiological review of a re-emerging infectious disease. Clinical Infectious Diseases, 49(6), 942-948.

Staples, J. E., & Fischer, M. (2014). Chikungunya virus in the Americas—what a vectorborne pathogen can do. New England Journal of Medicine, 371(10), 887-889.

Tang, B. L. (2012). The cell biology of Chikungunya virus infection. Cellular microbiology, 14(9), 1354-1363.

Taraphdar, D., Sarkar, A., Mukhopadhyay, B. B., & Chatterjee, S. (2012). A comparative study of clinical features between monotypic and dual infection cases with Chikungunya virus and dengue virus in West Bengal, India. The American journal of tropical medicine and hygiene, 86(4), 720-723.

Teixeira, M. G., Siqueira Jr, J. B., Ferreira, G. L., Bricks, L., & Joint, G. (2013). Epidemiological trends of dengue disease in Brazil (2000–2010): a systematic literature search and analysis. PLoS Negl Trop Dis, 7(12), e2520.

Thiberville, S.-D., Moyen, N., Dupuis-Maguiraga, L., Nougairede, A., Gould, E. A., Roques, P., & de Lamballerie, X. (2013). Chikungunya fever: epidemiology, clinical syndrome, pathogenesis and therapy. Antiviral research, 99(3), 345-370.

Thompson, J. D., Higgins, D. G., & Gibson, T. J. (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic acids research, 22(22), 4673-4680.

Umareddy, I., Pluquet, O., Wang, Q. Y., Vasudevan, S. G., Chevet, E., & Gu, F. (2007). Dengue virus serotype infection specifies the activation of the unfolded protein response. Virology journal, 4(1), 1.

Usme-Ciro, J. A., Méndez, J. A., Laiton, K. D., & Páez, A. (2014). The relevance of dengue virus genotypes surveillance at country level before vaccine approval. Human vaccines & immunotherapeutics, 10(9), 2674-2678.

Valentine, G., Marquez, L., & Pammi, M. (2016). Zika Virus-Associated Microcephaly and Eye Lesions in the Newborn. Journal of the Pediatric Infectious Diseases Society, 5(3), 323-328.

Velandia, M. L., & Castellanos, J. E. (2011). Dengue virus: structure and viral cycle. Infectio, 15(1), 33-43. Villamil-Gómez, W., Silvera, L. A., Páez-Castellanos, J., & Rodriguez-Morales, A. J. (2016). Guillain-

Barre syndrome after Chikungunya infection: A case in Colombia. Enfermedades infecciosas y microbiologia clinica, 34(2), 140-141.

Villar, L. A., Rojas, D. P., Besada-Lombana, S., & Sarti, E. (2015). Epidemiological trends of dengue disease in Colombia (2000-2011): a systematic review. PLoS Negl Trop Dis, 9(3), e0003499.

Waggoner, J. J., Gresh, L., Vargas, M. J., Ballesteros, G., Tellez, Y., Soda, K. J., . . . Harris, E. (2016). Viremia and Clinical Presentation in Nicaraguan Patients Infected with Zika Virus, Chikungunya Virus, and Dengue Virus. Clinical Infectious Diseases, ciw589.

Wauquier, N., Becquart, P., Nkoghe, D., Padilla, C., Ndjoyi-Mbiguino, A., & Leroy, E. M. (2011). The acute phase of Chikungunya virus infection in humans is associated with strong innate immunity and T CD8 cell activation. Journal of Infectious Diseases, 204(1), 115-123.

Weaver, S. C. (2014). Arrival of chikungunya virus in the new world: prospects for spread and impact on public health. PLoS Negl Trop Dis, 8(6), e2921.

Wilder-Smith, A., & Byass, P. (2016). The elusive global burden of dengue. The Lancet Infectious Diseases. Wilder-Smith, A., & Gubler, D. J. (2008). Geographic expansion of dengue: the impact of international

travel. Medical Clinics of North America, 92(6), 1377-1390. Wu, D., Zhang, Y., ZhouHui, Q., Kou, J., Liang, W., Zhang, H., . . . Zhong, H. (2013). Chikungunya virus

with E1-A226V mutation causing two outbreaks in 2010, Guangdong, China. Virol J, 10, 174. Yaseen, H. M., Simon, F., Deparis, X., & Marimoutou, C. (2014). Identification of initial severity

determinants to predict arthritis after chikungunya infection in a cohort of French gendarmes. BMC musculoskeletal disorders, 15(1), 1.

Yu, I.-M., Zhang, W., Holdaway, H. A., Li, L., Kostyuchenko, V. A., Chipman, P. R., . . . Chen, J. (2008). Structure of the immature dengue virus at low pH primes proteolytic maturation. Science, 319(5871), 1834-1837.

Yu, L., Nomaguchi, M., Padmanabhan, R., & Markoff, L. (2008). Specific requirements for elements of the 5′ and 3′ terminal regions in flavivirus RNA synthesis and viral replication. Virology, 374(1), 170-185.

Referencias

53

Yuki, N., & Hartung, H.-P. (2012). Guillain–Barré syndrome. New England Journal of Medicine, 366(24), 2294-2304.

Anexos

54

ANEXO A

Anexos

55

Anexos

56

Anexos

57

Anexos

58

Anexos

59

Anexos

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Anexos

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Anexos

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Anexos

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Anexos

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Anexos

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Anexos

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ANEXO B

FORMATO DE RECOLECCIÓN DE DATOS

Anexos

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ANEXO C

INSERTO QIAAMP VIRAL RNA MINI KIT

Anexos

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Anexos

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Anexos

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Anexos

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ANEXO D

INSERTO REVERTAID FIRST STRAND cDNA SYNTHESIS KIT (THERMO SCIENTIFIC®)

Anexos

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Anexos

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Anexos

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Anexos

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ANEXO E

PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA AL 1,5%.

Para realización del gel es necesario preparar 1 litro de buffer TAE 1X, a partir del Buffer TAE 50X. También preparar la cámara de electroforesis, bañándola con el buffer TAE 1X.

Para preparar un gel de agarosa al 1,5%, se pesa 1,2 gr de agarosa y se agrega en 80 ml de buffer TAE 1X (esta cantidad depende de las dimensiones de la cámara de electroforesis). A continuación se calienta esta solución en el microondas durante 1 minuto y 20 segundos hasta que se disuelva la agarosa complemente con el buffer, observándose traslucida

Se deja enfriar la solución hasta 60ºC aproximadamente y se adiciona 8 μl del agente intercalante (SYBR® Safe, Thermo Scientific®)

Se prepara la cámara de electroforesis para posteriormente verter la solución en la cubeta, colocar el peine y dejar solidificar por 30 minutos.

Ya solidificado el gel, se le retiran los peines, se ubica el gel en la cámara de electroforesis y se cargan las muestras.

Las muestras se dejaron migrar a 80 voltios durante 70 minutos hasta que el ultimo frente de migración haya migrado aproximadamente un 80% a lo largo del gel

Se visualiza el gel en el transiluminador y se toma registro por medio de una foto en el el fotodocumentador de geles MiniBIS (Bio Imaging Systems)

Documents

Identificación de Arbovirus circulantes en una cohorte de ... · (21.02%) para DENV, 47 (29.94%) para CHIKV y 29 (18.47%) para ZIKV. Adicionalmente, se encontró co-infección entre