Universidad de Antofagasta

Facultad de Recursos del Mar

Programa de Doctorado en Ciencias Aplicadas

Mención Sistemas Marinos Costeros

Identificación de productos extracelulares de dos bacterias marinas

inhibidoras de Vibrio parahaemolyticus y evaluación del potencial

uso de estos productos como control de este patógeno

Por

YANETT LEYTON LOBOS

Tesis presentada a la Facultad de Recursos del Mar de la

Universidad de Antofagasta, como uno de los requisitos para optar

al grado de Doctor en Ciencias Aplicadas. Mención Sistemas

Marinos Costeros

Profesor Guía : Dr. Carlos Riquelme Salamanca

Profesor Co-Guía : Dr. Jorge Bórquez Ramirez

Consejo de Tesis : Dr. Rubén Araya Valencia

Dra. Marcela Wilkens Anwandter

Dr. Carlos Riquelme Salamanca

Antofagasta, Chile Septiembre 2012

2

A mi esposo Rodolfo por su amor, comprensión y apoyo incondicional. A mi hija

Sofía a quien le quite un poquito de su tiempo para dedicarlo al término de esta tesis.

Ustedes son mis grandes amores y el pilar de mis actividades.

A mi madre por venir de tan lejos a ayudarme a cuidar de mi hija, gracias a usted he

podido dedicarle a esta tesis el tiempo que merecía.

A mis hermanos, a pesar de la distancia con su apoyo me han ayudado mucho.

A los que me quieren y acompañaron en este camino.

No quería terminar esta dedicatoria sin recordar a una persona que seguro se hubiera

sentido orgullosa de leer su nombre aquí, pero desafortunadamente no podrá verlo.

Estoy hablando de mi padre Lesme Leyton, que ya no está en este mundo pero

siempre esta en mis recuerdos.

Dedicatoria

3

Quiero expresar mis más sinceros agradecimientos a todas aquellas personas que de buena

fe, tuvieron un buen consejo para mi y ayudaron durante la realización de esta Tesis, en

especial:

Al Dr. Carlos Riquelme tutor de esta Tesis, por la oportunidad de integrarme en su

grupo de investigación en mis años de pre-grado, a usted le debo descubrir el lindo

mundo de la microbiología marina, agradezco su consejo de realizar este doctorado

para seguir mejorando mi formación profesional. Gracias por su dedicación y

asesoramiento en la revisión de mis manuscritos, por brindarme su apoyo en

momentos difíciles de mi vida profesional y personal. Usted es un verdadero ejemplo

de entrega y dedicación a la investigación.

Deseo expresar mi gratitud al Dr. Jorge Bórquez co-tutor de esta Tesis, gracias por

las facilidades dadas para trabajar en el Laboratorio de Química Orgánica de la

Universidad de Antofagasta, por ayudarme y estar dispuesto siempre a resolver mis

dudas y en todo lo necesario para completar los capítulos de aislamiento,

purificación y caracterización de las moléculas de este trabajo, por su interés en el

desarrollo de la misma. También agradezco su consejo y ayuda en conseguir mi

pasantía en la maravillosa Islas Canarias (Tenerife), España.

Al Dr. José Darias por aceptar hacer mi pasantía en el Instituto de Productos

Naturales y Agrobiología (IPNA), CSIC, Tenerife, España. Por las facilidades

proporcionadas durante mi estadía. A la Dra. Mercedes Cueto y Dra. Ana Díaz por

su colaboración en la identificación de las estructuras de los compuestos

relacionados a esta Tesis y en la enseñanza de uso de equipos. A los amigos que

conocí en Tenerife que hicieron que mi estadía fuera muy agradable y a quienes

tendré presente por siempre.

Al Dr. Romilio Espejo por proveer la bacteria Vibrio parahaemolyticus (cepa

PM48.5) usada en esta investigación.

Agradecimientos

4

A mis profesores del programa de Doctorado en Ciencias Aplicadas por el apoyo y

conocimientos entregados.

A mis compañeros de generación Carolina, Manuel y Marcos por los conocimientos

compartidos sobre todo en aquellos momentos de largo estudio para Diseño

Experimental.

A mis compañeros de laboratorio, con quienes he compartido incontables horas de

trabajo. A Fernando Valenzuela, Mauricio Cáceres por el buceo y obtención de los

ostiones para los ensayos biológicos y Rodrigo Varas por su apoyo en la ejecución

del último experimento de esta tesis, cuyo análisis dio validez y sentido de aplicación

a este trabajo. A Claudia Bahamondes por su ayuda en los análisis de secuencias. A

la Dra. Mariella Rivas por su ayuda en la corrección de esta tesis.

A mis queridas ex alumnas tesistas (ahora tituladas) quienes desinteresadamente me

ayudaron en algunas actividades prácticas de esta Tesis, lo que las hace parte de ésta.

A los aportes financieros recibidos durante el desarrollo de esta Tesis: Beca de

Doctorado Proyecto MECESUP (ANT0711); Beca de Postgrado. Dirección de

Investigación y Postgrado. Universidad de Antofagasta; Beca de Postgrado

CONICYT (21070555); Beca de apoyo para la realización de Tesis Doctoral.

CONICYT (24090153) y proyecto FONDEF (MRO7I1006).

Finalmente a los doctores Rubén Araya académico de la Universidad de Antofagasta

y Rubén Avendaño-Herrera académico de la Universidad Andrés Bello y Marcela

Wilkens académico de la Universidad de Santiago de Chile, quienes me ayudaron en

la revisión de esta tesis y que con su contribución permitieron el formato final.

Agradecimientos

5

Dedicatoria 2

Agradecimientos 3

Tabla de contenidos 5

Resumen 10

Abstract 11

1. INTRODUCCIÓN 12

1.1. Vibrios en los sistemas marinos costeros 13

1.1.1. Distribución y diversidad 13

1.1.2. Vibrios patógenos 14

1.1.3. Vibrio parahaemolyticus 16

1.1.3.1. Tipificación 16

1.1.3.2. Aspectos clínicos y factores de virulencia 17

1.1.3.3. Situación en Chile 18

1.2. Potenciales alternativas de control de bacterias patógenas marinas 20

1.2.1. Sustancias bioactivas de bacterias marinas 20

1.2.2. Probióticos 21

1.2.1.1. Vibrios probióticos 23

1.2.1.2. Bacillus probióticos 25

1.2.3. Bacteriófagos 25

1.3. Importancia de las sustancias bioactivas en la industria acuícola 26

1.4. Hipótesis 28

1.4.1. Hipótesis general 28

1.4.2. Hipótesis específica 28

Tabla de contenidos

6

1.5. Objetivos 28

1.5.1. Objetivo general 28

1.5.2. Objetivos específicos 28

2. METODOLOGÍA 29

2.1. Sitio de estudios 30

2.2. Pruebas de inhibición bacteriana 30

2.3. Identificación bacteriana de las bacterias antagonistas 30

2.3.1. Gen 16S ARNr 30

2.3.2. Tinción Gram 31

2.3.3. Kit API 20E / 50CHB 32

2.3.4. Prueba Kanagawa 32

2.3.5. Prueba de susceptibilidad a antibióticos 32

2.3.6. Prueba de susceptibilidad al compuesto vibriostático 0/129 32

2.3.7. Crecimiento en agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS) 33

2.4. Crecimiento de la cepa antagonista y extracción de sus productos antibacterianos 33

2.5. Evaluación del tamaño del producto antibacteriano 34

2.6. Sensibilidad a temperatura del producto antibacteriano 35

2.7. Purificación y caracterización del producto antibacteriano 35

2.7.1. Fraccionamiento del producto antibacteriano 35

2.7.2. Evaluación de pureza del producto antibacteriano 37

Tabla de contenidos

7

2.8. Inhibición de V. parahaemolyticus por los productos antibacterianos 37

2.9. Efecto antibacteriano del producto extraído desde las bacterias en ostiones

Argopecten purpuratus infectados 38

2.10. Efecto antibacteriano del producto comercial en ostiones infectados 39

2.11. Análisis estadístico 40

3. RESULTADOS 41

3.1. Identificación de las cepas antibacterianas 42

3.2. Crecimiento de la cepa antibacteriana y extracción de sus productos 45

3.3. Separación por tamaño y sensibilidad a temperatura del producto antibacteriano 46

3.4. Purificación y caracterización del producto antibacteriano 48

3.5. Inhibición de V. parahaemolyticus por productos antibacterianos 52

3.6. Actividad del ácido oleico (AO) y dicetopiperazinas (DKP) en ostiones

infectados con V. parahaemolyticus 55

3.7. Publicaciones 57

3.7.1. Publicación 1: Yanett Leyton y Carlos Riquelme. 2008. Vibrios en los

sistemas marinos costeros. Revista de Biología Marina y Oceanografía

43(3): 441-456. 58

Tabla de contenidos

8

3.7.2. Publicación 2: Yanett Leyton y Carlos Riquelme. 2010. Marine

Bacillus spp. associated with the egg capsule of Concholepas concholepas

(Commom name “Loco”) have an inhibitory activity toward the pathogen

Vibrio parahaemolyticus. Microbial Ecology: 60(3): 599. 59

3.7.3. Publicación 3: Yanett Leyton, Rodrigo Varas-Psijas y Carlos Riquelme.

2011. Probiotic activity of bacteria associated with egg capsules of

Concholepas concholepas (Common name “Loco”). Aquaculture

Research 1-7. 60

3.7.4. Publicación 4: Yanett Leyton, Jorge Borquez, José Darias, Mercedes

Cueto, Ana Díaz y Carlos Riquelme. 2011. Oleic acid produced by a

marine Vibrio spp. acts as an anti-Vibrio parahaemolyticus agent.

Marine Drugs. 9:2155-2163. 61

3.7.5. Publicación 5: Yanett Leyton, Jorge Borquez, José Darias, Mercedes

Cueto, Ana Díaz y Carlos Riquelme. 2012. Diketopiperazines produced by

a Bacillus sp. inhibit Vibrio parahaemolyticus. En prensa en Aquaculture

Research and Development. 62

3.7.6. Publicación 6: Yanett Leyton y Carlos Riquelme. 2012. Oleic

acid and diketopiperacines produced by marine bacteria reduce the load of

Vibrio parahaemolyticus in the scallop Argopecten purpuratus. Enviada a

Aquacultre Research. 63

4. DISCUSIÓN 64

4.1. Actividad probiótica de bacterias marinas 65

4.2. Antecedentes bioactivos de dicetopiperazinas (DKP) 68

4.3. Antecedentes de la bioactividad de los ácidos oleicos (AO) 69

4.4. Actividad de AO y DKP en bivalvos A. purpuratus 70

Tabla de contenidos

9

5. CONCLUSIÓN 74

6. PERSPECTIVAS FUTURAS DE INVESTIGACIÓN, INNOVACIÓN Y APLICACIÓN 76

7. ANEXOS 79

7.1. Anexo 1: Publicación: Yanett Leyton y Carlos Riquelme. 2008. Use of specific

Bacterial-Microbial biofilms for improving the larval settlement of Argopecten

purpuratus (Lamarck, 1819) on three types of artificial spat-collecting materials.

Aquaculture 276 78–82. 81

7.2. Anexo 2: XVIII Congreso Latino-Americano de Microbiología. Pucón 2006 82

7.3. Anexo 3: XII Congreso Latino-Americano de Ciencias del mar.

COLACMAR. Florianópolis. Brasil 2007 83

7.4. Anexo 4: XIX Congreso Chileno de Microbiología y IV Congreso Chileno de

Microbiología e Higiene de los Alimentos. Viña del Mar, Chile 2001 84

7.5. Anexo 5: XXXI Congreso Sociedad de Microbiología de Chile.

Santa Cruz, Chile 2009 85

7.6. Anexo 6: ISME-International Society for Microbial Ecology. Seattle,

USA 2010. 86

7.7. Anexo 7: XXXII Congreso Chileno de Microbiología.

Antofagasta, Chile 2010 87

8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 88

Tabla de contenidos

10

La bacteria patógena Vibrio parahaemolyticus es responsable de enfermedades

gastroentéricas causadas por la ingesta de organismos marinos, principalmente moluscos

contaminados. Debido a esto, en las industrias acuícolas existe un gran interés por aplicar

productos bioactivos medioambientalmente inocuos que eliminen bacterias patógenas desde

sus cultivos y así, reemplazar a los antibióticos usados por años, los que han generado

grandes problemas de contaminación en los ecosistemas marinos. El objetivo de este trabajo

fue identificar productos extracelulares de dos cepas bacterianas marinas, las cuales

evidenciaron actividad inhibidora del crecimiento de V. parahaemolyticus y evaluar su

potencial uso para controlar la proliferación de este patógeno en bivalvos como Argopecten

purpuratus. Cada cepa bacteriana fue identificada molecularmente mediante secuenciación

del gen 16S ARNr y pruebas bioquímicas. Los productos orgánicos activos de cada cepa se

extrajeron usando el solvente orgánico acetato de etilo (EtOAc), luego se purificaron las

moléculas activas fraccionando por cromatografía de fase reversa, permeación por Sephadex

LH20, fase normal y cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC, siglas en inglés).

Finalmente, la estructura de las moléculas se elucidó mediante el estudio de sus espectros de

Resonancia Magnética Nuclear (NMR, siglas en inglés) de protón (1H) y carbono 13 (

13C).

La actividad de los productos orgánicos se comprobó mediante el método de difusión de

disco y se determinó su concentración inhibitoria en el crecimiento de V. parahaemolyticus

en medio de cultivo líquido. Los resultados indicaron que las cepas bacterianas

corresponden a un Vibrio sp. y Bacillus pumilus, cuyos productos activos mayoritarios

corresponden a las moléculas: ácido oleico (Vibrio sp.) y dicetopiperazinas (B. pumilus). En

los organismos de A. purpuratus tratados con los productos ácido oleico y dicetopiperazinas

aislados desde las bacterias, se observó preliminarmente que se produce una reducción en la

carga bacteriana del patógeno V. parahaemolyticus. Este mismo comportamiento fue

observado al tratar los ostiones con, ácido oleico y dicetopiperazinas comerciales. En base a

la actividad inhibidora observada de los productos comerciales se planteó la posibilidad de

experimentar estos productos contra V. parahaemolyticus en diferentes organismos de

importancia comercial, principalmente en sistemas de depuración, que requieren de breve

tiempo (12 a 24 horas) para reducir la concentración de patógenos humanos como el V.

parahaemolyticus.

Resumen

11

The pathogenic bacterium Vibrio parahaemolyticus is responsible for gastroenteric diseases

caused by the ingestion of contaminated marine organisms, mainly mollusks. The

aquaculture industry has interest in the applification of bioactive products environmental

inocuous that eliminate pathogenic bacteria from the cultures and replace the antibiotics that

have been used for many years, which have given rise to great contamination problems in

marine ecosystems. The objective of this work was to identify extracellular products from

two marine bacterial strains that have shown growth inhibiting activity of V.

parahaemolyticus and evaluate their potential use to control the proliferation of this

pathogen in Argopecten purpuratus bivalves. Each strain was identified molecularly by

sequencing the rRNA16S fragment and by biochemical tests. The active organic products

from each strain were extracted with ethyl acetate (EtOAc), the active molecules were

purified fractionating them by reverse phase chromatography, permeation on Sephadex LH-

20, normal phase, and HPLC, and finally the structure of the molecules was elucidated by 1H

NMR and 13

C NMR. The activity of the organic products was verified by the diffusion disk

method and their growth inhibiting concentration against V. parahaemolyticus was

determined in liquid culture medium. The results showed that the bacterial strains

corresponded to Vibrio sp. and Bacillus pumilus, whose major active products are oleic acid

(Vibrio sp.) and diketopiperazines (B. pumilus). The A. purpuratus bivalves treated with the

oleic acid and diketopiperazines isolated from these bacteria showed preliminarily that they

cause a bacterial load reduction of the bacterial load of the pathogen V. parahaemolyticus.

The same trend was found when the scallops were treated with commercial oleic acid and

diketopiperazines. Based on the inhibitory activity seen with the commercial products we

suggest the possibility of testing these products against V. parahaemolyticus or other

pathogens in different commercially important organisms, mainly in depuration systems that

require a short time (12 to 24 h) to reduce the concentration of human pathogens like V.

parahaemolyticus.

Abstract

12

1. Introducción

13

1.1.- Vibrios en los sistemas marinos costeros

1.1.1.- Distribución y diversidad

Los Vibrios fueron uno de los primeros grupos bacterianos en ser reconocidos y descritos

taxonómicamente en la naturaleza (Pacini 1854). Se clasifican en la familia Vibrionaceae

abarcando diversos grupos de bacterias marinas heterótrofas, son gamma proteobacterias,

Gram negativas, oxidasa positivos, mesófilos y generalmente móviles por medio de al

menos un flagelo polar (Thompson et al. 2006). Toleran un amplio rango de salinidades, el

óptimo requerimiento de NaCl es de 2,0 a 2,5% (peso/volumen), algunas especies halófilas

requieren al menos una concentración del 0,5% de NaCl en el medio para crecer. La

presencia de altas concentraciones de nutrientes orgánicos o cationes divalentes pueden

compensar la falta de catión sodio (Urakawa y Rivera 2006). Naturalmente habitan

ambientes marinos y de agua dulce en formas de vida planctónica (Worden et al. 2006),

bentónica (desarrollando biopelículas en sedimentos), zooplanctónica (Heidelberg et al.

2002) o en el tracto gastrointestinal de organismos marinos (Watnick et al. 2001). La

distribución y dinámica de estas poblaciones está influenciada por gradientes

medioambientales de temperatura, salinidad, disponibilidad de nutrientes y factores

biológicos como depredación y abundancia de dinoflagelados y hospedadores (Thompson et

al. 2006), encontrándose distribuídas en el ecosistema marino costero (Leyton y Riquelme

2008b) (Figura 1). Aunque la costa difiere significativamente del océano abierto con

respecto a los rangos de producción primaria e influencia terrestre, la secuencia del 16S

ARNr de Vibrios aislados desde el océano abierto son filogenéticamente similares a las de

Vibrios aislados desde medio ambientes costeros (Radjasa et al. 2001). Los Vibrios son el

grupo mayormente cultivable de bacterias heterótrofas, especialmente de aguas costeras y la

proporción de recuento total en placas varía de acuerdo a los métodos de muestreo, área

geográfica, estacionalidad y medios de cultivos diferenciales (Austin et al. 1979).

Además de esto se han desarrollado métodos específicos para identificar la patogenicidad,

ecología y distribución de Vibrios (Eiler et al. 2007).

Introducción

14

Figura 1: Representación gráfica de las interacciones de Vibrios en diferentes

compartimentos del ecosistema costero, los números de la figura se detallan en Leyton y

Riquelme (2008b) (en resultados, publicación1).

En el ecosistema marino, los Vibrios cumplen funciones importantes como biodegradación

de la materia orgánica y regeneración de nutrientes (Cavallo y Stabili 2004). Thompson et

al. (2009) describen que dentro del género Vibrio, el número de especies válidamente

descritas aumentó a más de 100. Algunas de ellas son patógenas para el hombre y animales,

tanto vertebrados como invertebrados (Heitmann et al. 2005). Su taxonomía está en

constante revisión gracias a la incorporación de técnicas de biología molecular. Por ejemplo,

Romalde (2010) ha descrito cinco nuevas especies dentro del género Vibrio: V. breoganii, V.

gallaecicus, V. artabrorum, V. atlanticus y V. celticus, esta última con potencial patogénico

para almeja. Haley et al (2010) describieron dos nuevas especies V. metecus y V. parilis,

previamente caracterizados como no toxigénicas.

1.1.2.- Vibrios patógenos

El desarrollo de enfermedades es el resultado de la interacción entre patógeno, hospedador y

medio ambiente. Existen especies del género Vibrio que varían en su patogenicidad, hoy en

día no se definen las causas de su aparición y epidemiología, aún cuando éstos ocasionan

numerosos episodios patológicos, casos de mortalidad, pérdidas económicas en la industria

acuícola y alteraciones sociales en la población dedicada a la industria extractiva y

Introducción

15

procesadoras de productos marinos. Los Vibrios en la naturaleza pueden estar en un estado

inactivo o no ser capaces de crecer en los medios selectivos empleados (Colwell y Grimes

2000), no obstante, se ha evidenciado que las bacterias en estado de viables no

cultivables (VNC) pueden también causar enfermedades (Colwell 2000). Se han descrito

varios casos de vibriosis que afectan a organismos de importancia comercial como por

ejemplo, Gómez-León et al. (2005) reportaron que en el cultivo de larvas de almejas

Ruditapes decussatus, cultivadas en España durante los años 2001 y 2002, ocurrieron dos

episodios de mortalidades, el primero con un 62% y el segundo con un 73%,

respectivamente, asociados con infecciones bacterianas de V. alginolyticus en los dos

episodios, causando lesiones histológicas que afectaron principalmente el manto, el velo, y

el tejido conectivo de los organismos infectados. Otro ejemplo, es la especie V.

parahaemolyticus que actúa como patógeno en post larvas de abalón Haliotis diversicolor

supertexta (Cai et al. 2007). En el caso de la enfermedad del blanqueamiento de corales, que

se debe a la interrupción de la simbiosis entre el coral y el dinoflagelado Zooxanthellae, se

atribuye a los patógenos V. shilonii (también conocido como V. mediterranei), V.

coralliilyticus (Ben-Haim y Rosenberg 2002) y V. shiloi (Kushmaro et al. 2001). En peces,

los patógenos causantes de importantes pérdidas económicas en los cultivos de todo el

mundo son V. splendidus (Austin y Austin 1999), V. ordalii (Thompson et al. 2006), V.

vulnificus biotipo 2 (Toranzo et al. 2005), V. viscosus (Lunder et al. 2000) y Vibrio harveyi

(Austin y Zhang 2006).

Algunas especies de copépodos, rotíferos y artemias son usadas como importantes

fuentes nutricionales para el cultivo de muchos organismos acuáticos y existe evidencia de la

asociación que ocurre entre estos organismos con especies del género Vibrio. Por ejemplo,

los Vibrios tienen una relación de simbiosis con organismos quitinosos, como los copépodos

y la concentración de copépodos se correlaciona con el número de V. parahaemolyticus y V.

cholerae presentes en el agua de mar (Lipp et al. 2003). Tamplin et al. (1990) postulan que

los Vibrios utilizan la quitina como sustrato y el saco ovígero de los copépodos como un

vehículo para la diseminación cuando el copépodo libera los huevos fertilizados al ambiente.

También existen antecedentes de la asociación de Vibrios con diferentes especies de

de rotíferos, tal es el caso de V. rotiferianus aislado desde cultivos de Brachionus plicatilis

(Gómez-Gil et al. 2003). Por otro lado, se han aislado desde Artemia sp. V. hispanicus

Introducción

16

(Gómez-Gil et al. 2004) y V. alginolyticus (Snoussi et al. 2006). La asociación de Vibrios

patógenos con estos organismos tendría como consecuencia la transmisión de estas bacterias

a larvas que son alimentadas con estos organismos. Otras interacciones patogénicas de

Vibrios se han descrito en Leyton y Riquelme (2008b) (en resultados, publicación 1, tabla

2B).

1.1.3.- Vibrio parahaemolyticus

1.1.3.1.- Tipificación

La bacteria pandémica V. parahaemolyticus es un bacilo Gram negativo, levemente curvo,

aerobio facultativo, halofílico, oxidasa positivo, fermentador de glucosa, pero no de sacarosa

(Farmer et al. 2003). Existen diferentes clones patógenos de este agente, algunos de los

cuales tienen distribución mundial y otros son propios de algunas regiones específicas (Silva

et al. 2008). El esquema antigénico de tipificación fue diseñado inicialmente en Japón por

Sakazaki en 1963 (Elliot et al. 1998). En la tipificación se destaca la serotipificación de

lipopolisacáridos somáticos (O), polisacáridos capsulares (K) y flagelares (H) (Figura 2). El

antígeno H es común a todos los tipos, por lo que la serotipificación se realiza en base a los

antígenos O y K (Paris 2005). El sistema de serotipificación de V. parahaemolyticus incluye

13 diferentes antígenos O y 71 diferentes tipos K, y la determinación de serotipos por

combinación O:K ha resultado ser útil para el estudio epidemiológico de la enfermedad. De

los 71 tipos O:K reconocidos en V. parahaemolyticus, todos pueden causar gastroenteritis

(Nair y Hormazabal 2005). La distribución de los serotipos es mundial y la transición entre

un serotipo y otro se ha observado tanto en pacientes como en el ambiente (Paris 2005).

Figura 2: Esquema antigénico de tipificación considerada para bacterias del género Vibrio.

Introducción

17

1.1.3.2.- Aspectos clínicos y factores de virulencia:

Vibrio parahaemolyticus fue identificado por primera vez como agente de gastroenteritis por

Fujino (1951) y es responsable del 40 al 70% de las enfermedades gastrointestinales

causadas por el consumo de moluscos, crustáceos y peces crudos (Balcázar et al. 2007). El

primer reporte del clon patógeno O3:K6 fue detectado en India en febrero de 1996 (Okuda et

al. 1997) y hay registros de su diseminación en los diferentes continentes, por ejemplo, en

India, Bangladesh, Chile, Francia, Japón, Korea, Mozambique, Perú, Rusia, España, Taiwán,

Tailandia, Corea y Estados Unidos (Nair et al. 2007). Este clon pandémico posee el gen tdh

codificante de la hemolisina termoestable directa (TDH), principal factor de virulencia en

esta especie (Gil et al. 2007). Este serotipo, a diferencia de los otros, es capaz de incrementar

rápidamente no sólo la incidencia, sino la gravedad de los casos de diarrea aguda en zonas

donde se presenten condiciones favorables para su desarrollo. En el año 2005, el clon

pandémico fue asociado con casos clínicos de diarrea en Mozambique, África

(Ansaruzzaman et al. 2005). Igualmente, en México se reportó por primera vez

gastroenteritis causado por V. parahaemolyticus O3:K6 durante 2003 y 2004 (Cabanillas-

Beltran et al. 2006). Otros serotipos como O4:K68, O1: KNT, O1:K25, O1:K41, O4:K12

(Islam et al. 2004) y O3:KUT (Nair 2007) están presentes en diversas regiones del mundo,

determinándose por variados estudios moleculares su asociación genética con el clon

pandémico O3:K6. Estos nuevos serotipos parecieran haber divergido del clon pandémico

O3:K6 por alteración de los antígenos O:K (Tantillo et al. 2004).

La bacteria patógena V. parahaemolyticus produce una hemolisina directa

termoestable (TDH), codificada por genes tdh. La TDH es una proteína con actividad

hemolítica, esta toxina posee varias propiedades entre las que destacan: citotoxicidad y

aumento de la permeabilidad vascular. El 90% de los patógenos clínicos de esta especie

producen TDH. Además, esta bacteria puede presentar el gen trh (de la hemolisina

relacionada al tdh), así como el gen de la hemolisina termolábil (tlh) (De Paola et al. 2003).

Además requiere de otros factores para causar la enfermedad, como una variedad específica

de pili, factores de colonización y capacidad de invasión celular (Peterson y Zuppardo

2002). La alteración del flujo iónico de las células intestinales, es el que desencadena un

Introducción

18

cuadro intestinal (enteritis) caracterizado por diarrea acuosa y cólicos abdominales (Peterson

y Zuppardo 2002), que puede acompañarse de náuseas, vómitos, fiebre y cefalea.

Generalmente es autolimitado y dura alrededor de 3 días (rango 1 a 7), el período de

incubación entre 12 a 24 hrs. La muerte por esta causa es muy rara, no supera el 0,5%, la

cual se ha observado en casos aislados y suele ocurrir en pacientes con daño hepático,

alcoholismo, diabetes mellitus, embarazo y pacientes con edades extremas (Hlady y Klontz

1996, Heitmann et al. 2005).

El nivel de producción de TDH del clon patogénico y su susceptibilidad

antimicrobiana no es distinto a la de otras cepas patógenas de V. parahaemolyticus. Se

especula que su capacidad de persistir en el medioambiente o su habilidad en producir

infección son la base de su éxito como patógeno (Yi-Shin et al. 2003), por lo que no es

sorprendente que estas bacterias posean un gran repertorio de proteínas con enorme

especificidad de sustratos, los cuales le permiten realizar diferentes funciones catabólicas

para responder eficientemente a los constantes cambios en los ecosistemas (Connell et al.

1998). Desde el descubrimiento del clon pandémico de V. parahaemolyticus se han centrado

los esfuerzos en identificar el o los factores determinantes de este potencial pandémico. Sin

embargo, no se han observado diferencias en la producción de TDH, ni diferencias

significativas entre el porcentaje de sobrevida en similares condiciones de estrés medio

ambientales (temperaturas extremas, pH bajo, y alta salinidad), entre las cepas pandémicas y

no pandémicas de V. parahaemolyticus (Matsumoto et al. 2000, Wong et al. 2000).

1.1.3.3. Situación en Chile

Entre noviembre de 1997 y abril de 1998 en la ciudad de Antofagasta (23° 39'S 70° 24'W),

se detectaron por primera vez en Chile casos de gastroenteritis asociados a un cuadro de

intoxicación por V. parahaemolyticus, afectando a 340 personas (Córdova et al. 2002),

detectándose las cepas O1:K56 y O3:K6 en almejas, cholgas y ostiones (Heitmann et al.

2005). En los años posteriores se puede observar en los registros del Ministerio de Salud

(MINSAL, 2012) la ocurrencia de nuevos casos clínicos, registrándose el año 2005 un

aumento significativo de casos. El año recién pasado se registraron 71 casos, dos de ellos

ocurridos en Antofagasta (Figura 3).

Introducción

19

Figura 3: Casos clínicos ocurridos en Chile desde el año 1998-2011. Elaborado en base a

datos obtenidos del Ministerio de Salud (MINSAL).

En la zona norte de Chile se presentan las condiciones ambientales apropiadas como

temperatura superficial del mar y nutrientes para la proliferación del patógeno V.

parahaemolyticus. Esta ocurrencia de casos esporádicos de brotes de V. parahaemolyticus

en la Región de Antofagasta se podría explicar por factores biológicos, como la antibiosis

microbiana, entre otros. Fuenzalida et al. (2007) analizaron la presencia del patógeno V.

parahemolyticus en casos clínicos y muestras de mariscos en Puerto Montt y Antofagasta

durante los brotes de diarrea en 2006. En las muestras de Antofagasta no se detectó la

presencia de V. parahaemolyticus en moluscos ni en casos clínicos. Sin embargo, su

presencia se detectó en el 80% de las muestras de Puerto Montt. Las cepas de V.

parahaemolyticus aisladas evidenciaron que todos los patógenos (TDH+) provenientes

desde moluscos obtenidos de Puerto Montt correspondieron al clon pandémico O3:K6. Estos

autores discuten que los brotes son atípicos, debido a que la temperatura del agua de mar

en Puerto Montt, que tiene un rango entre 11 a 16ºC es 5°C más baja que en Antofagasta, y

la presencia de V. parahaemolyticus en pescados y mariscos se ha asociado con una mayor

temperatura del agua. Finalmente, Fuenzalida et al. (2007) concluyen que las posibles

causas de la desaparición de la cepa pandémica del norte y su persistencia en el sur son

desconocidas.

Introducción

20

1.2. Potenciales alternativas de control de bacterias patógenas marinas

1.2.1. Sustancias bioactivas de bacterias marinas

El ecosistema marino comprende alrededor del 70% de la superficie del planeta y por su

biodiversidad de microorganismos se sugiere que este medio es una fuente importante de

Productos Naturales Bioactivos Marinos (PNBM). Desde los años 60 ha habido un aumento

en la investigación de productos naturales marinos (Al-Zereini 2006), potenciado por la

industria farmacéutica, quien está en la búsqueda de nuevas drogas antitumorales,

antivirales, antifúngicas, antihelmínticas, anti-inflamatorias, analgésicas e

inmunoreguladoras y suplementos alimenticios, entre otros (Grabley y Thiericke 1999, Hale

et al. 2002, Kelecom 2002, Mydlarz et al. 2003, Piel 2004, Newman y Cragg 2004, Butler

2005). Al respecto, una revisión realizada por Faulkner (1984-1999) indica que durante los

años 1978-1987 se publicó un total de 3.076 metabolitos marinos, de los cuales 22

provenían de bacterias y hongos. Sin embargo, entre los años 1988-1997 se observó un

aumento a 7.099 metabolitos de origen marino, siendo 246 aislados desde microorganismos,

dejando en manifiesto el interés por investigar en esta área. Paralelamente se han realizado

estudios en bacterias, hongos, sedimentos, algas, peces, moluscos, tunicados y crustáceos

(Kelekom 2002). Estudios químicos y de actividad biológica de organismos como esponjas,

celenterados y equinodermos, han demostrado que contienen una gran cantidad y variedad

de metabolitos secundarios, con estructuras químicas diferentes a las encontradas en

organismos terrestres (Marquez et al. 2004). Sin embargo, algunos estudios evidencian que

productos naturales bioactivos, inicialmente aislados de esponjas marinas, son producidos

por microorganismos que están asociados como comensales o en simbiosis con

invertebrados marinos (Proksch et al. 2002), por lo que un buen aislamiento y selección con

medios de cultivo adecuados podrían aclarar el verdadero origen de las sustancias

bioactivas. Desde 1990, los metabolitos bioactivos descubiertos en bacterias marinas han

aumentado de manera exponencial (Hill 2003, Blunt et al. 2006). La mayoría de los

productos bioactivos se han obtenido desde géneros como Streptomyces,

Alteromonas/Pseudoalteromonas, Bacillus, Vibrio, Pseudomonas y Cytophaga, quienes

producen moléculas tales como quinonas, polienos, macrólidos, alcaloides, péptidos y

terpenoides (Al-Zereini 2006).

Introducción

21

La actividad metabólica bacteriana se divide en metabolismo primario, asociado a los

procesos normales de crecimiento y proliferación celular de un cultivo determinado, y

metabolismo secundario que tiene lugar en la fase estacionaria una vez que ha cesado el

crecimiento de la biomasa y en cuyo período se producen diferentes tipos de compuestos

denominados metabolitos secundarios (MS), presentando una enorme variedad de

estructuras químicas, consecuencia de la diversificación y ramificación de sus vías

biosintéticas (Parés y Juarez 1997), lo cuál es común en microorganismos marinos

(Kelekom 2002). En la década de los años cuarenta, las investigaciones sobre MS se

centraron particularmente en la producción de sustancias tóxicas para microorganismos

patógenos (antibióticos) (Parés y Juáres 1997). En general, los MS están representados por

moléculas con un peso molecular relativamente bajo que no sobrepasan los 1.500 a 2.000 Da

(Parés y Juárez 1997), constituidos total o parcialmente por péptidos (dipéptidos cíclicos).

No se conocen bien los factores que disparan la producción de MS, pero normalmente se

producen cuando algún nutriente del medio es limitante, como el nitrógeno, carbono o

fósforo alterando la producción de metabolitos primarios y originando inductores de

enzimas que darán lugar a MS. Parés y Juárez (1997) proponen que la actividad

antibiótica de los MS generados por las bacterias se fundamenta en su capacidad de inhibir

procesos metabólicos primarios esenciales de otras bacterias y así lograr la dominancia en su

nicho biológico.

1.2.2. Probióticos

El término “probiótico” se define como “microorganismos vivos que administrados en

cantidades adecuadas como alimento o suplemento alimenticio tienen efectos beneficiosos

sobre el equilibrio microbiológico intestinal del hospedador” (Sihag y Sharma 2012). Estos

están surgiendo como importantes complementos alimenticios en el campo de la profilaxis

(Geovanny et al. 2007). Algunos metabolitos obtenidos desde bacterias marinas tienen

efectos antagonistas contra otras bacterias marinas (Armstrong et al. 2000, Long et al. 2005,

Zapata et al. 2007, Castillo et al. 2008, Zhang et al. 2009) como inhibir su crecimiento. El

concepto “antagonismo” fue introducido en microbiología por el médico W. Roberts en

1874, quien describió las propiedades antibióticas de ciertos cultivos de hongo (Penicillium

glaucum) contra bacterias. Estas sustancias son productos extracelulares que recubren la

Introducción

22

célula, varían en complejidad estructural, desde una simple capa de mucus compuesta de

un polímero extracelular hasta una cápsula altamente estructurada o glicocalix (Fabregas et

al. 1991). Estas estructuras ayudan a la adherencia superficial para la formación de

biopelículas, lo que puede constituir también una estrategia para sobrevivir en períodos de

escasez de nutrientes (Lipp et al. 2002), protegerse contra cambios ambientales (Eboigbodin

et al. 2007), atrapar y absorber nutrientes, resistir antibióticos y establecer interacciones

favorables (Thompson et al. 2004) o patogénicas. Al respecto, Leyton y Riquelme (2008a)

(en anexo 1) observaron que biopelículas bacteria-microalgas específicas estimulan el

asentamiento de larvas de Argopecten purpuratus y sugieren estudiar las sustancias

producidas por estas biopelículas como posibles responsables de la estimulación del

asentamiento larval. Las interacciones antagónicas de tipo bacteria-bacteria que involucran

la inhibición del crecimiento de otra bacteria, corresponden a un mecanismo que puede

ayudar a mantener especies bacterianas (Long y Azam 2001), ya sea, mediante la

competencia por nutrientes, espacio, luz y/o a través de la producción de diversos

metabolitos secundarios, entre ellos sustancias antibacterianas (Verschuere et al. 2000).

Los mecanismos de acción de estas bacterias incluyen también, bacteriocinas, sideróforos,

lisozimas, proteasas y alteración del pH por producción de ácidos orgánicos (Sugita et al.

1998). Los primeros estudios de bacterias marinas productoras de sustancias

antimicrobianas fueron realizados por Rosenfeld y Zobell (1947). Desde entonces, la

búsqueda, aislamiento y caracterización de bacterias nativas con actividad antagónica sobre

microorganismos patógenos marinos y terrestres, se ha realizado en diversos hábitats como

agua de mar, sedimentos, fitoplancton, vertebrados e invertebrados (Gauthier 1976, Toranzo

et al. 1982, Lodeiros et al. 1988, Austin et al. 1995, Riquelme et al. 1997). La mayoría de las

investigaciones evalúan el efecto de bacterias antagonistas contra colecciones de bacterias

patógenas de peces y moluscos, así como también frente a cepas no marinas patógenas de

humanos (Fabregas et al. 1991, León y García-Tello 1998). Una alternativa para

biocontrolar la densidad bacteriana mediante el principio de exclusión competitiva es el uso

de cepas nativas de biopelículas productoras de sustancias inhibitorias contra otros géneros

del mismo hábitat (McCarthy et al. 1994) y/o producción de sustancias antibióticas

(Jorquera et al. 1999). Estas biopelículas microbianas muestran diferentes grados de

colonización en la interfase agua-sustrato (Wiencek y Fletcher 1995). Sin embargo, la

relación antagónica entre las bacterias adheridas que conforman una biopelícula y ocupan

Introducción

23

un mismo microcosmos, así como la interacción de estas bacterias contra otras cepas de

la micro-comunidad, han sido escasamente estudiados. Al respecto, Armstrong et al. (2000)

reportaron la existencia de microorganismos productores de metabolitos bacterianos,

utilizados para contrarrestar la colonización de organismos no deseados en superficies

sumergidas en ambientes marinos. Isnansetyo et al. (2009) proponen el uso de la cepa

bacteriana S2V2 como una alternativa de control biológico, la cual presentó actividad

inhibidora contra el 68% de un total de 28 patógenos analizados del género Vibrio, sin

embargo, plantean el interés de purificar y elucidar la estructura química de sus metabolitos

inhibidores.

Años atrás el uso de antibióticos en la industria acuícola fue una práctica común para

el tratamiento de enfermedades, pero su uso excesivo ha provocado una evolución

en las bacterias volviéndolas resistentes, al generar modificaciones en su metabolismo

(Cabello 2006), tener efectos tóxicos en la salud humana y generar un impacto negativo en

el medio ambiente provocando una alerta ambiental. Un método alternativo para el

tratamiento con antibióticos sería la utilización de probióticos, o bacterias benéficas, que

tienen el potencial para anular los agentes patógenos mediante la producción de

sustancias inhibidoras, o mediante la prevención de la colonización patógena en el

hospedador (Riquelme et al. 2000). Los antibióticos bacterianos son metabolitos de bajo

peso molecular, no son vitales para el crecimiento del propio microorganismo, pero sí se ha

descubierto su importancia para la salud humana (Sánchez et al. 2010). Estos metabolitos

derivan de diferentes vías biosintéticas que surgen de intermediarios intracelulares que se

condensan en estructuras más complejas (Sánchez et al. 2010). Los miembros de los géneros

Vibrio, Pseudomonas y Bacillus han sido utilizados como potenciales bacterias probióticas

en cultivos de peces, moluscos y crustáceos.

1.2.2.1. Vibrios probióticos

En la actualidad se investiga cada vez más, las interacciones benéficas o antagónicas de

algunas especies bacterianas con los demás componentes del ecosistema marino. Los

Vibrios se han identificado como mediadores significativos de interacciones antagonistas

entre bacterias marinas (Long y Azam 2001) y otros organismos marinos (Urakawa y

Introducción

24

Rivera 2006), algunas de las cuales se han usado en organismos acuáticos para

prevenir altas mortalidades larvales (Gómez-Gil et al. 2000). Una de las relaciones

simbióticas más estudiadas es la utilización de la quitina del calamar Eupyrmma

scolopes, nutriente importante para Aliivibrio fischeri, quien la utiliza como fuente de

carbono (Meibom et al. 2004) y a su vez el calamar aprovecha la bioluminiscencia de las

bacterias, en la comunicación, atracción de presas y defensa ante depredadores

(Fidopiastis et al. 1998). Vibrio harveyi secreta más de 10 enzimas que degradan la

quitina (Sugita et al. 2004), polímero natural (N-acetil-D-glucosamina) y una de las fuentes

más abundantes de amino azucares en el océano (Riemann y Azam 2002). Algunas

investigaciones en camarones silvestres sanos (Penaeus mergulensis) han reportado una alta

abundancia de bacterias del género Vibrio, sugiriendo que el camarón influencia y/o

selecciona su microflora bacteriana (Oxley et al. 2002). Además existen antecedentes que

evidencian que la asociación de Vibrios y plancton aumenta la supervivencia de

Litopenaeus vannamei indicando que Vibrios y Aeromonas componen hasta el 85% de la

flora bacteriana en el intestino del camarón. Algunas mezclas de bacterias probióticas de

V. alginolyticus y Vibrio sp. fueron sometidas a pruebas de inhibición in vitro con Vibrios

patógenos de camarones (V. harveyi, V. vulnificus y V. parahaemolyticus) para demostrar su

efecto antagónico, obteniendo porcentajes de inhibición mayores al 50% (Sotomayor y

Balcázar 2003). Igualmente los Vibrios se han utilizado con eficacia en el control biológico

de agentes patógenos en cultivo de peces (Austin et al. 1995, Gatesoupe 1997, Gram et al.

1999). Avendaño-Herrera et al. (2001) encontraron que Vibrio sp. fue un componente

predominante en la microflora de poblaciones de post-larvas de Argopecten purpuratus

alcanzando valores porcentuales de 53,4%. Posteriormente, Avendaño-Herrera et al. (2002)

observaron un número significativo de semillas Argopecten purpuratus en colectores

biologizados con 3 bacterias del género Vibrio después de 30 días de cultivo en el mar, lo

que evidencia un efecto benéfico de las bacterias. Otras interacciones benéficas de Vibrios

se detallan en Leyton y Riquelme (2008b) (en resultados publicación 1, tabla 2). Con esta

información se infiere que algunas bacterias del género Vibrio son beneficiosas para usarlas

como potenciales probióticos en organismos de importancia comercial, por lo que,

estudiar sus potencialidades benéficas y mecanismos de acción es una alternativa que

debiera considerarse en futuras investigaciones.

Introducción

25

1.2.2.2. Bacillus probióticos

Las bacterias del género Bacillus se encuentran distribuidas ampliamente através del hábitat

terrestre y acuático (Siefert et al. 2000), incluyendo sedimento marino (Miranda 2008). Se

han estudiado bastante en los últimos años, porque se ha evidenciado actividad

antimicrobiana (Oguntoyinbo 2007), bioinsecticida (Ben Khedher et al. 2011), antifúngica

(Liu et al. 2011) y probiótica (Cutting 2011). Las más estudiadas son Bacillus subtilis, B.

clausii, B. cereus, B. coagulans y B. licheniformis. La ventaja de este género es que se

reproducen en forma sencilla al crecer de manera eficiente con muy bajo costo de fuentes de

carbono y nitrógeno (Siefert et al. 2000). Además, pueden crecer en el tracto intestinal, al ser

capaces de sobrevivir a bajo pH (Barbosa et al. 2005, Spinosa et al. 2000). Hace más de 50

años que se utilizan las esporas de Bacillus como probióticos por sus ventajas de

manipulación, se pueden almacenar a temperatura ambiente en una forma de desecado sin

ningún efecto perjudicial sobre la viabilidad y son fáciles de incorporar a cultivos o sistemas

de alimentos (Gatesoupe 1999). Las esporas probióticas se utilizan como suplemento

dietético en humanos y en acuicultura como promotores de crecimiento y para aumentar la

resistencia a enfermedades de los individuos en cultivo como en el camarón Penaeus

monodon (Cutting 2011). Por otro lado, enzimas provenientes de bacterias del género

Bacillus son muy eficaces en romper una gran variedad de carbohidratos, lípidos y proteínas

en unidades más pequeñas (Ochoa-Solano y Olmos-Soto 2006).

Algunos productos extracelulares de bacterias del género Bacillus se han añadido a

cultivos de peces y camarones peneidos, inhibiendo el crecimiento de patógenos y

aumentando la sobrevivencia de los organismos cultivados (Sugita et al. 1998, Moriarty

1998, Rengpipat et al. 1998). Opalinski (2007) concluye que B. subtilis puede ser utilizado

como probióticos ya que promueve el crecimiento de pollos a través de la dieta de engorda.

Esta especie posee una marcada acción bactericida y fungicida, por lo que, se ha aprobado

su uso como biopesticida en plantas y es un ingrediente común en las mezclas de probióticos

recomendadas para el uso en animales acuáticos.

1.2.3. Bacteriófagos

En el medio marino existe una alta concentración de bacteriófagos los cuales afectan a

poblaciones de bacterias marinas (Curtis 2005). Por ejemplo, hay evidencia de cianófagos

Introducción

26

que infectan cianobacterias (fundamentales en la fotosíntesis marina) que codifican el

fotosistema I y II, así como proteínas de transferencia de electrones apuntando a una

perturbación en el flujo de electrones de las cianobacterias (Alperovitch-Lavy et al. 2011).

Clokie et al. (2010) afirmaron que los fagos son considerablemente importantes en el medio

ambiente por su impacto en la producción primaria oceánica.

Se ha planteado la terapia con fagos para controlar las bacterias patógenas en los

sistemas acuícolas. Según Crothers-Stomps et al. (2010) este desarrollo requiere de un

aislamiento inicial de bacteriófagos y la determinación posterior de huéspedes. Por ejemplo,

Crothers-Stomps et al. (2010) aislaron bacteriófagos líticos desde V. harveyi para aplicarlos

contra bacterias patógenas de larvas de langosta Panolirus ornatos observando que el fago

Myoviridae induce la producción de bacteriocinas en cepas huéspedes bacterianas.

Igualmente, Hyung et al. (2010) aislaron 5 bacteriófagos (dentro de los miembros

Myoviridae, podoviridae y Siphoviridae) que infectaron a bacterias Flavobacterium

psychrophilum, con el fin de estudiar métodos para controlar la enfermedad de bacterias

patógenas de peces Plecoglossus altiveiis. Los resultados evidenciaron que ninguno de estos

fagos se vio afectado a la prueba de diferentes condiciones de pH y temperatura resultando

ser eficaz en la reducción bacteriana. Bastías et al. (2010) estudiaron los fagos que infectan

la cepa pandémica de V. parahaemolyticus en las aguas costeras, de 143 muestras analizadas

se encontraron fagos sólo en 13, los que fueron capaces de multiplicarse en la cepa

pandémica, pero su concentración inicial fue insignificante respecto a su posterior

crecimiento, la bacteria infectada continuó produciendo el fago pero no se lisogenizó, lo que

sugiere que este tipo de fago (Podofagos) ejerce poco control sobre la propagación de la

cepa pandémica en el medio ambiente. En base a los antecedentes disponibles actualmente,

no queda claro que los bacteriófagos puedan ser controladores definitivos de las poblaciones

de V. parahaemolyticus.

1.3. Importancia de las sustancias bioactivas en la industria acuícola

La contaminación por patógenos en organismos de importancia comercial trae consigo

problemáticas como: ocurrencia de episodios pandémicos, mortalidad de recursos marinos y

humanos en los casos extremos, pérdidas económicas, alteraciones sociales en el sector

industrial de extracción/procesamiento de recursos marinos y pérdida en las capturas que son

Introducción

27

irrecuperables al no existir un plan de mitigación. Por lo tanto, se hace necesario conocer la

dinámica existente entre las bacterias antagonistas y patógenas en el ecosistema marino para

evaluar la función que pueden cumplir moléculas específicas presentes en bacterias nativas

antagonistas y que podrían generar antibiosis contra patógenos como V. parahaemolyticus.

En los ecosistemas acuáticos las interacciones bacteria-bacteria pueden ser específicas

entre especies que coexisten en un microcosmos, provocando un efecto positivo

(simbiosis) o negativo (antagonismo), dependiendo de las condiciones del ecosistema

(Riquelme y Avendaño-Herrera 2003), estas interacciones podrían ser reguladoras de la

proliferación de algunas especies bacterianas en el ecosistema marino.

El aumento de la resistencia bacteriana a antibióticos ha obligado a buscar

alternativas a su uso como control biológico, un camino viable para contrarrestar esta

problemática es la búsqueda de nuevos mecanismos más amigables con el medio ambiente.

Con estas alternativas se podría controlar la “vibriosis”, enfermedad común en los cultivos

marinos alrededor del mundo causada por bacterias, y que afecta a cultivos de moluscos,

crustáceos y peces (Isnansetyo et al. 2009). Algunas bacterias patógenas del género Vibrio

son resistentes a antibióticos tales como oxitetraciclina, norfloxacina y ciprofloxacina,

debido al uso frecuente de éstos en los sistemas de cultivo (Molina-Aja et al. 2002). Por otro

lado, hay algunos Vibrios presentes en el medio marino que además causan enfermedades en

humanos, tal es el caso de V. parahaemolyticus, cuya aparición produce una disminución en

el consumo de organismos marinos. Debido a lo anterior, tener estrategias de control o

conocer sustancias inocuas que puedan inhibir la proliferación de V. parahaemolyticus

podrían ser útiles para su uso en futuras plantas de depuración.

Introducción

28

1.4- Hipótesis

Considerando los antecedentes antes señalados, en esta investigación la hipótesis de trabajo

se planteó en base a la predicción que, en la región de Antofagasta se presentan las

condiciones ambientales apropiadas de temperatura superficial y nutrientes para la

proliferación de V. parahaemolyticus. Sin embargo, una de las causas que impiden la

proliferación de éste podrían ser factores biológicos como antibiosis microbiana.

1.4.1. Hipótesis general: Cepas bacterianas marinas nativas, secretan productos

extracelulares inhibidores del crecimiento de V. parahaemolyticus.

1.4.2. Hipótesis específica: La presencia de ciertos compuestos específicos de los productos

extracelulares (como péptidos u otros) de bacterias marinas nativas producirán inhibición en

el crecimiento de V. parahaemolyticus.

1.5. Objetivos

Para poner a prueba estas hipótesis se establecieron los siguientes objetivos:

1.5.1. Objetivo general: Identificar, caracterizar y evaluar productos extracelulares de 2

bacterias marinas nativas inhibidoras de V. parahaemolyticus para su potencial uso como

controlador de la proliferación de este patógeno.

1.5.2. Objetivos específicos

Identificar las especies antagonistas mediante técnicas bioquímicas y moleculares.

Aislar y caracterizar los productos extracelulares bacterianos que inhiben el

crecimiento de V. parahaemolyticus.

Determinar la capacidad inhibitoria de los productos antibacterianos en el

crecimiento de V. parahaemolyticus en ostiones (A. purpuratus) infectados.

Introducción

29

2. Metodología

30

2.1. Sitio de estudio

Las actividades de esta investigación se realizaron en el Laboratorio de Ecología

Microbiana del Centro de Bioinnovación de la Facultad de Recursos del Mar de la

Universidad de Antofagasta. Las bacterias fueron obtenidas desde el cepario de colección

del laboratorio. Se trabajó con la bacteria patógena V. parahaemolyticus (cepa PM48.5)

donada por el Doctor Romilio Espejo del Instituto de Nutrición y Tecnología de los

Alimentos (INTA), las bacterias antagonistas C33 fue aislada desde sistemas de cultivo de

A. purpuratus (Jorquera et al. 1999) y C32 aislada desde cápsulas de huevo de Concholepas

concholepas (Leyton y Riquelme 2010) (en resultados, publicación 2). Las bacterias se

mantuvieron en ceparios con medio de cultivo de agar tripticasa de soya (TSA Oxoid Ltd.,

Basingstoke, Hampshire, England) suplementado con 2% de NaCl, en condiciones axénicas

a 20 ± 1°C y congelados a -80ºC en criobank (PVequip).

2.2. Pruebas de inhibición bacteriana

Los ensayos de inhibición se realizaron mediante el método de “doble capa” (Dopazo et al.

1988), inoculando 10 µL (7,1x104 células/ml) de la cepa antagonista desde un cultivo de 18

horas, en el centro de una placa Petri con medio Mueller-Hinton (Difco) suplementado con

2% de NaCl, y se incubó a 20°C por 48 horas. Después de este tiempo, la macro colonia

formada se sometió a vapores de cloroformo por 45 minutos. Posteriormente, se agregó una

segunda capa de agar semisólido previamente inoculado con la bacteria patógena V.

parahaemolyticus (2,3x104 células/ml) y se incubó a 20°C por 48 horas. La presencia de un

halo de inhibición definido alrededor de la macro colonia fue considerada como actividad

antibacteriana. El estudio se realizó en triplicado y el grado de inhibición se determinó

midiendo el diámetro del halo, considerándose valores mayores a 5 mm como fuerte

inhibición según Avendaño-Herrera et al. (2005). Como control negativo se evaluó el efecto

del cloroformo inoculando la bacteria patógena sin el inóculo de la bacteria antagonista.

2.3. Identificación bacteriana de las bacterias antagonistas

2.3.1. Gen 16S ARNr: Desde un cultivo estéril se suspendió en buffer de lisis una colonia

de las bacterias (0,15M NaCl+0,1M Na2EDTA+0,1% Lisozima), se centifugó a 5000 rpm

por 20 minutos, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió en buffer de lisis más 10 µl de

Metodología

31

proteinasa K. Se incubó a 65ºC por 4 horas. El ADN genómico fue extraído mediante el

método descrito por Sambrook et al. (1989). Luego se amplificó el gen 16S ARNr mediante

reacción en cadena de la polimerasa (PCR, siglas en inglés) (Buffer 5x, MgCl2 25 mM,

dNTPs 10 mM, BSA 1X, 1 μM de cada oligonucleótido, y 0,04 U/μl Taq ADN polimerasa

(Fermentas)), usando partidores universales, una primera amplificación se realizó

con los partidores 27F (5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`) y 1542R (5`-

AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3`) previamente descritos por Brosius et al. (1981), luego

se realizaron 3 procesos más para obtener la secuenciación completa del 16S ARNr usando

los partidores 358F (5`-CCTACGGGAGGCAGCAG-3`), 907R (5`-CCGTCAATTCCTTTR

AGTTT-3`) y 1492R (5`-GGTTACCTTGTTACGACTT-3`). La amplificación de los

productos se realizó en un termociclador Px2 (Thermo Corporation), las condiciones de PCR

fueron 5 minutos a 94ºC y luego 30 ciclos de 45 s a 94ºC, 45 s a 55ºC, 90 s a 72ºC y 5

minutos a 72ºC, los productos amplificados fueron visualizados en gel de agarosa 1%. El

producto de PCR fue purificado con el kit de purificación (UltraCleanTM

15 DNA, MoBio

Laboratories, CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuenciación de los

fragmentos se realizó en Macrogen Inc. (Korea). Las secuencias fueron analizadas usando el

programa Bio Edit y Blast en GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Los

alineamientos fueron realizados con Clustal W (Thompson et al. 1994) y la secuencia fue

comparada con aquellas que se encontraron disponibles en la base de datos GenBank.

2.3.2. Tinción Gram: este procedimiento permite clasificar a las bacterias en dos grupos:

Gram positivas y Gram negativas (Doetsch 1981). Para ello, se tomaron 10 µl de un cultivo

de 18 horas de las cepas antagonistas en caldo de tripticasa de soya (TSB, siglas en inglés) y

se inoculó en un portaobjeto, para fijar la muestra, la gota se flameó sobre un mechero de

manera ondulante hasta que se secó, luego se cubrió la muestra con cristal violeta por un

minuto y se eliminó el exceso con abundante agua, posteriormente se cubrió la muestra por

un minuto con lugol (aumenta la afinidad entre la célula y la tinción) y se eliminó el exceso

con agua, posterior a esto se procedió a cubrir la muestra con alcohol-acetona por 10

segundos para luego lavar con abundante agua. Por último, el portaobjeto con la muestra se

cubrió con safranina por un minuto y se lavó el exceso con abundante agua. La muestra

teñida se secó finalmente y se observó en un microscopio de campo claro a 100X

(Olympus BN-2). El diagnóstico se realizó en base a la coloración de la bacteria,

Metodología

32

color violeta para las bacterias que poseen una gran proporción de péptidoglucano que

conforma la pared celular (Gram positiva) o una tonalidad rosada/roja las que poseen una

proporción reducida (Gram negativa).

2.3.3. Kit API 20E / 50CHB: Para pruebas bioquímicas de identificación se utilizó el kit

para cepas Gram negativas API 20E (BioMerieux) de acuerdo a lo descrito por Swanson y

Collins (1980) y el kit API 50CH (BioMerieux) para cepas Gram positivas siguiendo las

indicaciones del fabricante. Los resultados de las reacciones fueron enviados a la empresa

BioMerieux quienes reportaron la identificación.

2.3.4. Prueba Kanagawa: Se inoculó una gota de 1 µl del cultivo bacteriano de cada cepa

(C32 y C33) provenientes de cultivos de caldo de Tripticasa de soya suplementado al 2%

con NaCl (TSB siglas en inglés, Oxoid, Hampshire, England), en placas por triplicado de

agar Wagatsuma (sangre 5%, Blood Agar base, Oxoid, Hampshire, England). Se incubó por

37ºC y los datos se interpretaron 18 horas después de la incubación. Una reacción positiva

se indicó por la presencia de un halo de 3 mm o más, alrededor de la colonia observándose

una zona transparente de hemólisis por la ausencia de glóbulos rojos. Esta prueba se realizó

en base al protocolo descrito por Miyamoto et al. (1969).

2.3.5. Prueba de susceptibilidad a antibióticos: Se utilizó el test de susceptibilidad

antimicrobiana (Discos, Oxoid). Los discos fueron dispuestos sobre placas de agar Mueller-

Hinton (Oxoid, Ltd., Basingstoke, Hampshire, England) suplementada con 2% de NaCl,

previamente se sembró en extendido la cepa de interés a una concentración de 1x105

células/ml. Los antibióticos evaluados fueron: novobiocina (NV, 30 µg); tetraciclina (TE, 30

µg); amikacina (AK, 30 µg); cloranfenicol (C, 30 µg) y estreptomicina (S, 25 µg). Los

resultados fueron interpretados de acuerdo al método de (Bauer et al. 1966).

2.3.6. Prueba de susceptibilidad al compuesto vibriostático O/129: Se usó el compuesto

vibriostático O/129 (2,4diamino-6,7-diisopropilpteridina sal fosfato; SIGMA), mediante el

método de disco de difusión usado para identificar Vibrios halofílicos (Ericsson y Sherns

1971). La susceptibilidad al agente vibriostático fue determinada utilizando discos con una

concentración de 150 µg/disco, los que fueron colocados en una placa de agar Mueller-

Metodología

33

Hinton, suplementada con 2% NaCl, sembrada previamente en extendido con la bacteria de

interés. Las placas se incubaron 24 horas a 20ºC, un halo alrededor del disco, independiente

del diámetro, indicó susceptibilidad al vibriostático.

2.3.7. Crecimiento en agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS): Se inoculó 10 µl de

las cepas con actividad antagonista en placas de agar tiosulfato citrato con sales biliares al

2% NaCl (TCBS Cholera Medium, Oxoid, Hampshire, England), provenientes de un cultivo

de 18 horas en caldo de tripticasa de soya (TSB, siglas en inglés). La incubación se realizó a

20ºC por 24 horas para observar las unidades formadoras de colonia UFC.

2.4. Crecimiento de la cepa antagonista y extracción de sus productos antibacterianos

La cepa C33 fue cultivada en medio mínimo M9 (casaminoácidos 1 g/l; Na2HPO4 6 g/l;

KH2PO4 3 g/l; NH4Cl 1 g/l ; NaCl 20 g/l; 960 ml de agua destilada (DW), 10 ml MgSO4; 10

ml de CaCl2; vitamina B1 1 ml; glucosa 100 ml, pH 7) (Gerhardt et al. 1994) y la cepa C32

en medio mínimo M9 con algunas modificaciones (casaminoácido 1 g/l; Na2HPO4 1 g/l;

KH2PO4 2 g/l; NH4Cl 1 g/l ; NaCl 4 g/l; DW 960 ml, 10 ml MgSO4; 10 ml de CaCl2;

vitamina B1 1 ml; glucosa 100 ml, pH 4), con una concentración inicial de 1x107

células/ml a 20ºC. El crecimiento celular se registró mediante recuento total de células/ml a

las 6, 12, 24, 30, 36, 48, 54, 60, 72, 78, 90, 96, 102, 108 y 120 horas, tiñendo el núcleo de

las bacterias con el fluorocromo 4´ 6- diamino-2 phenylindol (DAPI ) (Porter y Feig 1980) y

fueron observadas en un microscopio de epifluorescencia a 100X (Olympus BN-2),

equipado con un espejo dicroico DM400 y filtros de excitación UG1 y absorción L420.

Paralelamente, se hizo extracción de los productos orgánicos a las 24, 48, 72, 96 y 120 horas

de cultivo, agregando 150 ml del solvente acetato de etilo por litro de cultivo

(bacteria+sobrenadante). Se recuperó la fase orgánica y se dejó por 20 minutos en sulfato de

sodio (Merck, Germany), luego se filtró con papel filtro de celulosa y se concentró hasta

sequedad en rotavapor a 45ºC. Finalmente, se dejó 24 horas en liofilizador para eliminar la

humedad. Para determinar la actividad del producto orgánico aislado a cada hora de

muestreo se realizó bioensayos con el método de disco de difusión agregando 2 mg/filtro del

producto diluido en el solvente diclorometano, cada filtro (4 mm diámetro) se colocó

sobre placas de Mueller-Hinton las que tenían sembrado en extendido la bacteria V.

parahaemolyticus a una concentración de (1x105 células/ml). Para el control se usó extracto

Metodología

34

de medio de cultivo sin la bacteria y el solvente orgánico usado para disolver los productos.

Las placas se incubaron por 48 horas a 20ºC.

2.5. Determinación del tamaño del producto antibacteriano

Sobre placas Petri con medio Mueller-Hinton se colocaron membranas de diálisis (1 y 10

kDa) conteniendo 3 ml de medio de cultivo líquido M9 más el inóculo (1x105 células/ml) de

las bacterias antagonistas C32 y C33 (cada bacteria se trabajó en forma independiente), se

inyectó con una jeringa sobre la parte superior de la membrana el cultivo bacteriano, se

mantuvieron por 48 horas a 20ºC, luego de este tiempo se retiraron las membranas y sobre

este agar se inoculó la bacteria patógena V. parahaemolyticus (a una concentración de 1x105

células/ml) proveniente desde un cultivo de 18 horas en medio TSB, las placas fueron

incubadas por 48 horas a 20ºC. La experiencia se realizó en triplicado y la inhibición se

determinó al no observar crecimiento del V. parahaemolyticus sobre el área donde estuvo la

bolsa de diálisis. Como control se usó el mismo procedimiento sin el inóculo de la bacteria

antagonista.

2.6. Sensibilidad a temperatura del producto antibacteriano

Sobre placas P etri con medio Mueller-Hinton se colocaron membranas de diálisis (1 y 10

kDa) unidas en sus extremos con selladores plásticos y se inoculó las bacterias

antagonistas C32 y C33 (a una concentración inicial de 1x105 células/ml, independientes

una de la otra) en 10 ml de medio de cultivo M9 específico para cada bacteria. Se

mantuvieron por 48 horas a 20ºC, luego de este tiempo se eliminaron las bolsas y el agar se

dispuso en botellas Schott en baño maría a 100ºC por una hora. El medio fundido se volvió

a plaquear, y una vez frío se sembraron gotas de un cultivo de 18 horas de la bacteria

patógena V. parahaemolyticus a una concentración (1x105 células/ml), las placas se

incubaron por 48 horas a 20ºC. La experiencia se realizó en triplicado y la inhibición se

determinó al no observar crecimiento de V. parahaemolyticus en las placas inoculadas.

Como control se usó el mismo procedimiento sin el inóculo de la bacteria antagonista.

Metodología

35

2.7. Purificación y caracterización del producto antibacteriano

2.7.1. Fraccionamiento del producto antibacteriano: Se cultivaron 80 litros de cada

bacteria en medio de cultivo M9 específico para cada bacteria según paso 2.4, durante 96

horas a una concentración inicial de 1×107 células/ml a 20°C. La extracción del producto

orgánico de cada bacteria se realizó según el paso 2.4. El extracto de acetato de etilo se

separó de acuerdo a su polaridad por cromatografía en fase reversa en una columna

de cromatografía compactada con gel de sílice (100-C18 fase reversa) a una altura de 10

cm. El extracto se añadió a la columna adsorbido en el mismo gel de sílice que se utilizó

en la columna. La fase móvil fue agua destilada (100 ml) como fracción inicial, seguido por

las mezclas (100 ml) de agua destilada y metanol en 3:1, 3:2, 2:3 y proporciones 1:4, y

finalmente 100 ml de los disolventes metanol, diclorometano y metanol. A partir de este

procedimiento se obtuvieron 8 fracciones para la cepa C32 y C33. De estas fracciones se

trabajó con aquella que presentó mayor biomasa considerándolo como producto mayoritario.

A las fracciones se les confirmó actividad contra el V. parahaemolyticus mediante el método

de disco de difusión, como se describió en el paso 2.4. Igualmente se comprobó actividad

Kanagawa a los productos extraídos desde las bacterias C32 y C33, para ello se agregó 2

mg/filtro de producto y se dispusieron sobre agar sangre. Se incubó por 37ºC y los datos se

interpretaron 18 horas después de la incubación con el mismo criterio usado en el ítem 2.3.4.

Luego de la fase reversa, las fracciones obtenidas de las bacterias C32 y C33 se

refraccionaron mediante fase normal para C32 y Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine

Chemicals. 17-090-01) para C33, durante este procedimiento se seleccionaron fracciones

basadas en el criterio de pureza y producto mayoritario. Finalmente, la identificación de las

fracciones se realizó en la cepa C32 mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC,

siglas en inglés) y resonancia magnética nuclear 1H (NMR, siglas en inglés) (Figura 4). Para

la cepa C33, se realizó la identificación mediante la comparación de sus espectros de masas

1H y

13C NMR (Figura 5). Durante todo el procedimiento, cada fracción se secó en un

rotavapor a 45°C y liofilizó durante 24 horas.

Metodología

36

Figura 4: Secuencia del fraccionamiento usada para el análisis de caracterización de los

productos de la bacteria C32.

Figura 5: Secuencia del fraccionamiento usada para el análisis de caracterización de los

productos de la bacteria C33.

Metodología

37

2.7.2. Evaluación de pureza del producto antibacteriano:

La separación y pureza de los productos de cada cepa se determinó por cromatografía en

capa fina (CCF) empleando cromatofolios (20 x 20 cm) de gel de sílice 60 F254 con base de

aluminio (Merck art. 105554) y pulverizado con oleum (H2SO4: H2O:AcOH (1:4:20)). Este

seguimiento proporcionó un criterio para reunir las fracciones obtenidas. Adicionalmente, a

la fracción que presentó un grado de pureza con la formación de cristales se le realizó

NMR de +H,

13C y Espectrometría de Masas (EM). Los espectros de NMR se realizaron en

el espectrómetro Bruker AMX 500 operando a 500 MHz para la obtención de los espectros

de 1H y a 125 MHz para

13C. Los experimentos de correlación homo y heteronuclear COSY,

HSQC, HMBC y NOESY se obtuvieron en el mismo equipo. Para la adquisición de datos se

empleó cloroformo deuterado como disolvente y cloroformo como patrón de referencia

interna (δH 7,25 ppm; δC 77,0 ppm). Los valores de desplazamiento químico (δ) se expresan

en partes por millón (ppm), en relación al disolvente empleado como referencia interna, y las

constantes de acoplamiento (J) en Hertzios (Hz). Finalmente los espectros de masas de baja

(EM) y alta (EMAR) resolución se adquirieron en un espectrómetro Micromass Autospec

operando con una energía de ionización de 70 eV y una temperatura de fuente de 220ºC.

2.8. Inhibición de V. parahaemolyticus de los productos antibacterianos

Se evaluó la inhibición del crecimiento del patógeno V. parahaemolyticus en presencia de

los productos antibacterianos obtenidos desde la bacterias y con productos de similares

carcaterísticas obtenidos comercialmente, esto último considerando que los productos

identificados son conocidos y además, la baja producción de moléculas activas obtenidas

desde las bacterias dificulta realizar ensayos en volúmenes mayores. El ácido oleico (AO) es

un producto fácil de obtener (Biosonda $62.000 / litro, aproximadamente), sin embargo las

dicetopiperazinas (DKP) no fue posible encontrar las mismas estructuras aisladas en este

trabajo, por lo que se trabajó con la DKP más similar en su estructura cuyo valor comercial

fue mucho mayor respecto a AO (Biosonda $45.000 / 5 gramos, aproximadamente). Los

productos fueron diluidos en diclorometano y distribuidos en placas multipozos de 96

pocillos, las concentraciones usadas fueron: 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,5 y 2 mg/ml.

Luego de la evaporación del diclorometano, se agregó 200 µl de agua de mar filtrada 0,2

µm y un inóculo inicial de 1x103 células/ml del patógeno. La inhibición del patógeno se

midió por absorbancia a 620 nm en un lector de placas (Tecan Sunrise, MAGELLAN

Metodología

38

interface), las lecturas se realizaron a las 24 y 48 horas de cultivo. Como control se usó agua

de mar, cada tratamiento se hizo por triplicado y las placas se mantuvieron a 20ºC.

2.9. Efecto antibacteriano del producto extraído de bacterias en ostiones infectados

El experimento se realizó en recipientes plásticos con 1 litro de agua de mar (previamente

filtrada y tratada con radiación ultra violeta (UV)), cada recipiente estuvo cubierto para

descartar factores de estrés de los ostiones, tenían en su interior producto bacteriano a una

concentración de 1 mg/ml y 3 ostiones A. purpuratus (previamente aclimatados e infectados

por 18 horas en recipientes independientes a una concentración de 1x105 células/ml del

patógeno V. parahaemolyticus). Los tratamientos usados fueron los siguientes: P-C32

(ostión + V. parahaemolyticus + producto de C32); P-C33 (ostión + V. parahaaemolyticus +

producto C33); y como control se usó CT (ostión + V. parahaemolyticus). Luego de 24

horas de tratados los ostiones infectados con los productos antibacterianos, se tomó cada

réplica y se dispuso el organismo completo en recipientes por separado con 100 ml de

solución salina marina (SSM) y se molió el tejido del organismo con minipimer. La

confirmación de V. parahaemolyticus en el tejido del molusco se determinó a través de la

técnica de número más probable (NMP) como se describe en el manual de análisis

bacteriológicos de EE.UU, Food and Drug Administration (Kaysner y DePaola 2004). Para

ello, cada muestra se diluyó en 3 series por triplicado en medio de cultivo enriquecido de

agua peptonada alcalina (APW siglas en inglés, peptona 10 g, NaCl 5 g y agua destilada

1000 ml, pH 8,4). Las muestras se incubaron en baño termorregulado a 37ºC durante 18

horas, luego se tomó 1 ml de cada muestra y se hirvió a 100ºC por 15 minutos,

posteriormente la muestra se centrifugó a 14,000 rpm por 10 minutos a 4ºC. Para

identificar la presencia de los genes indicadores de patogenicidad se usó los marcadores: tdh

(fwd 5’-GTA AAG GTC TCT GAC TTT TGG AC-3’, rev 5’-TGG AAT AGA ACC TTC

ATC TTC ACC-3’) y tlh (fwd 5’-AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG-3’, rev 5’-

GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC-3’). Finalmente, mediante el análisis de PCR

(Buffer 10x, MgCl2 50 mM, dNTPs 2,5 mM, tlh-F 20 mM, tlh-R 20 mM, tdh-F 20 mM, tdh-

R 20 mM y 0,04 U/μl Taq ADN polimerasa (Fermentas)), usando un termociclador Px2

(Thermo Corporation), cuyas condiciones de PCR fueron 3 minutos a 94ºC y luego 35 ciclos

de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 60ºC, 1 minuto a 72ºC y 7 minutos a 72ºC, se identificó

Metodología

39

por el tamaño de la banda la presencia de genes patogénicos en geles de agarosa al 1%,

previamente teñido con 5 µl de bromuro de etidio.

2.10. Efecto antibacteriano del producto comercial en ostiones infectados

El experimento se realizó en recipientes plásticos con 50 litros de agua de mar (previamente

filtrada y tratada con UV), cada recipiente contenía 22 ostiones previamente infectados en

las mismas condiciones mencionadas en el paso anterior. Al momento de inocular el

producto comercial se bajó el nivel de agua hasta 30 litros (con el objetivo de ahorrar

producto) y se agregó 1 mg/ml del producto, se dejó actuar por 40 minutos con agitación

manual cada 10 minutos, luego se subió el nivel de agua hasta 50 litros, no se realizó

recambio de agua durante el experimento, los tratamientos fueron; CT (ostión sin infectar);

Ost+Vp (ostión + V. parahaemolyticus); Ost+Vp+C (ostión + V. parahaemolyticus +

cloranfenicol (1mg/ml)); Ost+Vp+DKP (ostión + V. parahaemolyticus + DKP comercial);

Ost+Vp+AO (ostión + V. parahaemolyticus + AO comercial). Luego de 24 horas de

tratados los ostiones infectados con los productos antibacterianos comerciales se tomó

muestras por triplicado de cada tratamiento y se procesaron para el análisis de NMP

usando la misma metodología mencionada en el paso anterior.

Finalmente en la figura 6, se grafica la secuencia de la metodología usada desde la

identificación del producto activo hasta los bioensayos de actividad en A. purpuratus.

Figura 6: Síntesis de la metodología usada para aislar, purificar y probar actividad

antibacteriana desde bacterias marinas.

Metodología

40

2.11. Análisis estadístico

Se evaluó el cumplimiento de las presunciones de homogeneidad de varianza (prueba

Bartlett´s), distribución normal de los datos (prueba Kolmogorov-Smirnov), normalidad de

los residuales (prueba Anderson-Darling), independencia y linealidad del modelo usando

el software estadístico MINITAB 14. A los datos se les realizó análisis de varianza

(ANDEVA) de una vía (Zar 1994) y comparación de los tratamientos mediante el test

Kruskal Wallis (Kruskal y Wallis 1952).

Metodología

41

3. Resultados

42

3.1. Identificación de las cepas antibacterianas

La bacterias utilizadas en este trabajo C32 aislada desde cápsulas de huevo de Concholepas

concholepas (en resultados, publicación 2) y cepa C33 aislada desde sistemas de cultivo de

A. purpuratus obtenidas desde el cepario de colección del laboratorio, fueron seleccionadas

por su fuerte y estable actividad inhibidora contra la cepa patógena V. parahaemolyticus,

evidenciada por el método de doble capa (Dopazo) (Figura 7), observándose un halo de

inhibición de 27 mm en la bacteria C32 y 35 mm en la bacteria C33.

Figura 7: Identificación de actividad inhibidora de la cepa antagonista C32 y C33 contra el

clon pandémico V. parahaemolyticus mediante el método de Dopazo.

Sobre la base del análisis del 16S ARNr, se confirmó que la secuencia del gen de la cepa

C32 pertenece al género Bacillus y compartió el 99% de similitud con Bacillus pumilus

(número de acceso GU191914.1). La cepa C33 corresponde al género Vibrio y compartió el

100% de similitud con Vibrio sp. 52B8 (número de acceso JF346764). Las pruebas

complementarias de identificación de tinción Gram comprueban que la bacteria C32

pertenece al grupo bacteriano de las Gram positivas y la bacteria C33 al de las Gram

negativas (Figura 8).

Figura 8: Tinción Gram de las bacterias, observadas en microscopio de campo claro a

100X de magnificación. (A) bacteria C32 y (B) bacteria C33.

Resultados

43

Los resultados obtenidos con los kit de identificación API coinciden con los resultados

obtenidos en la identificación molecular 16S ARNr, donde el kit API 20E (BioMérieux)

reveló que la bacteria C33 tiene un 98% de identidad con Vibrio sp., y el kit API 50

CHB (BioMérieux) indicó que la bacteria C32 tiene un 96,1% de identidad con Bacillus

pumilus.

La prueba de Kanagawa realizada a las 2 cepas indicaron que ambas bacterias

presentan efectos hemolíticos en los eritrocitos de la sangre usada en el medio de cultivo.

Sin embargo, las pruebas de Kanagawa realizada a los productos orgánicos extraídos desde

las bacterias no revelaron actividad hemolítica (Figura 9).

Figura 9: Actividad hemolítica del cultivo bacteria versus producto orgánico activo aislados

desde las bacterias. C32A y C33A: inóculo de cultivo bacteriano C32 y C33; C32B y C33B:

filtros con el producto activo de las bacterias.

En las pruebas de antibiograma, se observó en ambas bacterias susceptibilidad a todos los

antibióticos usados: Novobiocina (NV, 30 µg); Tetraciclina (TE, 3 0 µg); Amikacina (AK,

30 µg); Cloranfenicol (C, 30 µg) y Estreptomicina (S, 25 µg). Los antibióticos que

presentaron la mayor susceptibilidad en la Cepa C32 fueron Tetraciclina/Novobiocina y

Cloranfenicol/Tetraciclina/Novobiocina para la cepa C33 (Figura 10).

Resultados

44

Figura 10: Antibiograma realizado a las bacterias antagonistas. Novobiocina (NV, 30 µg);

Tetraciclina (TE, 3 0 µg); Amikacina (AK, 30 µg); Cloranfenicol (C, 30 µg) y

Estreptomicina (S, 25 µg).

Las pruebas de susceptibilidad al compuesto vibriostático O/129 fue positivo para la cepa

C33 presentando un halo de inhibición de +/- 23 mm (valor promedio de 3 réplicas) y

negativo para la cepa C32. Los análisis de actividad mediante técnicas de Dopazo,

Kanagawa, antibiograma y susceptibilidad a vibrióstatico fueron reproducibles.

El crecimiento de las cepas en el medio de cultivo TCBS reveló crecimiento de unidades

formadoras de colonia (CFU) de color amarillo en ambas bacterias (Figura 18).

Figura 11: Crecimiento de las bacterias C32 (foto izquierda) y C33 (foto derecha) en medio

de cultivo TCBS.

Resultados

45

3.2. Crecimiento de la cepa antibacteriana y extracción de sus productos

La extracción óptima del producto orgánico activo bacteriano en relación al tiempo de

cultivo reveló que la actividad inhibidora aumentó significativamente en la bacteria C32 a

las 96 horas de cultivo, período en el que el crecimiento bacteriano se encuentra en la fase

estacionaria del cultivo (Figura 12). Respecto a la bacteria C33, la mayor actividad del

compuesto activo se observó entre las 96 y 120 horas de cultivo, cuando el cultivo

bacteriano se encontraba en la fase de decadencia del cultivo (Figura 13). El rendimiento

total del producto orgánico obtenido a partir del cultivo de la bacteria C32 fue de 260 mg/80

L de cultivo y para la bacteria C33 alrededor de 264 mg/80 L.

Figura 12: Evaluación del crecimiento y producción de sustancias antibacterianas de la

bacteria antagonista C32. Las barras indican zona de inhibición y la curva células / ml.

Barra vertical=error estándar.

Resultados

46

Figura 13: Evaluación del crecimiento y producción de sustancias antibacterianas de la

bacteria antagonista C33. Las barras indican zona de inhibición y la curva células / ml.

Barra vertical=error estándar.

3.3. Separación por tamaño y sensibilidad a temperatura del producto antibacteriano

El producto orgánico activo de las bacterias C32 (Figura 14) y C33 (Figura 15) demostró ser

menor que 1 kDa al observarse inhibición del crecimiento del patógeno V. parahaemolyticus

sobre el área del agar que estuvo en contacto con el producto que traspasó las bolsas de

diálisis de 1 y 10 kDa.

Figura 14: Separación por tamaño de los extractos antibacterianos de la cepa C32. Control

(CT): Crecimiento de V. parahaemolyticus en el área expuesta a la bolsa de diálisis con el

medio de cultivo sin la bacteria; Membranas de diálisis (1 kDa) y (10 kDa): Inhibición del

crecimiento de V. parahaemolyticus en el área expuesta a la bolsa de diálisis con el medio

de cultivo y la bacteria. El patógeno fue inoculado en una segunda capa de agar semi-sólido.

Resultados

47

Figura 15: Separación por tamaño de los extractos antibacterianos de la cepa C33. Control

(CT): Crecimiento de V. parahaemolyticus en el área expuesta a la bolsa de diálisis con el

medio de cultivo sin la bacteria; Membranas de diálisis (1 kDa) y (10 kDa): Inhibición del

crecimiento de V. parahaemolyticus en el área expuesta a la bolsa de diálisis con el medio

de cultivo y la bacteria. El patógeno fue inoculado en una segunda capa de agar semi-sólido.

La exposición a 100ºC de los productos orgánicos de las bacterias C32 (Figura 16) y

C33 (Figura 17) no afectó su actividad, observándose inhibición del crecimiento de V.

parahaemolyticus sobre el agar que tiene inmerso el producto bacteriano, demostrando ser

un producto termoestable. Las réplicas realizadas en los ensayos de separación por tamaño y

sensibilidad a temperatura fueron reproducibles.

Figura 16: Estabilidad térmica del extracto antibacteriano de la cepa C32. Control (CT):

Crecimiento de V. parahaemolyticus en agar con el medio de cultivo dialisado sin la

bacteria; Membrana de diálisis (1 kDa) y (10 kDa): Inhibición del crecimiento de V.

parahaemolyticus en agar con extracto antibacteriano obtenido de la diálisis del medio de

cultivo más la bacteria. Todos los tratamientos fueron expuestos 1 hr a 100 ºC. El patógeno

fue inoculado en una segunda capa de agar semi-sólido sobre el agar.

Resultados Resultados

48

Figura 17: Estabilidad térmica del extracto antibacteriano de la cepa C32. Control (CT):

Crecimiento de V. parahaemolyticus en agar con el medio de cultivo dialisado sin la

bacteria; Membrana de diálisis (1 kDa) y (10 kDa): Inhibición del crecimiento de V.

parahaemolyticus en agar con extracto antibacteriano obtenido de la diálisis del medio de

cultivo más la bacteria. Todos los tratamientos fueron expuestos 1 hr a 100 ºC. El patógeno

fue inoculado en una segunda capa de agar semi-solido sobre el agar.

3.4. Purificación y caracterización de los productos antibacterianos

El extracto total (260 mg) obtenido desde 80 litros de cultivo bacteriano se fraccionó en una

primera etapa en una columna de Fase Reversa (FR). A partir de este procedimiento se

obtuvo 8 fracciones para la cepa C32 y 8 fracciones para la cepa C33. De estas fracciones,

se trabajó con la que presentó mayor biomasa considerándolo como producto mayoritario.

Luego de la FR en la cepa C32 se continuó trabajando con la fracción 4 y 5, las que fueron

nuevamente separadas por cromatografía de Fase Normal (FN), consiguiendo 10 fracciones

de la número 4, y 11 de la número 5. Las fracciones activas 9/10 (de la fracción 4) y

11 (de la fracción 5) se separaron por HPLC (Figura 18). Luego, mediante los análisis

espectroscópicos (1H RMN) se identificaron 5 dicetopiperazinas conocidas (Figura 19), las

que fueron: cis-ciclo (L-Phe-L-Val) (Stark y Hofmann 2005, Cabrera et al. 2006), cis-ciclo

(L-Phe-L-Leu) (Cabrera et al. 2006, Tullberg et al. 2006, Takaya et al. 2007), cis-ciclo (L-

Phe-L-Pro) (Stark y Hofmann 2005, Takaya et al. 2007), cis-ciclo (L-Leu-L-Leu) (Huang et

al. 2007) y cis-ciclo (L-Leu-L-Val) (Stark y Hofmann 2005, Erikson et al. 1999).

Resultados

49

Figura 18: Cantidad de producto obtenido por fracción en la metodología usada para la

purificación y caracterización de los productos antibacterianos de la cepa C32. HPLC (High-

performance liquid chromatography) cromatografía líquida de alta resolución.

Resultados

50

Figura 19: Dicetopiperazinas (DKP) previamente publicadas, similares a las aisladas desde

la bacteria Bacillus pumilus: (A) composición estructural C11H20N2O2, (B) composición

estructural C12H22N2O2; (C) composición estructural C14H16N2O2; (D) composición

estructural C15H20N2O2; (E) composición estructural C14H18N2O2.

En la cepa C33, después de la fase reversa se continuó trabajando con la fracción 6, la cual

se refraccionó en una columna Sephadex LH-20, obteniéndose ocho fracciones. La fracción

activa 3 (76,9 mg) se comparó sus espectros de masas 1H and

13C NMR y se identificó un

ácido graso monoinsaturado de cadena larga llamado ácido oleico (OA) como producto

activo. Los datos espectroscópicos del producto fueron los siguientes: IR (KBr, cm-1

): 3000,

2965, 2928, 1710, 1413, 938, 600. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 5,33 (m, 2H); 2,35 (m,

2H); 2,01 (m, 4H); 1,62 (m, 2H); 1,28 (m, 20H); 0,76 (m, 3H). 13

C NMR (CDCl3, 500

MHz): 179,6 (s, -COOH); 130,0 (d, C-9); 129,7 (d, C-10); 34,0 (t, C-2); 31,9 (t, C-16); 29,7

(t, C-7, 12, 14); 29,4 (t, C-13, 15); 29,1 (t, C-4, 5, 6); 27,2 (t, C-8, 11); 24,7 (t, C-3); 22,6 (t,

C-17); 14,1 (q, C-18). EIMS m/z 282 ([M]+; 6,6); 265 (18); 264 (21); 257 (11); 111 (21); 97

(51); 83 (96); 82 (39); 81 (52); 70 (47); 69 (99); 67 (49); 60 (47); 57 (50); 56 (41); 55 (100).

HREIMS m/z [M]+ 282,2552 (calcd.C18H34O2, 282,2559) (en resultados, publicación 4). La

metodología seguida para el aislamiento e identificación del producto activo proveniente de

la cepa C33 se esquematiza en la figura 20.

Resultados

51

Figura 20: Cantidad de producto obtenido por fracción en la metodología usada para la

purificación y caracterización de los productos antibacterianos de la cepa C33. RMN

(resonancia magnética nuclear de protón y carbono 13); EM (espectroscopía de masas).

A los productos aislados desde la bacteria C32 y C33 se les evaluó la inhibición del

crecimiento de V. parahaemolyticus mediante el método de disco de difusión (Figura 21).

Resultados

52

Figura 21: Inhibición del crecimiento de V. parahaemolyticus, mediante el método de disco

de difusión. Producto de la bacteria C33 (Foto izquierda) y producto de la bacteria C32

(Foto derecha).

3.5. Inhibición de V. parahaemolyticus por productos antibacterianos

Se evaluó la inhibición del crecimiento del patógeno V. parahaemolyticus en diferentes

concentraciones de mg/ml (0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,5 y 2) del producto

antibacteriano. La actividad inhibidora del producto de ambas bacterias mostró inhibición

del patógeno en todas las concentraciones evaluadas con diferencias significativas respecto

al control (cultivo de V. parahaemolyticus sin la adición de productos y solvente),

observándose mejor inhibición entre 0,4-1 mg/ml, durante las primeras 48 horas de cultivo

(Figura 22). La actividad inhibidora del producto antibacteriano comercial mostró inhibición

del V. parahaemolyticus en todas las concentraciones tratadas con diferencias significativas

respecto al control. Las réplicas de cada tratamiento fueron reproducibles, no observándose

diferencias significativas. La mejor inhibición se observó a una concentración de 1 mg/ml en

AO y 1,5 mg/ml en DKP. El ácido oleico presentó mejor inhibición en todas las

concentraciones analizadas durante las 48 horas (Figura 23). Igualmente se comprobó la

actividad inhibidora del crecimiento de V. parahaemolyticus del AO (Sigma-Aldrich) y DKP

(Sigma-Aldrich) comercial por el método de disco de difusión antes mencionado (Figura

24). En la Figura 25 se puede observar la inhibición en medio líquido del patógeno en

presencia del producto antibacteriano extraído desde las bacterias.

Resultados

53

Figura 22: Crecimiento del V. parahaemolyticus a diferentes concentraciones del producto

activo obtenidos desde la cepa C32 y C33, después de 48 horas de cultivo.

Figura 23: Crecimiento del V. parahaemolyticus en SW a diferentes concentraciones de

AO y DKP comerciales, después de 48 horas de cultivo.

Resultados

54

Figura 24: Inhibición del crecimiento de V. parahaemolyticus expuesto a dicetopiperazina

(foto izquierda) y ácido oleico (foto derecha) comerciales (ambos). El patógeno fue

sembrado en extendido sobre el agar.

Figura 25: Crecimiento de V. parahaemlyticus en presencia de producto antibacteriano a

las 48 horas de tratamiento. Vp (V. parahaemolyticus concentración inicial 1x103

células/ml); M (Control Metanol medio de cultivo con Vp más el mismo volumen de

metanol usado para diluir el producto antibacteriano); PA (Producto antibacteriano) y C

(Cloranfenicol).

Resultados

55

3.6. Actividad del ácido oleico y dicetopiperazina en A. purpuratus infectados con V.

parahaemolyticus

El objetivo de esta experiencia fue probar la reducción de la carga bacteriana del patógeno

V. parahaemolyticus en ostiones A. purpuratus usando AO y DKP como antibacterianos.

En una primera etapa se trabajó en volúmenes pequeños con los productos extraídos desde

las bacterias Vibrio sp. y B. pumilus debido a la baja concentración del producto

bacteriano. La identificación de la reducción de la carga del patógeno en el ostión se evaluó

mediante el análisis de NMP, cuyos resultados mostraron una disminución de la carga de

patógenos en los tejidos del ostión A. purpuratus a las 24 horas de tratamiento respecto al

tratamiento control de 5.6 x 103 (NMP/100 gr de ostión) en los productos de la bacteria B.

pumilus y 2.6 x 103 (NMP/100 gr de ostión) de la bacteria Vibrio sp., respecto al control

1 x 104 (NMP/100 gr de ostión) (Figura 26).

Figura 26: Evaluación de la actividad inhibidora de los productos aislados desde las

bacterias antagonistas contra el patógeno V. parahaemolyticus (Vp) evidenciada con la

reducción del gen tdh indicadores de la presencia del patógeno en el tejido del ostión. NMP

(número más probable de bacterias patógenas por 100 gr de ostión); CT (medio de cultivo

con Vp sin producto antibacteriano); P-C32 (medio de cultivo con Vp+producto de C32) y

P-C33 (medio de cultivo con Vp+producto de C33).

Resultados

56

Como segunda etapa se trabajó con compuestos AO y DKP que se encontraron

disponibles comercialmente. Los resultados del NMP demostraron que los productos

comerciales redujeron la carga del patógeno V. parahaemolyticus en el tejido del ostión A.

purpuratus después 48 horas de tratamiento. Se observó 100% de sobrevivencia de los

ostiones durante las 48 horas en todos los tratamientos, con excepción del tratamiento

control con cloranfenicol en el que se observó 27% de mortalidad de ostiones a las 24 horas

y 100% de mortalidad a las 48 horas, demostrándose la toxicidad del cloranfenicol, distinto a

lo observado en los tratamientos con los productos comerciales AO y DKP. En el

tratamiento CT (ostiones sin infectar y sin tratar con AO y DKP) se observó la presencia del

gen tdh a las 48 horas de cultivo indicando que los ostiones eran portadores del patógeno V.

parahaemolyticus. El tratamiento Vp (ostiones infectados por 18 horas con el patógeno)

comprueba que los ostiones fueron infectados y que la concentración del patógeno aumento

a las 48 horas de cultivo. El tratamiento CL (ostiones tratados con cloranfenicol) demostró

su efecto antibiótico al no observarse presencia del gen tdh durante el experimento. El

tratamiento de los ostiones infectados con DKP comercial fue el que presentó mejor efecto

antibiótico contra el patógeno al observarse una disminución de 4,7x104

a 0 (NMP/100 gr de

ostión) a las 48 horas de cultivo. En el tratamiento AO igualmente se observó una

disminución de 4,7x104 a 91 (NMP/100 gr de ostión) a las 48 horas de cultivo (Figura 27).

Resultados

57

Figura 27: Evaluación de la actividad inhibidora de los productos comerciales contra el

patógeno V. parahaemolyticus (Vp) evidenciada con la reducción del gen tdh indicadores de

la presencia del patógeno en el tejido del ostión. NMP (número más probable de bacterias

patógenas por 100 gr de ostión); CT (ostión sin infectar y sin producto antibacteriano); Vp

(ostión con Vp sin producto antibacteriano); CL (ostión con Vp+cloranfenicol); DKP (ostión

con Vp+dicetopiperazina); AO (ostión con Vp+ácido oleico).

3.7. Publicaciones

Publicación 1: Yanett Leyton y Carlos Riquelme. 2008. Vibrios en los sistemas marinos

costeros. Revista de Biología Marina y Oceanografía 43(3): 441-456

Publicación 2: Yanett Leyton and Carlos Riquelme. 2010. Marine Bacillus spp. associated

with the egg Capsule of Concholepas concholepas (Common Name “Loco”) have an

inhibitory activity toward the pathogen Vibrio parahaemolyticus. Microbial Ecology

60(3): 59. DOI 10.1007/s00248-010-9674-x.

Publicación 3: Yanett Leyton, Rodrigo Varas-Psijas and Carlos Riquelme. 2011. Probiotic

activity of bacteria associated with egg capsules of Concholepas concholepas (common

name “Loco”). Aquaculture Research. 1-7. DOI: 10.1111/j.1365-2109.2011.02912.x

Publicación 4: Yanett Leyton, Jorge Borquez, José Darias, Mercedes Cueto, Ana Díaz-

Marrero and Carlos Riquelme. 2011. Oleic acid produced by a marine Vibrio spp. acts as

an anti-Vibrio parahaemolyticus agent. Marine Drugs. 9: 2155-2163.

DOI:10.3390/md9102155

Publicación 5: Yanett Leyton, Jorge Borquez, José Darias, Mercedes Cueto, Ana Díaz and

Carlos Riquelme. 2012. Diketopiperazines produced by a Bacillus sp. inhibit Vibrio

parahaemolyticus. En prensa en Aquaculture Research and Development.

Publicación 6: Yanett Leyton and Carlos Riquelme. 2012. Oleic acid and

Diketopiperazine produced by marine bacteria reduce the load of Vibrio parahaemolyticus

in the scallop Argopecten purpuratus. Enviada a Aquaculture Research.

Resultados

58

3.7.1. Publicación 1

Título: Vibrios en los sistemas marinos costeros.

Autores: Yanett Leyton y Carlos Riquelme

Resultados

59

3.7.2. Publicación 2

Título: Marine Bacillus spp. associated with the egg capsule of Concholepas concholepas

(Common Name “Loco”) have an inhibitory activity toward the pathogen Vibrio

parahaemolyticus.

Autores: Yanett Leyton y Carlos Riquelme

Resultados

60

3.7.3. Publicación 3

Título: Probiotic activity of bacteria associated with egg capsules of Concholepas

concholepas (common name “Loco”).

Autores: Yanett Leyton, Rodrigo Varas-Psijas y Carlos Riquelme.

Resultados

61

3.7.4. Publicación 4

Título: Oleic Acid produced by a marine Vibrio spp. acts as an anti-Vibrio

parahaemolyticus agent

Autores: Yanett. Leyton, Jorge Borquez, José Darias, Mercedes Cueto, Ana Díaz y Carlos

Riquelme.

Resultados

62

3.7.5. Publicación 5

Título: Diketopiperazines produced by a Bacillus sp. inhibit Vibrio parahaemolyticus

Autores: Yanett. Leyton, Jorge Bórquez, José Darias, Mercedes Cueto, Ana Díaz y Carlos

Riquelme.

Resultados

63

3.7.6. Publicación 6

Título: Oleic acid and Diketopiperazines produced by marine bacteria reduce the load of

Vibrio parahaemolyticus in the scallop Argopecten purpuratus.

Autores: Yanett Leyton y Carlos Riquelme.

Resultados

64

4. Discusión

65

4.1. Actividad probiótica de bacterias marinas

Los Vibrios son un grupo de bacterias que tienen múltiples interacciones con los demás

componentes del ecosistema marino. Varias especies pertenecientes a este grupo son

indispensables para la supervivencia y subsistencia de numerosos organismos marinos

(Leyton y Riquelme 2008b). No obstante, se pueden encontrar también muchos Vibrios

patógenos. La interacción entre cepas bacterianas antagonistas y patógenos marinos ha sido

considerada de interés para la acuicultura (Riquelme et al. 1997, Ochoa-Solano y Olmos-

Soto 2006, Merrifield et al. 2010), por los efectos positivos que estas bacterias probióticas

ejercerían en los cultivos de organismos de importancia comercial, donde su producción y

comercialización se ven afectadas por la contaminación de bacterias patógenas (García de la

Banda et al. 2010, 2011) como el V. parahaemolyticus, entre otros (Yi-Cheng y Chengchu

2007; Balcázar et al. 2007; Leyton y Riquelme 2010).

Debido a esto, desde hace 15 años se trabaja en el desarrollo y aplicación de

bacterias probióticas antagonistas, ya que éstas a través de la secreción de metabolitos

permiten desplazar o inhibir el crecimiento de otras bacterias. Estos efectos inhibidores

pueden deberse a la producción de antibióticos, bacteriocinas, lisozimas, proteasas y/o

peróxido de hidrógeno, así como la alteración de valores de pH por la producción de ácidos

orgánicos (Tao 2009). Parés y Juáres (1997), discuten que las moléculas antibióticas

producidas por bacterias suelen ser péptidos con capacidad de inhibir procesos de los

metabolitos primarios esenciales. Existen evidencias de los beneficios que produce la

aplicación de bacterias probióticas en sistemas de cultivo (García de la Banda et al. 2010,

2011). Por ejemplo, las bacterias del género Bacillus han demostrado tener propiedades

probióticas (Avella et al. 2010, Cutting 2011), como beneficios en la sobrevivencia,

tolerancia a estrés y estado inmunológico de larvas de camarón (Liu et al. 2010),

propiedades antibacterianas contra el patógeno V. harvey (Gullian et al. 2004), V.

alginolyticus, V. parahaemolyticus (Balcázar et al. 2007) y Legionella pneumophila

(Temmerman et al. 2007), y como bioinsecticidas (Ben Khedher et al. 2011). Las enzimas

provenientes de Bacillus son muy eficaces en transformar en unidades más pequeñas una

gran variedad de carbohidratos, lípidos y proteínas (Ochoa-Solano y Olmos- Soto, 2006),

además crecen de manera eficiente con muy bajo costo de carbono y fuentes de nitrógeno

(Siefert et al. 2000). Al-Dohail et al. (2011) indican que el uso del probiótico Lactobacillus

Discusión

66

acidophilus es un buen candidato para usarlo como biocontrol contra bacterias patógenas

como Staphylococcus xylosus, Aeromonas hydrophila y Streptococcus agalactiae en cultivo

de peces juveniles (Clarias gariepinus). Igualmente se han atribuido propiedades benéficas a

bacterias del género Vibrio, por ejemplo, V. halioticoli es la especie dominante en

organismos sanos de Haliotis discus discus, H. diversicolor aquatilis, H. diversicolor

diversicolor y H. midae. Sawabe et al. (2003) sugieren que la abundancia de poblaciones de

V. halioticoli en el intestino de abalón puede ser importante para la conversión de alginato a

ácido acético lo que contribuiría a la nutrición del hospedador. Los Vibrios producen ácidos

grasos poliinsaturados, nutrientes esenciales para muchos organismos marinos en la cadena

trófica (Nichols 2003). Además, son conocidos por participar en muchas de las vías de

reducción del nitrógeno como: fijación del nitrógeno gaseoso a nitrógeno; reducción del

nitrato a dióxido de nitrógeno o amonio (Herbert 1999). La asimilación del nitrato es

requerida para el transporte a través de la membrana celular (Chou et al. 1999). Por otro

lado, los Vibrios expresan enzimas extracelulares que participan en la degradación del

fósforo para la producción primaria (Thompson et al. 2006). La actividad enzimática

periplasmática contribuye a la función de los Vibrios en la remineralización del fósforo

orgánico e inorgánico y pueden servir para enriquecer su entorno de nutrientes. Además, son

capaces de hidrolizar polímeros tales como quitina (Thompson et al. 2006), que puede ser

uno de los procesos enzimáticos extracelulares más importantes en el ambiente marino (Li y

Rosemam 2004). No obstante, habiendo antecedentes del efecto probiótico de varias

bacterias, es importante identificar los metabolitos activos para evaluar la factibilidad de

usarlos en sistemas de cultivo como suplemento al aportar con requerimientos nutricionales

que favorezcan la sobrevivencia de los organismos y además para conocer el o los

metabolitos que tienen efectos antibióticos contra los patógenos, lo que permitiría

comprender mejor su ecología.

En base a esto nace el interés de este estudio por buscar bacterias nativas con

potencialidades probióticas, estudios preliminares permitieron comprobar la presencia de

bacterias en el interior de cápsulas (huevos) de Concholepas concholepas, con resultados

positivos considerando que no hay información respecto a la microbiota asociada a C.

concholepas, ya sea, para larvas o adultos. Por ejemplo, un 71% de los tratamientos de

larvas expuestas a las diferentes cepas bacterianas aisladas tuvieron sobrevivencia larval

Discusión

67

mayor al control, esto demuestra que la mayoría de las cepas aisladas desde las cápsulas no

son deletéreas para las larvas, si no lo contrario, cumplirian alguna función benéfica para

ellas. Posterior a esta investigación, se evidenció que 8 de las bacterias aisladas desde

cápsulas (huevos) de C. concholepas tienen efectos inhibidores contra el clon pandémico de

V. parahaemolyticus, las que resultaron ser en su totalidad del género Bacillus (una de éstas

fue usada en esta tesis). Según los análisis filogenéticos, los Bacillus aislados pertenecen a

las especies B. pumilus, B. lincheniformis o Bacillus sp. (Leyton y Riquelme 2010).

Las cepas bacterianas usadas en esta tesis se escogieron por su capacidad de inhibir

el crecimiento del patógeno V. parahaemolyticus. Según la base de datos GenBank, la

bacteria C33 resultó tener como especie más cercana (primer hit), a la especie Vibrio sp.

52B8 (JF346764.1) con 100% de similitud, la especie siguiente (segundo hit) correspondería

a V. neptunius (Leyton et al. 2011b) la misma especie presentó antagonismo contra

patógenos en el trabajo de Wietz et al. (2010). Los resultados demostraron que los productos

aislados son metabolitos activos, excretados durante el término de la fase estacionaria,

período en el que según Parés y Juárez (1997), el crecimiento del microorganismo se reduce

y se desarrolla a su máximo nivel la información genética necesaria para producir

metabolitos secundarios (MS) con capacidad de inhibir procesos metabólicos primarios

esenciales. El tamaño molecular de las sustancias activas fue menor a 1000 Da,

encontrándose dentro del rango del tamaño de los MS según Parés y Juárez (1997) y de

Hancok and Scott (2000), quienes indican que los péptidos antimicrobianos están

comprendidos entre 12 a 50 aminoácidos.

El uso de metabolitos activos debe garantizar seguridad en el ecosistema marino y en

la ingesta de organismos comerciales tratados y/o consumidor final como el hombre. En este

trabajo se probó la actividad hemolítica de las bacterias vivas versus su producto

antibacteriano, en el que se comprobó que los productos extraídos de la bacteria no

presentan actividad hemolítica al compararlo con las bacterias vivas, indicando que no se

encuentra presente la hemolisina directa termoestable (TDH). Las moléculas identificadas

como los metabolitos activos mayoritarios fueron ácido oleico (AO) en Vibrio sp. (C33) y 5

dicetopiperazines (DKP) en B. pumilus (C32).

Discusión

68

4.2. Antecedentes bioactivos de dicetopiperazines (DKP)

Las DKP son derivados de piperazinas, estas últimas se conocen hace más de un siglo y sólo

recientemente las 2,5-dicetopiperazinas han atraído la atención por sus propiedades

biológicas antibacterianas (Park et al. 2006; Ren et al. 2010). Las DKP se han aislado desde

esponjas marinas como Dysidea sp. (Ren et al. 2010), hongos marinos como Chromocleista

sp (Park et al. 2006), bacterias Gram negativas (Jayatilake et al. 1996) y bacterias Gram

positivas (Stierle et al. 1998). Entre las propiedades atribuibles a DKP, estos metabolitos

están dotados de propiedades citotóxicas, antineoplásicas (Kikuchi et al. 1983),

antileucémicas (Varoglu 1997), antitumorales (Kanzaki 2000), antivirales (Sinha et al. 2004)

y antibacterianas (Fdhila et al. 2003). Otra característica interesante de las DKP se debe a su

función en el mecanismo de señalización celular bacteriano llamado quorum sensing (QS),

donde se ha demostrado que las DKP son capaces de activar o desactivar el sistema de

LuxR, receptor que promueve la expresión de un grupo de genes para regular respuestas

fisiológicas hacia una señal química (Degrassi et al. 2002). Las DKP constituyen una nueva

familia de compuestos de señalización, sin embargo, el papel exacto que desempeñan en el

QS aún no se establece. No obstante, se destaca su potencialidad para prevenir la formación

de biopelículas bacterianas, por intermedio de pequeñas moléculas solubles que actúan como

auto-inductores, generando un sistema de protección contra agentes tóxicos para las

bacterias que la conforman y/o prevención de la formación de biopelículas bacterianas

(Abraham 2005, De Kievit y Iglewski 2000). Es importante destacar el estudio realizado por

Michel y Blanc (2001) que indican que la capacidad de las DKP aisladas no pierden su

actividad frente a cambios de salinidad y temperatura del medio, al contrario de lo que

ocurre con antibióticos comerciales como cloranfenicol, florfenicol, flumequina y

trimetoprim/ sulfadiazina.

Entre los estudios que describen la presencia de DKP se destacan varios ejemplos

como el de Uhegbu y Trischman (2005) donde el extracto orgánico purificado del cultivo de

B. pumilus tiene como compuesto activo a leucina y prolina, presentando actividad contra la

bacteria marina Mycobacterium marinum. Kelecom (2002) menciona que metabolitos

aisladas desde Bacillus son derivados de la vía biosintética nitrogenada, los que podrían ser,

entre otros, péptidos cíclicos. Fdhila et al. (2003) demuestran que las DD-

dicetopiperazinas obtenidas desde bacterias aisladas del bivalvo Pecten maximus

Discusión

69

presentaron actividad inhibidora contra el patógeno V. anguillarum. Resultados similares

son descritos por Vega et al. (2004), quienes encontraron 5 DKP extraídas desde bacterias

marinas Roseobacter sp. (CECT 5718) y R. gallaecensis (CECT 5719), aisladas desde

cultivos larvarios de P. maximus, quienes presentaron actividad antibateriana contra V.

anguillarum, cuyos compuestos activos fueron: Z54: ciclo(D)-prolina-(D)-leucina; Z56:

ciclo(D)- prolina-(D) -Isoleucina; Z57: ciclo(D)-prolina-(D)-valina; Z59: ciclo(D)-prolina-

(D) -fenilalanina y B717: ciclo(D)-trans-4-hidroxiprolinil-(D)-fenilalanina. La adición de

estos compuestos en una concentración de 0,5 mg/ml a cultivos de moluscos, crustáceos y

peces, aumenta su supervivencia en valores que oscilan entre el 12% y el 33%. Estos autores

postulan que la actividad inhibidora es comparable a la de los antibióticos utilizados

actualmente en acuicultura, lo que constituye un buen antecedente para el uso de DKP en

sistemas de cultivo intensivo.

Las diferentes acciones biológicas reconocidas en las DKPs las hacen aún más

interesantes para su investigación como potencial clínico (Milne y Kilian 2010) y acuícola.

Además, debido a su estructura rígida, naturaleza quiral y variadas cadenas laterales, son

atractivas para el diseño de fármacos (Martins y Carvalho 2007).

4.3. Antecedentes de la bioactividad de los ácidos oleicos (AO)

La acción antibacteriana de los ácidos grasos se suele atribuir a ácidos grasos insaturados de

cadena larga como el ácido oleico, ácido linoleico y el ácido linolénico, cuyo mecanismo de

acción es inhibir la síntesis de ácidos grasos (Zheng et al. 2005). Grasian et al. (2011)

igualmente atribuyen actividad antibacteriana contra el patógeno V. parahaemolyticus

a ácidos grasos de cadena corta (acético, propiónico y butírico) al disminuir la mortalidad en

el cultivo de Artemia franciscana. La producción de ácidos grasos poli insaturados (PUFAs)

mayormente se ha caracterizado a partir de microalgas (Nichols 2003).

El AO es un ácido graso monoinsaturado de cadena larga, denominado omega (ω) 9

debido a la posición de su doble enlace y está compuesto por 18 átomos de carbono

(Nicolosi et al. 2004). En bacterias, la relación entre la estructura y la actividad

antimicrobiana del AO no está clara, parece que el número y posición de dobles enlaces, así

como tener tanto una cabeza hidrofílica y una cola hidrofóbica podría influir en la actividad

Discusión

70

antimicrobiana afectando la membrana bipolar de la pared celular bacteriana actuando como

una barrera contra sustancias hidrofóbicas (Balcázar et al. 2007). El AO es conocido por

ser bactericida de importantes microorganismos patógenos (Seidel y Taylor 2004, Sun et

al. 2003), incluyendo Staphylococcus aureus (Farrington et al. 1992), Helicobacter pylori

(Sun et al. 2003), y Mycobacteria (Seidel y Taylor 2004) y se ha sugerido que proporciona

numerosos beneficios para la salud humana. Su uso moderado puede bajar los niveles de

colesterol y reducir la arteriosclerosis (Nicolosi et al. 2004). Además, participa en la síntesis

de fosfolípidos de la membrana, contribuye en la fisiología de la membrana celular, en

mecanismos tales como transducción de señales y proliferación celular (Ziboh et al. 2000).

Lunde et al. (2009) sugieren que el efecto antibacteriano de los AO se podría relacionar a la

capacidad de penetrar las membranas celulares de bacterias y hongos.

Huang et al. (2010) reportó por primera vez una amplia actividad antibacteriana de AO

contra microorganismos orales incluyendo Streptococcus mutans, Aggregatibacter

actinomycetemcomitans, Candida albicans, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium

nucleatum y Streptococcus gordonii sugiriendo que se necesitan más estudios para

demostrar que AO se puede usar como una biomolécula complementaria para incorporarla

en las personas a través de diversos vectores para atacar in situ infecciones orales, caries y/o

enfermedades periodontales, usando diferentes métodos como goma de mascar, pasta de

dientes, enjuague bucal, entrega de flúor, jugos, yogurt y leche. Por otro lado,

Cardoso et al. (2010) proponen que el AO modula la inflamación en heridas y aumenta la

respuesta de reparación in vivo en lesiones cutáneas y sugieren que éste podría ser usado

como tratamiento para heridas cutáneas especialmente en quemaduras, diabetes o úlceras.

4.4. Actividad de ácido oleico (AO) y dicetopiperazinas (DKP) en bivalvos Argopecten

purpuratus

Los resultados del Número Más Probable (NMP) en ostiones infectados y tratados con

producto antibacteriano de las bacterias Vibrio sp (AO) y B. pumilus (DKP), revelaron

disminución de la bacteria patógena en el tejido de los ostiones respecto al tejido de los

tratamientos control, demostrando que la actividad del producto se mantiene dentro del

organismo. El uso de productos comerciales permitió usar volúmenes y número de

Discusión

71

organismos mayores al que se trabajó en el experimento con producto antibacteriano

(debido a la reducida cantidad de producto que se puede obtener de la extracción

bacteriana). El ácido oleico es un producto fácil de obtener (aproximadamente

$80.000+IVA/litro). Sin embargo, para el producto DKP no se encontró una molécula

comercial con igual estructura química, no obstante, en el mercado existen otros

derivados (y con valores mucho más altos comparado con el ácido oleico), por lo que se usó

uno cuya estructura molecular fuera lo más cercana a la obtenida desde la bacteria C32 (B.

pumilus). Los resultados de los productos comerciales revelaron una disminución en el NMP

de la bacteria patógena en el tejido de ostión, avalando los resultados preliminares obtenidos

en el experimento con los productos bacterianos.

El antibiótico cloranfenicol usado como control en los tratamientos (a una

concentración de 1 mg/ml), muestra un aumento significativo en la mortalidad bacteriana en

los tratamientos. Además, se observó a las 48 horas un 100% de mortalidad de los

individuos tratados, no ocurriendo lo mismo en los tratamientos en los cuales se usó 1

mg/ml de metabolitos activos bacterianos, en donde hubo 0% de mortalidad de ostiones.

Respecto al antibacteriano comercial similar al DKP extraído de la bacteria, se observó que

éste tiene efecto antibiótico similar al cloranfenicol, mostrando una disminución en el

NMP de bacterias patógenas en los tejidos de ostión, con la diferencia que no se

obtuvieron organismos muertos durante las 48 horas de experimento. Esto indica que

este producto comercial es un buen candidato para combatir patógenos, garantizando

inocuidad en los organismos.

Considerando los resultados obtenidos en este estudio, respecto a la actividad

inhibidora de los productos obtenidos desde las bacterias y por otro lado, su baja producción

en las condiciones de cultivo actual, es importante evaluar futuras investigaciones para

optimizar la producción bacteriana manipulando diferentes parámetros con el objetivo de

alcanzar mejor rendimiento del metabolito deseado. En el medio de cultivo M9 usado en

este trabajo para el Vibrio sp (C33) y M9 modificado para B. pumilus (C32), la mejor

extracción de productos activos se obtuvo a las 96 horas de cultivo con una producción

aproximada de 3,3 mg/L en ambas bacterias. Sin embargo, permanece abierta la posibilidad

de considerar nuevas modificaciones en los medios de cultivo, como la incorporación de

Discusión

72

iones metálicos tales como magnesio, hierro y zinc conocidos por ser claves para el

desarrollo de MS en bacterias del género Bacillus (Parés y Juárez 1997). O desarrollar

nuevas tecnologías para la optimización industrial de la producción de estos antibióticos,

mediante la síntesis de estas moléculas, o bien la aplicación de técnicas de ingeniería

genética o utilización de tratamientos mutagénicos, tal como sucedió en el aumento de la

producción de penicilina en Penicillium chrysogenum desde 5 mg/l en 1941 a 10.000 mg/l

en 1970 en función de la selección de mutantes superproductores (Parés y Juárez 1997). Las

condiciones de cultivo dependerán de las condiciones óptimas de crecimiento de la cepa,

tales como, temperatura, aireación, pH, tiempo de incubación y/o nutrientes, que pueden

afectar la producción del metabolito deseado (Betina 1994, Shimada et al. 1996). Para ello,

la cepa de interés se puede cultivar en una gran variedad de condiciones en paralelo y luego

evaluar las diferencias en sus espectros metabólicos (Bills et al. 2008, Knight et al. 2003).

De esta forma, se podrá facilitar el desarrollo de productos a mayor escala para su futura

comercialización. Es por esto que se debe aprovechar las bacterias marinas con actividad

antagonista que crecen en medios clásicos (Staley y Konopka 1985, Ward et al. 1990), para

aislar y purificar con las herramientas de elucidación estructural existentes (Penesyan et al.

2010) y usar estas moléculas activas contra patógenos.

Si bien son muchas las variables que se deben seguir investigando para comprender la

ecología del clon pandémico de V. parahaemolyticus, el análisis de factores ambientales y

evolución de las pandemias brindará la posibilidad de comprender las causas y mecanismos,

por los cuales, este microorganismo se disemina en lugares específicos. Además, la baja

incidencia de casos clínicos en la región de Antofagasta, otorga la oportunidad para analizar

los factores que favorecen e impiden un brote epidemiológico. Esta investigación evidencia

por primera vez que las cepas de Vibrio sp. y B. pumilus tienen importantes metabolitos

benéficos como ácido oleico y dicetopiperazinas que reducen la carga del patógeno

V. parahaemolyticus en ejemplares adultos de A. purpuratus, sin afectar la viabilidad de los

bivalvos. Estos resultados significan un aporte a lo discutido por Bhatnagar y Kim (2010),

al indicar que los microorganismos marinos no han recibido la atención que merecen,

existiendo una visión muy limitada de las capacidades y potencial bioactivo en la literatura.

El efecto antibacteriano de las bacterias se puede generar como consecuencia de una

interacción ecológica que puede utilizar para competir con otras bacterias u organismos que

Discusión

73

se encuentren presentes en su mismo hábitat. El uso de estos productos antibacterianos en

sistemas de cultivo como método de depuración podrá actuar como agente de biocontrol

contra V. parahaemolyticus, optimizando el sistema de cultivo. De esta forma, permitirá

asegurar la producción de organismos comerciales libres de este patógeno, además, de

favorecer la economía del mercado interno y externo, constituyendo un aporte no sólo en la

industria acuícola sino también a nivel clínico. Por otro lado, estos resultados validan aún

más el potencial probiótico ya reportado de la cepa bacteriana B. pumilus (Leyton et al.

2010, 2011a) y Vibrio sp. (Jorquera 1999, Leyton et al. 2011b). Respecto a la aplicación de

probióticos en acuicultura, Merrifield et al. (2010) plantean que los estudios son muy

variados, y que es difícil planificar una estrategia de aplicación eficaz a nivel comercial, por

lo que, sugieren que futuros estudios deberían centrarse en proporcionar aplicaciones

prácticas a escala industrial.

Finalmente, La investigación realizada en esta tesis es una conjunción de

microbiología básica y aplicada, cuyos resultados obtenidos representan un aporte a

las investigaciones recientes sobre bacterias marinas productoras de sustancias

inhibidoras y podrá servir como base para estudiar la naturaleza de las sustancias

inhibidoras de otras bacterias antagonistas para su posible aplicación en acuicultura

intensiva.

Discusión

74

5. conclusiones

75

La identificación de las bacterias inhibidoras del patógeno V. parahaemolyticus

revelaron que C33 es Vibrio sp y C32 B. pumilus.

Las sustancias secretadas por las bacterias correspondieron a los metabolitos

ácido oleico para C33 y dicetopiperazina para C32.

Los metabolitos aislados desde las bacterias son menores de 1kDa y

termoestables.

Los análisis con metabolitos comerciales de ácido oleico y dicetopiperazinas

confirmaron que estos presentaron actividad inhibidora del crecimiento del

patógeno V. parahaemolyticus.

Finalmente, se puede concluir que la investigación realizada responde a la

hipótesis afirmada que bacterias marinas nativas tienen potencial inhibidor de

V. parahaemolyticus y sus metabolitos secretados podrían ser usados en el

control de este patógeno.

Conclusiones

76

6. Perspectivas futuras de

investigación, innovación y aplicación

77

A continuación, se expresan algunas propuestas basadas en los resultados obtenidos de esta

tesis, como nuevas líneas de investigación, innovación y aplicación. Estas perspectivas se

pueden tomar considerando las bacterias ya estudiadas en esta tesis u otras.

6.1. Nuevas estrategias para combatir bacterias patógenas del género Vibrio.

En la revisión bibliográfica expuesta en esta tesis se manifiesta que los metabolitos

secundarios estarían afectando las respuestas fisiológicas de las bacterias, alterando la

comunicación celular o QS usadas para supervisar su densidad poblacional, sincronizar su

comportamiento y actuar recíprocamente (Van et al. 2007). Se propone como futura

investigación confirmar que las bacterias usadas en esta tesis secretarían los metabolitos

activos que interrumpen el QS como una estrategia de competencia por espacio. Lo

propuesto es posible debido a que se ha documentado la capacidad de monitorear la

densidad celular y regular la expresión de genes de virulencia por medio de QS para el

patógeno Vibrio parahaemolyticus (Henke y Bassler 2004).

6.2. Optimización de cultivos bacterianos a mayores escalas

Una de las grandes problemáticas enfrentadas en esta tesis se debió a la baja producción

obtenida del producto activo por litro de cultivo. Para mejorar esta producción se plantea la

necesidad de evaluar sistemas masivos de cultivos bacterianos (fermentadores industriales)

que permitan manejar mayores volúmenes y manipulación. Sumado a esto, se debe

investigar la optimización de los medios de cultivos propuestos en esta tesis como la adición

de nuevos nutrientes que permitan optimizar la producción del metabolito deseado.

Perspectivas futuras de investigación, innovación y aplicación

78

6.3. Aplicación del uso de productos activos en larvas y otros organismos de

importancia comercial.

Esta tesis deja abierta la posibilidad de aplicar y evaluar el comportamiento del producto

activo en larvas y otros organismos de importancia comercial con diferente metabolismo y

estado de desarrollo. Por lo cual, se requiere de ensayos previos de toxicidad. Estudiar las

potencialidades benéficas, mecanismos de acción y optimización de la producción de estas

moléculas activas es un desafío que se debe considerar en futuras investigaciones para

combatir a este patógeno el cual nos permitiría también comprender mejor su ecología.

Así como también, evaluar la utilización de estos metabolitos obtenidos en sistemas

de depuración en cultivos de invertebrados marinos donde se requiere de breve tiempo (12 a

24 horas) para reducir patógenos.

6.4. Síntesis de los productos activos

Una alternativa en particular para la producción de la sustancia activa dicetopiperazina

(DKP) encontrada en este estudio y la cual no está disponible en el mercado, sería estudiar

la factibilidad de realizar su síntesis química.

En base a estos resultados se espera generar interés en la comunidad científica dedicada al

estudio de probióticos para dilucidar la estructuras química y mecanismos de acción de

moléculas activas bacterianas, mas allá de identificar actividad antagonistas.

Perspectivas futuras de investigación, innovación y aplicación

79

7. Anexos

80

Anexo 1: Publicación: Yanett E. Leyton, Carlos E. Riquelme. 2008. Use of specific

bacterial-microalgal biofilms for improving the larval settlement of Argopecten

purpuratus (Lamarck, 1819) on three types of artificial spat-collecting materials.

Aquaculture 276 (2008) 78–82.

Anexo 2: XVIII Congreso Latinoamericano de Microbiología. Pucón 2006

Anexo 3: XII Congresso Latino-Americano de Ciências do Mar - XII COLACMAR.

Florianopolis, Brasil 2007.

Anexo 4: XIX Congreso Chileno de Microbiología y el IV Congreso Chileno de

Microbiología e Higiene de los Alimentos. Viña del Mar, Chile 2007.

Anexo 5: XXXI Congreso Sociedad de Micobiología de Chile. Santa Cruz, Chile 2009.

Anexo 6: ISME-International Society for Microbial Ecology. Seattle , USA 2010.

Anexo 7: XXXII Congreso Chileno de Microbiología. Antofagasta, Chile 2010.

Anexos

81

7.1. Anexo 1: Publicación: Yanett E. Leyton, Carlos E. Riquelme. 2008. Use of specific

bacterial-microalgal biofilms for improving the larval settlement of Argopecten

purpuratus (Lamarck, 1819) on three types of artificial spat-collecting materials.

Aquaculture 276 (2008) 78–82.

Anexos

82

7.2. Anexo 2: XVIII Congreso Latinoamericano de Microbiología. Pucón 2006

Estudio de bacterias intracapsulares en Concholepas concholepas (Bruguière, 1789).

Leyton Y, Varas R and Riquelme C

El presente trabajo determina la presencia de bacterias intracapsulares y evalúa el efecto de

éstas en la sobrevivencia de larvas tempranas de C. concholepas. Se recolectaron 32

cápsulas del intermareal en las bahías San Jorge, Antofagasta (2005) y Tongoy, Coquimbo

(2006), se agruparon en función de su estado: inmaduras, maduras e inviables (coloración

púrpura). El contenido intracapsular se diluyó y se sembró en medio de cultivo Zobell para

la obtención de bacterias cultivables y se determinó la presencia de Vibrios mediante la

técnica de Hibridación Fluorescente in situ (FISH). Para cada cepa aislada se realizaron

bioensayos de 48 horas con larvas en placas multipozos. En un 78% de las cápsulas hubo

presencia de bacterias, pudiendo aislar 53 cepas de las cuales un porcentaje significativo

corresponden al género Vibrio. Se observó alta sobrevivencia larval con la mayoría de las

cepas aisladas. Se vislumbra la existencia de bacterias con potenciales probióticos para las

larvas. Estas bacterias pueden ser de utilidad para mejorar la sobrevivencia en la etapa de

cultivo larval de C. concholepas.

Financiamiento: FONDEF DO4/1203

Anexos

83

7.3. Anexo 3: XII Congresso Latino-Americano de Ciências do Mar - XII COLACMAR.

Florianopolis, Brasil 2007

Bacterias intracapsulares y sus efectos en la sobrevivencia en larvas de

Concholepas concholepas

Leyton Y, Varas R and Riquelme C

El presente trabajo determina la presencia de bacterias intracapsulares y evalúa el efecto de

éstas en la sobrevivencia de larvas tempranas de C. concholepas. Se recolectaron 32

cápsulas del intermareal en las bahías San Jorge, Antofagasta (2005), se agruparon en

función de su estado: inmaduras, maduras e inviables (coloración púrpura). El contenido

intracapsular se diluyó y se sembró para la obtención de bacterias cultivables en medio de

cultivo Zobell 2216 (Difco), ST10 (medio general para bacterias) y Extracto de loco+ST10.

Para cada cepa aislada se realizaron bioensayos larvales por 48 horas en placas multipozos.

Se determinó la presencia de Vibrios mediante, técnica de Hibridación Fluorescente in situ

(FISH), se evaluó el crecimiento de cada cepa en medio thiosulphate citrate bile-salt sucrose

agar (TCBS, Difco). En un 78% de las cápsulas hubo presencia de bacterias, pudiendo aislar

53 cepas de las cuales un alto porcentaje corresponden al género Vibrio. Se observó alta

sobrevivencia larval con la mayoría de las cepas aisladas. Se vislumbra la existencia de

bacterias con potenciales probióticos para las larvas. Estas bacterias pueden ser de utilidad

para mejorar la sobrevivencia en la etapa de cultivo larval de C. concholepas.

Anexos

84

7.4. Anexo 4: XIX Congreso Chileno de Microbiología y el IV Congreso Chileno de

Microbiología e Higiene de los Alimentos.Viña del Mar, Chile 2007.

Bacterias marinas asociadas a estados larvales de Concholepas concholepas inhibidoras

de Vibrio parahaemolyticus

Leyton Y y Riquelme C

En Chile y otros países del mundo, el V. parahaemolyticus es responsable de enfermedades

gastroentéricas causada por moluscos y pescados contaminados extraídos de ambientes

marinos. En el presente estudio, se examinaron bacterias marinas asociadas a estados

larvales de C. concholepas con actividad inhibidora de Vibrios patógenos en particular de V.

parahaemolyticus para el cuál no existen medidas de control biológico. Se analizaron

microbiológicamente el contenido de 32 capsulas recolectadas en la zona intermareal de la

bahía San Jorge Antofagasta. Aislando 54 morfotipos de colonias bacterianas, a cada una se

les realizo ensayos de producción de sustancias inhibidoras mediante el método de Dopazo

et al. (1988). La presencia de un halo de inhibición del crecimiento alrededor de la colonia

se consideró como resultado positivo. Para estas cepas fue secuenciado el fragmento el 16S

para determinar su identidad en el GenBank. Se determinó actividad inhibitoria de V.

parahaemolyticus en 8 de las cepas aisladas (14,8%). Las bacteria con actividad inhibitoria

pertenecieron al genero Bacillus y dentro de las cuales se detecto Bacillus pumilus el cual ha

sido recientemente reportado como bacterias habitante del medio marino (Oguntoyinbo,

2007). Los resultados evidencian la presencia de bacterias marinas asociada a larvas de C.

concholepas con actividad inhibidoras del crecimiento de V. parahaemolyticus los cuales

podrían ser utilizados como herramienta de control biológico de esta especie patogénica.

Financiamiento: FONDEF DO4I1203

Anexos

85

7.5. Anexo 5: XXXI Congreso Sociedad de Micobiología de Chile. Santa Cruz, Chile 2009.

Detección e Identificación de Vibrio parahaemolyticus desde muestras ambientales,

durante la aparición de nuevos casos clínicos en Antofagasta, Chile.

Hengst M, Garcia-Bartolomei E, Leiva JC, Cáceres M, Leyton Y, Varas R and Riquelme C.

Vibrio parahaemolyticus (Vp) constituye el principal agente causante de gastroenteritis por

consumo de mariscos crudos en todo el mundo. En Chile fue detectado por primera vez en

Antofagasta, durante un brote patógeno del clon pandémico O3:K6 en la temporada estival

1997–1998, con 300 casos clínicos. Durante los últimos años, nuevos brotes han ocurrido en

la zona sur de Chile (Puerto Montt) alcanzando a más de 13.000 casos clínicos; sin embargo

no se han registrado nuevos brotes masivos en Antofagasta. El objetivo de este trabajo fue

detectar e identificar potenciales cepas patógenas de Vp, aisladas desde distintos

componentes ambientales en la Bahía de Antofagasta y evaluar la existencia de variaciones

temporales en la cultivabilidad (CFU), la abundancia y la presencia de genes de virulencia,

en muestras obtenidas durante el período febrero-abril de 2008. Los resultados mostraron

que Vp estuvo presente en todas las muestras colectadas asociado a: sedimento, columna de

agua, macroalgas y moluscos bivalvos (A. purpuratus), siendo macroalgas y moluscos, los

que presentaron las mayores abundancias de Vp cultivables. Adicionalmente se obtuvo un

total de 20 aislados bacterianos los que fueron caracterizados en base a: 1) las secuencias del

gen 16S rRNA y 2) a la presencia de los factores de virulencia toxR, tlh, trh, tdh2, ORF8.

Los resultados mostraron que los aislados pertenecen a distintos géneros cuyas abundancias

se distribuyen en 30% de V parahaemolyticus, 20% de otras especies de Vibrio, y 50% de

otros géneros. El análisis de los factores de virulencia mostró los siguientes genotipos: (tlh+,

tdh+, ORF8

+); (tlh

+, trh

+, tdh

+); (trh

+, tdh

+); (tlh

+, tdh

+). Financiamiento.

FONDEF MR07/1006

Anexos

86

7.6. Anexo 6: ISME-International Society for Microbial Ecology. Seattle, USA 2010.

Caracterization of an anti Vibrio parahaemolyticus substance produced

by a marine Vibrio

Leyton Yanett, Jorge Borquez y Riquelme Carlos

La bacteria pandémica V. parahaemolyticus es responsable de enfermedades gastroentéricas

causada por la ingesta de organismos marinos contaminados. Aún existen inconvenientes

para controlar la proliferación de V. parahaemolyticus y depuración de moluscos marinos

contaminados cuando ocurren brotes de esta bacteria. El objetivo de este trabajo es

identificar productos excretados por una bacteria marina inhibidora de V. parahaemolyticus.

Métodos : Se realizó la identificación de sustancias antibacterianas de una bacteria marina

(C33) contra la bacteria patógena V. parahaemolyticus mediante el método de doble capa.

Se hizo una extracción y secuenciación del gen 16S rRNA de la cepa C33, se estimó su

curva de crecimiento y paralelamente se hizo extracción por solventes orgánicos a las 24, 48,

72, 96 y 120 horas de cultivo para estimar el tiempo óptimo de producción. Los productos

activos se analizaron con Infrared Spectroscopy, Nuclear Magnetic Resonance y High

Performance Liquid Chromatography para su elucidación estructural. Igualmente fueron

separados por tamaño poniendo sobre placas de Müller-Hinton bolsas de diálisis de 1, 3.5,

7.5 y 10 KDa, con el cultivo de la bacteria en su interior, luego de 24 horas se retiraron las

bolsas y sobre el agar se sembró V. parahaemolyticus. Finalmente se estimó la sensibilidad a

la temperatura usando el mismo procedimiento anterior pero con bolsas de 10 kDa y luego

de las 24 horas se expuso por 1 hora el agar a 100ºC, se plaqueo nuevamente y se inoculo el

V. parahaemolyticus. Resultados: La bacteria C33 pertenece al género Vibrio, sus productos

inhiben el crecimiento de V. parahaemolyticus, es un metabolito secundario, menor a 10

kDa, termoestable, bacteriostático y orgánico. El Infrared Spectroscopy arroja presencia de

OH/Carbonilo. Conclusión: La molécula antibacteriana podría ser usado como biocontrol

contra V. parahaemolyticus y constituir un aporte a nivel clínico y en la industria acuícola.

Anexos

87

7.7. Anexo: 7: XXXII Congreso Chileno de Microbiología. Antofagasta, Chile 2010.

Efecto de bacterias marinas productoras de antibacterianos sobre el crecimiento de

microalgas y su microbiota asociada

Martínez Marcela, Leyton Yanett, Heghst Martha, Infante Claudia, Riquelme Carlos

Existe evidencia que el crecimiento de microalgas puede ser afectado positiva o

negativamente por la presencia de bacterias, interacción que puede estar regulada por

vitaminas u otros compuestos orgánicos. De esta forma las bacterias asociadas a microalgas

pueden ser un factor clave en el crecimiento de estas. A su vez las microalgas utilizadas

comúnmente como alimento en acuicultura son un potencial vector de bacterias con

propiedades antagonistas de patógenos. El objetivo de este estudio es evaluar el efecto de

bacterias productoras de antibacterianos sobre el crecimiento de dos microalgas bentónicas

(Nitzschia sp, Navícula sp), dos microalgas de vida libre (Isochrysis galbana T-ISO y

Chaetoceros gracilis) y su microbiota asociada, además de evaluar la factibilidad de

establecer consorcios de microalgas con bacterias antagonistas de patógenos. Se evaluó el

crecimiento de la microalga (microscopía de campo claro) y el recuento de bacterias totales

(microscopia de epifluorescencia), en tratamientos con la adición de las bacterias

antagonistas Bacillus sp. C32 y Vibrio sp. C33 añadidas en la fase logarítmica del cultivo

microalgal. También se evaluó el efecto de estas bacterias sobre la microbiota cultivable

heterótrofa asociadas a la microalga (Dopazo). Los resultados evidencian que el crecimiento

de las microalgas se correlacionan positivamente con sus bacterias asociadas. Las bacterias

antagonistas mostraron una significativa inhibición de las bacterias cultivables asociadas a

las microalgas. Las bacterias antagonistas presentaron efectos tanto estimulatorios e

inhibitorios del crecimiento de las microalgas estudiadas. Las bacterias antagonistas C32 y

C33 favorecieron el crecimiento de C. gracilis y inhibieron el crecimiento de Navícula sp. I.

galbana y Nitzshia sp., mientras que el Mix (C32+C33) inhibió el crecimiento de todas las

microalgas estudiadas. En base a nuestros resultados C. gracillis sería una buena candidata

para ser utilizada como vector en el alimento de los sistemas acuícolas como un alimento

probiótico amigable con el medio ambiente ya que podría ayudar a reducir el uso

indiscriminado de antibióticos en los sistemas de cultivo. Financiamiento: Financiamiento:

FONDEF MR07I1006.

Anexos

88

8. Referencia bibliográfica

89

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