IDENTIFIKASI BAKTERI

Oleh:Nama: Wiwien ZulaikhahNIM: B1J012100Kelompok: 3Rombongan: IAsisten: Oktaviani Naulita Turnip

LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI

KEMENTERIAN RISET TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGIUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO

2014I. PENDAHULUANA. Latar BelakangProblema utama yang dihadapi petani Indonesia terkait lahan pertanian yang memiliki salinitas tinggi adalah keterbatasan varietas tanaman yang adaptif terhadap situasi tersebut serta teknologi pembudidayaan yang belum memadai. Salah satu upaya yang dilakukan petani dalam menangani kondisi tersebut adalah dengan pemberian biofertilizer. Keberadaan biofertilizer dalam lahan sangat membantu meningkatkan ketersediaan unsur hara dalam tanah. Unsur hara merupakan komponen yang sangat penting bagi suatu organisme untuk kelangsungan hidupnya. Salah satu jenis unsur hara yang dibutuhkan oleh organisme hidup adalah nitrogen (Widawati & Muharam, 2012).Nitrogen merupakan salah satu unsur di alam yang terdapat dalam jumlah besar. Kelimpahannya di udara, tanah dan air sangat diperlukan oleh organisme untuk bertahan hidup. Nitrogen di atmosfer memang sangat melimpah yaitu sekitar 80%, namun hanya sebagian kecil organisme yang mampu menggunakannya dalam keadaan bebas. Sebagian besar organisme (misalnya tumbuhan tingkat tinggi) hanya dapat menggunakan nitrogen yang telah berikatan dengan oksigen atau hydrogen. Umumnya nitrogen diserap oleh tanaman dalam bentuk amonium (NH4) yang diperoleh dari tanah dengan bantuan mikroorganisme tertentu. Mikroorganisme yang mampu menambat nitrogen bebas umumnya berasal dari kelompok bakteri sehingga dikenal sebagai bakteri penambat nitrogen. Nitrogen yang ditambat oleh bakteri ini akan diubah kedalam bentuk senyawa organik seperti protein dan asam nukleat. Setelah sel bakteri tersebut mengalami lisis sel, senyawa-senyawa organik ini akan dilepas sehingga terakumulasi di lingkungan dan selanjutnya akan dimanfaatkan oleh organoisme lain melalui proses mineralisasi (Benson, 2001). Beberapa mikroba nonpatigenoik dan nonsimbiotik yang mampu menambat nitrogen, selain menambat nitrogen bebas bakteri tersebut juga mampu melarutkan pospat (P) yang terikat pada unsur Ca, Al, dan Fe. Kelompok mikroba ini dapat hidup di berbagai ekosistem, misalnya di dataran tinggi atau pegunungan, dataran rendah sampai daerah pantai, pada ekosistem yang mempunyai tingkat kemasaman tinggi dan rendah, bahkan dapat pula dijumpai pada ekosistem yang tercemar pestisida serta pada kondisi tanah marginal. Salah satu mikroba penambat nitrogen yang terkenal adalah dari genus Azospirillum (Widawati & Muharam, 2012). Daerah perakaran tanaman (rhizosfer) merupakan bagian tanaman yang paling kaya akan mikroorganisme (Bruehl,1987). Berbagai spesies mikroba penambat nitrogen bebas ditemukan di daerah tersebut. Beberapa bakteri penambat nitrogen pada rizosfer tanaman gramineae, contohnya Azotobacter paspali dan Beijerinckia spp. adalah salah satu dari kelompok bakteri aerobik yang mengkolonisasi permukaan akar (Baldani et al. 1997). Sedangkan bakteri penambat nitrogen bebas yang terdapat pada perakaran dan dalam jaringan tanaman padi, antara lain Pseudomonas spp., Enterobacteriaceae, Bacillus sp., Azotobacter sp., Azospirillum sp., dan Herbaspirillum sp. (James and Olivares, 1997). Meskipun terdapat banyak spesies bakteri yang memiliki kemampuan menambat nitrogen bebas, tetapi hanya sebagian kecil yang mampu mengekskresikannya kedalam bentuk amonium. Hal ini adalah alasan mengapa kontribusi dari mikroorganisme dalam menyediakan nitrogen bagi tanaman masih tergolong rendah (Dobbelaere et al, 2003). Weniger dan Veen (1991) melaporkan bahwa kemampuan Azospirillum brasilense untuk mengekskresikan NH4+ hanya sekitar 1 sampai 2 % dari nitrogen yang difiksasi dari atmosfer.

B. TujuanTujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui cara serta mampu melakukan tahapan-tahapan identifikasi bakteri Azospirillum sp.

II. MATERI DAN METODEA. MateriAlat yang digunakan dalam praktikum ini adalah cawann petri, tabung reaksi, jarum ose, tusuk sate, pipet ukur, mikropipet dan tip, mikroskop, incubator, PCR, elektroforesis set, eppendorf 2 ml, sentrifugator, object glass, cover glass dan pipet tetes.Bahan yang digunakan adalah isolate azospirillum sp., medium NA, medium Caceres, medium Nfb, reagen pawarnaan flagel, tetramethyl D-phenylene diamine didhydrocloride, H2O2, safranin, OF medium+glukosa 1%, paraffin cair, medium TB, medium PB, medium simmons citrate medium basal+gula 0,5%, medium TSIA, medium NB+KNO3, medium basal+asam-asam organik 0,5%, medium NB, agarosa, STE, tenderizer 20 %, SDS 1%, kalium iodide, isopropanol, etanol 70%, TE 1X, ddH2O, dNTP, prime R, prime F, buffer dan taq polymerase.B. MetodePeremajaan KulturIsolate Azospirillum sp. diambil satu ose dan diinokulasikan pada medium NA miring.Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 30oCPengamatan Makromorfologi Media NAAzospirillum sp. diambil satu ose kemudian diinokulasikan pada media NA dengan cara streak kuadran. Diinkubasi selama 5 x 24 jam pada suhu 30oCMedia CaceresAzospirillum sp. diambil satu ose kemudian diinokulasikan pada media Caceres dengan cara streak kuadran. Diinkubasi selama 5 x 24 jam pada suhu 30oCMedia Nfb AgarAzospirillum sp. diambil satu ose kemudian diinokulasikan pada media Caceres dengan cara streak kuadran. Diinkubasi selama 5 x 24 jam pada suhu 30oCPewarnaan GramKultur isolat diambil satu ose kemudian diulaskan ke object glass dan difiksasi di atas spiritus dengan melewatkanya sebanyak 3-5 kali.Ulasan bakteri ditetesi dengan Crystal Violet selama 60 detik lalu dicuci dengan akuades dan dikeringanginkan.Setelah itu, ditetesi dengan Lugols Iodine selama 60 detik lalu dicuci dengan akuades dan dikeringkan.Selanjutnya ditetesi dengan Ethanol 96% sampai tetesannya jernih kemudian dicuci dengan akuades dan dikeringanginkan.Terakhir ditetesi dengan Safranin selama 45 detik lalu dicuci dengan akuades dan dikeringanginkan.Diamati warna ulasan bakteri dengan mikroskop. Apabila warnanya merah berarti termasuk gram negative dan apabila warnanya ungu berarti gram positif.Pengamatan PolimorfikStok isolat diambil satu ose dan diulas pada object glass.Isolate difiksasi diatas pembakar spirtus.Diteteskan safranin pada ulasan tunggu sampai 45 detik.Diamati bentuk selnya dengan mikroskoppada hari ke 2, 4, 6 dan 8.Pewarnaan FlagelSatu ose isolat diambil dan ditempelkan pada object glass yang telah diberi akuades.Ulasan ditiutup dengn cover glass lalu diamkan hingga kering.Setelah kering diamati bentuk flagel dengan mikroskop.Uji OksidaseStok isolat diambil satu ose dan diulas pada object glass.Ulasan ditutup dengan kertas tissue.Diteteskan reagen oksidase dan ditunggu selama 60 detik.Perubahan warnanya diamati.Uji KatalaseStok isolat diambil satu ose dan diulas pada object glass.Reagen H2O2 diteteskan diatas ulasan.Gelembung gas yang terbentuk diamati.Uji Oksidasi FermentatifIsolate diinokulasikan dengan menggunakan tusuk sate pada OF medium + 1% glukosa semi solid tegak dengan metode stab inoculationSalah satu tabung ditambahkan dengan paraffin cair.Diinubasi 5 x 24 jam pada suhu ruang. Felikel yang terbentuk diamatiUji IMViCIsolat diinokulasikan dengan jarum ose pada medium tryptone broth untuk uji indole.Isolat diinokulasikan dengan jarum ose pada medium protease broth untuk uji methyl red.Isolat diinokulasikan dengan jarum ose pada medium tryptone broth untuk uji voges proskauerIsolat Azospirillum sp. diinokulasi dengan jarum ose pada medium simmons citrate dengan metode streak zig-zag. Kemudian diinkubasi 2x24 jam pada suhu 30Setelah diinkubasi untuk uji indole ditambahkan dengan reagen kovack indole, interpretasi positifnya akan terbentuk cincin merah.Untuk uji methyl red diteteskan dengan methyl red dan interpretasi positifnya akan berubah menjadi warna merah pada media. Uji voges proskauer ditambahkan dengan KOH 40% + alpha naphtole dan intrpretasi positifnya kan berubah menjadi warna meraj pada media. Uji CC interpretasi positifnya media kan berubah menjadi warna biru dari hijau. Uji Reduksi GulaStok isolat Azosprillum sp. diinokulasikan dengan menggunakan jarum ose pada medium basal+xylulosa 0,5% dengan metode streak kuadran.Stok isolat Azosprillum sp. diinokulasikan dengan menggunakan jarum ose pada medium basal + laktosa 0,5% dengan metode streak kuadran.Stok isolat Azosprillum sp. diinokulasikan dengan menggunakan jarum ose pada medium basal + galakstosa 0,5% dengan metode streak kuadran.Stok isolat Azosprillum sp. diinokulasikan dengan menggunakan jarum ose pada medium basal + maltosa 0,5% dengan metode streak kuadran.Stok isolat Azosprillum sp. diinokulasikan dengan menggunakan jarum ose pada medium basal + arabinosa 0,5% dengan metode streak kuadran.Kemudian diinkubasi 2x24 jam pada suhu 30Interpretasi positifnya akan berubah menjadi keruh. Uji Media TSIAStok isolat Azospirillum sp. diinkoluasikan pada mediu Nfb semi solid tegak dengan metode stab inoculation yang kemudian ditarik lurus dengan menggunakan tusuk sate.Kemudian diinkubasi 2x24 jam pada suhu 30Perubahan yang terjadi pada media diamati.Interpretasi positif warna media akan berubah menjadi kuning.Uji Penggunaan Sumber Asam OrganikStok isolat Azospirillum sp. diinokulasi pada medium basal + asam suksinat.Stok isolat Azospirillum sp. diinokulasi pada medium basal + asam fumarat.Lalu diinkubasi 2x24 jam pada suhu 30.Interpretasi positifnya warna media akan menjadi keruh.Uji Reduksi NitratStok isolat Azospirillum sp. diinokulasi dengan jarum ose pada medium NB + KNO3 0,001 gr.Lalu diinkubasi 2x24 jam pada suhu 30. Kemudian ditambahkan reagen nitrat reduktase.Perubahan warna yang terjadi diamati.Isolasi DNABuffer TE sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam eppendorf.Sebanyak 5 ose isolat Alfa diambil dan dimasukkan dalam ependorf tersebut, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit.Supernatan dibuang, ditambahkan 50 l tenderizer, dibolak-balik sebanyak 20x (homogenisasi) dan diinkubasi selama 15 menit.Hasil inkubasi kemudian ditambahkan 50 l SDS 10 % dan dipanaskan dengan suhu 65 C 10.000 selama 10 menit (waterbath).Disentrifugasi kembali dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit.Supernatan dipindahkan ke dalam eppendorf steril baru, ditambahkan isopropanol sebanyak setengah dari volume supernatan dan diresuspensi, kemudian dibolak-balik 20x.Etanol 70% ditambahkan dan disentrifugasi 10.000 rpm selama 10 menit.Supernatan dibuang, DNA dikeringkan 10 menit dan ditambahkan 100 l buffer TE 1x.Pembuatan Gel Agarosa250 ml larutan buffer TAE 1x dibuat dengan cara mencampurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades.Gel agarosa 1% dibuat dengan cara menimbang agarosa 0,75 gram untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 75 ml. Agarosa dididihkan hingga larut sempurna.Baki disiapkan, selotip dilekatkan pada ujung baki dan dipastikan melekat kuat serta tidak ada yang bocor.Sisir elektroforesis dipasang hingga menyentuh ujung baki.Suhu gel agarosa diperiksa, jika turun sampai 45 C ditambahkan 3,75 l EtBr.Sisir diambil dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki.Baki yang telah berisi gel agarosa dimasukan ke dalam tangki elektroforesis yang telah berisi TAE 1X sampai terendam semua.PCRKertas parafilm disiapkan di dekat tangki elektrroforesis.Perbandingan Loading dye dan DNA sampel 3:7, dicampurkan pada kertas parafilm menggunakan mikropipet dan tip.DNA sampel dan Loading dye yang telah homogen dimasukanke dalam sumuran. Kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis dihubungkan, harus dipastikan kutub negatif berada di dekat sumuran dan positif berada jauh dari sumuran.Sumber arus pada 100 V dengan 400 mA dinyalakan, running selama 30 menit.Elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai dengan bunyi alarm. Sumber arus dimatikan dan baki elektroforesis diangkat.Visualisasi menggunakan UV transiluminator (letakan selubung kaca hitam diatas UV transiluminator).UV transiluminator dinyalakan dan pita-pita yang tervisualisasi diamati.Didokumentasikan dengan kamera digital.

III. HASIL DAN PEMBAHASANA. HasilTabel 3.1 Hasil Pengamatan Makromorfologi Bakteri Azospirillum sp. No.Karakter yang diamatiMedia NAMedia CaceresMedia NfB

1Bentuk-SirkularSirkular

2Warna-PutihPutih

3Permukaan-MengkilatMengkilat

4Ukuran-SmallPinpoint

5Elevasi-RaisedRaised

6Margin-RataRata

Tabel 3.2 Hasil Pengamatan Bakteri Azospirillum sp. Karakter yang diujiKeterangan

Uji IMVIC

1. Uji Indol(-)

2. Uji Methyl Red(-)

3. Uji Voges Proskauer(+)

4. Uji Simons Citrat(+)

Uji Reduksi Gula

1. Xylosa(+)

2. Galaktosa (+)

3. Maltosa(+)

4. Arabinosa(+)

5. Laktosa(+)

Uji Oksidasi-Fermentatif

1. Uji Oksidasi(+)

2. Uji Fermentatif(+)

Uji TSIA (+)

Uji Asam Organik

1. Fumarat(+)

2. Suksinat(+)

Uji reduksi nitrat(+)

Media miringEffuse

Media TegakEchinulate

Uji media NfB(+)

Uji Oksidase(+)

Uji katalase(+)

Pewarnaan gram(-)

Pewarnaan flagel(-)

Tabel 3.3 Hasil Pengamatan Polimorfik Bakteri Azosspirillum sp.Hari ke-Bentuk

0Basil

2Basil pendek

4Basil pendek

6Coccus

Gambar 1. StokGambar 2. MakromorfologiGambar 3. Makromorfologimedia NA miringmedia NA tegak

Gambar 4. Makromorfologi media NfB Gambar 5. Makromorfologi media caceresStreak kuadranStreak kuadran

Gambar 6. Makromorfologi media NA Gambar 7. Polimorfik hari ke-0Streak kuadran

Gambar 8. Polimorfik hari ke-2Gambar 9. Polimorfik hari ke-4

Gambar 10. Polimorfik hari ke-6Gambar 11. Pewarnaan gram

Gambar 12. Pewarnaan flagelGambar 13. Uji oksidase

Gambar 14. Uji katalaseGambar 15. Uji Oksidatif Fermentatif

Gambar 16. Uji IMViCGambar 17. Uji IMViCGambar 18. Uji IMViC(Indole)(Methyle Red)(Voges Proskauer)

Gambar 19. Uji IMViCGambar 20. Uji reduksi gulaGambar 21. Uji reduksi gula(Citrat)ArabinosaGalaktosa

Gambar 22. Uji reduksi gulaGambar 23. Uji reduksi gulaGambar 24. Uji reduksi gulaLactosaMaltosaXylosa

Gambar 25. Uji reduksi Gambar 26. Uji media TSIAGambar 27. Uji asam organikNitrat(fumarat)

Gambar 28. Uji asam organik Gambar 29. Uji media NfB Gambar 30. DNA sebelum(suksinat)di PCR

Gambar 3.28 Wellplate sebelumGambar 3.29 DNA setelah di PCR di PCR

B. PembahasanAzospirillum merupakan bakteri penambat nitrogen dari kelompok Rhizobacteria (Widawati 2011; Nurosid et al., 2008). Bakteri ini ditemukan hidup bebas di dalam tanah dekat perakaran tanaman. Umumnya berasosisasi dengan akar rerumputan atau tanaman serealis (Okon, 1985). Bakteri tersebut biasanya diisolasi dari perakaran tanaman jagung (Lydia, 2004). Meskipun hidupnya berasosiasi dengan akar tanaman, bakteri ini diketahui sebagai bakteri nonsimbiotik (Nurosid et al., 2008). Sebagai bakteri penambat nitrogen, kelompok bakteri tersebut menambat nitrogen pada kondisi mikroaerofil (Rao 1982). Bakteri ini juga merupakan kelompok bakteri mesofil yang hidup pada rentang temperatur 20-25C (Theil, 1999). Peran Azospirillum dalam bidang pertanian sangat besar terutama sebagai biofertilizer (Nurosid et al., 2008). Disamping itu, kelompok bakteri ini juga memiliki kemampuan untuk mengahasilkan IAA (Okon, 1985). Keberadaan IAA yang disintesis oleh bakteri tersebut dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman, oleh karena itu Azospirillum disebut juga sebagai plant growth promoting Rhizobacteria (PGPR) (Glick 1995). Rao (1982) menerangkan, selain meningkatkan efisiensi pemupukan, Azospirillum mampu menghasilkan giberelin, auksin serta senyawa yang menyerupai sitokinin.Kehadiran Azospirillum pada perakaran tanaman mampu menyediakan unsur N, P dan K bagi pertumbuhan tanaman serta akumulasi bahan kering pada tanaman jagung, sorgum, gandum, dan setaria (Okon and Kalpunik, 1986). Produksi IAA oleh Azospirillum akan menyebabkan perubahan morfologi akar seperti peningkatan jumlah rambut akar, perpanjangan akar, dan luas permukaan akar. Selain itu, Azospirillum yang berasosiasi dengan perakaran mampu meningkatkan kecepatan penyerapan air dan nutrisi dari tanah (Okon, 1985), serta dapat memproduksi allelopati, bakteriosin, atau antibiotik (Hartman and Zimmer, 1994).Okon (1985) menerangkan, Azospirillum menambat nitrogen (N2) dari udara dan mengubahnya menjadi NH3 menggunakan enzim nitrogenase. Senyawa ammonia yang dihasilkan kemudian diubah menjadi glutamin atau alanin (Waters et al. 1998), sehingga dapat diserap oleh tanaman dalam bentuk NO3 dan NH4+. Widawati (2011) juga menambahkan, selain menambat nitrogen, bakteri tersebut juga mampu melarutkan P terikat pada Al, Ca, dan Fe dalam tanah menjadi unsur P yang tersedia bagi tanaman. Azospirillum sp. sebagai pelarut fosfat berperan dalam mineralisasi fosfat organik melalui produksi enzim fosfatase asam dan basa, khususnya fosfomonoesterase. Enzim tersebut dapat melepaskan satu ikatan ester pada P organik melalui proses hidrolisis P organik menjadi P anorganik (H2PO4) dan HPO42-) yang tersedia bagi tanaman. Enzim tersebut banyak dihasilkan oleh bakteri pelarut fosfat apabila ketersediaan fosfor dalam tanah rendah (Lal 2002). Genus Azospirillum memiliki anggota yang terdiri atas beberapa spesies. Tarrand et al. (1978), pertama kali mengidentifikasi dua spesies Azospirillum yaitu Azospirillum lipoferum dan Azospirillum brasilense. Beberapa waktu setelah Tarrand mengidentifikasi spesies tersebut, pera peneliti lainnya mulai menemukan spesies-spesies yang lain dari genus tersebut. Spesies tersebut diantaranya Azospirillum amazonense (Magalha`es et al., 1983), Azospirillum halopraeferens (Reinhold et al., 1987), Azospirillum irakense (Khammas et al., 1989), Azospirillum largimobile (Ben Dekhil et al., 1997), Azospirillum doebereinerae (Eckert et al., 2001), Azospirillum oryzae (Xie & Yokota, 2005) dan Azospirillum melinis (Peng et al., 2006), Azospirillum canadense (Mehnaz et al. 2007a; Lin et al. 2009; Zhou et al. 2009), Azospirillum zeae (Mehnaz et al. 2007b; Lin et al. 2009), and Azospirillum palatum (Zhou et al. 2009).Berdasarkan hasil praktikum diketahui bahwa hasil peng

IV. KESIMPULAN DAN SARANA. KesimpulamBerdasarkan hasil praktikum yang diperoleh, dapat disimpulkan bahwa :

B. SaranClick here to enter text.

DAFTAR REFERENSIWidawati, dan Muharam, A. 2012. Uji Laboratorium Azospirillum sp. yang Diisolasi dari Beberapa Ekosistem. J. Hort, Vol. 22(3) : 258-267.Baldani J.I, L. Caruso Vera, L.D. Baldani, Silvia R. Goi, and J. Dobereiner. 1997. Recent Edvance in BNF with Non-legume Plants. Soil Biology and Biochemistry.Benson. 2001. Microbiological Applications Lab Manual Eighth Edition. The McGraw-Hill Companies.Bruehl, GW. 1987. Soilborne Plant Pathogen. New York : Macmillan Pubhlishing Company.p.James, E. and F.L. Olivares. 1997. Infection and Colonization of Sugarcane and Other Graminaceous Plants by Endophytic Diazotrophicus. Plant Science and Bioengineering, Vol. 110 (4) : 415-418.Dobbelaere, S., J. Vanderleyden, and Y. Okon. 2003. Plant Growth-Promoting Effects of Diazotrophs in the Rhizosphere. Critical Reviews in Plant Sciences, Vol. 22(2) : 107149.Weninger, C. C., and J. A. Van Veen. 1991. NH4+-Excreting Azospirillum brasilense Mutants Enhance the Nitrogen Supply of Wheat Host. Appl. Environ. Microbiol, Vol. 57 : 3006-3012.Glick, B.R. 1995. The Enhancement of Plant Groth by Free-Living Bacteria. Can. J. Microbiol, Vol. 41 : 109-17.Hartman, A., W. Zimmer. 1994. Physiology of Azospirillum. in Azospirillum Plant Associations. Y. Okon. (Ed). pp. 15-39. CRC Press, Boca raton, USA.Lal, L. 2002. Phosphate Biofertilizers. Agrotech Publ. Academy. Udaipur, India.Lydia, I. 2004. Kemampuan Bakteri Penambat Nitrogen Azospirillum spp. yang DiIsolasi dari Beberapa Akar Tanaman dalam Meningkatkan Pertumbuhan Tanaman Jagung. Skripsi. Fakultas Biologi Unsoed, PurwokertoNursoid, Oedjijono, dan Puji Lestari. 2008. Kemampuan Azospirillum Sp. JG3 dalam Menghasilkan Lipase pada Medium Campuran Dedak dan Onggok dengan Waktu Inkubasi Berbeda. Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto.Okon, Y & Kalpunik, Y. 1986. Development and Function of Azospirillum Inoculated Roots. Plant and Soil, Vol. 90 : 3-16.Okon, Y. 1985. Azospirillum as a Potential Inoculants for Agriculture. Trends in Biotechnol, Vol. 3 : 223-228.Rao, S. 1982. Biofertilizers in agriculture. Oxford & IBH Pub., New Delhi.Thiel, T. 1999. Introduction to Bacteria. In Science in The Real World. Deptement of Biology Univ.of Missouri, St. Louis.Waters, T.K., Hughes II, B. L., Purecell, L. C., Gerhardt, K. O., Mowhinney, K. O., & Emerich, D. W. 1998. Alanine, Not Ammonia, is Excreted from N2-Fixing Soybean Nodule Bacteroids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 95 : 12038-12042.Widawati, S. 2011. The Role of Phosphate Solubilizing Bacteria and Freeliving Nitrogen Fixing Bacteria on the Growth and Adptation of Gmelina arborea Roxb. Grown on Degraded Land. J. Environ Engineering, Vol. 7(1) : 89-95.