1964 NEURATH, PIRMANN und DUNGER 1631

GEORG NEURATH, BARBARA PIRMANN und MICHAEL DUNGER

Identihierung von N-Nitroso-Verbindungen und asymmetrischen Hydrazinen als

5-Nitro-Zhydrox y-benal-Derivate und Anwendung im Mikromallstab

Aus dem Forschungslaboratorium der Firma H. F. & Ph. F. Reemtsma, Hamburg (Eingegangen am 24. Dezember 1963)

Die Uberfiihrung der Nitrosamine in kristalline 5-Nitro-2-hydroxy-benzal- Derivate der ihnen entsprechenden unsymmetrischen Hydrazine im praparativen MaRstab und MikromaRstab wird beschrieben. Die farbigen. gut kristallisieren- den Derivate ermoglichen die Identifierung der Nitrosamine und der sich von ihnen ableitenden, durch Reduktion mit Lithiumalanat gewonnenen unsymme

trischen Dialkylhydrazine durch Schmelzpunkt und RPWert.

Die Identikierung organischer N-Nitroso-Verbindungen in Gemischen unbekann- ter Zusammensetzung ist bisher noch nicht beschrieben worden. Es war erforderlich, hierfiir eine Methode zu erarbeiten, zumal H. HERMANN~) in dem eBbaren Pilz Cfito- cybe suaveofens einen naturlichen Vertreter dieser Stoff klasse, den 4-[Nitroso-methyl- amino]-benzaldehyd, nachweisen konnte und dariiber hinaus in den letzten Jahren das ubiquittire Vorkommen der Nitrosamine von H. DRUCKREY und R. PREUSSMANN~) diskutiert wird. Vertreter dieser Stoffklasse wirken aukrdem cancerogen3-12) und mutagen 13).

Fur die N-Nitroso-Verbindungen wurden Anfirbemethoden fur die Papierchromato- graphie sowie ein dunnschichtchromatographischs Verfahren beschrieben 14n15). Der Identifizierung durch kristalline Derivate, die zur chromatographischen Reinigung und

1) Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem. 326, 13 [1961]. 2) Naturwissenschaften 49, 498 [1962]. 3) J. M. BARNES und P. N. MAGEE, Brit. J. ind. Med. 11, 167 [1954]; Brit. J. Cancer 10, 114

4) H. DRUCKREY, R. PREUSSMANN, D. SCHMAHL und M. MULLER, Naturwissenschaften 48,

5) H. DRUCKREY und D. STEINHOFF. Naturwissenschaften 49,497 [1962]. 6) F. G. ZAK, J. H. HOLZNER, E. J. SINGER und H. POPPER, Cancer Res. 20,96 [1960]. 7 ) H. DRUCKREY und R. PREUSSMANN, Naturwissenschaften 49,111, 166 (19621. 8) H. DRUCKREY, R. PREUSSMANN, D. SCHMAHL und M. MULLER, Naturwissenschaften 48,

9 ) R. SCHOENTHAL und P. N. MAGEE, Brit. J. Cancer 16,92 [1962]. 10) H. DRUCKREY. R. PREUSSMANN. G. BLUM und S. IVANKOVIC, Naturwissenschaften 50,

(19561.

134 [1961].

165 [1961].

100 [1963]. 11) H. DRUCKREY. R. PREUSSMANN. D. SCHMAHL und M. MOLLER, Naturwissenschaften 49,

19 (19621. 12) P. N. MAGEE und J. M. BARNES, J. Pathol. Bacteriol. 84, 19 (19621. 13) L. PASTERNAK, Naturwissenschaften 49, 16 [1962]. 14) R. PREUSSMANN, D. DAIBER und H. HENGY, Nature [London] 201, 502 [1964]. 15) R. PREUSSMANN, G. NEURATH, G. WULF-LORENTZEN, D. DAIBER und H. HENGY, Z.

analyt. Chem., im Druck.

1632 NEURATH, PIRMANN und DUNGER Jahrg. 97

Elementaranalyse geeignet sind, steht jedoch die ausgesprochene Reaktionstragheit der N-Nitroso-Gruppe entgegen. Deshalb haben wir versucht, die bekannte Reduktion der Nitrosamine mit Lithiumalanat 16.17) zu den entsprechenden unsymmetrisch disubsti- tuierten Hydrazinen zu nutzen, da sich diese leicht in kristalline Derivate umwandeln lassen.

Bei der Umwandlung der Hydrazine mit Reagenzien wie Acylchloriden und Ae l - halogeniden konnen in Gemischen neben den Hydrazinen auch primare und sekundare Amine sowie Alkohole und Phenole reagieren. Deshalb erscheint von vornherein die Umsetzung mit aromatischen Aldehyden zu farbigen Azomethinen geeigneter, da dabei lediglich primare Amine storen konnen.

Bei zum Vergleich durchgefuhrten Umsetzungen mit 4'-Nitro-azobenzol-carbon- saure(4)-chloridl8), 2.4-Dinitroth1orbenzo1, 2.4-Dinitro-benzaldehyd, CNitro-benz- aldehyd und 5-Nitro-2-hydroxy-benzaldehyd (5-Nitro-salicylaldehyd) erwiesen sich die Derivate des letztgenannten Reagenzes als besonders geeignet.

Bei der Reaktion mit 2.4-Dinitro-chlorbenzol wurden neben der genannten Storung durch sekundare Amine jeweils drei verschiedene Substanzen erhalten, die auf teilweise Spaltung der Hydrazine hindeuteten. Die Umsetzung mit 4-Nitro-benzaldehyd erfolgt glatt; jedoch schmelzen die Derivate relativ niedrig. Bei 2.4-Dinitro-benzaldehyd verlauft die Umsetzung nicht vollsttindig, so daB die Derivate siulenchromatographisch abgetrennt werden miissen (s. Tab. 1).

Tab. 1. Vergleich der Benzalderivate aus Hydrazinen und substituierten Benzaldehyden. UV-Absorptionen in Methanol bnv. unter Zugabe von einigen Tropfen 3-prOZ., methanol.

Natriumhydroxydlosung --- ---- ___ ~ _ - _ _ _ - _ _ _ ~ _ _ ~ . --

2.4-Dinitro-benzaldehyd 4-Nitro-benzaldehyd 5-Nitro-2-hydroxy- benzaldeh yd Schmp. 126" Schmp. 72" Schmp. 106"

Schmp. 124-1265' Schmp. 112" Schmp. 164-165" (CH3)zN -NH2 UV H : 242 420 nm UV H : 252 390 nm UV H : 294 nm

UV 0-0 : (242) 420 nm UV 0-0 : 252 390 nm UV M : 343 421 nm Schmp. 187-190" Schmp. I32 - 134" Schmp. 207 -208"

UV0-0:(246)447.5nm UV0-0:264416nm u V 0 - 0 : 370447nm (C6Hs)zN-NHz UV H : 246 447.5 nm U V 1-1 : 264 416 nm UV 1-1 : 232 301 350 nm

c--l (neutral) e-c (alkalisch)

Die Umsetzung der asymmetrischen Hydrazine zu 5-Nitro-2-hydroxy-benza1- Derivaten verlauft in siedendem Athanol dagegen fast quantitativ ohne Nebenprodukte. Die besseren Ausbeuten im Vergleich zu den anderen arornatischen Aldehyden fuhren wir in Analogie zu den Befunden von F. C. MCINTIRE 19) an den Schiffschen Basen von Aminosauren auf die Ausbildung einer stabilisierenden Wasserstoff briicke vom Hydroxylproton zum Azomethinstickstoff zuriick.

J. LEICESTER und A. 1. VOGEL, Research 3, 148 [1950). 17) F. W. SCHUELER und C. HANNA, J. Amer. chem. SOC. 73, 4996 119511. 18) E. HECKER, Chem. Ber. 88, 1666 [1955]. 19) F. C. MCINTIRE, J. Amer. chern. SOC. 69, 1377 [1947].

1964 Identifierung von N-Nitroso-Verbindungen und asymmetrischen Hydrazinen 1633

Sowohl die Reduktion der N-Nitroso-Verbindungn als auch die Umsetzung zu den Benzalderivaten lassen sich im MikromaRstab durchfuhren.

NOz

Die Schmelzpunkte und UV-Absorptionsmaxima der Derivate sind in Tab. 2 zu- sammengefaat.

Tab. 2. Schmelzpunkte und Absorptionsmaxima *) der 5-Nitro-2-hydroxy-benzal-Derivate von unsymmetrisch disubstituierten Hydrazinen

--

Benzalderivat von Amax Imax Molare Extinktion (nm) (nm) neutral alkalisch Schmp.

neutral alkalisch

(5-Nitro-2-h ydroxy-benzaldeh yd

Dimethylh ydrazin

Diilthylhydrazin

Di-n-propylhydrazin

D1-n-butylhydrazin

Di-n-pentylhydrazin

Di-n-hexylhydrazin

Diisopropylhydrazin

Diisobutylhydrazin

Methyliithylhydrazin

Methylbutylhydrazin

Methylpent ylhydrazin

khylhept ylhydrazin

Diallylhydrazin

Methylallylhydrazin

1 -Amino-pyrrolidin

1 -Amino-piperidin

126'

164-165'

98-100'

35-37

39-40'

15-17'

33-34O

79 - 80"

70-71'

1 18 - 1 19'

34-35'

49 - 50'

24-25'

40-43'

91.5-92.5'

145-146'

174- 175'

234 312 294

300

302

303

303

305

304

295

297

298

302

296

299

30 I

294

241 358 343 421 345 423 344 427 344 430

344

342 438 344 436 342 422 342 426 341 43 1 344 428 343 425 3 50 420 346 423 346 423

428

28 200

28 500

30 600

29 OOO

29 300

30 400

29 500

29 800

29 800

30 300

29 100

29 400

29 600

30 200

27 300

1

15 300

17 200 10 500 20 OOO 10 3 0 0 19 OOO 10 200

19 400 10 300 23 OOO

8 9 0 0 20 900 10 OOO 16 200 11 300 17 400 10 600 19 500 10 400 18 500 10 200 17 500 11 900 16 500 11 800 17 900 11 OOO 14 900 12 800

1634 NEURATH, PIRMANN und DUNGER Jahrg. 97

Tab. 2 (Fortsetrung) . _ _ _ _ _ _ -~ -. .____

Benzalderiva t von

lmax Molare Extinktion neutral a,kalisch neutral alkalisch Schmp. (nm) (nm)

4-Amino-morpholin 197-199" 290 347 27 500

4-Amino-I -methyl-piperazin 185-187O 290 347 28000

Meth ylphenylh ydrazin 178-180' 303 363 22 300 343 438 29 300

khylphenylhydrazin 182-184' 302 368 20400 348 438 28 600

Diphenyl hydrazin 207-208' (232) 372 22 600 302 438 19500 350 26 OOO

417

41 6

Methylbenzylhydrazin 125-126' 296 342 30000 424

von Aminen und monosubstituierten Hydrazinen Methylamin 218-219O 257 398 19300

Methylhydrazin 150-151' 287 345 27200

Anilin 133.5-134" 232 400 15600 307 11 700

Phenylhydrazin 196-198" 231 370 18400 301 428 20200 354 28 200

348 12 700

416

14 200 13 300 14 100 13 400 27 400 10 000 27 700 9 100

26 300 11 600

17 700 I 1 800

15 400

13 000 12 700 18 900

26 200 9 800

0 ) Gemessen in Methanol bzw. nach Zusatz von 3 Tropfen Zproz.. methanol. Natriumhydroxydl6sung.

Die rein aliphatischen Derivate absorbieren in geringem MaBe konstitutionsabhangig im Bereich von 300 nm, wahrend die Diaryl- und Alkylarylderivate ein Hauptmaximum bei 340-350 und nur ein Nebenmaximum bei 300 nm zeigen. Bei Alkalizusatz tritt bei allen Derivaten eine bathochrome Verschiebung ein. Die Dialkylderivate zeigen dann ein Hauptmaximum bei 340-350 nm und ein flaches Nebenmaximum bei 420 bis

-? Icm-'l 40 35 30 25.10' 20

4 8

4 6

t 4 4 w 4 2

- 4 0

38

36

cn D

250 300 350 400 Mnml-

Abbild. I . Typisches UV-Spektrum des 2-Hydroxy-5-nitro-bed-Derivates eines dialkyl- substituierten Hydrazins in Methanol

1964 Identifizierung von N-Nitroso-Verbindungen und asymmetrischen Hydrazinen 1635

430 nm. Das Hauptmaximum liegt bei Diaryl- und Alkylarylderivaten in alkalischem Medium bei 370 nm, das schwache Nebenmaximum bei 438 nm (Abbild. 1,2).

hlnml- Abbild. 2. Typisches UV-Spektrum des 2-Hydroxy-5-nitro-benzal-Derivates eines alkylaryl-

substituierten Hydrazins in Methanol

In den Spektren unterscheiden sich die Derivate der Hydrazine von denen der primaren Amine deutlich durch die langerwellige Absorption (s. Tab. 2, unten).

DUNNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE Die 5-Nitro-2-hydroxy-benzalhydrazine lassen sich ausgezeichnet auf Kieselgel diinn-

schichtchromatographisch trennen. Fur die meisten angegebenen Derivate ist das - _ T-.

I .

a 0

@@ * a. 0 . 1- ; * \* I

: , . . . . . .I:, :. . . . . . . . . . - q . . . , 1 2 3 L 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 IS 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Abbild. 3. Diinnxhichtchromatogramme von Benzalderivaten unsymmetrischer Hydrazine, 20 y, mit 3-prOZ., athanol. Kaliumhydroxydlbsung bespriiht

1 Methyliithylhydrazin 13 Di-n-butylhydrazin 2 Methyl-n-butylhydrazin 14 Diisobutylhydrazin 3 Methylbenzylhydrazin 15 Di-n-pentylhydrazin 4 Methylallylhydrazin 16 Di-n-hexylhydrazin 5 Methyl-n-pentylhydrazin 17 Methylphenylhydrazin 6 Xthyl-n-heptylhydrazin 18 Diphenylhydrazin 7 Xthylphenylhydrazin 19 1 -Amino-pyrrolidin 8 5-Nitro-2-hydroxy-benzaldehyd 20 1-Amino-piperidin 9 Dimethylhydrazin 21 4-Amino-morpholin

10 Diathylhydrazin 22 4-Amino-1-methyl-piperazin I I Di-n-propylhydrazin 23 Diallylhydrazin 12 Diisopropylhydrazin 24 Testgemisch

I636 NEURATH, PIRMANN und D ~ ~ N G E R Jahrg. 97

System TetrachlorkohIenstoffjAthylacetat (95 : 5 ) gut geeignet (Abbild. 3). Fur Sub- stanzen, die in diesem System am Startpunkt bleiben, eignet sich Chloroform/Methanol (95 : 5) .

Beim Ekspriihen mit Alkali vertieft sich die gelbe Farbe der Flecken zu gelbbraun; die Intensitat wird dabei so erhoht, daR noch 0.5 y gut zu erkennen sind. Die Derivate der Amine werden auf der Platte durch Alkali nicht verfabt.

Mit Kaliumhexacyanoferrat(II1) 20) farben sich die Benzalhydrazine auf der Platte intensiv blau; noch 0.05 y sind deutlich zu erkennen.

fur die Uberlassung einiger Nitrosamine. H e m Prof. H. DRUCKREY und Herrn Dipl.-Chem. R. PREUSSMANN. Freiburg, danken wir

BESCHREIBUNG DER VERSUCHE

Die Mikroanalysen wurden von der Firma ILSE BEETZ, vorm. Dr. Ing. A. SCHOELLER, Kronach/Oberfranken, durchgefuhrt. Alle Schmpp. warden auf dem Kofler-Heizmikroskop bestimmt und sind unkorrigiert.

Redirktion der Nitrosamine In einem 2SO-ccm-Rundkolben mit Magnetruhrer, Kuhler und Tropftrichter werden 2.1 g

(55 mMol) LiAIH4 in 125 ccm absol. Ather suspendiert und 50 mMol Nitrosumin in ca. 20ccm absol. Ather innerhalb von 15 Min. zugetropft. Nach 1 Stde. Kochen, Abkiihlen und Zusetzen von 4.0 ccm Wasser wird filtriert und der Ather abgedampft. Man destilliert den Ruckstand bis einschlieRlich Dibutylhydrazin bei 760 Torr, die haheren Hydrazine i. Vak.

5- Nitro-2- h ydroxy-benzal- Deri vale 5 mMol unsymmetrisches Hydrarin werden zu einer Losung von 0.84 g (5 mMol) 5-Nitro-

2-hydroxydenzaldehyd (Schuchardt, reinst) in 10 ccm Xthanol gegeben. Das Gemisch wird 5 Min. lang zum Sieden erhitzt. Nach dem Abkiihlen (z. T. unter Eiskuhlung) kristallisiert das 5-Nitro-2-hydroxy-benzulhydrazin aus. Die Ausbeute betragt noch nach zweimaligem Umkristallisieren aus Athano1 40--80%. Die Schmpp. und Spektren der Benzalhydrazine sind in Tab. 2, die Analysendaten in Tab. 3 zusammengefaRt.

Reduktion der Nitrosnmine im Mikromajstab Eine Losung von ca. 10 y Nitrosumin in 5 ccm absol. Ather (oder auf Kieselgel nach

1. c. 14.151 vorgetrennte und mit Ather extrahierte Nitrosamine) werden in einem Reagenzglas mit 20-30 mg LiAIH4 versetzt. Nach 1 Stde. bei Raumtemperatur wird uberschiiss. Reduk- tionsmittel durch Zugabe von einem Tropfen Wasser zersetzt. Man fugt zwei Tropfen khan01 hinzu und filtriert. Das Filtrat wird unmittelbar zur Umsetzung in die Benzal- derivate verwendet.

5-Nitro-2-hydroxy-benzal-Derivate im Mikromajstub Vorstehendes Filtrat wird nach Zusatz von 20 y 5-Nitro-2-hydroxy-benzuldehyd in Athanol

solange im Wasserbad erhitzt, bis der Ather verdunstet ist. Die Lasung wird anschlieaend fur die Diinnschichtchromatographie verwendet.

Diinnschichtchromatographie der Benzalhydrazine Schicht: Kieselgel G, 250 p, 2 Stdn. bei I 10' aktiviert. Laufrnittel: Tetrachlorkohlenstoff/

khylacetat (95 : 5); fur 4-Amino-I-methyl-piperazin und 4-Amino-morpholin Chloro- form/Methauol (95 : 5).

20) A. MEHLITZ, K. GIERSCHNER und T. MINAS, Chemiker-Ztg. 87, 573 [1963].

1964 ldentifizierung von N-Nitroso-Verbindungen und asymmetrischen Hydrazinen 1637

Um die Flecke besser sichtbar zu machen, wird die Platte anschlieflend mit 3-prOZ.. athanol. Kaliumhydroxydlgsung bespruht. Nachweisgrenze 0.5 y. Noch intensiver, aber unspezifisch, ist die Blauflrbung der Benzalhydrazine mit 1 -proz. Kaliumhexacyanoferrat(lI1)- Lasung in 5-proz., waRr. Salzsaure nach Erwarmen. Nachweisgrenze 0.05 y.

Tab. 3. Analysendaten der dargestellten 5-Nitro-2-hydroxy-benzal-Derivate von Hydrazinen

Benzalderivat von Summenformel (Mol.-Gew.) C H N

Dimethylhydrazin

Diathylh ydrazin

Di-n-propylhydrazin

Di-n-butylhydrazin

Di-n-pentylhydrazin

Di-n-hex ylhydrazin

Diisopropy lhydrazin

Dusobut yl h ydrazin

Methyllthylhydrazin

Methylbutylhydrazin

Methylpentylhydrazin

khylheptylhydrazin

Diallylh ydrazin

Methylallylhydrazin

I-Amino-pyrrolidin

I-Amino-piperidin

4-Amino-morpholin

4-Amino-I-methyl-piperazin

Methylphenylhydrazin

khylphenylh ydrazin

Diphenylhydrazin

Ber. Gef. Ber. Gef. Ber. Gef. Ber. Gef.

Ber. Gef. Ber. Gef. Ber. Gef. Ber. Gef. Ber. Gef. Ber. Gef.

Ber. Gef. Ber. Gef. Ber. Gef. Ber. Gef. Ber. Gef. Ber. Gef. Ber. Gef. Ber. Gef. Ber. Gef.

51.72 5.31 20.11 51.84 4.95 19.84 55.74 6.38 17.73 55.78 6.13 17.75 58.92 7.23 15.86 59.16 6.77 16.32 61.48 7.91 14.34 61.60 7.29 14.70

65.38 65.60 58.92 58.84 61.48 61.36 53.86 53.81 57.42 57.38 58.92 59.28

59.82 59.64 56.22 55.96 56.22 56.20 57.88 58.18 52.63 52.63 54.59 54.62 62.04 61.94 63.21 63.05 68.53 68.55

8.95 8.45 7.23 6.99 7.91 7.93 5.88 6.06 6.83 6.62 7.23 6.84

5.79 5.49 5.58 5.75 5.58 5.49 6.07 5.76 5.22 5.51 6.1 I 6.38 4.84 4.48 5.31 5.27 4.54 4.80

12.04 12.26 15.86 15.85 14.34 14.71 18.84 18.97 16.74 15.79 15.86 15.70

16.10 16.00 17.88 18.01 17.88 17.97 16.88 17.41 16.74 17.00 21.22 20.64 15.51 15.87 14.75 14.71 12.62 12.70

1638 NEURATH, PIRMANN und DUNGER Jahrg. 97

Tab. 3 (Fortsetrung)

Benzalderivat von Summenformel (Mo1.-Gew.) C H N

Methylbenzyl hydrazin G s H 1sN303 Ber. 63.21 5.31 14.75 (285.3) Gef. 63.21 5.59 14.68

von Aminen und monosubstituierten Hydrazinen Methylamin

Methylhydrazin

Anilin

Phenylh ydrazin

CSHSN203 Ber. ( I 80.2) Gef.

CSH9N303 Ber. (195.2) Gef.

CI 3HirN203 Ber. (242.2) Gef.

Ci3Hi 1N3O3 Ber. (257.3) Gef.

53.38 4.48 15.56 53.43 4.44 15.21 49.27 4.65 21.55 49.20 5.01 21.00 64.52 4.17 11.58 64.94 4.16 11.67 60.75 4.31 16.35 60.88 4.55 16.70