タンデム LC/MS の感度を高める iFunnel テクノロジー

Agilent 6490 トリプル四重極 LC/MS システムに搭載

技術概要

概要

エレクトロスプレーイオン化 (ESI) は、幅広い化合物の分析に利用できる確実な手法として確立されています。しかし、ESI により生成された分析対象イオンのうち、質量分析計に送りこまれるイオンは 1 % を大きく下回り、MS 検出器でシグナルレスポンスを生じさせるイオンは 103～ 105 個に 1 個の割合にすぎないことが、研究により明らかになっています 1。この点が、LC/MS の感度の根本的な制約となっています。アジレントの新しい iFunnel テクノロジーは、Agilent Jet Stream (AJS) テクノロジーの優れた ESI イオン生成およびフォーカシング機能と、質量分析計のイオンオプティクスに送りこまれるイオン量を大幅に増加させるヘキサボアキャピラリ

サンプリングアレイを組み合わせたものです。また、独自のデュアルステージイオ

ンファネルにより、イオン透過率を向上させると同時に、より多くのガスを除去す

ることが可能になっています。この革新的なデザインにより、装置への汚染や中性

物質の混入が抑制され、システム全体のシグナルが大幅に高まると同時に、システ

ムノイズが減少します。この技術概要では、新しい 6490 トリプル四重極 LC/MS システムに搭載された iFunnel テクノロジーにより、四重極のタンデム質量分析計において、従来の流量で初めてゼプトモル (10-21 モル ) 域の感度を実現できることを説明します。

著者

Paul Momoh、Anabel Fandino、 Ed Aisawa、Tim Schlabach、 Ken Miller、George StaffordAgilent Technologies, Inc. Santa Clara, CA USA

Agilent 1290 Infinity LC システムと iFunnel を搭載する Agilent 6490 トリプル 四重極 LC/MS

2

0.1

1

2

2

x10

0

- MRM (321.00000 -> 152.00000)

カウント vs. 取り込み時間 (分)1.5

クロラムフェニコール

標準的な ESI

Agilent Jet Stream テクノロジー

よるイオンサンプリングを向上させます。AJS テクノロジーでは、イオン源での噴霧中に生じた液滴が、熱により効率的に脱溶媒化されます。精密な微小スプレイヤーが加熱シースガスにより液滴を包み込み、特徴的な熱濃縮ゾーンにイオンを集束させる噴霧状態を生み出し、非常に効率よく MS システムにイオンを導入することが可能となりました。最高 400 ºC (ヒーター設定温度) に加熱された高流速シースガスを用いてイオンが濃縮された領域を形成し、標準的な ESI イオン源により生成されるスプレー噴霧状態のおよそ 5 分の 1 のサイズに集束させます。このスプレーによる集束を図 1 に示しています。この図では、標準的な ESI スプレー噴霧状態と、それよりも小さい AJS スプレー噴霧状態を比較しています。高温ガスによりスプレーを集束させることで、サイズの小さい液滴が生み出されます。

ESI または AJS により生じるシグナルを比較すると、図 2 に示すように、サーマルフォーカシングを用いた場合のほうが、シグナル強度が数倍も向上することがわかります。

Agilent Jet Stream 技術新しい 6490 トリプル四重極 LC/MS システムのデザインでは、感度を高めるために、総合的なアプローチが採用されています。特に、気相状態でのイオン生成と、その後の質量分析計へのイオンの移動を重視した結果、イオン透過率を向上させ、システム全体のノイズを低減しました。

エレクトロスプレーの噴霧領域の写真を見れば、大気圧 ESI プロセスの途中で多くの分析対象イオンが失われてしまう 2 つの理由がわかります。1 つ目の理由は、脱溶媒化が不十分なために、噴霧されたスプレー液滴中に分析対象イオンが保持されること。そして 2 つ目が、液滴および脱溶媒化されたイオンの多くが、MS 注入口のエントランスから離れてしまうことです。イオンが大気気体に浮遊して運ばれることを考えると、静電場のみを使ってすべてのイオンを捕捉することは不可能です。

Agilent Jet Stream (AJS) サーマルグラジエントフォーカシングテクノロジーは、この 2 つの問題を克服し、大気圧 ESI に

図 1. Agilent Jet Stream スプレーの封じ込め緑 = 標準的な ESI オレンジ = Agilent Jet Stream

図 2. 飲料水に添加したクロラムフェニコールをネガティブイオンモードで分析した場合における MRM 強度の比較。50 ppb 溶液を 5 µL 注入。

3

キャピラリ数の増加に加えて、キャピラリの長さを 50 % 短くし、キャピラリガスフローの抵抗を抑えています。これにより、イオン透過率のロスが最小限に抑えられ、大気サンプリングの効率がさらに向上します。

キャピラリの数が増えると、質量分析計のガス負荷量がキャピラリ数に比例して増加します。Agilent 6460 トリプル四重極 LC/MS のシングルボアキャピラリでは、大気気体が質量分析計に取り込まれる流量は 2 L/min です。それに対して、短いヘキサボアキャピラリサンプリングアレイのガス取り込み流量はおよそ 23 L/min です。AJS 熱封じ込めゾーンにより、多くのイオンがサンプリングされるようになりますが、イオンと大量のガスを分離する必要も生じます。

それに代わるアプローチが、AJS 熱濃縮ゾーンの中央にあたるイオンの豊富な領域全体にわたって、複数のキャピラリを配置することです。複数のキャピラリを使えば、イオンサンプリング効率が向上し、良好な脱溶媒能力も維持できることが明らかになっています。6490 トリプル四重極 LC/MS では、図 4 に示すように、6 つのキャピラリを円形に配置しています。6 つのキャピラリは幅 3 mm にわたって配置され、AJS 熱封じ込めゾーンの気相イオンを高効率にサンプリングするインターフェースとなります。標準的な ESI でも効果を期待できますが、AJS で生成されたイオン集束ゾーンでは、効果はさらに劇的なものになります。

ヘキサボアサンプリング キャピラリ

このように感度が向上したにもかかわらず、さらなる実験では、集束された AJS 噴霧中で生成されるイオンの多くが、質量分析計で捕捉されていないことが明らかになりました。質量分析計のエントランスキャピラリ正面に位置する AJS 噴霧状態の横方向の位置を変える実験を行いました。図 3 のデータでは、もっとも多くのイオンが生成されるのは、噴霧中心から水平方向に 3～ 5 mm の範囲の領域であることが示されています。イオンは通常、MS システム用のシングルインレットキャピラリに取り込まれます。標準的なアジレント製キャピラリの内径は 600 µm です。

イオン熱濃縮ゾーン内にあるキャピラリインレットの入口部を大きくすれば、イオンサンプリング効率を高めることが可能です。従来の MS システムでは、単純にシングルエントランスキャピラリの直径を大きくして、感度を高める手法がとられてきました。しかし当然のことながら、こうしたアプローチでは、イオンサンプリング効率が大幅に向上するわけではないため、感度の向上は限定的なものになります。ほとんどのイオンは空間的に捕捉不可能なので、質量分析計へ移動できません。直径が大きいキャピラリの場合、気体の流れが穏やかな層流から乱流に変化し、イオンのロスにつながります (さらに、質量分析計のガス負荷量は、キャピラリ直径の 4 乗に比例して増加します。つまり、直径がほんの少し大きくなっただけでも、大気気体負荷量が大きく増加し、真空システムを改良する必要が生じます)。

図 3. AJS のスプレー噴霧を中心から横方向に移動させた場合における標準化されたイオン強度。イオン強度がもっとも高くなるのは、サンプリングキャピラリ表面の幅 3～ 5 mm の領域です。

図 4. ヘキサボアキャピラリサンプリングアレイ と開口部プレート。ヘキサボアキャピラリは AJS 熱濃縮ゾーン全体に配置されているため、イオンサンプリング効率が高まります。

0.5

1

0-6.5 -5.5 -4.5 -3.5

強度分布

距離 (mm)-2.5 -1.5 -0.5 0.5 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5

標準化された強度

300 °C400 °C

200 °C100 °C33 °C

4

デュアルイオンファネル

この問題を解決するのが、イオンファネルシステムの導入です。イオンオプティクスの構成要素であるこのシステムは、真空度が高めの第 1 ステージから直接導入されるイオンと同様に広く分散したイオンも効率的に取込み、集束させることが可能です。

6490 トリプル四重極 LC/MS システムでは、デュアルイオンファネルアセンブリが導入されました。このアセンブリは、図 5 に示すように、2 段階でガスを除去します。第 1 のファネルは高圧で、粗引き用のロータリーポンプによって保たれています。この第 1 のファネルの直流電圧と高周波電圧がイオンを前方へ送り出し、第 2 の低圧ファネルの入口に合わせてイオンの軌道を集束させます (第 1 のファネルの中心軸が、キャピラリおよび第 2 のファネルの中心軸とずれている点

に注目してください。これにより、中性分子が下流のイオンオプティクスに侵入するのを防ぎます)。第 2 の低圧イオンファネルでも、このプロセスが繰り返されます。標準的なスキマー /Q0 オプティクスアセンブリと比べて、第 2 のファネルから出るガスの量が少なくなり、ターボポンプのガス負荷量が減少します。これにより、ポンプの稼動寿命も長くなります。

AJS のサーマルフォーカシング機能は、ESI スプレー噴霧を集束させ、キャピラリアセンブリでより多くのイオンを捕捉することができます。ヘキサボアサンプリングアレイは、より広角な円錐状のスプレー噴霧状態を捕捉し、ガスと中性分子をイオンから分離するデュアルイオンファネルと連携して機能します。この iFunnel テクノロジーの 3 つの要素がすべて組み合わされることで、感度が劇的に向上します。

アジレントの iFunnel テクノロジーは、Agilent Jet Stream テクノロジーとヘキサボアキャピラリサンプリングアレイ、デュアルステージイオンファネルアセンブリの組み合わせにより、イオンサンプリング効率とイオン透過率を高めます。

図 5. iFunnel デュアルイオンファネルアセンブリは、大気ガスと中性分子を除去し、イオンを Agilent 6490 トリプル四重極 LC/MS の低圧オプティクスへ導きます。

5

図 8 に示すように、イオン強度の向上は、ネガティブイオンでよりいっそう顕著です。シグナル強度は、6490 トリ プル四重極の質量範囲全体で、平均 10 倍も向上しています。

ポジティブ ESI モードで平均 6 倍向上しています。通常、シグナル強度は、6490 の質量範囲全体で一貫して向上します。

200 400 600 800 1000 1200 1400

カウント

10x

14x

11x

10x

7x

113

302

602

1034

1334

iFunnel テクノロジー搭載の 6490

Agilent Jet Stream テクノロジー搭載の 6460

0

4x105

3x105

2x105

1x105

1x106

2x106

3x106

0

4x106

5x106

Da

6490 トリプル四重極に搭載された iFunnel テクノロジーによる 感度の向上

iFunnel テクノロジーを備えた新しい 6490 トリプル四重極 LC/MS では、AJS およびシングルサンプリングキャピラリを備えた 6460 トリプル四重極と比べて、アルプラゾラムのシグナル/ノイズ比が 10 倍も向上します (図 6)。6490 では、ポジティブイオンモードとネガティブイオンモードの両方で、多くの化合物の感度が大幅に向上することが確認されています。

図 7 に示すように、iFunnel テクノロジーによる感度の向上は、質量スペクトル全体にわたっています。シグナル強度は、

図 6. アルプラゾラム、オンカラム 1 pg。A. Agilent Jet Stream を搭載する標準的な 6460: S/N = 1,157:1 B. iFunnel テクノロジーを搭載する新しい 6490: S/N = 11,640:1

x102

0

1

2

3

4

カウント vs. 取り込み時間 (分)1 2

A S/N 1157.1

0

1

2

カウント vs. 取り込み時間 (分)1 2

B S/N 11640.1x103

図 8. 6490 (上 ) および 6460 ( 下 ) のネガティブ ESI モードにおける較正標準物質のシグナル強度は、6490 では質量範囲全体で強度が向上することを示しています。

200 400 600 800 1000 1200 14000

5x105

1x106

2x106

3x106

1222

922

622

322

118

5x

5x

7x

7x

カウント

iFunnel テクノロジー搭載の 6490

7x

0Agilent Jet Stream テクノロジー搭載の 6460

4x105

3x105

2x105

1x105

Da

図 7. 6490 (上 ) および 6460 ( 下 ) のポジティブ ESI モードにおける較正標準物質のシグナル強度は、6490 では質量範囲全体で強度が向上することを示しています。

6

iFunnel テクノロジーによる劇的なシグナル強度の向上は、検出下限の大幅な向上につながります。オンカラムでわずか 100 アトグラムのベラパミルを注入した分析では、ノイズと明確に区別できるレスポンスが得られています (図 9)。このケースのベラパミルの検出下限は、約 100 ゼプトモルです。

血漿や尿といった複雑なマトリックスに含まれるサンプルは、分析がきわめて困難です。生物分析において選択性を高める 1 つの方法として、プリカーサイオンの取り込みマス幅を小さくして、化学的干渉の可能性を排除するという手法があります。その例として、血漿中プロピオン酸フルチカゾン 2.5 fg の分析結果を図 10 に示しています。狭い取り込みマス幅 (0.4 Da) では、化学的ノイズが大幅に減少するため、分解能が低い (0.7 Da) 場合に比べて検出下限 (LOD) が 2 倍向上します。0.4 Da における LOD は 1 fg です。

図 10. 血漿サンプル中のプロピオン酸フルチカゾン 2.5 fg。分解能 0.7 Da (赤 ) および 0.4 Da (青 ) のプリカーサ分離を用いた MRM データ。取り込みマス幅が狭いと、不要なシグナルが減り、検出下限が向上します。

0.9取り込み時間 (分)

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

x101

4.2

4.3

4.4

4.5カウント

x101

5

6

7

カウント vs. 取り込み時間 (分)0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4

Q1 ユニット (0.7 Da)Q2 ユニット (0.7 Da)

Q1 拡張 (0.4 Da)Q2 ユニット (0.7 Da)

4

図 9. ベラパミル 100 アトグラム (オンカラム ) を新しい 6490 トリプル四重極で分析した結果

7

参考文献

1. J. S. Page, R. T. Kelly, K. Tang, R. D. Smith, “Ionization and transmission efficiency in an electrospray ionization-mass spectrometry interface,” J. Am. Soc. Mass Spectrom., 18:15821590, 2007.

まとめ

iFunnel テクノロジーを搭載した 新しい 6490 トリプル四重極 ・タンデム LC/MS の感度が大幅かつ 安定して向上

・ポジティブイオンとネガティブイオンの感度がともに劇的に向上

・汚染を防ぐ堅牢な設計

・最大 6 桁の直線ダイナミックレンジ

・拡張プリカーサ分離で 0.4 Da という Q1 分解能

・一部の化合物でゼプトモル域の検出下限

・マトリックス中の化合物でアトグラム域の検出下限

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アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 2010Printed in Japan. May 21, 20105990-5891JAJP