• Il più piccolo oggetto che l’occhio umano può percepire è quello che interessa almeno 10 cellule sensoriali, però se avviciniamo l’oggetto all’occhio questo interesserà più cellule e quindi apparirà più grande (dimensioni reali, dimensioni apparenti).

• Ad occhio nudo non possiamo diminuire illimitatamente la distanza tra l’oggetto e l’occhio perché a partire da una distanza minima il cristallino non riesce più a mettere a fuoco (250mm).

• Se vogliamo aumentare l’angolo che sottende l’oggetto e vederlo ingrandito a maggiori dettagli dobbiamo mettere una lente tra l’oggetto e l’occhio. La lente trasmette un’immagine ingrandita su un piano che possiamo comodamente osservare.

• Microscopio semplice: formato da una sola lente (obiettivo)

• Microscopio composto: formato da almeno 2 lenti oltre alla prima detta obiettivo, si usa una seconda lente detta oculare che prende l’immagine proiettata dalla prima per ingrandirla ulteriormente.

Microscopia: osservazioni superiori a 30 ingrandimenti

STEREOMICROSCOPI

•Campioni non preparati

•Generalmente non piatti

•Effetto 3D

•Ingrandimenti fino a 200x

•Alta distanza di lavoro

•Profondità di fuoco elevata

•Ampio campo visivo

MICROSCOPI OTTICI

•Ingrandimenti fino a 1500x

•Elevata correzione ottica

•Elevata risoluzione

•Elevata “qualità”dell’immagine

•Tecniche di osservazione “particolari” (interferenziale)

STEREOMICROSCOPIMICROSCOPI OTTICI

Lo stereomicroscopio

• Uno stereomicroscopio trasferisce un’ immagine profonda di oggetti a tre dimensioni

• Come nell’osservazione comune, ognuno dei due occhi vede l’oggetto da una direzione diversa rispetto all’ altro

• Il cervello elabora le due immagini e le unisce in una sola immagine stereoscopica

Componenti di uno stereomicroscopio

• Oculare

• Tubo binoculare

• Corpo ottico

Supporto

• Obiettivo

• Colonna e sistema di messa

a fuoco

• Base

Il microscopio

• Il microscopio trasferisce un immagine ad alto ingrandimento e ad alta risoluzione

• Il percorso ottico è singolo e viene sdoppiato solo per rendere più ergonomica la visione

• Il cervello elabora le due immagini e le unisce in una sola immagine non stereoscopica

Condensatore

Campione

Tubo fotografico

Sistema di acquisizione immagini

Osservatore

FiltriDiaframma di campo

Diaframma di apertura

Specchio

Obiettivo

Stativo

Tecniche di osservazione

Campo chiaro

Campo oscuro

Contrasto di fase

Contrasto interferenziale

Osservazioni in Luce polarizzata POL

Fluorescenza

Il Campo Chiaro• La luce passa direttamente attraverso l’obiettivo • Difrazione, rifrazione e assorbimento della luce formano

l’immagine microscopica• Luminosità, Risoluzione, Contrasto e Profondità di Campo

sono i parametri che determinano la qualità dell’immagine

Campo OscuroCon la microscopia in campo oscuro si osservano campioni non visibili in campo chiaro, sia perché trasparenti o perché al di sotto del potere di risoluzione del microscopio.

Con la microscopia in campo oscuro si osservano campioni non visibili in campo chiaro, sia perché trasparenti o perché al di sotto del potere di risoluzione del microscopio.

La luce non arriva perpendicolarmente all’obiettivo ma viene difratta da un anello che si trova nel condensatoreSolo la luce difratta è utilizzata per la formazione dell’immagine.

Campo Oscuro

Effetti della ossidazione su metallo

Contrasto di Fase

La microscopia in Contrasto di Fase consente di osservare oggetti viventi, cellule o tessuti molto sottili oggetti trasparenti e non colorati

Contrasto InterferenzialeLa microscopia in Contrasto Interferenziale o Nomarski (DIC) viene utilizzato per l’osservazione di organismi vivi, oggetti molto sottili non colorati e con minime differenze di indice di rifrazione rispetto al mezzo o tra le loro parti

Larva di Riccio di mare Micromanipolazione

Polarizzazione

•Polarizzazione lineare della luce•Birifrangenza•Componenti per il contrasto pol•Immagini ed esempi

•LUCE POLARIZZATA:Fibre Tessili

IMMAGINI PRESE CON I VARI METODI DI CONTRASTO

Campo chiaro ICR

Luce polarizzataCampo scuro

METODI DI CONTRASTOMETODI DI CONTRASTOFibreFibre TessiliTessili

Campo chiaro

Luce polarizzata

Luce polarizzata con lamina lambda

Potere di Risoluzione

Il Potere di Risoluzione è la possibilità di distinguere distintamente 2 punti molto vicini

SEM SEM ((MMicroscopia icroscopia EElettronica a lettronica a SScansione) cansione) Potente tecnica per l’osservazione e la caratterizzazione di superficie di materiali organici ed inorganici eterogenei.

Storicamente il SEM è nato come tecnica a sé stante mentre in seguito è stato combinato con l’EPA (Electron Probe Analyzer) in un’unica apparecchiatura permettendo di ottenere contemporaneamente informazioni topografiche e composizionali della stessa area del polimero

•• strumento sofisticato, ma relativamente semplice da usarestrumento sofisticato, ma relativamente semplice da usare•• l’interpretazione dei risultati può essere abbastanza l’interpretazione dei risultati può essere abbastanza semplicesemplice

Limitazioni all’uso sui polimeri:Limitazioni all’uso sui polimeri:•• i polimeri sono in genere cattivi conduttorii polimeri sono in genere cattivi conduttori•• gli elettroni accelerati possono danneggiare il campionegli elettroni accelerati possono danneggiare il campione

Gli elettroni vengono in genere Gli elettroni vengono in genere generati per emissione termoionica generati per emissione termoionica da un filamento di W, ripiegato a V, da un filamento di W, ripiegato a V, dalla zona in prossimità della punta.dalla zona in prossimità della punta.

ee-- convergono nella regione cross overconvergono nella regione cross overAnodo forato accelera eAnodo forato accelera e-- (tensione (tensione 00--50 50 kVkV))Sistema di lenti elettromagneticheSistema di lenti elettromagneticheDiaframma finale definisce l’apertura del Diaframma finale definisce l’apertura del fascio sul campionefascio sul campione

Il SEM viene usato sempre in condizioni di vuoto dell’ordine di 10-4 mbar con una pompa meccanica più una turbomolecolare

Perché?

In un ambiente con aria il fascio sarebbe instabile

I gas potrebbe reagire con la sorgente causandone la combustione

I gas potrebbero ionizzarsi causando scariche

Si potrebbero formare composti tra le molecole dell’atmosfera e quelle del campione

e- incidenti

e- trasmessi

e- retrodiffusi (E tra 50 eV e E incidente)Raggi X e- secondari (E tra 0 e 50 eV)

e- AugerFotoni

Conducibilità indottae- assorbiti

e- incidenti

1 nm e- AugerSuperficie campione5-50 nm e- secondari

raggi X del continuo

1-2 µm e- retrodiffusi 2-5 µm raggi X caratteristici

raggi X di fluorescenza

CONTRASTOCONTRASTOComposizionaleComposizionale::le rese in elettroni secondari ed elettroni le rese in elettroni secondari ed elettroni retrodiffusiretrodiffusi aumentano all’aumentare del numero atomico, ma l’effetto aumentano all’aumentare del numero atomico, ma l’effetto è apprezzabile solo se le regioni a diversa composizione hanno cè apprezzabile solo se le regioni a diversa composizione hanno confini onfini nettinetti

TopograficoTopografico: : è il più importante visto che la maggior parte delle è il più importante visto che la maggior parte delle applicazioni SEM sono volte allo studio della forma dei campioniapplicazioni SEM sono volte allo studio della forma dei campioni. Trae . Trae origine dal fatto che il numero e le traiettorie degli eorigine dal fatto che il numero e le traiettorie degli e-- secondari ed esecondari ed e--

retrodiffusiretrodiffusi dipende dall’angolo tra il fascio e la superficie del dipende dall’angolo tra il fascio e la superficie del campione.campione.

Mappa Mappa XX--raysrays::Se lo strumento dispone di un detector per raggi X, il Se lo strumento dispone di un detector per raggi X, il segnale caratteristico di un particolare elemento può segnale caratteristico di un particolare elemento può essere mostrato sullo schermo contemporaneamente essere mostrato sullo schermo contemporaneamente alla scansione. alla scansione.

RISOLUZIONERISOLUZIONE

la risoluzione è limitata dalle dimensioni del fascio e la risoluzione è limitata dalle dimensioni del fascio e quindi dall’ottica dello strumento, ma dipende anche da quindi dall’ottica dello strumento, ma dipende anche da ciò che accade agli elettroni dopo l’impatto con il ciò che accade agli elettroni dopo l’impatto con il campione campione

dimensioni medie del fascio: 5dimensioni medie del fascio: 5--10 10 nmnm

la massima risoluzione sarà maggiorela massima risoluzione sarà maggiore

PREPARAZIONE DEL CAMPIONEPREPARAZIONE DEL CAMPIONE•• Dimensioni variabili, tipicamente Dimensioni variabili, tipicamente ∅∅ ca. 10mmca. 10mm

•• Per i materiali non conduttori (polimeri) è indispensabile ricoPer i materiali non conduttori (polimeri) è indispensabile ricoprire prire il campione con uno strato sottile di un conduttore il campione con uno strato sottile di un conduttore

METALLIZZAZIONEMETALLIZZAZIONE::•• Au, ca. 25 Au, ca. 25 nmnm (alta resa SEI)(alta resa SEI)•• lega Aulega Au--PdPd•• AlAl•• C, strato sottile (bassa resa SEI, indicato per C, strato sottile (bassa resa SEI, indicato per XX--raysrays))

•• analisi di frattureanalisi di fratture

•• sezionisezioni

•• etchingetching (trattamenti fisici, solventi o miscele di solventi (trattamenti fisici, solventi o miscele di solventi p.es. HMnOp.es. HMnO44, HNO, HNO33))

ARTEFATTIARTEFATTI

•• oggetti estranei inglobati accidentalmenteoggetti estranei inglobati accidentalmente

•• modificazioni intervenute durante la preparazione del modificazioni intervenute durante la preparazione del campione o durante l’analisicampione o durante l’analisi

–– DecomposizioneDecomposizione–– Aumento di temperaturaAumento di temperatura–– Scissioni di catena Scissioni di catena

CONDIZIONI OPERATIVECONDIZIONI OPERATIVEper l’uso su polimeriper l’uso su polimeri

•• PotenzialePotenziale:: un potenziale più elevato garantisce una un potenziale più elevato garantisce una migliore risoluzione, ma aumenta il rischio di migliore risoluzione, ma aumenta il rischio di artefatti e il campione si carica in misura maggioreartefatti e il campione si carica in misura maggiore

•• CorrenteCorrente: : un’elevata corrente aumenta la produzione di artefatti ed un’elevata corrente aumenta la produzione di artefatti ed acuisce il problema della carica, ma la corrente minima è acuisce il problema della carica, ma la corrente minima è determinata dall’esigenza di mantenere un buon rapporto determinata dall’esigenza di mantenere un buon rapporto segnalesegnale--rumore e dipende quindi dalle prestazioni del rumore e dipende quindi dalle prestazioni del detectordetector

•• IngrandimentoIngrandimento: : ad ingrandimenti elevati aumenta l’intensità di ad ingrandimenti elevati aumenta l’intensità di corrente per unità di area, aumentando quindi il corrente per unità di area, aumentando quindi il rischio di danneggiare il campionerischio di danneggiare il campione

UHMWPE caricato con sferette di vetroUHMWPE caricato con sferette di vetro

Adesione di Adesione di macrofagimacrofagi su film di su film di poletilenepoletilene

Fibre di poli(Fibre di poli(vinilalcolvinilalcol))

Retine in polipropilene Retine in polipropilene per il sostentamento per il sostentamento

della parete della parete addominaleaddominale

nuovanuova espiantataespiantata14 mesi14 mesi

nuovanuova espiantataespiantata50 mesi50 mesi

Retine in Retine in poli(poli(etilentereftalatoetilentereftalato) per ) per

il sostentamento della il sostentamento della parete addominaleparete addominale