http://www.flandersfood.com/artikel/2009/04/02/immobilisatie-van-%C3%9F-galactosidase

Immobilisatie van de enzymen op de Ca-alginaat-zetmeel-beads gedurende 2 maanden zorgt voor 61% behoud van de activiteit van de enzymen. THF geimmobiliseerde enzymen hebben na 6 weken al een verlies van 31% van de activiteit van de enzymen.

Immobilisatie van enzymen

Beatriz M. Brena and Francisco Batista-Viera

In dit deel van de literatuurstudie worden de verschillende methodes besproken die je kan uitvoeren om enzymen te immobiliseren en het nut van het immobiliseren.

Inleiding

Immobilisatie van een enzym is een manier om de stabiliteit van het enzym te verbeteren. Hierbij worden enzymen fysiek beperkt of gelokaliseerd op een bepaald vaste drager of matrix zodat men hun activiteit optimaal kan gebruiken. Door het enzym te immobiliseren wordt de levensduur van het enzym aanzienlijk verlengd en is het beter beschermd tegen veranderende condities in de reactor zoals pH, temperatuur, concentratie van het reagens,... . Vrije enzymen zijn immers minder geschikt als ze in minder optimale omstandigheden van de substraatcondities geplaatst worden omdat ze dab heel snel onstabiel worden. Na een reactie is het uiterst moeilijk om deze vrije enzymen terug te verwijderen van de reactor en zijn producten, wat betekent dat men de enzymen niet kan hergebruiken. Enzymen zijn helemaal niet goedkoop dus is het belangrijk om zuinig met de proteinen om te gaan en ze te hergebruiken, zeker in industriele processen waar men op grote schaal met hen werkt. De industrie wilt de productie kosten van hun afgewerkte eindproducten zolaag mogelijk houden, daarom is er al veel onderzoek gedaan naar het immobiliseren van enzymen om ze te stabiliseren en hergebruiken in processen.

De enzymen kunnen reacties katalyseren onder mildere condities met een hoge nauwkeurigheid op vlak van substraat specificiteit waardoor er ook minder ongewenste bij producten worden geproduceerd. Chemische bindingen in levende systemen of moleculen worden getransformeerd door de enzymen zodat uiteindelijk de eigenschappen van moleculen verandert. Molucelen bevatten duizenden afzonderlijk atomen die georganiseerd zijn in een bepaalde structuur en volgorde en hebben afhankelijk van deze structuur elk hun eigen functie in biologische of chemische processen. Het zijn de enzymen die deze structuur kunnen veranderen door de volgorde te veranderen zodat de functie/eigenschappen van de moleculen verandert.

Bij het immobiliseren zijn er 3 hoofd factoren die het uiteindelijke het rendement van het gemobiliseerd enzyme kunnen benvloeden: het enzyme zelf, de matrix en de methode van binding. (J.M. Guisan)

De matrix

De drager is zeer belangrijk voor het bepalen in welk soort reactor het enzym kan werken. In een stirring reactor moet de drager natuurlijk bestand zijn tegen impact en compressie, bij een kolomreactor moet de drager liefst poreus zijn voor een optimale werking tussen enzym en reagens (zo groot mogelijk oppervlak). Algemeen is een poreuze matrix zeer ideaal voor het optimaal gebruik van de enzymen doordat een groter oppervlak van de matrix zorgt voor meer capaciteit bij het binden van de enzymen en geeft tegelijkertijd bescherming tegen de omgevingsfactoren.Een niet-poreuze matrix heeft een gelimiteerde capaciteit en een lage diffusie grote doorheen de drager waardoor het reagens ook minder snel of in mindere hoeveelheden met de enzymen kan reageren. De industriele Biochemie is voorstander van een poreuze matrix van organische materie aangezien deze gesynthetiseerd kan worden waarbij de eigenschappen naar keuze kunnen worden aangepast. Agarose is een veelvuldig gebruikte matrix door zijn hoge porositeit, hydrofiel karakter, afwezigheid van geladen groepen die niet-speciefieke absorptie van substraat en producten belet en natuurlijk de commercile beschikbaarheid voor het gebruik op industrieel vlak.

Enkele voorbeelden van drager materiaal voor gemmobiliseerde enzyemn

Organisch:

Natuurlijke polymeren Polysacchariden: cellulose, dextrose, agar, agarose, chitine, alginaatProteinen: collageen, albumineKoolstog

Synthetische polymeren:PolystyreenAndere polymeren: polyacrylaat, polymethacrylaten, polyacrylamide, polyamides, vinyl en allyl-polymeren

Inorganisch:

Natuurlijke mineralen: bentonite, siliciumGeproduceerde materialen: glas (niet-poreus of gecontroleerd poreus), metalen, metaal oxiden

Binding

Het immobiliseren kan onderverdeeld worden in 2 hoofd catergorien, de reversibele en irreversibele methode waarbij het enzym enerzijds kan gerecupereerd worden van zijn drager zonder het te beschadigen en anderzijds zeker beschadigd wordt bij het verwijderen van zijn matrix. De sterkte van de binding is logischer wijze een factor die de gemmobiliseerde enzymen in deze catergorien in deelt.

irreversible enzyme immobilisatie

De bekendste technieken bij het irreversible immobiliseren zijn de covalente binding, omsluiting, micro-encapsullering.

Adsorptie van enzymen op een vaste stof is waarschijnlijk de makkelijkste manier om enzymen te immobiliseren. Het is gebaseerd op niet speciefiek interactie tussen de matrix en het enzym wanneer men deze met elkaar mengt. De binding bestaat voornamelijk uit waterstofbruggen, meerdere zoutbruggen and van der waals krachten waarbij een minimum aan activatie stappen nodig is. Daarom is dit de meest eenvoudig uit te voeren en goedkoopste immobilisatie techniek. Als gevolg van de zwakkere bindingen is desorptie door sterke veranderingen in pH, temperatuur,... veel voorkomend. (M.K. Goel, 1994)

Omsluiting in een gepolymeriseerde gel of een tralie netwerk is een andere methode van immobiliseren. De belangrijkste factor bij deze methode is de porie grootte, zodat gewenste molecule grootte kunnen diffunderen doorheen de porin. Men mengt een hydrofiele matrix in een waterige oplossing met het enzym zodat de enzymen worden opgevangen in het tralie werk. Een groot voordeel is dat de proteinen niet gebonden zijn aan het polymeer zodat in theorie de enzym moleculen niet verstoord worden en hun eigenschappen behouden. Een nadeel zijn de vrije radicalen die kunnen onstaan tijdens het polymerisatie proces van het polymeer en de activiteit van de enzymen negatief kunnen benvloeden. Omsluiting is enkel geschikt voor kleine proteine moleculen dus onbruikbaar voor enzymen die op macromoleculaire substraten werken zoals dextrase, trypsine,... . (Figuur d)(M.K. Goel, 1994)

Cross-linking wordt gekenmerkt door de meerdere covalente bindingen tussen het proteine en zijn matrix. Dit gebeurt door binding met de functionele groepen van moleculen of een onoplosbare drager. Men heeft 2 soorten cross-linking, eente met een matrix en een zonder de matrix. Bij cross-linking zonder een matrix zullen de enzymen aan elkaar gehecht worden waardoor er een enzym aggregatie onstaat genaamd 'CLEA' (cross linked enzym aggregate). De enzymen zijn stabiel, makkelijk recycleerbaar door hun gevormde cluster en hebben een hoge activiteit afhankelijk van hun manier van binding. Een nadeel van deze methode is dat de enzymen zich kunnen gaan gedragen als een dragen resulterend in een verlaagde enzymatische activiteit. Meestal wordt deze methode gebruikt in combinatie met een ander methode. (M.K. Goel, 1994)

De Covalente binding tussen het enzym en de matrix zorgt voor een zeer stabiele samenhang zodat deze niet makkelijk van elkaar gescheiden kunnen worden. Deze methode wordt voornamelijk gebruikt als het uiterst nodig is om het enzym gescheiden te houden van het gevormde product. De reactie moet gebeuren onder milde omstandigheden zodat het enzym niet gedeactiveerd wordt. Het actieve deel van het enzym mag ook niet aangetast worden anders verliest het zijn activiteit volledig. De koppeling kan in 2 klassen opgedeeld worden, eentje waarbij de matrix geactiveerd wordt door het toevoegen van een reactieve functie aan een polymeer en een andere waarbij de ruggengraat van het polymeer aangepast wordt zodat er een actieve groep ontstaat. Deze activatie processen zijn nodig om electrofiele groupen te creren die dan sterk reageren met de nucleofiele groupen van de proteinen. De functionele groepen amides, ether, thio groepen of carboxyl groepen zorgen voor een een gestabiliseerde binding. De covalente binding is een van de meest gebruikte technieken maar ook een van de duurdere en ingewikkeldste. Het resultaat mag er wel zijn aangezien het enzym uiterst stabiel is, makkelijk te hergebruiken en er minder kans is dat het enzym zich mengt met de verkregen producten in vergelijking met adsorptie. (Figuur b) (M.K. Goel, 1994) (Brena en Batista-Viera, 2006)

De entrapment methode maakt gebruik van een polymeer netwerk dat het enzym omsluit waarbij het substraat en het product kunnen penetreren maar de capsule impermeabel is voor het enzyme. Deze methode is mogelijk door gelimiteerd massa transport doorheen het membraan of gel. (Figuur c)

reversible enzyme immobilisatie

Deze methode gebruikt men voornamelijk voor economische redenen aangezien de matrix gescheiden kan worden van zijn huidig enzym en later terug kan geladen worden met verse enzymen. Een duurzaam gebruik van de drager kan kosten bij industrieel processsen flink doen dalen maar met moet wel oppassen voor enzymen lekken bij de procducten als de bindingen relatief zwak zijn.

Adsorptie met niet covalente interacties

Niet-specifieke adsorptie: De simpelste techniek bij deze methode is fysieke adsorptie waarbij de enzymen met de matrix verbonden zijn via waterstofbruggen, van der Waals krachten, hydrofobe interacties of de ionische binding tussen moleculen. De krachten die betrokken zijn bij de sterkte van het niet-covalent immobiliseren van enzymen worden bepaald door de condities zoals pH, temperatuur, polariteit van het solvent en de ionische sterkte. Adsorptie is een techniek die de activiteit van het enzym goed bewaard tijdens het immobiliseren en is economisch aantrekkelijk. Het kan wel voor problemen zorgen als er enzymen lekken in de producten door te zwakke interacties tussen matrix en enzym.

Ionische binding: Deze methode is gebaseerd op het proteine-ligand interactie met principes gebruikt in de chromatography, een voorbeeld is het gebruik van ion-exchangers. Een ligand is een ion of molecule dat aan een centraal metaal atoom bind om een gecordineerd complex te vormen. Maar het is moeilijk om condities te vinden waar de ion-exchangers tegelijkertijd een sterke binding vormt en de activiteit van het enzym optimaal realiseert. De polymeer-ionische liganden zorgen wel voor een optimalisering van eigenschappen van de producten.

Hydrofobe adsorptie: De interactie is niet gebaseerd op de chemische binding maar op de entropische gedreven interactie dus gebaseerd op de wanorde van het systeem. De sterkte van de binding is afhankelijk van de hydrofobische aspect van de matrix en het proteine. De hydrofobiciteit van de drager is regelbaar via de graad van substitutie van de matrix en de grootte van de hydrofobe ligand molecule. Men kan via Beta-amylase en amyloglucosidase de immobilisatie makkelijke omkeren en het enzym afzonderen van zijn drager.

Affiniteit binding: Deze methode is opmerkelijk in zijn selectiviteit bij de interactie tussen matrix en enzymen. Maar de procedure heeft meestal nood aan covalente binding van een kostelijke affiniteit ligand ( lectine of antibody) aan de matrix zodat deze methode op industrieel vlak niet al te interessant is.

Metaal binding of chelatietherapie

Immobilisatie via metalen gebeurt via overgangsmetaalzouten of hydroxides die op de organische matrixen geplaatst zijn en via nucleofiele groupen verbonden zijn met de matrix. Via verwarming of neutralisatie slaan de metaalzouten of hydroxides neer op de matrix (zoals cellulose, chitine, alginaatzuur en silicium gebaseerd dragers). Sterische factoren zorgen ervoor dat het onmogelijk is dat alle posities van het metaal reageren met de matrix. Hierdoor is er nog plaats voor enzymen om met de metalen te reageren en wordt de immobilisatie specifieke activiteit relatief hoog (30-80%). Maar de operationele stabiliteit zijn zeer variable bij deze methode en is daarom moeilijk om te reproduceren. Dit kan mogelijk komen door het bestaan van niet-uniforme adsorptie plaatsen of door het lekken van metaalionen. Men kan de vorming van adsorptie sites controleren door chelator ligands te immobiliseren op de vaste matrix via covalente bindingen. Zo zijn de metaal ionen stabiel en gecordineerd gebonden en zorgen ze voor behoud van het proteine.

Disulfide bindingen

Het maken van disulfide bindingen bij het immobiliseren is zeer uniek aangezien de stabiele covalente bindingen tussen matrix en enzymen makkelijk kunnen gebroken worden via dithiotreitol (DTT) onder milde condities. De activiteit van de thiol groepen kan aangepast worden door de pH te laten variren zodat de disulfide binding gevormd worden met een hoog rendement en de thiol reactieve adsorbent een hoge specificiteit krijgen. (Brena en Batista-Viena, 2006)

De algemene eigenschappen van de gemmobiliseerde enzymen

Het immobilizeren van enzymen kan er toe leiden dat sommige eigenschappen zoals de catalytische activiteit of de thermische stabiliteit gewijzigd zijn ten op zichte van zijn vrije enzymen. Deze wijziging kan veroorzaakt zijn door enerzijds verandering in de inwendige activiteit van het enzyme of door het verandering in de 3 dimensionale structuur veroorzaakt door de binding van het enzyme met de matrix. De operationele stabiliteit van het enzym wordt heel vaak verbetert door het immobiliseren op een vaste matrix waarbij de proteinen door meerdere punten via covalente binding worden bevestigd. Volgens een studie van enkele wetenschappers blijkt dat de stabilisatie van de enzymen en het aantal covalente bindingen samenhangend zijn op een min of meer lineaire manier. Een nadeel van het immobiliseren van enzymen is het verlies aan catalytische activiteit op macromoleculaire substraten. Hierbij is de gelimiteerd bereikbaarheid van het substraat voor de actieve plaats van het enzyme van grote invloed. De sterische restrictie van het substraat kan het karakterisiteke patroon van de gemaakte producten veranderen zodat er bijvoorbeeld minder producten gevormd worden of zelfs andere producten. Men kan deze sterische problemen voorkomen door specifiek de matrixen te selecteren of te synthetiseren.

Besluit

Het aanbrengen van enzymen op vaste oppervlakken (matrixen) zorgt ervoor dat de enzymen op de plaats blijven waar hun activiteit het meest vereist is. Het zorgt ook voor bescherming voor veranderende of extreme reactor condities zodat men voorkomt dat de heel kostbare enzymen vernietigd of beschadigd worden. Daarom is deze techniek van zeer groot belang in industrile processen om zo optimaal mogelijk en met zo min mogelijke kosten tijdens het productie proces de gewenste eind producten te verkrijgen. Onderzoek in de Biochemie naar de verschillende krachten en reacties op enzymen in een bioreactor is zeer belangrijk en wordt door vele wetenschappers in acht gesteld voor het ontwikkelen van steeds beter gemmobiliseerde enzymen.

URL: http://en.wikipedia.org/wiki/Ligand

URL: http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/IMMOB/goel2nd.htm (M.K. Goel, 1994)

URL: http://www.sprintechnologies.com/sprin/servlets/FileDownload?filePath=%2Fhome%2Fhttpd%2Fvhosts%2Fsprintechnologies.com%2Fhttpdocs%2Fsprin-docs%2Fcontenuti%2Fdocumenti%2F53&fileName=2009%20Enzyme%20Immobilization%20Techniques.pdf&fileContentType=application/pdf (Ulf Hanefeld,2008)

URL: http://www.flandersfood.com/artikel/2009/04/02/immobilisatie-van-%C3%9F-galactosidase

Chen, W., Chen, H., Xia, Y., Yang, J., Zhao, J., Tian, F., Zhang, H.P. & Zhang, H. (2009): Haider, T. & Husain, Q. (2009)