Immunpathologische Veränderungen in der Effektorphase des ... · Im dichten inflammatorischen Infiltrat der papillären Dermis finden sich u.a. eosinophile Granulozyten, die durch

Aus der Klinik für Dermatologie

der Universität zu Lübeck

Direktor: Prof. Dr. med. Detlef Zillikens

Immunpathologische Veränderungen in der Effektorphase des allergischen Kontaktekzems im

Menschen

Inauguraldissertation

zur

Erlangung der Doktorwürde der Universität zu Lübeck

-Aus der Medizinischen Fakultät-

vorgelegt von Christine Bangert

aus Mosbach

Lübeck 2009

1. Berichterstatter: Prof. Dr. Jürgen Grabbe

2. Berichterstatter: PD Dr. Helmut Haas

Tag der mündlichen Prüfung: 14.01.2010

zum Druck genehmigt. Lübeck, den 14.01.2010

gez. Prof. Dr. med. Werner Solbach

-Dekan der Medizinischen Fakultät -

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG 1

1.1. Definition und Klinik des Kontaktekzems 1

1.2 Die Histologie des allergischen Kontaktekzems 5

1.3 Haptene 7 1.4. Die Epikutantestung 10 1.5. Die Pathogenese des Kontaktekzems 12 1.5.1. Dendritische Zellen 13 1.5.2. T-Zellen im Kontaktekzem 18 1.5.3. Die Sensibilisierungsphase 20 1.5.4. Die Effektorphase 21

2 ZIELSETZUNG 25

3 MATERIAL UND METHODEN 26

3.1 Material 3.1.1 Patienten 26 3.1.2 Biopsien 28 3.1.3 Blutproben 28 3.1.4 Antikörper 29 3.1.5 Chemikalien 31 3.1.6 Verbrauchsmaterial 32 3.1.7 Geräte 33 3.1.8 Puffer 33

3.2 Methoden 3.2.1 Anfertigung von Gefrierschnitten 34 3.2.2 Immunhistochemie 34 3.2.3 Immunfluoreszenz 35 3.2.4 Auswertung der Immunfluoreszenz 36 3.2.5 Gewinnung von PBMC 37 3.2.6 Herstellung von Einzelzellsuspensionen 37 3.2.7. Zellzählung in Suspension 37 3.2.8. Durchflußzytometrie 38 3.2.8.1 Durchführung und Darstellung 38 3.2.8.2 Phänotypische Analysen von Oberflächenmarkern 38

4 ERGEBNISSE 40

4.1. Anzahl und Verteilung der Leukozyten 40 4.2. T-Zellen im ECT 42 4.2.1. Typisierung der T-Zellen im dermalen Infiltrat 42 4.2.2. Charakterisierung der CD4+/CD25+ T-Zellsubpopulation 45 4.3. DZ Populationen im ECT 50 4.3.1. LZ im ECT 50 4.3.2. DDZ im ECT 52 4.3.3. Maturationsverhalten von LZ und DDZ im ECT versus NH 53 4.3.4. PDZ im Infiltrat der ECT Reaktionen 55 4.3.5. NK-Zellen und pDZ 655 4.4. Vergleich des Zellinfiltrats in ECT Reaktionen induziert durch Nickel oder Duftstoff 69 4.4.1. T-Zell-Infiltrat 69 4.4.2. DZ-Populationen 69 4.4.3. Identifizierung weiterer Leukozyten 70 4.4.4. Reaktion eines Nicht-Allergikers auf 24Std Nickelprovokation 70

5 DISKUSSION 74

6 ZUSAMMENFASSUNG 84

7 LITERATURVERZEICHNIS 86

8 DANKSAGUNG 97

9 LEBENSLAUF 98

10 ANHANG 103

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS APZ Antigen-präsentierende Zelle

CLA kutanes Lymphozyten-assoziiertes Antigen

DNFB Dinitrofluorbenzol

DDZ dermale dendritische Zelle

DZ dendritische Zelle

ECT Epikutantest

GM-CSF Granulozyten Macrophagen-Kolonie Stimulierender Faktor

HEV ‚high endothelial venules’

IDEZ inflammatorisch-dendritische epidermale Zellen

IDDZ inflammatorisch-dendritische dermale Zellen

IFN Interferon

IL Interleukin

KE Kontaktekzem

LZ Langerhans Zelle

LFA-1 Lymphozytenfunktion-assoziiertes Antigen-1

LK Lymphknoten

MHC ‘Major Histocompatibility Complex’

Ni Nickel

NH Normalhaut

NK-Zelle natürliche Killerzelle

PBMC periphere Blut-mononukleäre Zellen

pDZ plasmazytoide dendritische Zelle

Std Stunde

reg T-Zellen regulatorische T-Zellen

TGF ‚Transforming-Growth-Faktor’

TNF Tumor-Nekrose-Faktor

TZR T-Zellrezeptor

Einleitung Ch. Bangert

- 1 -

1. EINLEITUNG

1.1. Definition und Klinik des Kontaktekzems

Das Ekzem ist eine durch eine typische (krankheitsspezifische) Gewebsreaktion

charakterisierte Intoleranzreaktion der Haut auf meist äußerlich einwirkende, nicht-

infektiöse Noxen.

Klinisch-histologisch läßt sich die akute Ekzemreaktion in 4 Stadien einteilen: Im

Stadium erythematosum kommt es zur scharf begrenzten Rötung des betroffenen

Areals mit Ausbildung eines intraepidermalen, interzellulären Ödems (Spongiose), das

die Hautoberfläche matt erscheinen lässt. Das anschließende Stadium vesiculosum

zeichnet sich durch spongiotische Bläschenbildung aus, die von heftigem Juckreiz

begleitet wird. Durch Platzen der wasserklaren Bläschen entsteht eine nässende

Läsion, der sich nach Eintrocknen des Exsudats das Krustenstadium anschließt

(Stadium crustosum). Falls es zu keiner weiteren Noxeneinwirkung kommt, heilt das

Ekzem mit Schuppenbildung ab (Stadium squamosum). Bei andauerndem oder

wiederholtem Kontakt mit der auslösenden Substanz zeigt das klinische Bild

verschiedene Morphen (Erythem, Bläschen, Krusten, Schuppen und entzündliche

Knötchen), die von Kratzexkoriationen überlagert sein können. Im chronischen Stadium

des Ekzems kommt es zum Abklingen der akuten Entzündung und zur Lichenifizierung

der Haut [1], [2].

Ekzeme gehören mit 3 bis 20% Prävalenz zu den am häufigsten vorkommenden

Hautkrankheiten weltweit. Bedingt durch die große Vielfalt der ekzematösen Reaktion

(z.B. seborrhoisches, atopisches, nummuläres (mikrobielles), dyshidrotisches Ekzem,

Stauungsekzem) wird die Wahrscheinlichkeit, im Laufe des Lebens mindestens einmal

an einem Ekzem zu erkranken, auf etwa 100% geschätzt.

Zu den sehr häufigen Erscheinungsformen der ekzematösen Reaktion zählen das

allergische und toxische Kontaktekzem (KE).

Das toxische KE entsteht bereits bei Erstkontakt mit toxisch wirksamen Substanzen

(Alkalien, Säuren, organische und anorganische Öle, Lösungsmittel etc.) und ist

meistens an besonders exponierten Körperstellen (Unterarme und Hände) lokalisiert.

Ein klassisches Beispiel für ein toxisch-irritatives KE ist das sogenannte

‚Hausfrauenekzem’ bei Personen, die ohne Handschuhe in häufigen Kontakt mit

Wasser, Waschlaugen und Detergentien kommen. Durch das wiederholte Schwellen

der Hornschicht entwickelt Wasser einen eigenen irritierenden Einfluß, durch den die

inflammatorische Wirkung toxischer Substanzen verstärkt werden kann [1], [2].


- 2 -

Das allergische KE hingegen entsteht bei Kontakt der Haut mit chemisch

hochreaktiven, kleinmolekularen Substanzen, genannt Haptene, über eine allergische

Typ-IV Reaktion (Abb 1.1, 1.2). Diese allergische Reaktion wird in zwei Phasen

unterteilt [3]: in der Sensibilisierungs phase kommt es zur Ausbildung von

haptenspezifischen Effektor T-Zellen, die dann 48-72 Stunden (Std) nach erneutem

Kontakt mit dem entsprechenden Hapten in der Effektor phase die eigentliche

ekzematöse Reaktion auslösen (siehe auch 1.5. ‚Die Pathogenese des

Kontaktekzems’).

Im Gegensatz zum toxischen KE kommt es nur bei einem Teil der exponierten

Personen zu einer Ekzemreaktion.

Einen bevorzugten Befall eines bestimmten Körperteils gibt es nicht, da Haptene an

unterschiedlichen Stellen mit der Haut in Kontakt kommen (Abb. 1.1., 1.2.).

Obwohl es etwa 5-10x seltener als das toxische KE auftritt, so spielt das allergische KE

doch eine wesentlich bedeutsamere Rolle als Berufskrankheit. Da eine Chronifizierung

des KEs nur durch Haptenkarenz zu vermeiden ist, können betroffene Personen in

letzter Konsequenz zur Aufgabe ihres ursprünglich gewählten Berufes gezwungen sein

und sich dadurch plötzlich mit sozial und wirtschaftlich schwer lösbaren Problemen

konfrontiert sehen [2], [4].

Außer im Berufsleben kann es auch in der Freizeit zu relevanter Allergenexposition

kommen, die, je nach Hapten, unterschiedlichste Substanzklassen betrifft

(Körperpflege und Kosmetik, Tragen von Schmuck, Kontakt mit Textilien, Schuhwerk,

Salben oder Desinfektionsmittel).

Die Therapiemöglichkeiten des KEs sind derzeit noch limitiert. Im akuten Ekzemschub

gelten lokaltherapeutische Maßnahmen mit z.B. steroidhaltigen Produkten sowie

pflegenden Externa als Mittel der Wahl, eine längerfristige Heilung kann jedoch nur

durch die strikte Meidung des Haptens erzielt werden.


- 3 -

Abbildung 1. 1. Typische Lokalisationen für Haptene inwirkung beim

Menschen

Modifiziert aus Fritsch, Lehrbuch für Dermatologie und Venerologie, Springer 1998

KE können durch direkte Einwirkung von exogenen Substanzen hervorgerufen werden.

Die Lokalisationen der Haptene sind charakteristisch für die jeweilige Substanz (z.B.

Deodorant-axillär etc.).


- 4 -

Abbildung 1.2. Allergische Kontaktdermatitis ausgel öst durch Nickel

Modifiziert aus Johannes Ring, Allergy in Practice, Kapitel 5: Allergic Diseases (and

Differential Diagnosis), Springer 2005

Das obere Bild zeigt eine Patientin mit einem Kopfschmuck aus Metall, der nach

längerem Tragen eine allergische Kontaktdermatitis mit typischer lokal begrenzter

Rötung und Bläschen auslöste (unteres Bild).


- 5 -

1.2 Die Histologie des allergischen Kontaktekzems

Die Histologie des akuten allergischen KE zeigt üblicherweise eine Überlappung mit

anderen Arten von akuter Dermatitis und ist deswegen nicht als einziges

diagnostisches Kriterium zu sehen, sondern eher als unterstützende Maßnahme bei

Verdacht auf das Vorliegen eines KE.

Die klassischen histologischen Veränderungen der kontaktallergischen Reaktion

zeigen im frühen Stadium ein Ödem in den unteren Schichten der Dermis, gefolgt von

spongiotischer Bläschenbildung auf verschiedenen epidermalen Ebenen [5] (Abb. 1.3).

Diese Bläschenbildung wird durch die Ödem-bedingte Dehnung der interzellulären

Räume und die damit verbundene Auflösung der Haftung mittels Desmosomen

verursacht. Meistens finden sich die Vesikel intraepidermal, allerdings können sie sich

bei sehr starker Entzündung auch bis subepidermal ausbreiten. Im Allgemeinen kommt

es nur zu einer geringen Akanthose der Epidermis [6].

Die obere Dermis zeigt je nach Ausmaß des Ekzems ein deutlich leukozytäres,

mononukleares Infiltrat, das vor allem um den oberen Gefäßplexus lokalisiert ist. Auch

eosinophile Granulozyten sind vorhanden und können mittels H&E (Hämatoxylin

&Eosin) Färbung gut dargestellt werden.

Im Unterschied zu der oben beschriebenen akuten Form des Ekzems findet sich in

chronischen Läsionen kaum Spongiose der Epidermis. Statt dessen steht die

epidermale Akanthose im Vordergrund, die einer psoriasiformen Hyperplasie der

Epidermis ähneln kann [5]. Häufig zeigt sich eine dicke, hyperkeratotische Hornschicht

mit minimaler Parakeratose. In der papillären Dermis kann es zu einer milden

Fibrosierung kommen.


- 6 -

Abbildung 1.3. Die Histologie des KE

Modifiziert aus David Weedon, Skin Pathology Second Edition, Churchill Livingstone

2002

Die H&E Färbung zeigt spongiotische Vesikulation in der Epidermis (oberes Bild, Pfeil).

Im dichten inflammatorischen Infiltrat der papillären Dermis finden sich u.a. eosinophile

Granulozyten, die durch ihre intensive rote Farbe auffallen (unteres Bild, Pfeil).


- 7 -

1.3. Haptene

Der Begriff ‚Hapten’ wurde erstmals 1935 von Karl Landsteiner für niedermolekulare

Chemikalien eingeführt, die im Tierversuch nach kovalenter Bindung an Proteine

Hapten-spezifische Antikörper induziert haben [3].

Obwohl Ursprung und Natur dieser kleinen allergenen, elektrophilen Substanzen sehr

unterschiedlich sein können, stimmen sie in einigen Eigenschaften überein: sie sind

niedermolekular (MG < 500 Dalton), und können daher leicht die Hautbarriere

überschreiten, in die normalerweise größere Moleküle nicht eindringen können [7]. Der

Besitz lipophiler Reste erleichtert den meisten Haptenen zusätzlich das Überwinden

der Barriereschicht der Epidermis.

Aufgrund der geringen Größe besitzen Haptene selbst keine immunogenen

Eigenschaften, sondern brauchen die (kovalente) Bindung an körpereigene

Trägerpeptide wie z.B. Serumalbumin, epidermale Proteine oder in den ‚Major

Histocompatibility Complex’ (MHC)-Gruben präformierte Peptide, um eine immunogene

Wirkung durch T-Zellantworten zu erlangen [8]. Die Bindung an Proteine kann sehr

verschieden sein: bei Bindung an ein lösliches Trägerprotein wird das Hapten indirekt

von CD4+ T-Zellen über MHCII auf Antigen-präsentierenden Zellen (APZ) erkannt, da

das lösliche Protein vor Präsentation seiner Peptide prozessiert wird. Alternativ können

Haptene aber auch direkt an MHC-assoziierte Moleküle binden und dann entweder

über MHC Klasse I von CD8+ T-Zellen oder über MHC Klasse II von CD4+ T-Zellen

erkannt werden [8].

Andere Haptene, die z.B. von instabilen chemischen Substanzen abstammen, können

durch einen zusätzlichen Metabolisierungsschritt in einen Stoff mit allergener Wirkung

umgewandelt werden. Metallsalze, beispielsweise, gehen mit kutanen Proteinen keine

kovalente Bindung ein, sondern formen lediglich Komplexe über schwache chemische

Interaktionen.

Bislang wurden etwa 3000 Haptene entdeckt (Tab. 1.1), wobei nur ein kleiner Teil

davon häufig in unserer Umwelt zu finden ist. Ihre chemische Struktur reicht von

einfachen Metallionen, zum Beispiel Nickel (Ni), bis zu komplexen aromatischen

Ringen in Duftstoffen.

In der industrialisierten Welt zählt Ni zu den häufigsten Auslösern einer Kontaktallergie

[9]. Dieses Hapten wurde in vielen Studien zur Klärung der Struktur des Antigens sowie

zur Identifizierung der Ni-Protein-Bindungsstelle an T-Zellen untersucht [10]; [11]; [12].

Anders als klassische Haptene formen Ni-Ionen keine kovalenten Brücken mit

Proteinen, sondern werden in reversiblen Komplexen strukturiert [13].


- 8 -

Ni kann von T-Zellen sowohl direkt als auch indirekt erkannt werden, da nicht alle Ni-

spezifischen T-Zellklone in der Lage sind, das Hapten direkt auf Aldehyd-fixierten APZ

zu erkennen. Dies bedeutet, dass Ni vor seiner immunogenen Wirkung auf T-Zellen

zumindest zum Teil prozessiert werden muß [14].

Als Protein, das für den Transport des Ni-Ions von der äußeren Hautoberfläche zu den

APZ in der Epidermis [z.B. Langerhans Zellen (LZ)], verantwortlich sein könnte, wurde

aufgrund seiner bekannten Bindungskapazität an Ni das humane Serumalbumin in

Betracht gezogen. In einer rezenten Arbeit konnte tatsächlich gezeigt werden, dass

humanes Serumalbumin -Ni Komplexe, in Anwesenheit geeigneter APZ, Ni-reaktive T-

Zellen stimulieren können [12].

Im Gegensatz zu dem gut erforschten Ni-Ion sind experimentelle Daten zum

Mechanismus der Haptenpräsentation des Duftstoffmix eher begrenzt. Duftstoffe

kommen in einer Vielzahl von Kosmetik- und Haushaltsprodukten vor, eine Exposition

ist schwer vermeidbar. Der klassische Duftstoffmix, der auch bei Allergietestungen

verwendet wird, besteht aus Eugenol, Isoeugenol, Geraniol, Eichenmoos, a-Amyl

Zimtaldehyd, Zimtaldehyd, Zimtalkohol und Hydroxycitronella. Die häufigsten

allergenen Komponenten des Mix sind Isoeugenol, Eichenmoos, Hydroxycitronella und

Eugenol. Spezifische T-Zellantworten auf Eugenol und Isoeugenol konnten anhand von

Lymphozyten- Transformationstestungen nachgewiesen werden [15], so dass eine rein

irritative Reaktion auf Duftstoffe ausgeschlossen werden kann. Auch ist bekannt, dass

Zimtalkohol und Zimtaldehyd ihre allergene Wirkung durch ein gemeinsam

metaboliertes Hapten ausüben [16].

Es ist jedoch besonders wichtig zu erwähnen, dass nicht alle kleinen, elektrophilen

Moleküle nach Proteinbindung zwangsläufig bei jeder Person als Allergen wirken. Zu

den prädisponierenden Faktoren, die zur Entwicklung eines allergischen KE beitragen

können, zählen neben der Notwendigkeit einer kritischen Haptenmenge eine

bestehende Vorschädigung der Haut und vor allem auch der Histokompatibilitätstyp

der betreffenden Person.


- 9 -

Tabelle 1.1. Häufige Kontaktallergene und ihr Vorkommen (modifiziert nach Fritsch,

Lehrbuch für Dermatologie und Venerologie, Springer 1998)

Nickelsulfat: Metalle, Modeschmuck, Katalysatoren, Farben, Euromünzen

Kobaltsulfat: Zement, Galvanisation, Öle, Kühlmittel, Lacke

Duftsstoffe: Parfüms, Kosmetika

Perubalsam: Salben, Kosmetika, Lokalanästhetika

Wollwachsalkohole: Salbengrundlagen, Kosmetika, Skiwachse, Möbelpolitur

Neomycin: antibiotischer Zusatz in Lokaltherapeutika

Procain, Benzocain: Lokalanästhetika, antipruriginöse und analgesierende Externa

Kaliumdichromat: Zement, Antioxidans, Farben, Öle, Gerbstoffe, Streichhölzer

Thiomersal (Sulfonamide): Lokaltherapeutika, Augentropfen

Sorbitansesquioleat: Emulgator in Lokaltherapeutika, Kosmetika

Acrylate: Prothesen, Zahntechnik, Lacke

Kolophonium: adhäsives Harz, in Wachsen

Para-Phenylendiamin: dunkle Farbstoffe in Textilien, Druckerschwärze


- 10 -

1.4 Die Epikutantestung

Die gängige Testmethode zur Erfassung von Typ IV- Sensibilisierungen erfolgt durch

die Epikutantestung. Josef Jadassohn, der im Jahre 1895 erstmalig eine

kontaktallergische Reaktion auf Quecksilber beschrieb, brachte den Test im Jahre

1896 auf [17]. Im Falle einer korrekten Durchführung und Interpretation mit genauen

Regeln und Grundlagen stellt der Epikutantest (ECT) bis heute eine wissenschaftlich

anerkannte Untersuchungsmethode zur Diagnosestellung des KE dar.

Die Prinzipien der Testung sind in Tabelle 1.2. aufgeführt. Die zu testenden

Substanzen werden in eine „Finn chamber“ (kleine Aluminiumschälchen) gefüllt und

mittels Pflaster auf dem Rücken des Patienten fixiert (Abb. 1.4.). Der Vorteil des ECT

besteht in dem relativ kleinen einzelnen Testareal, wodurch eine große Anzahl

Substanzen gleichzeitig getestet werden kann, und zusätzlich selbst bei massiver

allergischer Reaktion auf eine zu testende Substanz keine körperliche

Beeinträchtigung des Patienten entsteht.

Die Beurteilung des ECT erfordert eine gewisse Erfahrung des Untersuchers, der die

Reaktionen nach einer bestimmten Skala einteilt:

Negativ (0)

Positiv +/-: mildes Erythem

Positiv + : Erythem mit leichter Infiltration

Positiv ++ : Erythem mit Papeln und kleinen Bläschen

Positiv +++ : Erythem, Blasen und Erosionen

Die Typ IV Allergie zeigt ihr Reaktionsmaximum nach 2-3 Tagen. Prinzipiell gilt, dass

ein allergisch bedingtes KE eine Zunahme der Reaktionsstärke von 48 Std nach 72 Std

zeigt, während ein irritatives KE eine „decrescendo“ Reaktion zwischen erster und

zweiter Ablesung aufweist.


- 11 -

Tabelle 1.2. Prinzipien der Epikutantestung (modifiziert nach: Robert L. Rietschel,

Fisher’s Contact Dermatitis, Fifth Edition)

1. Nur bekannte Substanzen werden anhand von standardisierten Konzentrationen

getestet. Falls Unsicherheiten bestehen, wird eine offene Testung mit

entsprechenden Kontrollen durchgeführt. Industrielle Substanzen unbekannter

Konzentration sollten nicht getestet werden.

2. Die Testung darf nur an Lokalisationen durchgeführt werden, die keine Zeichen einer

akuten Dermatitis aufweisen.

3. Der Patient wird ersucht, das Testpflaster für 48 Std nicht zu entfernen.

4. Der Patient wird während der Testzeit ersucht, nicht zu duschen, den Rücken

trocken zu halten und Sport zu vermeiden. Schwere körperliche und

schweißtreibende Arbeit sollte ebenfalls vermieden werden.

5. Nach 48 Std werden die Substanzen entfernt und eine Erstablesung durchgeführt.

Weitere Ablesungen sollten zwischen 72 und 120 Std nach Aufbringen der

Substanzen vorgenommen werden.

6. Irritative und allergische Reaktionen können in vielen Fällen schwer voneinander

unterschieden werden. In der Regel verursachen allergische Reaktionen mehr

Juckreiz als irritative Reaktionen.


- 12 -

Abbildung 1.4. Epikutantestung.

Der Test wird auf den Rücken einer Patientin aufgebracht (links), die Endablesung

nach 72 Std zeigt eine positive Reaktion auf Thiuram Mix (+) und Ni (++) (rechts).

1.5. Die Pathogenese des Kontaktekzems

Die Haut ist unser Grenzorgan zur Umwelt und liefert eine Barriere gegen

verschiedene physikalische Einflüsse und eine Vielzahl von Krankheitserregern. Als

nicht-lymphatisches Immunorgan wird die normale, nicht-entzündete Haut von

unterschiedlichen Zellen der angeborenen sowie erworbenen Immunität besiedelt. In

der Epidermis finden sich neben strukturgebenden Keratinozyten hauptsächlich LZ, die

für Antigen-Aufnahme/Präsentation zuständig sind. In der Dermis sind

physiologischerweise Mastzellen, dermale dendritische Zellen (DDZ) als APZ und eine

kleine Anzahl patrouillierender Gedächtnis-T-Zellen detektierbar.

Das Repertoire der ansässigen Zellen ändert sich schlagartig bei Gefahrensignalen

und Entzündungsreizen. Neben Zellen der angeborenen Immunität wie Makrophagen,

natürliche Killerzellen (NK-Zellen) und Granulozyten vervielfältigt sich die Anzahl von

T-Zellen unterschiedlichster Funktionen (z.B. naive T-Zellen, regulatorische T-Zellen,

Effektor-T-Zellen). Zusätzlich können noch andere dendritische Zellen (DZ) in die Haut

eindringen; hier werden in der Literatur v.a. plasmazytoide dendritische Zellen (pDZ)

und spezielle inflammatorische dendritische Zellen beschrieben.

Damit ein allergisches KE entsteht, sind auf immunologischer Ebene zwei Phasen

notwendig: die Sensibilisierungs - und die Effektorphase .


- 13 -

In der klinisch stummen Sensibilisierungsphase wird ein eindringendes Hapten von

APZ erstmals den T-Zellen als ‚Gefahr’ präsentiert, woraufhin diese zur klonalen

Proliferation angeregt werden.

Die Effektorphase resultiert 48-72 Std nach erneutem Haptenkontakt im klinischen Bild

eines Ekzems.

Der ausführliche Ablauf dieser beiden Phasen nach derzeit gültigem Konzept sowie die

möglichen Zellpopulationen, die an der Pathogenese des allergischen KE beteiligt sind,

werden im Folgenden genauer erörtert.

1.5.1. Dendritische Zellen

Langerhans Zellen

Paul Langerhans beschrieb 1868 mittels der damals genutzten Goldchlorid-

Impregnationstechnik erstmals eine dendritisch geformte Zelle in der menschlichen

Epidermis [18]. Die so identifizierte LZ war die erste DZ, die überhaupt detektiert

wurde. Trotz dieser frühen Entdeckung blieb die wahre Identität dieser berühmten Zelle

noch mehr als ein Jahrhundert verborgen.

Zunächst wurde die LZ irrtümlich den Nervenzellen zugeordnet, später Melanozyten,

die ihre Fähigkeit zur Pigmentbildung bereits verloren hatten [19]. Birbeck et al gelang

Anfang der 60er Jahre sowohl die elektronenmikroskopische Darstellung von

Tennisschläger-ähnlich geformten Zellorganellen in den LZ, seither als Birbeck Granula

bezeichnet, als auch die Detektion der Zellen in der Melanozyten-freien Vitiligo [20].

Zusätzlich konnte in den darauffolgenden Jahren die Fähigkeit der ATPase (CD39)

Expression von LZ festgestellt werden [21], [22].

Die Verbindung zum Immunsystem wurde in den 70er Jahren hergestellt, als MHCII

Moleküle, Fc- und Komplementrezeptoren auf LZ entdeckt wurden [23], [24], [25].

Diesen ersten Berichten folgte bald der Nachweis der Antigenpräsentation der LZ

sowohl in Meerschweinchen und Mäusen als auch im Menschen [26], [27], [28], [29].

Heute zählt die LZ zu den gut charakterisierten Zellen, die noch immer die

Aufmerksamkeit vieler Wissenschaftler fesselt.

Die Dichte der LZ in der normalen menschlichen Haut variiert je nach Körperteil. So

findet sich z.B. an Kopf, Gesicht oder Stamm eine hohe Anzahl von LZ (zwischen 600-

1000/mm2), während Hand- und Fußsohlen lediglich ~200/mm2 aufweisen.

Die Vorläuferzelle der LZ ist die sogenannte CD34+ hämatopoetische Vorläuferzelle

und stammt aus dem Knochenmark [30], [31]. Zur Entwicklung der LZ aus dieser Zelle


- 14 -

werden die Zytokine GM-CSF, Interleukin (IL)-3, Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-α und

‚Transforming Growth Factor’ (TGF)-β1 benötigt [31], [32].

Die Besiedelung der Epidermis während der Ontogenese ist mit dem stufenweisen

Erwerb immunologisch wichtiger Moleküle wie CD45, CD1a, MHCII Komplex (HLA-

DR/DQ/DP), ATPase und Langerin (CD207) verbunden [33], [34]. Aufgrund der

Expression von Antigenen wie CD11b oder CD33 wird die LZ außerdem einem

myeloiden Ursprung zugeordnet [35], [36]. In letzter Zeit durchgeführte in vitro

Experimente lassen vermuten, dass die Differenzierung der LZ auch aus einer CD14+

myeloid-monozytären Zelle erfolgen kann [37].

Das an der Zelloberfläche der LZ exprimierte Antigen Langerin ist ein Kalzium-

abhängiges C-Typ Lektinmolekül der Gruppe II (Familie der Asialoglycoproteine), das

an der Entstehung der charakteristischen Birbeck Granula beteiligt ist [38]. Aufgrund

seines einzigartigen Vorkommens auf LZ eignet sich das Molekül hervorragend zur

Charakterisierung dieser epidermalen DZ.

C-Typ Lektine stellen ‚pattern recognition receptors’ (PRR) dar, die eine große Anzahl

unterschiedlicher Antigene/Mikroorganismen wie HIV, Hepatitis C Virus, CMV, EBV,

Helicobacter pylori etc. binden können [39], [40], [41]. Die genaue Identifizierung der

Mikroorganismen, die an Langerin binden, ist allerdings noch nicht gelungen. Auch ist

unklar, welche Funktion Langerin bei der Entwicklung der LZ tatsächlich einnimmt, da

Mäuse, bei denen das Langerin Gen entfernt wird, keinen deutlichen Funktionsverlust

der LZ aufweisen [42].

LZ sind äußerst mobile DZ, die ein phagozytiertes Antigen via afferentem Lymphgefäß

in den Lymphknoten (LK) transportieren, wo es den T-Zellen präsentiert wird und so

eine Immunantwort auslösen kann.

Die proinflammatorischen Zytokine TNF-α und IL-1β, die von LZ-benachbarten

Keratinozyten nach unterschiedlicher Provokation produziert werden, bilden den ersten

Impuls zur Auswanderung der Zellen [43]. Dann folgt eine Kaskade von Ereignissen

(Stimulierung von Chemokinrezeptoren, Abregulierung von haftenden Integrinen,

Expression von Matrix-Metalloproteinasen), die schließlich zur kompletten Emigration

der epidermalen DZ aus der Haut führt [44], [45], [46].

Welche Rolle schreibt man nun dieser immunologisch äußerst vielfältigen Zelle im KE

zu?

LZ nehmen nach dem Kontakt, der zur Sensibilisierung führt, das Hapten auf,

prozessieren es und wandern danach zum nächsten regionären LK, um es dort den T-

Zellen zu präsentieren. In Studien konnte gezeigt werden, dass das Zytokin IL-1β und


- 15 -

das Chemokin Osteopontin (OPN) eine wichtige Rolle bei der Migration der LZ und

somit auch in der Sensibilisierungsphase des KE spielen [47], [48], [49]. In Mäusen

ohne IL-1β oder OPN wird die Auswanderung der LZ aus der Epidermis verhindert.

Eine bei diesen Tieren durchgeführte Sensibilisierung mit dem Kontaktallergen

Trinitrophenyl führt bei erneuter Haptenapplikation zu einer deutlich abgeschwächten

Ekzemreaktion, was auf eine bedeutende Rolle der LZ in der Induktionsphase des KE

deutet [47], [48].

Ob die LZ in der Effektorphase des humanen KE nun eher eine Effektorrolle einimmt

oder einen regulierenden Einfluß auf T-Zellen ausübt, ist nicht bekannt [51].

Ursprünglich wurde dieser DZ eine Antigen(Hapten)-präsentierende Funktion

zugedacht, welche die T-Zell-mediierte Entzündung des Ekzems provoziert [52]. Später

zeigte sich jedoch, dass eine Depletion der LZ nach Sensibilisierung in der Maus zu

einer verstärkten, und nicht wie erwartet, zu einer abgeschwächten Ekzemreaktion

führt [50].

Dermale (myeloide) dendritische Zellen

DDZ wurden mehr als 120 Jahre später beschrieben als LZ [36], [53]. Trotz intensiver

Forschung sind DDZ noch immer weniger gut charakterisiert als ihre epidermalen

Partner. Dies ist zum Großteil der Tatsache zu verdanken, dass bisher kein

unverwechselbarer Marker vergleichbar z.B. Langerin auf LZ identifiziert wurde und es

daher schwer ist, DDZ aus dem Blut oder der Haut zu isolieren. Meistens muß auf

Mausmodelle oder in vitro generierte DZ zurückgegriffen werden.

DDZ haben durch die ihnen eigenen, sogenannten C-Typ Lektine DC-SIGN (CD209)

und Mannose Rezeptor (CD206), ähnlich wie LZ über Langerin, die Fähigkeit

Mikroorganismen, Zellfragmente oder auch einzelne Moleküle zu phagozytieren.

Neben der PRR-assoziierten Aufnahme von Mikroorganismen, können DDZ Rezeptor-

mediierte Endozytose und Makropinozytose durchführen und sind damit in der Lage,

lösliches Protein zu prozessieren und zu präsentieren [54].

Die Wanderung von DDZ kann ebenfalls über inflammatorische Zytokine/Chemokine

gelenkt werden. Alleinige Daten über das Migrationsverhalten der DDZ- im Unterschied

zu LZ- wurden in einer rezenten Studie von Kissenpfennig et al mittels in vivo-

Mikroskopie an Mäusen geliefert [55]. Die Autoren konnten zeigen, dass DDZ nach

Haptenapplikation bereits nach 24 Std im ableitenden LK zu finden sind und die größte

Anzahl der Hapten-tragenden DDZ nach 48 Std erreicht wird. Antigen-beladene LZ


- 16 -

hingegen migrieren deutlich langsamer und zeigen ihren Zahlengipfel erst nach 4

Tagen. Auch wandern DDZ im Unterschied zu LZ eher zu B-Zell nahen Arealen im LK

(äußerer Paracortex), während sich LZ bei T-Zell Arealen (innerer Paracortex)

ansiedeln.

Humane DDZ können je nach der Expression von CD1a und CD14 in unterschiedliche

Subpopulationen unterteilt werden [53]; i) Faktor XIIIa++/CD1a++/CD4+/DC-SIGN-

/CD14- und ii) Faktor XIIIa++/CD1a+/-/CD4+/DC-SIGN+/CD14+. Letztere sind

schwächere allogene Stimulatoren und dadurch mit Makrophagen vergleichbar.

Inwieweit Makrophagen und DDZ einen gemeinsamen Differenzierungsweg aufweisen,

ist bislang noch nicht im Detail geklärt. Charakteristisch für DDZ, aber nicht exklusiv, ist

außerdem die Expression von klassischen (HLA-DQ/DR) und nicht-klassischen MHC

Molekülen (CD1a, CD1c, CD1d), dem Scavenger Rezeptor CD36, Anti-

koagulationsfaktor XIIIa sowie die Adhäsionsmoleküle CD11b/CD18 und CD11c/CD18

[53]; [56]. Die genannten Moleküle können jedoch unter gewissen Umständen

ebenfalls von Makrophagen exprimiert werden, weswegen besonders in entzündlichen

Hauterkrankungen mit dichtem leukozytärem Infiltrat eine eindeutige Zuordnung der

DDZ schwierig ist.

Eine der DDZ ähnliche Zellpopulation wurde unter entzündlichen Bedingungen im

Infiltrat atopischer Dermatitis beschrieben: die sogenannten inflammatorischen

epidermalen dendritischen Zellen (IDEZ) [57]. Diese DZ zeichnet sich durch die

Präsenz des hochaffinen IgE Rezeptors (FcεRI) aus sowie durch die hohe Expression

von MHCII, CD1c und CD36, und die niedrige Präsenz von CD1a und CD1b. Rezente

in vitro Studien zeigen, dass IDEZ, nach Stimulation von FcεRI, bei T-Zellen die

Produktion von IFN-γ anregen und dadurch die typische T2 Antwort in der atopischen

Dermatitis zugunsten einer T1 Reaktion verändern können [58].

Zusätzlich besitzen IDEZ, ähnlich wie DDZ, die Fähigkeit zur Rezeptor-mediierten

Endozytose, da sie den Mannose Rezeptor CD206 tragen [59].

Das Vorkommen von IDEZ im allergischen KE wurde bisher nicht beschrieben.

Aufgrund ihrer Antigen-präsentierenden Funktion ist aber eine Aufnahme und

Präsentation der Haptene prinzipiell möglich und somit eine entzündungsverstärkende

Rolle im KE denkbar.


- 17 -

Plasmazytoide dendritische Zellen

PDZ wurden erstmals im Jahre 1958 beschrieben, als man ‚Plasmazellen’ ohne B-

oder Plasmazellmarker in der T-Zellzone von humanen LK entdeckte und sie

dementsprechend plasmazytoide T-Zellen taufte [60]. 20 Jahre später wurde von

Trinchieri et al eine Zellart entdeckt, die auf virale Stimulation mit der Produktion von

Zytokin IFN-α reagierte, das wiederum zu einer deutlichen Stimulation des

angeborenen Immunsystems führt [61].

Es dauerte weitere 20 Jahre bis die Verbindung zwischen diesen beiden Zellarten

hergestellt werden konnte; im Jahre 1999 wiesen zwei unterschiedliche Gruppen nach,

dass es sich bei den plasmazytoiden T-Zellen und Interferon-produzierenden Zellen

um die gleiche Zellart, nämlich um pDZ handelt [62]; [63].

PDZ lassen sich anhand ihres Phänotyps leicht charakterisieren: sie tragen

typischerweise CD4, CD123, MHCII und CD45RA an ihrer Oberfläche. Ein für diese

Zellart exklusives C-Typ Lektin ist ‚Blood Dendritic Cell-Antigen’ (BDCA)-2, das eine

wesentliche Rolle bei der Antigenpräsentation einnimmt [64]. Die Blockade von BDCA-

2 führt zur eingeschränkten Typ I IFN-Produktion von pDZ. Ein weiteres, bisher

ebenfalls auf keiner anderen DZ beschriebenes Oberflächenantigen ist BDCA-4

(Neuropilin-1). Bisher konnte keine wesentliche Funktion des BDCA-4 auf pDZ

festgestellt werden, so dass dieses Molekül zur Identifizierung dieser Zellen aus dem

Blut herangezogen wird, ohne dadurch deren Funktion zu beeinflussen [65].

Da pDZ im Menschen in der fetalen Leber, im Thymus und Knochenmark gefunden

wurden, wird derzeit eine Entwicklung der pDZ aus hämatopoetischen Stammzellen

angenommen [66].

Unter physiologischen Bedingungen findet man pDZ im Erwachsenen v.a. in der T-

Zellzone der LK, in der Nähe von ‚high endothelial venules’ (HEV) [67]. Die Bindung an

diese Venolen wird über CD62L (L-Selektin) gesteuert, von dem pDZ reichlich an ihrer

Oberfläche besitzen [63].

Während pDZ in normaler humaner Haut nicht vorhanden sind, wurden sie in

entzündlichen Hauterkrankungen beschrieben [68]. Das bekannteste Beispiel einer

entzündlichen Hauterkrankung mit hohem Anteil von Haut-infiltrierenden pDZ ist der

Lupus erythematodes (LE). Bei der systemischen Verlaufsform dieser Erkrankung sind

pDZ in der Zirkulation deutlich erniedrigt [69], aber eine hohe IFN-α Produktion der

aktivierten pDZ im Gewebe nachweisbar [68].


- 18 -

Auch in soliden Tumoren wie Mamma-Karzinomen oder Melanomen konnten pDZ

bereits detektiert werden [70], [71].

Trotz intensiver Forschung ist die volle Funktion der Zellen noch nicht bekannt und

weitere Studien sind notwendig, um die vielen offenen Fragen betreffend Ursprung und

Krankheitsbeteiligung dieser außergewöhnlichen DZ zu beantworten.

1.5.2. T-Zellen im Kontaktekzem

Das allergische KE ist eine T-Zell-mediierte Erkrankung und gehört zu dem Kreis der

Hypersensitivitätsreaktionen vom verzögerten Typ. Inwieweit die Ausprägung des

allergischen KEs durch die Aktivität von T-Zellen vom Typ 1 (T1) oder vom Typ 2 (T2)

bzw. von CD4+ oder CD8+ T-Zellen vermittelt wird, ist derzeit noch größtenteils unklar

[72], [73], [74], [75]. Typisch für eine T1 Antwort ist die Produktion von IFN- γ, während

bei der T2 Antwort die Zytokine IL-4 und IL-5 dominieren.

Immunhistochemische Analysen des zellulären Infiltrats ergaben ein deutliches

Überwiegen der CD4+ gegenüber den CD8+ Zellen [76].

Außerdem zeigten Untersuchungen von zwei unabhängigen Gruppen [73], [74] bei Ni-

Allergikern, dass aus peripherem Blut kultivierte Hapten-spezifische CD4+ Zellen ein

Zytokinmuster wie Typ 1 T-Zellen (IFN-γ und IL-2) aufweisen. Aus diesen Gründen

wurde der CD4+ T-Helfer Zelle lange die Rolle der Effektorzelle zugewiesen.

Untersuchungen im Mausmodell des allergischen KE sowie einige Studien des

humanen KE ergaben jedoch auch einige Hinweise auf eine pathogenetische

Beteiligung der CD8+ T-Zellen [77], [78], [79], [80].

Ein Indiz dafür, dass die Ekzemreaktion zumindest bei Ni-Allergikern nicht

ausschließlich auf die Präsenz von T1-Zellen als Effektorzellen zurückgeführt werden

kann, ist das Vorkommen von Ni-spezifischen CD4+ T-Zellen auch bei nicht-

allergischen Personen. Ni-spezifische CD8+ T-Zell Antworten konnten jedoch nur bei

allergischen Patienten detektiert werden [78], [81]. Überdies produzieren Ni–

spezifische CD4+ Zellklone von Allergikern eine bedeutend geringere Menge des

entzündungshemmenden Zytokins IL-10, als die Klone nicht-allergischer Individuen

[82]. Das könnte bedeuten, dass ein nicht-allergischer Zustand nicht notwendigerweise

durch einen Mangel an Antigen entsteht, wie vordergründig anzunehmen ist, sondern

dass bei Nicht-Allergikern, im Gegensatz zu Allergikern, massive

entzündungshemmende und gegenregulatorische Mechanismen in Kraft treten.

Zudem fanden Werfel et al. dass, anders als im peripheren Blut, die Mehrheit der aus

der inflammierten Haut stammenden CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten ein T0 (IL-10)


- 19 -

oder ein T2 (IL-4, IL-5 und IL-13) Zytokinmuster aufweisen [83], was ebenfalls als

Argument gegen die T1 Theorie gewertet wird. Tatsächlich verdichteten sich in den

letzten Jahren die Hinweise auf das Vorliegen von entzündungsauslösenden Effektor-

CD8+ T-Zellen und entzündungshemmenden reg CD4+ T-Zellen (Abb 1.5.) [84].

Humane regulatorische T-Zellen (reg T-Zellen) wurden erst vor einigen Jahren und

deutlich später als das murine Pendant entdeckt [85], [86]. Diese Zellen tragen häufig

die Oberflächenmarker CD4 und CD25, wobei diese Antigene nicht einzigartig für reg

T-Zellen sind, sondern auch auf Effektor T-Zellen zu finden sind. Dadurch wird die

phänotypische Charakterisierung der Zellen erschwert und die endgültige

Identifizierung meist mittels funktioneller Versuche vorgenommen. Die am häufigsten

angewendete Methode ist das in vitro Ko-Kultur-Suppressions System, bei dem

während polyklonaler Stimulation potentielle CD4+CD25+ reg T-Zellen zu CD4+CD25-

T-Zellen hinzugefügt werden. Die reg T-Zellen verhindern die Proliferation der

CD4+CD25- T-Zellen und können anhand dessen als solche identifiziert werden [87].

Erst vor wenigen Jahren wurde ein zusätzliches Antigen detektiert, welches von reg T-

Zellen exprimiert wird und die Identifizierung der Zellen deutlich erleichtert: FOXP3,

das zu der ‚Forkhead’ Familie der DNA Transkriptionsfaktoren zählt [88]. FOXP3 wird

spezifisch mit der regulatorisch/suppressiven Aktivität von CD4+ T-Zellen in

Verbindung gebracht [89].

Eine weitere T-Zellpopulation, die im murinen KE nachgewiesen werden konnte, trägt

den γδ T-Zellrezeptor (TZR). Kutane γδ T-Zellen können von Hapten-tragenden

Keratinozyten aktiviert werden [90], wobei diese Aktivierung nicht auf MHC I oder MHC

II beschränkt ist [91]. In Folge kann diese Subpopulation, die vor allem in Haut und

Lymphorganen zu finden ist, zu T-Zellen mit unterschiedlichem Phänotyp ausreifen.

Askenase et al hat den γδ T-Zellen eine Rolle in der Entwicklung des murinen KE

zugeschrieben [92]. Eine andere Studie konnte jedoch zeigen, dass γδ T-Zellen die

Entwicklung von CD8+ Effektor-T-Zellen in der Sensibilisierungsphase hemmen und

somit eher eine entzündungsregulierende Wirkung ausüben [93].

Ob allerdings diese T-Zellen im humanen KE vorhanden sind und welche Funktion sie

innehaben, ist bisher ungeklärt.

1.5.3. Die Sensibilisierungsphase (afferenter Schen kel der Immunantwort)

Bei dem die Sensibilisierung auslösenden Erstkontakt mit dem entsprechenden Hapten

kommt es nach dem Eindringen durch die Hautoberfläche zur Phagozytose des


- 20 -

Haptens durch APZ der Haut, wie z.B. epidermale LZ und DDZ. Im Anschluß wandern

diese APZ innerhalb von 24 Std in die regionalen LK und präsentieren

Hapten/Peptidkomplexe den dort ansässigen naiven T-Zellen [94], [95] (Abb. 1.5.).

Während dieses Vorgangs werden APZ von einem ruhenden in einen aktivierten

Zustand versetzt, der vor allem durch die Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine

[IL-1β, TNF-α, Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF)]

von Keratinozyten und dermalen Fibroblasten bedingt ist. Die Aktivierung der LZ/DDZ

kann zusätzlich auch durch das Haptenmolekül selbst beeinflusst werden, da in vitro

Experimente von DZ, die unterschiedlichen Haptenmolekülen ausgesetzt wurden,

Hinweise auf ein solches Phänomen liefern [96], [97].

Aktivierte DZ produzieren ebenfalls Zytokine (IL-1β, IL-6, IL-12) und es kommt zur

erhöhten Expression von MHCI und MHCII sowie von Kostimulations- und

Adhäsionsmolekülen (z.B. CD80, CD86, CD11b/CD18).

Mausexperimente zeigten, dass die Aktivierung und Migration der LZ in Abhängigkeit

von Haptenmolekülen ausschließlich bei der allergischen Reaktion beobachtet wird,

hingegen nicht bei der toxischen bzw. irritativen Immunantwort [48], [98], [99].

Die MHCI- oder II-restringierte Antigenpräsentation im LK führt schließlich zur

Differenzierung von naiven T-Zellen in Hapten-spezifische Effektorzellen und

gleichzeitig zur klonalen Proliferation. Die aktivierten Hapten-spezifischen T-Zellen

regulieren den Chemokinrezeptor CCR7 auf ihrer Oberfläche hinunter, ein Merkmal,

das die Zellen den peripheren Gedächtnis (Memory) T-Zellen zuordnet. Zu der

Aufgabe der peripheren Memory T-Zellen gehört das ‚Patroullieren’ im peripheren

Gewebe, v.a. der Haut [100].

Bei ihrer Umwandlung zu Effektorzellen erwerben die T-Zellen ein wichtiges

Adhäsionsmolekül, das kutane Lymphozyten-assoziierte Antigen (CLA), welches für

die spätere Migration der Zellen in die Haut verantwortlich ist. Ein weiteres Merkmal

der Haut-infiltrierenden Hapten-spezifischen T-Zellen ist die Expression von CCR4, der

ihnen über die Bindung an seinen von Endothelzellen produzierten Liganden CCL17

‚Thymus and Activation Regulated Chemokine’ (TARC) ermöglicht, am Endothel zu

adhärieren und in Folge über CLA in die Haut einzuwandern. Hierbei werden die zur

Adhäsion benötigten Rezeptoren ‚Very Late Antigen’ (VLA)-4 und ‚Lymphocyte

function-associated antigen’ (LFA)-1 auf T-Zellen hinaufreguliert [101]. Nach etwa 7-10

Tagen ist eine ausreichende Anzahl Effektorzellen gebildet, die immunologisch ein KE

auslösen kann. Die CLA+/CCR4+ T-Zellen verharren in der klinisch unauffälligen Haut

und sind bereit für den nächsten Antigenkontakt.


- 21 -

1.5.4. Die Effektorphase (efferenter Schenkel der I mmunantwort)

Nachdem sich die Sensibilisierung ereignet hat, löst ein erneuter Kontakt mit dem

entsprechenden Hapten eine Reihe von Ereignissen aus (Abb. 1.5.), die letztendlich in

dem klinischen Bild eines allergischen KE resultieren.

Das Immunsystem reagiert allergen-spezifisch, mit dem Ziel, das Hapten durch eine

entsprechende Entzündungsreaktion zu eliminieren.

Zu Beginn der Effektorphase produzieren Haut-ansässige Leukozyten wie

Keratinozyten (KZ) oder DZ proinflammatorische Zytokine wie TNF-α und IL-1β [102].

Frühe Ereignisse beinhalten auch Mastzell-Degranulation und Vasodilatation, gefolgt

vom Eindringen der Zellen des angeborenen Immunsystems, wie z.B. von neutrophilen

Granulozyten und Natürlichen Killer (NK)-Zellen. Die Mastzellen scheinen eine Rolle in

der Verstärkung der Immunantwort zu spielen, da sie, aktiviert von CD8+ T-Zellen,

TNF-α und ‚Macrophage Inflammatory Protein’ (MIP-2/CXCL8) ausschütten, die

wiederum für die Rekrutierung von CXCR1- und 2-tragenden Neutrophilen wichtig sind

[103].

Im nächsten Schritt kommt es zusätzlich zur schnellen Einwanderung von

CCR4+/CLA+ aktivierten Hapten-spezifischen T-Lymphozyten sowie von unspezifisch

rekrutierten Lymphozyten in das betroffene Hautareal [83], [104].

Hapten-spezifische T-Zellen stellen lediglich etwa 1% der gesamten Population

infiltrierender T-Zellen dar, trotzdem ist die Anzahl dieser in der Haut akkumulierenden,

spezifischen T-Lymphozyten 10-100 mal höher als deren Gesamtmenge im

Blutkreislauf zu diesem Zeitpunkt.

Sowohl Hapten-spezifische als auch nicht-spezifische T-Zellen produzieren Zytokine,

sobald sie den Ort der Entzündung erreichen. TNF-β übt einen zytotoxischen Effekt auf

das Gewebe aus und induziert die Expression des Adhäsionsmoleküls ‚Intercellular

Adhesion Molecule’ (ICAM)-1 (CD54) auf Gefäßendothelzellen und basalen

Keratinozyten innerhalb von 48 Std nach Haptenkontakt. Das wiederum verstärkt die

Bindung der T-Zellen über LFA-1 an ICAM-1, und sie gelangen dadurch nicht nur in die

Haut, sondern auch von der Dermis in die Epidermis [105].

CD8+ zytotoxische T-Zellen spielen in der Effektorphase des KE eine wichtige Rolle:

neben der Produktion von Interferon (IFN)-γ wird die Entzündung durch deren

Zytotoxizität anhand von FAS/FASL sowie Perforin/Granzyme gesteuert [77] (Abb

1.5.). Die Ziele dieser zytotoxischen Angriffe sind überwiegend Keratinozyten, die


- 22 -

dadurch in Apoptose gehen [106]; [107], [108]. Das erleichtert dem Hapten das

Eindringen in die Epidermis, was wiederum die Entzündung verstärkt [109]. Durch IFN-

γ wird eine Vielzahl anderer Zytokine von hautansässigen und durch die Haut

zirkulierenden Leukozyten gebildet, wie ‚IFN-γ Inducible Protein’ (IP)-10 (CXCL-10),

‚Monokine-Induced by IFN-γ’ (MIG/CXCL-9), IL-1, IL-6, GM-CSF und CXCL-8. Zytokine

wie GM-CSF aktivieren Makrophagen/Monozyten und DZ und erhöhen dadurch die

Ausschüttung weiterer Entzündungsmediatoren, die erneut Proliferation und

Aktivierung der T-Zellen verstärken.

Die Effektorphase hat nach 24-72 Std ihren Höhepunkt, danach kommt es zur

Regulierung der Immunantwort. Verantwortlich für die ‚Gegenregulation’ des

Immunsystems könnten die sogenannten CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen (reg T-

Zellen) sein, die über einen bislang noch nicht vollständig geklärten Mechanismus die

weitere Expansion der CD8+ T-Zellen blockieren [110], [111], [112] (Abb 1.5.).


- 23 -

Dermal dendritic cells

Abbildung 1.5. Schema der Sensibilisierungs- und Ef fektorphase des

allergischen Kontaktekzems. Bearbeitet nach Saint-Mezard et al, Eur J Dermatol

2004 [113].

1-4: Sensibilisierungsphase; 5-7: Effektorphase

1. Eindringen des Haptens in das Stratum corneum und Aufnahme von LZ und DDZ 2.

LZ und DDZ werden durch die Haptenbindung/-aufnahme aktiviert und wandern durch

das afferente Lymphgefäß zum ableitenden LK 3. Die DZ finden sich in der

parakortikalen Zone des LK ein und präsentieren die Hapten-Peptid-Komplexe

entweder über MHCI oder MHCII den CD8+ bzw. CD4+ T-Zellen 4. Es kommt zur

klonalen Proliferation der spezifischen T-Zellvorläufer im LK, die dann über die

efferente Lymphbahn und den Ductus thoracicus in den Blutstrom auswandern und

dort die zur Hauteinwanderung benötigten Moleküle CLA und CCR4 akquirieren. Damit

ist die Sensibilisierungsphase abgeschlossen.

5. Bei einem zweiten Antigenkontakt penetriert das Hapten erneut durch die Epidermis

und wird von LZ, DDZ oder anderen MHC Moleküle-tragenden Zellen (Keratinozyten)

prozessiert und auf ihrer Oberfläche über MHCI/MHCII präsentiert. Die Hapten-

spezifischen T-Zellen sind in der Lage, das Antigen zu erkennen und eine spezifische

Immunantwort einzuleiten 6. Durch die Aktivierung zytotoxischer CD8+ T-Zellen und


- 24 -

die Apoptose von Keratinozyten wird die Entzündungsreaktion eingeleitet, die durch die

Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine und Chemokine zustande kommt 7. Die

Ausschüttung dieser Chemokine ist für die anschließende Rekrutierung von

zusätzlichen T-Zellen (einschließlich reg T-Zellen) verantwortlich. Die Klinik zeigt nach

48-72 Std die maximale Ausprägung des KEs.

Zielsetzung Ch. Bangert

- 25 -

2. ZIELSETZUNG

Bisher wurde nur lückenhaft untersucht, welche Zellen tatsächlich an der Effektorphase

des allergischen KE beteiligt sind. Das Auslösen dieser Phase erfordert vermutlich

intensiven Kontakt zwischen T-Zellen und APZ, die sowohl in der Haut residieren als

auch vom Blut eingewandert sein können. Um welche APZ es sich jedoch handelt, die

eine Hapten-spezifische Antwort auslöst, ist bislang unklar. Obwohl LZ häufig als

zentrale Verstärker der Effektorphase angesehen werden [52], zeigen andere

Ergebnisse, dass eine Depletion dieser Zellen nach der Sensibilisierungsphase eher

eine verstärkte als eine abgeschwächte Immunantwort bei erneuter Hapten-

Provokation zur Folge hat [50].

Auch ist nach wie vor unbekannt, weswegen die Erkrankung nur bei bestimmten

Personen und nicht (wie das toxische KE) bei allen Menschen auftritt. Neben dem

Mangel an Sensibilisierung wird bei Nicht-Allergikern vor allem das Vorkommen von

Hapten-spezifischen regulatorischen T-Zellen diskutiert, die eine allergische Reaktion

unterdrücken können [78]. Bislang ist nicht restlos geklärt, ob CD4+ oder CD8+ T-

Zellen die Immunantwort der Effektorphase auslösen [78], [79], [81], [83], [114], [115].

Diese gegensätzlichen Ergebnisse hinsichtlich der Natur der unmittelbar involvierten

Zellen in der Effektorphase weisen daraufhin, daß das allergische KE ein wesentlich

komplexeres Ereignis darstellt als bisher angenommen. Um einen umfassenden

Überblick über das Geschehen in dieser Erkrankung zu erhalten, haben wir in der

vorliegenden Studie das leukozytäre Infiltrat von ECT zu unterschiedlichen Zeitpunkten

phänotypisch analysiert und richten unser Augenmerk besonders auf APZ und T-

Zellen.

Zusätzlich wird der Einfluß von Ni und Duftstoffen auf die Qualität des entzündlichen

Infiltrats bestimmt. Im Besonderen interessiert uns, ob phänotypische Unterschiede

hinsichtlich der Verteilung von Effektor-, reg T-Zell-Populationen und/oder APZ durch

diese chemisch differenten Haptene induziert werden können.

Durch die erhaltenen Informationen über Kinetik, Ausmaß und Art der entzündlichen

Immunantwort soll ein weiterer wichtiger Grundstein für das Verständnis der

Immunpathologie im humanen KE gelegt und dadurch eine gezielte Forschung zur

Aufklärung der Immunpathogenese erleichtert werden.

Methoden Ch. Bangert

- 26 -

3. MATERIAL UND METHODEN 3.1 Material 3.1.1 Patienten Nach Anerkennung des Studienprotokolls durch die Medizinische Universität Wien und

Zustimmung der lokalen Ethikkommission wurde die Studie nach den Richtlinien der

Deklaration von Helsinki durchgeführt. Alle Patienten hatten zuvor ihr schriftliches

Einverständnis zur Studienteilnahme gegeben.

5 Patienten mit positivem ECT für Ni, 5 Patienten mit positivem ECT für Duftstoff sowie

5 gesunde Kontrollpersonen wurden für die Analyse des zellulären Infiltrats läsionaler

Haut in die Studie aufgenommen (Tab. 3.1.1.). Weitere 3 Patienten mit positivem ECT

für Ni wurden zur Analyse der Infiltrationskinetik von Leukozyten in die Haut

eingeschlossen.

5 Patienten mit positivem ECT für mindestens 3 verschiedene Haptene wurden

zusätzlich für die durchflußzytometrische Charakterisierung von pDZ in läsionaler Haut

und peripherem Blut aufgenommen.

Folgende Ausschlusskriterien wurden vor Einschluß der Patienten beachtet:

1) Orale Verabreichung von systemischen Steroiden oder

Immunsuppressiva bis 2 Wochen vor der Gewebsentnahme

2) PUVA, UVB Bestrahlung bis 4 Wochen vor der Gewebsentnahme

3) Applikation von kortikosteroidhaltigen Externa bis 2 Wochen vor

Entnahme der Gewebsprobe

4) Immunsuppression aufgrund einer Erkrankung (z.B. HIV-Infektion) oder

medikamentös induziert (bei onkologischen Patienten oder im Zuge einer

Transplantation)

5) Atopische Disposition


- 27 -

Tabelle 3.1.1. Probandenübersicht

Probanden Alter Geschlecht Allergen Entzündungs- Nummer (Jahre) grad

1 47 W Nickel 2 2 43 W Nickel 3 3 44 W Nickel 1 4 48 W Nickel 2 5 46 W Nickel 2 6 58 M Duftstoff Mix 3 7 76 M Duftstoff Mix 2 8 48 W Duftstoff Mix 1 9 22 W Duftstoff Mix 2 10 27 W Duftstoff Mix 1

Probanden Alter Geschlecht Nummer (Jahre)

1 61 W 2 55 M 3 47 W 4 38 W 5 53 M

Normalhaut (Kontrollgruppe)

Epikutantestungen (72 Std) Std)


- 28 -

3.1.2 Biopsien

Die Haptene (Ni bzw. Duftstoff) wurden auf ein Areal am Rücken der Patienten mittels

standardisiertem ECT für 48 Std aufgetragen. Nach 48 sowie 72 Std wurde die

allergische Reaktion nach den Kriterien der ‚International Contact Dermatitis Research

Group’ beurteilt und entsprechend dem Status der Entzündung von Stufe 1 bis 3

eingeteilt, wobei Stufe 1 die am wenigsten positive Reaktion klassifizierte. Zur

Charakterisierung des zellulären Hautinfiltrats wurde den Patienten 72 Std nach Beginn

der Haptenauftragung eine 4 mm im Durchmesser große Stanzbiopsie entnommen.

Um die Infiltrationskinetik der Leukozyten in der allergischen Reaktion zu beurteilen,

wurden bei 3 Patienten zum Zeitpunkt 0, nach 24, 48 und 72 Std eine 4 mm große

Probeexcision durchgeführt. Bei 2 Patienten wurde zusätzlich eine Biopsie nach 6 Std

entnommen. Die Analyse mittels Durchflußzytometrie erforderte die Exzision von 3x6

mm großen Stanzbiopsien bei 5 Patienten.

Allen Patienten wurde vor der Entnahme subkutan ein Lokalanästhetikum in das zu

biopsierende Hautareal injiziert, um den Eingriff möglichst schmerzfrei zu gestalten.

Eine Allergie auf Lokalanästhetika wurde zuvor anamnestisch ausgeschlossen. Nach

Entnahme der Biopsien wurde die Wunde mit 1-3 Stichen vernäht. Den Patienten

wurde geraten, schwere körperliche Belastungen sowie sportliche Aktivitäten für 14

Tage zu unterlassen und die Wunde trocken und sauber zu halten. Nach 2 Wochen

wurden die Nähte entfernt. Alle Patienten haben die Entnahme ohne Nebenwirkungen

oder Komplikationen vertragen.

3.1.3 Blutproben

Zur durchflußzytometrischen Analyse der pDZ im peripheren Blut wurde 5 Patienten

mit positiven ECT 100ml Vollblut in heparinisierten Röhrchen entnommen. Die

Blutprobe wurde parallel zur Entnahme der Hautbiopsien vorgenommen. Bei allen

Patienten lag zum Zeitpunkt der Blutentnahme keine akute infektiöse Erkrankung vor.


- 29 -

3.1.4. Antikörper

Antikörper für immunhistochemische Analysen

Antigen Klon Firma

CD1a M2120; mIgG2b PeliCluster; CLB, Niederlande

CD1c M241;mIgG1 Ancell, Bayport, MN, USA

CD3 UCHT1; mIgG1 DAKO, Glostrup, Dänemark

CD4 SK 3; mIgG1 Becton Dickinson (BD)

Biosciences, San Jose, CA, US

CD8 C8/144B; mIgG1 DAKO

CD14 MФP9; mIgG2b BD

CD15 VIM16; rIgM Otto Majdic, Immunologie, AKH,

Wien, Österreich

CD25 2A3; mIgG1 BD

CD45RA L48; mIgG1 BD

CD45 HLE-2; mIgG1 BD

CD56 biot My31; mIgG1 BD

CD62L SK11; mIgG2a BD

CD83 HB15e; mIgG1 BD PharMingen, San Jose, CA,

USA

CD94 HP-3D9; mIgG1 BD PharMingen

CD117 95C3; mIgG1 An der Grub GmbH, Österreich

CDw123 biot 9F5; mIgG1 BD PharMingen

CxCR3 49801.111; mIgG1 R&DSystems GmbH,

Biomedica, Wien

ECP EG1; mIgG1 Kabi Pharmacia Diagnostics,

Schweden

FcεRIα-chain 15.1; mIgG1 (Ref. Wang et al, J Exp Med

1992)

Foxp3 biot 236A/E7, mIgG1 eBioscience, San Diego, CA,

USA


- 30 -

Antigen Klon Firma

γδ -TCR 5.A6.E9; mIgG1 Endogen, Woburn, MA, USA

Ki-67 Ki-S5; mIgG1 DAKO

Langerin (CD207) DCGM4; mIgG1 Immunotech, Coulter, Marseille,

Frankreich

PNAd MECA-79; rIgM BD PharMingen

Sekundärantikörper

Bezeichnung Firma

Streptavidin TRITC Jackson Immuno Research

Laboratories, West Baltimore,

Pennsylvania, USA

Streptavidin Alexa Fluor 488 Molecular Probes, Eugene, OR,

USA

Streptavidin Cy5 Jackson Immuno Research

Laboratories

Rhodamine (TRITC) goat-anti-mouse IgG Jackson Immuno Research

Laboratories

Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Molecular Probes

Oregon Green labelled goat anti-FITC Molecular Probes

Antikörper für die Durchflußzytometrie

Antigen Klon Firma

BDCA-2 FITC AC144; mIgG1 Miltenyi Biotech GmbH,

Bergisch-Gladbach, Deutschland

CD4 FITC RPA-T4; mIgG1 BD PharMingen

CD4 PerCP RPA-T4; mIgG1 BD

CD3 FITC SK-7; mIgG1 BD


- 31 -

CD3 PerCP SK7; mIgG1 BD

CD25 FITC M-A251; mIgG1 BD PharMingen

CD45RA FITC ALB11; mIgG1 Immunotech

CD62L FITC Dreg 56; mIgG1 BD PharMingen

CD83 FITC HB15a; mIgG2b Immunotech

CD86 FITC HA5.2B7; mIgG2b Immunotech

CD123 PE 9F5, mIgG1 BD PharMingen

CLA FITC HECA-452; rIgM BD PharMingen

CTLA-4 PE BNI3; mIgG2a BD PharMingen

MHCII FITC L243; mIgG2a BD

MHCII PerCP L243; mIgG2a BD

3.1.5. Chemikalien

Chemikalie Abkürzung Firma

3-Amino-9-Äthyl-Carbazol AEC Sigma-Aldrich St.Louis,

MO, USA

Acetonum purum Fluka, Buchs, Schweiz

Aethanol rein, 96% Anstaltsapotheke, AKH,

Wien, Österreich

Aethanol 70% Anstaltsapotheke, AKH

Aquamount Eindeckmedium BDH Laboratories Supplies,

Poole, UK

Bovines Serum Albumin BSA Sigma-Aldrich

Ficoll-Hypaque Amersham Biosciences AB,

Uppsala, Schweden

Humanes Immunglobulin Octagam Octapharma

Pharmazeutika, Wien,

Österreich

Hämatoxylin Merck

Normales Mausserum NMS DAKO

Nickelsulfat NiSO4 Sigma-Aldrich

PBS GIBCO, Invitrogen GmbH,

Lofer, Österreich

PBS (x10) GIBCO

RPMI 1640 GIBCO


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Tissue-Tek Einbettmedium OCT Sakura Finetek Europe

B.V., Zoeterwoude,

Niederlande

Trypanblau Sigma-Aldrich

Wasser H2O Anstaltsapotheke, AKH,

Wien

Wasserstoffperoxid 30% H2O2 MERCK-Schuchardt,

Hohenbrunn, Deutschland

Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories,

Burlingame, CA, USA

Vectastain Elite ABC Kit Vector Laboratories

(Mouse anti-human)

3.1.6. Verbrauchsmaterial

15ml, 50ml Röhrchen Fa. Greiner, Frickenhausen,

Deutschland

Deckgläser 25x40mm Fa.Menzel-Gläser,

Braunschweig, Deutschland

Einbettschälchen ‚Cryomold Standard’ Sakura Finetek Europe B.V.

(25mmx20mmx5mm)

Objektträger ‚ChemMateTM Capillary Gap DAKO

Microscope Slides (100µm)’

PS (Polystyrol)-Röhrchen (0,6ml) Fa. Greiner

Sterilfilter (EasyflowTM) BD Falcon, BD Biosciences

Zellsieb 40µm, steril BD Falcon, BD Biosciences

Steriles Einmalskalpell Größe 10 Kehr Surgical Private

Limited, Indien

Sterile Spritze, 2ml Chirana T.injecta, Slowakei


- 33 -

3.1.7. Geräte

Durchflusszytometer (FACScalibur) BD Biosciences

Durchlichtmikroskop Standard BHSU Olympus Life and Material Science

Europa GmbH, Hamburg,

Deutschland

Fluoreszenzmikroskop Axiophot Zeiss, Oberkochen, Deutschland

Laser Scanning Microscope (LSM) 510 Zeiss

Sterilbank (Lamina Air Flow) Fa. Heraeus, Osterode,

Deutschland

Zentrifuge (J-6B) Fa. Beckman, München,

Deutschland

Zentrifuge (Omnifuge 2.0 RS) Fa. Heraeus, Osterode

Zentrifuge (Biofuge pico) Fa. Heraeus, Osterode

Innova 4000, Incubator shaker P. Haack Laborausrüstung,

Wien, Österreich

3.1.8. Puffer

PBS-BSA-Puffer 2% Rinderserum-Albumin (BSA)

in PBS-Puffer


- 34 -

3.2 Methoden

3.2.1. Anfertigung von Gefrierschnitten

Die von den Patienten entnommenen Biopsien werden direkt nach der Entnahme bis

zum Zeitpunkt des Einbettens in RPMI 1640 Medium aufbewahrt. Um die Hautproben

möglichst trocken einzubetten, werden mit einer Kompresse zunächst vorsichtig Blut

und RPMI entfernt. Im Anschluß werden die Biopsien in eine mit Tissue Tek

Einbettmedium gefüllte Kammer gebettet und mit flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Bis

zur weiteren Verarbeitung werden sie bei –80°C gela gert.

Zum Anfertigen der Gefrierschnitte werden die Biopsien für etwa 30 Minuten bei -20°C

aufbewahrt und im Anschluß in 5µm dicke Schnitte verarbeitet. Die Schnitte werden

auf beschichtete Objektträger aufgetragen und für 20 Minuten luftgetrocknet. Danach

werden die Schnitte in eiskaltem Aceton bei 4°C für 10 Minuten fixiert und bis zur

weiteren Verarbeitung bei -20°C aufbewahrt.

3.2.2. Immunhistochemie

Zur Anfertigung von immunhistochemischen Färbungen werden die gefrorenen

Schnitte zunächst beschriftet und in PBS für ca. 10 Minuten aufgetaut. Zwischenzeitlich

werden die unmarkierten Antikörper in der jeweils entsprechenden Konzentration in 2%

BSA-PBS Puffer verdünnt. Zur Blockade unspezifischer Bindung des Zweitantikörpers

mischt man zusätzlich 1% normales Pferdeserum in den Puffer. Die gemischte Lösung

wird auf die Schnitte pipettiert und für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht

auf 4°C in einer feuchten Färbekammer inkubiert.

Nach der Inkubationszeit werden die Schnitte für 5 Minuten in 1xPBS gewaschen und

im Anschluß für 15 Minuten in 1% H202 zur Neutralisierung der endogenen Peroxidasen

aufbewahrt. Nach erneutem Waschen mit PBS werden 0,5% des Zweitantikörpers für

45 Minuten in einer feuchten Kammer aufgebracht.

Vor dem dritten und letzten Inkubationsschritt werden die Schnitte wiederum 3x5

Minuten in PBS gewaschen. Der 1%ige Avidin-Biotin-Komplex mit integrierter

Peroxidase wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf den Schnitten in der feuchten

Kammer belassen, und die Schnitte werden im Anschluß mit AEC Lösung entwickelt.

Zellen, die den Antikörper binden, färben sich rot. Die Gegenfärbung wird mit

Hämatoxylin durchgeführt.


- 35 -

3.2.3. Immunfluoreszenz

Die Liste der verwendeten Antikörper ist unter 3.1.4. aufgeführt.

Die Einzelfärbungen werden folgendermaßen vorgenommen:

Unmarkierte oder biotinylierte Antikörper werden in 2% BSA-PBS in der gewünschten

Konzentration verdünnt und die Schnitte damit über Nacht auf 4°C in einer feuchten

Kammer inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wird der Erstantikörper mittels

Zweitantikörper sichtbar gemacht und für 45 Minuten aufgebracht. Als

Sekundärantikörper wird je nach Färbekombination entweder Alexa 488- oder

Rhodamin-goat anti-mouse IgG, Streptavidin Alexa 488 oder Streptavidin TRITC

verwendet. Nach der Inkubation werden die Schnitte gewaschen, in 96% Äthanol

plaziert und direkt mit ‚Vectashield Mounting Medium’ eingedeckt.

Um das Zellinfiltrat besser analysieren zu können, sind auch Zwei- oder

Dreifachfärbungen notwendig.

Der erste Schritt der Doppelfärbungen erfolgt wie oben beschrieben. Die Schnitte

werden nach der Inkubation mit dem Sekundärantikörper jedoch nicht eingedeckt,

sondern für 20 Minuten mit 1-3% normalem Mausserum inkubiert, um freie

Bindungsstellen zu blockieren und somit den unspezifischen Hintergrund der Färbung

zu reduzieren. Danach wird der zweite Antikörper, diesmal mit Fluorescein (FITC)

direkt markiert oder biotinyliert, für mindestens 6 Std bei 4°C in der feuchten Kammer

aufgetragen.

Da FITC-markierte Antikörper dazu neigen, schnell zu verblassen, wird ein weiterer

Färbeschritt mit einem Oregon Green anti-FITC Antikörper angeschlossen (30 Minuten

bei Raumtemperatur). Biotinylierte Antikörper können mit Streptavidin TRITC für 45

Minuten entwickelt werden.

Für Dreifachfärbungen wird ein unmarkierter Antikörper mit TRITC ‚goat-anti-mouse

IgG’ entwickelt, die Schnitte mit normalem Mausserum inkubiert, ein direkt FITC-

markierter als auch ein biotinylierter Antikörper für 60 Minuten bei Raumtemperatur

aufgetragen und die Schnitte im Anschluß gleichzeitig mit Streptavidin Cy5 und Oregon

Green anti-FITC für 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

In allen Färbeexperimenten wird analog eine Isotypkontrolle durchgeführt, die mit den

gewünschten Antikörpern hinsichtlich Konzentration und Typ übereinstimmt.


- 36 -

3.2.4. Auswertung der Immunfluoreszenz

Die Schnitte werden von 2 unabhängigen Untersuchern an einem Fluoreszenz

Mikroskop in 400x Vergrößerung verblindet ausgezählt. Das Fluoreszenz Mikroskop ist

mit einem Doppelfilter für TRITC (Rot) und FITC (Grün) ausgestattet, der doppelt

gefärbte Zellen in einer gelben Farbe erscheinen lässt und somit klar erkennbar macht.

Die infiltrierenden Leukozyten werden für Epidermis und Dermis getrennt ausgezählt.

Die markierten Zellen werden pro Gesichtsfeld (GF) ausgezählt und als Anzahl pro mm

Basalmembran Epidermis oder pro mm2 Dermis angegeben.

Um die Anzahl der Zellen auf mm Epidermis umrechnen zu können, wird zunächst der

Durchmesser des verwendeten GF errechnet.

Hier gilt, dass die Sehfeldzahl durch die Maßstabszahl des verwendeten Objektivs

geteilt wird, um den Durchmesser des GF zu erhalten. Die Sehfeldzahl des

verwendeten Okulars 10x/25 des Fluoreszenzmikroskops Axiophot der Firma Zeiss

beträgt 25. Die Maßstabzahl des Objektivs ist 40, so dass der Durchmesser 0,625mm

beträgt (Durchmesser des GF= 25/40 (Sehfeldzahl/Maßstabzahl)=0,625mm)). Die

Länge der GF wurde daraufhin auf 1mm berechnet, um die gesuchte Zellzahl pro mm

Epidermis zu erhalten (z.B. 3 GF= 3*0,625mm=1,875mm. 300 Zellen/1,875mm=160

Zellen/mm)

Um die Anzahl der Zellen/mm2 Dermis zu errechnen, wird zunächst die Fläche des

Kreises bzw. des GF ermittelt (Kreisfläche=r2*π d.h. Fläche des

GF=(0,3125mm)2*π=0,097656mm2*3,141593=0,306796mm2).

Die gerundete Zahl und somit das Ergebnis der Fläche des Gesichtsfelds betragen

0,31mm2. Die Anzahl der Zellen pro GF wird schließlich mit 3,2258 multipliziert, um das

Ergebnis pro mm2 Dermis angeben zu können.

Nur Zellen, die deutlich positiv sind, werden in die Wertung aufgenommen.

Statistische Signifikanz wird mit dem Students T-Test bestimmt.

Um Dreifachfärbungen visuell dokumentieren zu können, wird konfokale

Lasermikroskopie (LSM510) angewendet.


- 37 -

3.2.5. Gewinnung von mononukleären Zellen aus dem p eripheren Blut (PBMC)

Die Isolierung von mononukleären Leukozyten aus Patientenblut erfolgt über eine

Dichtegradientenzentrifugation. Heparinisiertes Vollblut wird zunächst im Verhältnis 1:2

mit PBS-Puffer verdünnt und dann mit 10ml Ficoll-Trennlösung, Dichte 1,077, in 50ml-

Röhrchen unterschichtet.

Nach 30min Zentrifugation bei 1600 rpm (550g) wird die Interphase, die die

mononukleären Zellen als Ring über der Ficoll-Lösung enthält, mittels einer

Einmalpipette abgenommen. Die so isolierte Fraktion wird in 50ml PBS-Puffer bei 1600

rpm gewaschen und anschließend mit 50ml PBS-Puffer bei geringerer Drehzahl (1200

rpm) zentrifugiert, um die leichteren Thrombozyten entfernen zu können. Abschließend

werden die verbleibenden mononukleären Zellen in PBS-Puffer resuspendiert und

gezählt.

3.2.6. Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus d er Haut

Für die Einzelzellsuspensionen der Haut werden 3x4mm Biopsien von 5 verschiedenen

Patienten mit positivem ECT auf mindestens 3 verschiedene Haptene entnommen. Die

Biopsien werden mittels sterilem Sklapell in winzige Stückchen zerteilt und danach in

50ml Röhrchen, gefüllt mit RPMI 1640 Medium, für 2 Std in einem Zellschüttler bei

37°C inkubiert. Aufgrund der dadurch erzielten Lock erung des Gewebes wird die

Migration der Zellen in das Medium unterstützt.

Die kleinen Biopsiestückchen werden im Anschluß mitsamt Medium in ein Zellsieb mit

der Größe 40µm geschüttet, das auf 50ml Röhrchen aufgesetzt wird. Die Haut wird

dann mit dem Stempel einer 2ml Plastikspritze zerrieben und die Zellen so aus dem

Gewebe in eine Suspension überführt. Das verbleibende Gewebe, hauptsächlich

bestehend aus Kollagenfasern, wird entsorgt.

Die Zellsuspension wird im Anschluß gewaschen, zentrifugiert und die Zellen gezählt.

3.2.7. Zellzählung in Suspension

20µl der Zellsuspension werden mit 20µl Trypanblau zur Vitalitätsbestimmung verdünnt

und im Anschluß ausgezählt. Zellen, die sich durch Trypanblau verfärbt haben,

verfügen über keine intakte Zellwand mehr und werden nicht mitgezählt.

Die gesamte Suspension wird in eine Neubauer-Zählkammer (Kammertiefe 0,1mm)

pipettiert. Unter dem Mikroskop werden alle Zellen in den vorhandenen 20 Quadraten

(Gesamtfläche: 1mm2) ausgezählt und das Zählergebnis mit dem Verdünnungsfaktor


- 38 -

sowie dem Faktor 104 für das Kammervolumen/ml multipliziert (siehe Formel). Die

gesamte Zellzahl ergibt sich aus der Multiplikation mit dem Suspensionsvolumen.

Ausgezählte Zellen *2 (Verdünnung) * 104 (Faktor für Kammervolumen) * x (ml

Suspension) = Gesamtzellzahl

3.2.8. Durchflusszytometrie

3.2.8.1. Durchführung und Darstellung

Die Durchflußzytometrie bzw. englisch: FACS-Analyse („fluorescent activated cell

sorting“) dient zur Identifizierung von zellspezifischen Antigenen. Hierfür werden die

Zellen über ein Schlauchsystem aufgesaugt und mit Druck in einen sogenannten

Mantelstrahl (Sheath) injiziert. Die Zellen werden so beschleunigt und hintereinander

aufgereiht, dass sie einzeln in die Meßkammer gelangen. Dort wird jede Zelle vom

Laserstrahl getroffen. Das gestreute Licht wird bei 180° (FSC = forward light scatter)

und 90° (SSC = sideward light scatter) gemessen. Di e entstehende Streuung ist

zelltypspezifisch und abhängig von der Größe der Zellen (FSC) sowie deren

Granularität (SSC). So entstehen in der Dot Plot Grafik abgegrenzte Punktwolken für

Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten oder auch Erythrozyten.

Bei der Fluoreszenzanalyse mittels antigenspezifischer Antikörper werden die

einzelnen Zellen durch einen Laser angeregt und an elektronischen Detektoren

vorbeigeführt, die die Fluoreszenzintensität der Zelle registrieren. Die jeweils zu

analysierenden Zellpopulationen können über ein „Gate“ eingegrenzt und somit von

den anderen Zelltypen für die Analyse getrennt werden.

3.2.8.2. Phänotypische Analysen von Oberflächenmark ern

Zur Analyse der Proteinexpression auf der Zelloberfläche werden die Zellen zunächst

mit spezifischen Antikörpern gegen das zu untersuchende Antigen inkubiert. Die

verwendeten Antikörper sind unter 3.1.4. aufgeführt. Die Analysen werden mit FITC-,

PE- oder PerCP-konjugierten Antikörpern als direkte Dreifarbenfluoreszenz

durchgeführt.

Pro Ansatz werden etwa 3x105 aus dem Blut oder aus der Haut isolierte Zellen in etwa

50µl PBS pipettiert. Zur Blockade unspezifischer Bindungen der Antikörper an Fcγ-

Rezeptoren der Zellen werden pro Ansatz 100µg/ml humanes Immunglobulin

zugegeben. Anschließend werden die mit Fluoreszenzfarbstoffen konjugierten

Antikörper in der vom Hersteller empfohlenen Dosierung hinzugefügt. Die Inkubation


- 39 -

erfolgt daraufhin für 15min auf Eis. Nach dreimaligem Waschen mit je 150µl PBS

werden die Zellen im FACS analysiert.

Je Ansatz werden 10.000 eingegrenzte Zellen mit Hilfe des Computerprogramms

‚CellQuest®’ ausgewertet. Um bei der Analyse von pDZ aus peripheren

Blutlymphozyten die T-Zellen auszugrenzen, wird ein für DZ spezifisches ‚Gate’

gesetzt. Ebenso werden zur besseren Analyse der reg T-Zellen aus der Haut die DZ

anhand ihrer Größe und Granularität mit einem ‚Gate’ ausgeschlossen.

Die Autofluoreszenz wird durch Negativkontrollen mit dem entsprechenden Isotyp

bestimmt. Die prozentuale Verteilung negativer und positiver Zellen wird anschließend

im Dot Plot ermittelt.

Die Expressionsdichte des entsprechenden Antigens wird durch die Höhe der

Fluoreszenzintensität (MFI = mittlere Fluoreszenzintensität) repräsentiert. Bei der

Auswertung mit der CellQuest® Software wird der Dot Plot in Quadranten unterteilt

sowie die Verteilung der Zellen und die MFI des jeweiligen Quadranten ermittelt. Die

jeweilige Prozentzahl der positiv gefärbten Zellen wird im rechten oberen Quadranten

der Dot Plots angegeben.

Ergebnisse Ch. Bangert

- 40 -

4. ERGEBNISSE

4.1. Anzahl und Verteilung der Leukozyten

In dieser Studie haben wir versucht, einen detaillierten Überblick über die

verschiedenen Zellarten zu geben, welche maßgeblich an der ekzematösen Reaktion

in der Effektorphase des humanen KE beteiligt sind. Es wurden Biopsien sowohl aus

positiven 72 Std ECT (n=10) als auch von Normalhaut (NH) (n=5) entnommen, und wir

führten mittels Immunfluoreszenz eine ausführliche Analyse der infiltrierenden

Zellpopulationen durch. Die Resultate sind in der Tabelle 4.1. zusammen gefasst. Die

Färbung der NH mit dem Pan-Leukozyten Marker CD45 zeigte nur wenig positive

Zellen in Epidermis und Dermis. Die genaue Analyse der gesunden Biopsien ergab,

dass diese CD45+ Zellen in der Epidermis hauptsächlich aus CD1a+ DZ und in der

Dermis vor allem aus CD3+ T-Zellen, CD14+ Makrophagen, CD1c+ DZ und CD117+

(c-kit) Mastzellen bestehen.

Im Gegensatz dazu fanden wir in den ECT ein massives leukozytäres CD45+ Infiltrat in

beiden Hautschichten. Verglichen mit der NH war die Anzahl der Zellen beinahe

doppelt so hoch in der Epidermis und verfünffacht in der Dermis. Zu einem großen Teil

bestand das Infiltrat aus T-Zellen oder Mitgliedern der DZ Familie. Es fand sich aber

auch ein beträchtlicher Anstieg der Zellzahl von Mastzellen, CD15+ neutrophilen und

EG1+ eosinophilen Granulozyten und Makrophagen. Ebenso stieg auch die Anzahl

von CD56+ oder CD94+ NK-Zellen.


- 41 -

Tabelle 4.1. Anzahl der Leukozyten in NH und 72 Std ECT Läsionena

Zellart Antigen (e) Epidermis (positive Zellen/mm) Dermis (positive Zellen/mm 2)

NH 72 Std ECT NH 72 Std ECT

Leukozyten CD45+ 14,1 (12,1-17,7) 30,8 (21,5-50,6) 86 (64,7-97,6) 435,3 (240,6-858)

T-Zellen CD3+ 2,7 (0-3,5) 20,9 (3,7-43,2) 39,5 (2,4-58,4) 513,1 (109,3-896)

DN T-Zellen b CD3+/CD4-/CD8- 0 (0) 0,4 (0-6,1) 0 (0-1) 14,4 (7,6-24,7)

Helfer T-Zellen

CD3+/CD4+ 2,3 (0-2,9) 16,8 (3,2-29,2) 20,4 (2,4-45,2) 396,7 (83-696,8)

Zytotoxische T-Zellen CD3+/CD8+ 0,6 (0,3-0,9) 6,7 (0,5-13) 8,6 (3,2-44,4) 133,9 (26,3-363,4)

γδ T−Zellen γδ-TCR+ 0 (0) 1 (0-6,4) 2,2 (0-3,7) 11,9 (2,2-36,6)

Teff / Tregc CD4+/CD25+ 0 (0) 2,2 (1,6-11,2) 3,2 (1,3-5,2) 21 (9,7-53,8)

NK T-Zellen CD94+/CD3+ 0 (0) 0 (0-3,1) 0,7 (0-1,6) 10,1 (3,2-19,4)

NK-Zellen CD94+ 0 (0) 1,9 (0-5,2) 2,4 (0,4-8,2) 39,7 (12,2-217,6)

NK-Zellen CD56+ 0 (0) 0,2 (0-5,3) 7,7 (3,7-19,7) 23,1 (8,1-115,1)

pDZ CD123+/CD45RA+ 0 (0) 3,5 (0-6,5) 1,4 (0-2,8) 39,8 (14,6-85,8)

LZ Langerin+ 27,7 (18,2-32,8) 18 (13,3-21,5) 1,1 (0,9-3,2) 17,5 (1,1-28,1)

LZ CD1a+ 18,7 (14,1-24,3) 12,1 (4,1-20,3) 13,5 (10,9-31,4) 44,5 (20,6-95,7)

DDZ CD1c+ 4,45 (1,6-7,7) 16,6 (3-26,3) 24 (11,6-49) 97,1 (53-164,5)

IDEZ/IDDZd CD1a+/CD1c+ 0,5 (0-2,4) 5,2 (1,4-8,2) 2,3 (1,1-20,4) 18,9 (4,8-43,5)

Mature LZ CD1a+/CD83+ 0,7 (0-1,6) 3,5 (1-6,4) 0,9 (0-1,8) 14,9 (9-40,9)

Mature DDZ CD1c+/CD83+ 1 (0,2-2) 1,4 (0,8-2,3) 5,9 (1,6-17,2) 11 (3,7-14,8)

Mastzellen CD117+(c-Kit) 0 (0) 0 (0) 18,5 (6-40,3) 31,1 (14,7-54,5)

Makrophagen CD14+ 0 (0-1) 1,9 (0-3,8) 15,2 (9,7-25,8) 30,6 (14,8-51)

Neutrophile CD15+ 0 (0) 0 (0-6,4) 0 (0) 29,8 (4,8-167,7)

Eosinophile EG1+ 0 (0) 0 (0) 0 (0) 21,5 (1,1-37,6)

a Die Zellen wurden mit den angegebenen Markern visualisiert und mittels IF analysiert.

Die Zahlen zeigen den Mittelwert und die Spannbreite (in Klammern) der Zellen, die in

10 ECT Reaktionen und 5 NH ermittelt wurden.

b Doppelt-negative T-Zellen

c Effektor T-Zellen / regulatorische T-Zellen

d Inflammatorische epidermale/dermale dendritische Zellen (IDEZ/IDDZ)


- 42 -

4.2. T-Zellen im ECT

4.2.1. Typisierung der T-Zellen im dermalen Infiltr at Die überwältigende Mehrheit der infiltrierenden Zellen der Epidermis und Dermis in

ECT Läsionen besteht nach 72 Std aus CD3+ T-Zellen. Zwei Drittel dieser Zellen

zählen zu den CD4+ Helfer T-Zellen während das verbleibende Drittel den CD8+

zytotoxischen T-Zellen zuzuordnen ist (Abbildung 4.2.1.1.). Wir konnten einen geringen

Anteil CD3+/CD4-/CD8- T-Zellen detektieren, aber keine CD3+/CD4+/CD8+ Zellen

(Abbildung 4.2.1.2.; Tabelle 4.1.).

In einem Maus Modell für Kontakthypersensitivität konnte gezeigt werden, dass γδ-T-

Zellen eine regulierende Rolle einnehmen können [93]. Wir versuchten, diese Zellen

auch im humanen ECT zu charakterisieren und verglichen deren Anzahl mit der Anzahl

der häufiger vorkommenden αβ-Rezeptor tragenden T-Zellen. Obwohl die Mehrheit der

dermalen infiltrierenden T-Zellen den αβ TZR trägt, zeigt doch eine kleine, gut

abgrenzbare Population den γδ Rezeptor (Tabelle 4.1.).

Um herauszufinden, ob die T-Zellen in der Haut proliferieren oder ob der Anstieg der

CD3+ Zellen durch einen Zustrom aus dem Blut bedingt ist, führten wir

Doppelfärbungen mit dem Proliferationsmarker Ki-67 und CD3 durch (Daten s.

Anhang). Keine der T-Zellen reagierte mit dem Antikörper Ki-67, so dass wir davon

ausgehen, dass in ECT Läsionen die T-Zellen aus dem Blut in die Läsion rekrutiert

werden.


- 43 -

Abbildung 4.2.1.1. Doppelfärbungen durch IF zur Charakterisierung der T-

Zellpopulationen im dermalen Infiltrat in 72 Std bestehenden ECT Reaktionen

(Originalvergrößerung: 200x). T-Helfer Zellen wurden durch anti-CD3 (FITC, links

oben)/anti-CD4 (TRITC, Mitte oben) charakterisiert, zytotoxische T-Zellen durch anti-

CD3 (FITC, links unten)/anti-CD8 (TRITC, Mitte unten). Zellen, die jeweils beide

Zielantigene tragen, erscheinen gelb (rechts oben bzw. unten). Die Mehrzahl der Zellen

ist der Subpopulation der CD4+ T-Zellen zuzuordnen.


- 44 -

Abbildung 4.2.1.2. Zunahme von T-Zellen in der Epidermis (A) und Dermis (B) von

positiven 72h ECT. Gefrierschnitte von NH und ECT Läsionen wurden mittels IF

ausgewertet. T-Zellen sowie ihre Subpopulationen wurden entweder mittels anti-CD3

alleine, anti-CD3 (FITC)/anti-CD4 (TRITC) oder anti-CD3 (FITC)/anti-CD8 (TRITC)

Doppelfärbungen analysiert. Für die Identifizierung der DN T-Zellen wurden die

Schnitte zunächst mit anti-CD4 (TRITC) und anti-CD8 (TRITC) inkubiert und

anschließend mit anti-CD3 (FITC) gefärbt. Gezählt wurden dann einfach CD3+ Zellen.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Zellen/mm Epider-mis

Zellen/mm2 Dermis

CD3+ CD3+/CD4-/CD8- CD3+/CD4+ CD3+/CD8+

0

100

200

300

400

500

600

700

800

CD3+ CD3+/CD4-/CD8- CD3+/CD4+ CD3+/CD8+

∗

∗

∗

∗

∗

∗

∗

NH

ECT 72 Std

NH

ECT 72 Std

A

B


- 45 -

Insgesamt wurden nur Zellen ausgewertet, die eine deutlich positive Reaktion zeigten.

Die Daten zeigen den Mittelwert der T-Zellanzahl ± Standardabweichung in 10 ECT

Läsionen und 5 Biopsien von NH. Statistische Signifikanz wurde mit Students T-Test

ermittelt (٭p<0,012).

4.2.2. Charakterisierung der CD4+/CD25+ T-Zellsubpo pulation

Ungefähr 5% aller dermalen CD4+ Zellen reagierte mit Antikörpern gegen die IL-2-

Rezeptor α−Kette (CD25). Sowohl CD4 als auch CD25 können von aktivierten DZ,

Makrophagen oder reg T-Zellen exprimiert werden. Wir wollten wissen, ob im Infiltrat

der ECT Läsionen auch letztere vorhanden sind und führten deswegen eine FACS

Analyse von Zellsuspensionen durch, die wir aus Biopsien von 72 Std ECT gewannen.

Wir charakterisierten die T-Zellen im FACS anhand ihrer typischen Morphologie und

Größe. DZ oder Makrophagen konnten wir ausschließen.

Diese Untersuchungen zeigten eine CD4+/CD25+ T-Zellpopulation (ca. 30% der

Gesamtzellzahl), die zusätzlich das Antigen CTLA-4 aufwiesen. Die überwiegende

Mehrzahl der CD4+/CD25- T-Zellen hingegen zeigte keine gleichzeitige Expression

von CTLA-4 (Abb. 4.2.2.1.). Auch in situ konnte anhand von konfokaler

Lasermikroskopie mittels Dreifach- Immunfluoreszenzfärbungen eine beträchtliche

Anzahl von Zellen mit den phänotypischen Zeichen von reg T-Zellen nachgewiesen

und somit das Ergebnis der FACS Färbungen bestätigt werden (Abb. 4.2.2.2.). Eine

weitere Analyse mittels IF zeigte zusätzlich das Vorkommen des Moleküls Foxp3 auf

den CD4+/CD25+ T-Zellen (Daten s. Anhang).

Um Aufschluss über den zeitlichen Ablauf der Einwanderung von T-Zellen in die Haut

zu erhalten, untersuchten wir ECT Reaktionen, die wir zum Zeitpunkt 0, nach 24, 48

und 72 Std entnahmen. Bereits 24 Std nach Auftragen des Haptens beobachteten wir

eine beträchtliche Anzahl von CD4+ T-Zellen, die allerdings nur sehr wenig Reaktivität

gegen CD25 aufzeigten (Abb.4.2.2.3.). Allerdings stieg nach 48 Std Haptenkontakt der

relative Anteil von CD25+ Zellen an der CD4+ Zellpopulation deutlich an. Dies könnte

entweder bedeuten, dass die Subpopulation der CD4+/CD25+ T-Zellen verzögert aus

dem Blut rekrutiert wird oder dass sich die bereits eingewanderten CD25- T-Zellen

nach 48 Std in CD25+ Zellen umgewandelt hatten.

Diese CD25+/CD4+ T-Zelluntergruppe kann sowohl reg T-Zellen als auch Effektor T-

Zellen darstellen [85]. Derzeit kann noch nicht anhand eines bestimmten

Oberflächenmoleküls die eindeutige Zuordnung der Zellen in die eine oder andere


- 46 -

Gruppe erfolgen. Es gibt aber einige Antigene, die typischerweise auf reg T-Zellen zu

finden sind, wenn auch nicht ausschließlich. Zu diesen Molekülen zählen u.a. CTLA-4

und Foxp3.

Die von uns definierten Zellen wiesen diese Oberflächenstrukturen auf. Im humanen

KE könnten diese Zellen somit als reg T-Zellen zur Beendigung der Immunantwort

beitragen oder auch als Effektor- T-Zellen die Reaktion verstärken. Leider konnten wir

aufgrund der äußerst limitierten Zellzahlen, die wir aus den entnommenen 4mm ECT

Biopsien erhielten, keine funktionellen Untersuchungen durchführen, so dass die letzte

Bestätigung der regulatorischen Funktion dieser Zellen vorerst fehlt.


- 47 -

Abbildung 4.2.2.1. FACS Analyse von epidermalen/dermalen Zellsuspensionen aus

72 Std ECT Läsionen. Nach Ausschluss von Makrophagen oder DZ durch

morphologische Trennung nach Größe und Granularität, wurden CD4+ T-Zellen nach

positiver Reaktivität auf CD25 oder CTLA-4 untersucht. Ein Großteil der CD4+/CD25+

Zellen exprimiert CTLA-4, aber nur ein geringer Anteil der CD25- Zellen. Diese

Abbildung repräsentiert die Ergebnisse von 3 unabhängigen Experimenten.

CD25- CD25+

76.4%

8.7%

CD4

CD25 CTLA-4

CD25-

CD25+


- 48 -

Abbildung 4.2.2.2. In situ IF Färbungen mit CD4-FITC, CD25-TRITC

und CTLA-4-Cy5 in ECT Läsionen. In den typischen Infiltrathaufen der

Dermis finden sich viele CD4+ Zellen, die mehrfach auch CTLA-4 und

CD25 tragen. Das rechte untere Bild zeigt die Überlappung der

Färbungen, dreifach positive Zellen sind durch Pfeile gekennzeichnet

(Originalvergrößerung: 600x).


- 49 -

Abbildung 4.2.2.3. Zeitabfolge des Erscheinens von CD4+/CD3+ T-Zellen (oberes Bild)

und CD4+/CD25+ T-Zellen (unteres Bild) in das Infiltrat von positiven ECT. Die Biopsien

wurden zu vier unterschiedlichen Zeitpunkten nach Auftragung des Haptens

entnommen (Zeitpunkt 0, nach 24, 48 und 72 Std). Anhand von Doppelfärbungen in der

Immunfluoreszenz wurden entweder CD4/CD3 oder CD4/CD25 positive Zellen in der

Epidermis (Zellen/mm Basalmembran) und Dermis (Zellen/mm2) ausgezählt. In der

Epidermis gibt es nur sehr wenige T-Zellen zu jedem Zeitpunkt. Interessanterweise

findet sich nach 24 Std in der Dermis lediglich eine Zunahme von CD4+/CD3+ T-Zellen,

aber keine Vermehrung der CD4+/CD25+ Zellen. Nach 48 Std steigt der Anteil dieser

Zellen im Infiltrat jedoch deutlich an und bleibt auch noch nach 72 Std detektierbar.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Zellen/mm 2 Dermis

NH ECT 24 Std ECT 48 Std ECT 72 Std

CD4+/ CD25+ Zellen

0

50

100

150

200

250

300

CD4+/CD3+

Zellen

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis

Zellen/mm Epidermis

NH ECT 24 Std ECT 48 Std ECT 72 Std


- 50 -

4.3. DZ Populationen im ECT

4.3.1. LZ im ECT

Zur Charakterisierung der LZ in NH und läsionaler Haut führten wir Färbungen mit anti-

CD1a und anti-Langerin durch (Abbildung 4.3.1.1.). Unter physiologischen Umständen

zeigte sich eine hohe Anzahl von CD1a+ und Langerin+ DZ in der Epidermis.

Demgegenüber wies die allergische Haut 72 Std nach Haptenapplikation eine deutliche

Veränderung auf: CD1a+ Zellen sind in der Epidermis deutlich reduziert und dafür in

der Dermis erhöht; Langerin+ LZ ebenfalls in der Epidermis vermindert, aber in der

Dermis nur leicht erhöht. Die Gesamtzahl der CD1a+ DZ ist im ECT verglichen mit NH

höher (Abbildung 4.3.1.2.).

Abbildung 4.3.1.1. Doppelfärbungen der LZ in 72 Std ECT Reaktionen mittels

Immunfluoreszenz anhand von CD1a-FITC (links) und Langerin-TRITC (Mitte). Die

Überlappung der beiden Antikörper zeigt sich in gelb (rechts). Die Zellen befinden sich

überwiegend in der Epidermis, wie durch die Pfeile angedeutet. Die weiße Linie markiert die

Basalmembran (Originalvergrößerung: 400x).


- 51 -

Abbildung 4.3.1.2. Verteilung der LZ, DDZ und pDZ in der Epidermis (A) und

Dermis (B) von NH und von positiven 72 Std ECT Reaktionen. Gefrierschnitte

wurden mittels Immunfluoreszenz analysiert. Anhand von Einzelfärbungen wurden

LZ (CD1a und Langerin) sowie DDZ (CD1c) evaluiert, pDZ durch anti-CD123 und

anti-CD45RA Doppelfärbungen. Nur Zellen mit deutlich positiver Färbung wurden

ausgezählt. Statistische Signifikanz wurde mit dem Students-T-Test ermittelt

.(p<0,025٭٭ ;p<0,005 ٭)

0

5

10

15

20

25

30

35

0

50

100

150

A

CD1a+ Langerin + CD1c+ CD123+/CD45RA+

CD1a+ Langerin + CD1c+ CD123+/CD45RA+

B

∗ ∗

∗

∗∗

∗∗ ∗

∗

∗

NH

ECT 72Std

NH

ECT 72Std

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis


- 52 -

4.3.2. DDZ im ECT

Um die Anzahl der DDZ in der läsionalen Haut versus NH beurteilen zu können,

führten wir Einzelfärbungen mit CD1c durch und werteten die Gefrierschnitte aus

(Abbildung 4.3.2.1.). Die NH wies in der Dermis im Gegensatz zur Epidermis mehrere

DDZ auf. Wie bei entzündlichen Veränderungen der Haut zu erwarten, fand sich im KE

eine massive Zunahme der DDZ sowohl in der Epidermis als auch in der Dermis

(Abbildung 4.3.1.2.).

Eine nähere Analyse der Oberflächenantigene dieser Zellen ergab, dass sowohl in der

Dermis als auch in der Epidermis ca. 20% der CD1c+ Zellen in ECT Läsionen mit

derselben Intensität CD1a exprimieren (Abbildung 4.3.2.2.). Anhand solcher

Koexpression könnte es sich bei diesen Zellen entweder um eine Untergruppe von LZ

oder um inflammatorische dendritische epidermale/dermale Zellen (IDEZ/IDDZ)

handeln [36], [57]. Letztere stellen eine Subpopulation von DDZ dar und wurden

bislang nur im Infiltrat der atopischen Dermatitis charakterisiert.

Abbildung 4.3.2.1. Identifizierung der DDZ anhand von CD1c-TRITC im KE. DDZ

finden sich in sowohl in der Epidermis als auch in der Dermis (links;

Originalvergrößerung: 400x). Die Basalmembran wird durch die Linie symbolisiert. Die

Vergrößerung der Zellen in der Dermis (rechts) zeigt dendritische Strukturen der Zellen

(Pfeil; Original Vergrößerung: 800x).


- 53 -

Abbildung 4.3.2.2. Die Grafik zeigt den Anteil der CD1a+/CD1c+ Zellen an der CD1c+

Gesamtpopulation im dermalen Infiltrat von allergischer und normaler Haut. Im ECT

beträgt die Anzahl der CD1a-tragenden DZ ca. 1/5 der CD1c+ Zellen. In der NH ist die

Population insgesamt kleiner, allerdings sind die CD1a+/CD1c+ Zellen anteilsmäßig

gleich verteilt.

4.3.3. Maturationsverhalten von LZ und DDZ im ECT v ersus NH

Um herauszufinden, wie sich der Reifegrad der DZ in der inflammierten Haut verhält,

führten wir in situ Doppelfärbungen der Gefrierschnitte mit einem Antikörper gegen

CD83 durch.

NH zeigte kaum reife CD1a+ LZ in der Epidermis (3,6%) und Dermis (4,3%). Ganz im

Gegensatz dazu war der Anteil der CD83+ LZ in ECT Reaktionen deutlich erhöht (28%

der epidermalen und 38% der dermalen Zellen). Erstaunlicherweise zeigte die CD1c+

DZ Population keinerlei Anzeichen von Maturationsverhalten im KE (Abbildung

4.3.3.1.).

ECT NH

Zellen/mm2 Dermis

0

20

40

60

80

100

120

140

CD1a+/CD1c+ Zellen CD1c+ Zellen


- 54 -

Abbildung 4.3.3.1. Anteil von CD83+ Zellen in den CD1a+ und CD1c+

Zellpopulationen der Haut. Der Maturations- bzw. Aktivierungsgrad der LZ und DDZ in

NH und ECT Reaktionen wurde mittels Immunfluoreszenz Doppelfärbungen

untersucht.

Diagramme links: Man findet im ECT im Gegensatz zur NH eine deutliche Zunahme

von CD1a+ Zellen in der Dermis (links unten). Während in der NH die CD1a+ Zellen

nur wenig CD83 exprimieren, ist die LZ Population in der Epidermis und Dermis der

ECT ungefähr zu einem Drittel aktiviert/reif (links oben und unten).

Diagramme rechts: Verglichen mit NH sind in der allergischen Reaktion sowohl in der

Epidermis als auch in der Dermis vermehrt CD1c+ DDZ zu finden. Im Gegensatz zu LZ

bleibt die Mehrheit dieser Zellen nach Haptenkontakt negativ für CD83 (rechts oben

und unten).

0

5

10

15

20

25

0

5

10

15

20

25

EPIDERMIS

DERMIS

NH NH ECT ECT

CD1c/CD83

CD1c

CD1a/CD83

CD1a Zellen/ mm

0

20

40

60

80

NH ECT

CD1a/CD83

CD1a

0

20

40

60

80

100

120

140

NH ECT

CD1c/CD83

CD1c Zellen/ mm 2


- 55 -

4.3.4. PDZ im Infiltrat der ECT Reaktionen

Interessanterweise konnten wir in den läsionalen Biopsien der ECT die erst vor einigen

Jahren identifizierte pDZ entdecken [63]. Zu unserer Überraschung war der Anteil

dieser Zellen an der gesamten infiltrierenden DZ Population im ECT relativ hoch

(Abbildung 4.3.1.2.).

Charakterisierung des Phänotyps der pDZ in situ

Im Menschen kann die pDZ anhand mehrerer verschiedener Oberflächenantigene

identifiziert werden. Zu diesen zählen: CD123, CD45RA, BDCA-2, CD68, CXCR3 und

CD62L [63], [64], [68], [116]. Um mehr über den Phänotyp dieser Zelle in NH und ECT

Läsionen zu erfahren, führten wir mittels Immunfluoreszenz Doppel- und

Dreifachfärbungen an Gefrierschnitten mit den aufgezählten Markern durch

(Abbildungen 4.3.4.1., 4.3.4.2.). In der NH konnten kaum pDZ detektiert werden. Die

Epidermis war überhaupt frei von pDZ, und in der Dermis waren einzelne Zellen mit

Reaktivität gegen CD123/CD45RA, CD123/BDCA-2 und CD123/CD68 zu finden

(Abbildung 4.3.4.3.). Läsionale Haut hingegen enthielt pDZ sowohl im epidermalen als

auch im dermalen Anteil der Haut. Während CD123+ Zellen eine vergleichbare

Koexpression von CD45RA (Mittelwert: 3,5 Zellen/mm Epidermis und 39,8/mm2

Dermis), BDCA-2 (1,6 Zellen/mm Epidermis und 32,8/mm2 Dermis) und CD68 (2,3

Zellen/mm Epidermis und 24/mm2 Dermis) aufwiesen, konnte CD62L (L-Selectin)

lediglich auf einem Drittel der pDZ nachgewiesen werden (0,4 Zellen/mm Epidermis

und 8,5/mm2 Dermis) (Abbildung 4.3.4.3.). Da wir eine lokale Entstehung der pDZ

anhand von Doppelfärbungen mit dem Proliferationsmarker Ki-67 ausschließen

konnten, wäre es denkbar, dass unsere Ergebnisse aus einer Einwanderung dieser

Zellen von dem Blut in die Haut resultieren. Diese Einwanderung könnte mit dem

Verlust von CD62L einhergehen.


- 56 -

Abbildung 4.3.4.1. In situ Doppelfärbungen von pDZ im dermalen Infiltrat

von ECT Biopsien, die 72 Std nach Haptenkontakt entnommen wurden.

Charakterisierung anhand von CD123-TRITC/ BDCA-2-FITC (oben,

Vergrößerung: 800x), CD68-TRITC/ CD123-FITC (Mitte, Vergrößerung:

400x) und CD45RA-TRITC/ CD123-FITC (unten, Vergrößerung: 400x). Die

Bilder auf der rechten Seite zeigen die Überlappung der auf der Zelle

vorhandenen Antigene jeweils in gelb.


- 57 -

Abbildung 4.3.4.2. Dreifachfärbungen von pDZ im dermalen Infiltrat von ECT, die

mittels konfokaler Lasermikroskopie ausgewertet wurden. Charakterisierung anhand

von CD45RA-TRITC/CD123-Cy5/ BDCA-2-FITC (oben, Vergrößerung: 800x) und

CD45RA-TRITC/ CD123-Cy5/CD4-FITC (unten, Vergrößerung: 400x). Die Bilder auf der

rechten Seite zeigen dreifach gefärbte Zellen jeweils in weiß (Pfeile).


- 58 -

Abbildung 4.3.4.3. Phänotypische Charakterisierung der pDZ in Epidermis (A) und

Dermis (B) von NH und ECT nach 72 Std. Während Doppelfärbungen mit anti-

CD45RA/anti-CD123, anti-BDCA-2/anti-CD123, anti-CD68/anti-CD123 und anti-

CD62L/anti-CD123 nur wenige pDZ in der Dermis von NH zeigen, sind die Zellen in der

Epidermis und Dermis von ECT Reaktionen deutlich vorhanden. Interessant ist die

geringe Expression von CD62L auf pDZ in situ. Statistische Signifikanz wurde durch

den Students T-Test bestimmt (٭p<0,001).

A

CD45RA+/CD123+ BDCA-2+/CD123+ CD68+/CD123+ CD62L+/CD123+

0

1

2

3

4

5

6

∗

∗ NH

ECT 72Std

∗

∗

B

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90∗

NH

ECT 72Std

∗

∗

∗

CD45RA+/CD123+ BDCA-2+/CD123+ CD68+/CD123+ CD62L+/CD123+

Zellen/ mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis


- 59 -

Vergleich des Phänotyps in läsionaler Haut und Blut

Um die in der läsionalen Haut vorhandenen pDZ noch besser charakterisieren zu

können, führten wir an Einzelzellsuspensionen, die aus Biopsien der ECT-Reaktionen

angefertigt wurden, durchflußzytometrische Analysen durch und verglichen diese

Ergebnisse mit dem peripheren Blut des jeweiligen Patienten (Abbildung 4.3.4.4.).

Sowohl in der Haut als auch im Blut wiesen ungefähr 90% der definierten

CD123+/CD45RA+ Zellpopulation ebenso CD4 und MHCII an der Oberfläche auf. Bei

der Analyse der CD123+/MHCII+ Zellen zeigte sich, dass diese pDZ aus Haut und Blut

ein homogenes Expressionsmuster von BDCA-2 besitzen. PDZ aus dem Blut zeigten

keine Zeichen der Maturation, da keine Reaktivität gegen CD83 oder CD86 zu finden

war. Ganz im Gegensatz dazu sind ca. 50% der pDZ aus der Haut aktiviert/gereift, wie

die Expression von CD83 und CD86 vermuten lässt (Abbildung 4.3.4.4.).

Migrationsmoleküle auf pDZ

Weiterhin suchten wir nach Mechanismen, welche die Adhäsion der pDZ an

Endothelzellen und die Einwanderung aus dem peripheren Blut möglich machen

könnten.

Tatsächlich zeigten 80% der PDZ aus der Haut und 95% der PDZ aus dem Blut eine

verstärkte CLA Expression (cutaneous lymphocyte-associated antigen). Die Adhäsion

der CLA+ pDZ könnte über die Bindung an E-Selectin vollzogen werden, da bekannt

ist, dass dieser Ligand auf Venen in entzündlichen Hauterkrankungen wie dem KE

deutlich vermehrt vorkommt [117], [118].

Die im Blut zirkulierenden pDZ gelangen über die Bindung von CD62L an PNAd

(peripheral lymph node addressin) auf Endothelzellen von HEV (high endothelial

venules) in den LK [63].

Tatsächlich zeigte sich in unserem Experiment, dass beinahe 100% der pDZ aus dem

Blut das Oberflächenantigen CD62L trugen. Demgegenüber war das Molekül nur auf

etwa 50-70% der pDZ aus der Haut vorhanden (Abbildung 4.3.4.4.). Diese Abnahme

von CD62L in der Haut ist mit unseren in situ Daten gut vereinbar (Abbildung 4.3.4.3).

Um herauszufinden, ob pDZ tatsächlich die Möglichkeit haben, die ECT Läsionen über

CD62L zu betreten, untersuchten wir, ob PNAd auf dem Gefäßendothel in der Haut

vorhanden ist. Wir konnten zeigen, dass ein kleiner Anteil Endothelzellen in den nach

72 Std entnommenen ECT-Biopsien auf die immunhistochemische Färbung mit MECA-

79 positiv reagierte (Abbildung 4.3.4.5.).


- 60 -

Ein weiteres Signal zur Einwanderung in die Haut kann durch Chemokine vermittelt

werden, die von verschiedenen entzündlichen, infiltrierenden Zellen produziert werden

können [119]. Auf einer Untergruppe der pDZ konnten wir den Chemokinrezeptor

CXCR3 nachweisen, der die Zellen für eine Anlockung über Botenstoffe wie CXCL9

(MIG), CXCL10 (IP-10) oder CXCL11 (ITAC) empfänglich macht (Abbildung 4.3.4.6.).

Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass eine beträchtliche Anzahl

CD62L+/CLA+ pDZ in ECT Läsionen einwandern und dort auch teilweise maturieren.


- 61 -


- 62 -

Abbildung 4.3.4.4. FACS Analyse von Einzelzellsuspensionen aus Blut und Haut. A)

PDZ aus Haut und Blut exprimieren CD123/CD45RA/CD4/MHCII auf ihrer Oberfläche.

CD123+/CD45RA- sowie CD123+/CD45RA+ Populationen wurden ausgewählt und auf

ihre Expression von CD4 und MHCII hin begutachtet. Sowohl in der Haut als auch im

Blut zeigte die CD45RA+ Population, ganz im Gegensatz zur CD45RA- Gruppe,

deutlich MHCII und CD4 auf der Oberfläche.

B) Vergleich der Adhäsionsmoleküle und Maturationsmarker auf CD123+/MHCII+

Zellen in der Haut und im Blut. Während CLA auf pDZ aus beiden Milieus eine ähnliche

Reaktivität aufweist, haben pDZ aus der Haut zu etwa 30% den Ligand für E-Selektin,

nämlich CD62L, auf ihrer Oberfläche verloren. Im Vergleich zum Blut findet sich in der

Haut eine eindeutige Oberflächenexpression der Maturations-/Aktivierungsmoleküle

CD83 und CD86 auf pDZ. Die Abbildung repräsentiert eines von 5 ähnlichen

Experimenten.


- 63 -

Abbildung 4.3.4.5. Immunhistochemische Färbungen von humanen ECT Reaktionen

(A und B) sowie von NH (C) mit anti-PNAd (MECA-79).

A) Übersichtsaufnahme; Vergrößerung 100x. Im Infiltrat zeigen sich rot gefärbte,

MECA-79+ Zellen. B) Vergrößerter Ausschnitt von A) (200x).

C) In der NH zeigt das Gefäßendothel keine Reaktivität mit dem Liganden für CD62L,

anti-PNAd (Vergrößerung 100x).


- 64 -

Abbildung 4.3.4.6. Dreifachfärbungen von pDZ im dermalen Infiltrat von ECT

wurden mittels Immunfluoreszenz und konfokaler Lasermikroskopie ausgewertet.

Die Bilder zeigen dreifach positiv gefärbte Zellen jeweils in weiß (kleine Pfeile).

Doppelt gefärbte Zellen mit anti-CD123-Cy5 und anti-MHCII-FITC erscheinen

türkis und stellen Endothelzellen der Gefäße dar (große Pfeile). Links: Die

CD45RA+ (TRITC)/CD123+ (Cy5)/ MHCII+ (FITC) Zellen sind in der Nähe von

CD123+ Gefäßen (großer Pfeil), die man auch anhand der Morphologie

identifizieren kann (Vergrößerung: 400x). Rechts: CD123+ (Cy5)/MHCII+ (FITC)

pDZ tragen CXCR3 (TRITC) (Vergrößerung: 400x). Der große Pfeil deutet auch

hier auf das Lumen eines Gefäßes.


- 65 -

4.3.5. NK-Zellen und pDZ im ECT Infiltrat

Kinetik

Um zu untersuchen, wie schnell pDZ das KE infiltrieren und wieder verschwinden,

entnahmen wir Biopsien von ECT Reaktionen zu vier unterschiedlichen Zeitpunkten.

Die Auswertung der CD123+/CD45RA+ Zellen nach 24 Std Haptenkontakt zeigte eine

deutliche Zunahme der Zellzahl (0,7/mm Epidermis und 17,4/mm2 Dermis), die nach 48

Std gipfelte (1,2/mm Epidermis und 28,2/mm2 Dermis) und danach wieder abnahm

(Abbildung 4.3.5.1.). Auch Analysen von einem frühen Zeitpunkt (nach 6 Std) ergaben,

verglichen mit NH, bereits einen deutlichen Anstieg von pDZ im Infiltrat.

Die Tatsache, dass pDZ als Zellen des angeborenen Immunsystems bereits früh in der

Effektorphase ins KE rekrutiert werden, sowie Berichte über eine Beteiligung von

Proteinen des angeborenen Immunsystems an der Pathogenese der

Hypersensitivitätsreaktion [120, 121], verleitete uns dazu, nach Zellen dieser Immunität

zu suchen.

Wir identifizierten NK-Zellen anhand von CD56 oder CD94 im Infiltrat der seit 72 Std

bestehenden kontaktallergischen Reaktionen (Tabelle 4.1.). Weiters interessierte uns

der zeitliche Ablauf der Einwanderung dieser Zellen und die zuvor beschriebenen

Biopsien wurden auf CD56+ NK-Zellen untersucht.

Es fand sich eine Migrationskinetik ähnlich der von pDZ mit einer Zunahme der NK-

Zellen bereits nach 24 Std (13,7/mm2 Dermis), einem Gipfel nach 48 Std (21,8/mm2)

und einer Abnahme der Zellzahl nach 72 Std (Abbildung 4.3.5.1.).

Nachbarschaft

PDZ können bei entsprechender Stimulation große Mengen an IFN-α ausschütten,

welches wiederum ein potentieller Aktivator von NK-Zellen ist. Um herauszufinden, ob

dieses Szenarium im KE eintreten könnte, untersuchten wir, ob eine räumliche Nähe

von pDZ und NK- Zellen detektierbar ist.

Bei der Analyse des Infiltrats zeigte sich tatsächlich häufig eine Nachbarschaft dieser

Zellen (Abbildung 4.3.5.2.).

Da CD56 als Oberflächenmolekül ebenfalls auf NK-T-Zellen vorkommt, prüften wir als

nächstes, wie hoch der Anteil von CD56+/CD3+ NK-T-Zellen in den Läsionen ist.

Zu unserer Überraschung exprimierten keine der CD56+ Zellen den T-Zellrezeptor

(Abbildung 4.3.5.3.). Hingegen fanden wir einige CD94+/CD3+ NK-T-Zellen, ein Viertel


- 66 -

der gesamten CD94+ NK-Zellpopulation (Tabelle 4.1.). Diese Entdeckung könnte das

Ungleichgewicht in der Anzahl der CD94+ und CD56+ NK-Zellen erklären (Tabelle

4.1.).

Abbildung 4.3.5.1. Biopsien, entnommen zu vier verschiedenen Zeitpunkten (0,

24, 48 und 72 Std) nach Haptenkontakt, wurden mittels immunhistochemischer

Analysen ausgewertet. Die Diagramme zeigen bereits nach 24 Std einen

gleichzeitigen Anstieg der CD123+/CD45RA+ pDZ (A) und CD56+ NK-Zellen (B).

Die Abbildung zeigt eine repräsentative Kinetik von drei ähnlichen Experimenten.

A

B

0

5

10

15

20

25

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis

NS EPT 24h EPT 48h EPT 72h

CD56+ Zellen

0

5

10

15

20

25

30

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis

NS EPT 24h EPT 48h EPT 72h

CD123+/ CD45RA+ Zellen


- 67 -

Abbildung 4.3.5.2. PDZ wurden anhand von Doppelfärbungen mit anti-CD123

Cy5 und anti-MHCII FITC im dermalen Infiltrat von ECT visualisiert und mittels

Immunfluoreszenz und konfokaler Lasermikroskopie ausgewertet. Doppelt

gefärbte Zellen erscheinen in weißlichem Blau (Pfeil). Anti-CD56 TRITC wurde zur

Färbung von NK-Zellen verwendet, die als rote Zellen in den Bildern imponieren.

Links: Das dermale Infiltrat zeigt Nachbarschaft von CD56+ NK-Zellen und

CD123+(Cy5)/ MHCII+(FITC) pDZ (Vergrößerung: 400x). Rechts: Vergrößerung

des linken Bildes (800x).


- 68 -

A

Abbildung 4.3.5.3. Doppelfärbungen mit anti-CD56 (TRITC) (links) und anti-CD3

(FITC) (Mitte) im dermalen Infiltrat von ECT Reaktionen zeigen keine

Überlappung der Oberflächenantigene auf den Zellen (Bilder rechts). Analysen

wurden mittels konfokaler Lasermikroskopie durchgeführt.


- 69 -

4.4. Vergleich des Zellinfiltrats in ECT Reaktionen induziert durch Nickel und

Duftstoff

4.4.1. T-Zell-Infiltrat

Bisher ist unbekannt, ob unterschiedliche Haptene eine Auswirkung auf die

Zusammensetzung des Zellinfiltrats in ECT Reaktionen, die nach 72 Std entnommen

wurden, haben.

Um herauszufinden, ob die Quantität und Qualität von T-Zellen in Läsionen, die durch

Ni oder Duftstoff hervorgerufen wurden, Unterschiede aufzeigt, analysierten wir jeweils

fünf Biopsien von den entsprechenden Kontaktallergikern mittels IF (Abbildung

4.4.1.1).

Es zeigte sich, dass die Anzahl der CD3+ T-Zellen in beiden Reaktionen vergleichbar

ist (Abbildung 4.4.1.1). Nickelallergiker wiesen eine leicht höhere absolute Zellzahl auf,

bedingt durch die etwas stärkeren ECT Reaktionen (siehe auch Material und

Methoden, Tabelle 3.1.1.).

Auch die einzelnen T-Zellpopulationen zeigten keine Unterschiede im Verhältnis

zueinander. Dominierend waren CD4+ T-Zellen, gefolgt von CD8+ T-Zellen. Hingegen

bildeten CD25+/CD4+ T-Zellen, CD94+/CD3+ NK-T-Zellen und γδ-Rezeptor tragende

T-Zellen nur einen kleinen Anteil des gesamten CD3+ Zellinfiltrats.

Statistische Signifikanz zwischen den Ni- und Duftstoff-induzierten Reaktionen bestand

nicht.

4.4.2. DZ-Populationen

Eine weitere zu identifizierende große Zellbevölkerungsgruppe ist die der DZ.

Unterschiede im Verhältnis der LZ, DDZ oder pDZ untereinander könnten Aufschluss

über eine unterschiedliche Art der Antigenpräsentation der Haptene geben.

Wie schon zuvor beschrieben, charakterisierten wir DDZ mittels anti-CD1c, LZ mit anti-

Langerin, pDZ mit anti-BDCA-2/anti-CD123 und IDEZ/IDDZ mit anti-CD1c/anti-CD1a in

ECT Reaktionen von Ni- und Duftstoffallergikern sowie in NH (Abbildung 4.4.2.1.).

Die Anzahl der Langerin+ LZ in der Epidermis der NH war höher als in der Epidermis

von ECT Reaktionen. PDZ und IDEZ/IDDZ waren in der NH praktisch nicht vorhanden.

Unterschiede hinsichtlich Verteilung und Anzahl von DZ in den ECT Reaktionen auf die

beiden Haptene waren nicht zu finden.


- 70 -

4.4.3. Identifizierung weiterer Leukozyten

Um einen vollständigen Überblick über die infiltrierenden Zellpopulationen zu erhalten,

charakterisierten wir auch Granulozyten (CD15), Makrophagen (CD14), NK-Zellen

(CD94) und Mastzellen (CD117) in den Läsionen und in der NH (Abbildung 4.4.3.1.).

Auch diese Zellarten betreffend kam es zu keinerlei signifikanten Unterschieden in der

Verteilung der Populationen im Ni- oder Duftstoff-induzierten KE. Lediglich die Anzahl

der CD94+ NK-Zellen war im Ni-ECT gegenüber dem Duftstoff-ECT erhöht, was aber

wiederum am wahrscheinlichsten auf die allgemein stärkere Reaktion auf Ni

zurückzuführen ist (Abbildung 4.4.3.1.).

Interessant war, dass Mastzellen zumindest nicht durch ihre Quantität an der

Pathologie des KE beteiligt zu sein scheinen, da die Anzahl der CD117+ Mastzellen in

der NH und im ECT vergleichbar hoch ist.

Weiterhin konnten wir zeigen, dass etwa die Hälfte aller CD14+ Makrophagen in den

Läsionen auch eine Oberflächenexpression von CD1c aufweist. Dies könnte ein

Hinweis auf den positiven Aktivierungsstatus der Zellen sein, oder es handelt sich um

die in humaner Haut beschriebenen Vorläuferzellen, die je nach Stimulationsmodus in

LZ oder DDZ transformiert werden können (TGF-β1: LZ; IL-4+GM-CSF: DDZ) [37],

[122] (Abbildung 4.4.3.1.).

4.4.4. Reaktion eines Nicht-Allergikers auf 24Std N ickelprovokation

Wir untersuchten weiterhin, ob bei einem Nicht-Allergiker nach Applikation von Ni

zumindest eine frühzeitige Immunreaktion ausgelöst wird, die sich in Form von

Einwanderung der Zellen des angeborenen Immunsystems wie NK-Zellen oder pDZ

zeigen würde. Die zelluläre Analyse ergab ein Infiltrat, welches mit dem Infiltrat in der

NH vergleichbar ist.


- 71 -

Abbildung 4.4.1.1. Umfassende Analyse der T-Zellpopulationen in Epidermis (A) und

Dermis (B) von 72 Std ECT Reaktionen, ausgelöst durch Ni oder Duftstoff, und NH. Die

Biopsien wurden anhand von Einfach- oder Doppelfärbungen in der IF ausgewertet.

Signifikante Unterschiede zwischen den beiden (durch unterschiedliches) Hapten-

induzierten Läsionen konnten nicht detektiert werden.


- 72 -

Abbildung 4.4.2.1. Charakterisierung der DZ-Populationen in Epidermis (A) und

Dermis (B) von 72 Std ECT Reaktionen, ausgelöst durch Ni oder Duftstoff, und NH.

Wie schon erwähnt, wurden die Biopsien anhand von Einfach- oder Doppelfärbungen

in der IF ausgewertet. Signifikante Unterschiede zwischen den beiden Hapten-

induzierten Läsionen konnten nicht detektiert werden.


- 73 -

Abbildung 4.4.3.1. Identifizierung weiterer Zellpopulationen in Epidermis (A) und

Dermis (B) von 72 Std ECT Reaktionen, ausgelöst durch Ni oder Duftstoff, und NH.

Auch hier wurden die Biopsien anhand von Einfach- oder Doppelfärbungen in der IF

ausgewertet. Signifikante Unterschiede zwischen den beiden Hapten-induzierten

Läsionen konnten nicht detektiert werden.

Diskussion Ch. Bangert

- 74 -

5. DISKUSSION

Viele Studien, die sich bisher mit dem humanen KE beschäftigt haben, konzentrierten

sich auf die Sensibilisierungsphase. Während einige Kenntnis über die dieser Reaktion

zugrunde liegenden zellulären und molekularen Ereignisse existiert, ist das Wissen

über Mechanismen der Effektorphase des KE begrenzt [74], [81]. Um mehr über

infiltrierende Zellpopulationen, insbesondere über APZ, die während dieses Prozesses

die T-Zell Antwort beeinflussen, zu erfahren, haben wir in der vorliegenden Studie das

leukozytäre Infiltrat von ECT phänotypisch analysiert. Hierbei richteten wir unser

Augenmerk besonders auf dendritische und T-Zellen. In diesem Zusammenhang

beschreiben wir das Vorkommen von pDZ in ECT Läsionen und vergleichen deren

Anzahl und Aktivierungszustand mit LZ und DDZ.

LZ und DDZ (Abb 5.1.)

Während der LZ in der Sensibilisierungsphase der Kontaktallergie eine maßgebliche

Rolle zugeschrieben wird [52], ist ihre Funktion in der Effektorphase, falls sie eine

solche innehaben, noch immer umstritten [49], [50]. Basierend auf der Expression von

Langerin und CD1a verglichen wir die Anzahl von LZ, die in NH und ECT Läsionen zu

finden sind. Auffallend war eine deutliche Verminderung der LZ in der Epidermis,

während es in der Dermis zu einem Anstieg der Zellzahl kam. Diese Daten sind

übereinstimmend mit Berichten in der Literatur. Die LZ sind in der Epidermis über

Adhäsionsmoleküle mit Keratinozyten verbunden. Bei entzündlichen Prozessen bzw.

auch nach Haptenapplikation schütten Keratinozyten u.a. die Zytokine IL-1β und TNF-α

aus, die LZ zur Hinabregulierung ihrer Adhäsionsmoleküle und in Folge zur Migration

aus der Epidermis veranlassen können [49], [123], [124].

Die Mehrheit der LZ zeigte CD83 an ihrer Oberfläche, ein Molekül, das während des

Maturationsprozesses von LZ bzw. DDZ zu finden ist. Dieser Maturationsvorgang

könnte auf die Haptenprovokation zurückzuführen sein, da einige in vitro Experimente

gezeigt haben, dass mit Haptenmolekülen inkubierte DZ/LZ in einen aktivierten

Zustand versetzt wurden [96], [97].

Es sollte betont werden, dass die Anzahl der CD1a+ Zellen jene der Langerin+ LZ in

der Dermis der ECT Läsionen deutlich überstieg. Die Frage, welcher Population diese

CD1a+Langerin- Zellen angehören, lässt sich mit drei möglichen Theorien

beantworten.


- 75 -

Sie könnten

1. LZ Vorläufer Zellen aus dem peripheren Blut

2. CD1a+/CD1c+ IDEZ/IDDZ

3. mature LZ nach Haptenprovokation auf dem Weg aus der Epidermis in den LK

darstellen [57].

Da wir nachweisen konnten, dass ca. 1/5 der CD1c+ Zellen auch CD1a in der Dermis

der ECT Läsionen exprimieren, könnte es sich tatsächlich um IDDZ handeln.

Antigen kann ebenso von DDZ aufgenommen und präsentiert werden. Bei DDZ

handelt es sich um eine Subpopulation von myeloiden DZ, die CD1c an ihrer

Oberfläche haben [36], [125]. Wir fanden ein dichtes CD1c+ Infiltrat in der Dermis von

ECT Reaktionen, die in ihrer Mehrheit kein CD83 an der Oberfläche exprimierten, d.h.

in einem immaturen, nicht-aktivierten Zustand waren. Basierend auf diesen

Entdeckungen stellten wir die Hypothese auf, dass LZ nach Antigenkontakt maturieren

und im Anschluss den Hapten-spezifischen Effektor T-Zellen das Allergen

präsentieren. Dadurch wird die Immunantwort der Effektorphase gestartet. Die unreifen

DDZ hingegen könnten eher eine regulierende Rolle spielen, in der sie reg T-Zellen

aktivieren, welche dann wiederum etwas später für die Beendigung der Immunantwort

verantwortlich sind [126].

Die Daten von Kissenpfennig et al widersprechen dieser These. Mittels eines

Mausmodells, in dem LZ durch an Langerin gebundenes Diphterietoxin vor

Sensibilisierung mit Dinitrofluorbenzol (DNFB) eliminiert wurden, konnte die Gruppe

zeigen, dass die Hypersensitivitätsreaktion nach erneutem DNFB Kontakt trotz Fehlen

der LZ in keinster Weise abgeschwächt wird [55]. Depletiert man bei Diphterietoxin

unbehandelten Mäusen 6 Wochen nach der Sensibilisierung mit DNFB und 3 Tage vor

erneutem DNFB Kontakt die LZ, kann die Immunantwort trotzdem ohne

Beeinträchtigung stattfinden. Dieses letzte Experiment zeigt, dass nach Ausbildung der

Hapten-spezifischen Gedächtnis T-Zellen keine LZ zur Auslösung der Effektorphase

notwendig sind [55].

Ob allerdings diese in der Maus generierten Daten direkt auf das humane KE

übertragbar sind, bleibt (wie immer) fraglich. Auch ist nach wie vor denkbar, dass

mature epidermale oder dermale LZ im Menschen zur Amplifizierung der

Immunantwort beitragen; d.h. sie verstärken lediglich durch Haptenpräsentation die

Effektorphase. Sollten sie nicht vorhanden sein, könnte das KE zwar milder, aber

dennoch stattfinden. Der (Gegen)Beweis bleibt aus, da hier im humanen System das

Vergleichsmodell fehlt.


- 76 -

PDZ (Abb. 5.1.)

Die wichtigste Neuigkeit unserer Arbeit war die Entdeckung der pDZ im KE. Wir

konnten die Zelle zunächst anhand der Oberflächenantigene CD123 und CD45RA

identifizieren und stellten fest, dass eine beträchtliche Anzahl dieser Zellen in der

Dermis der ECT zu finden war. Die zusätzlich positive Reaktion auf CD68, MHCII und

BDCA-2 charakterisierte die Zellen schließlich eindeutig als pDZ.

Da die pDZ negativ für den Proliferationsmarker Ki-67 waren, schlossen wir lokales

Wachstum aus und stellten die These auf, dass pDZ nach Haptenkontakt in das

betroffene Areal rekrutiert werden. Die Tatsache, dass diese besonderen DZ nicht in

der normalen Haut zu finden sind, unterstützt unsere Theorie. Tatsächlich waren die

pDZ bereits sehr früh nach Beginn der Effektorphase, nämlich nach 6 Std, in ECT

Läsionen zu finden.

Abbildung 5.1. An der Effektorphase des KE beteilig te DZ Populationen

Um die Mechanismen herauszufinden, die an der Endotheladhäsion der pDZ beteiligt

sind, und um mehr über deren Migration aus dem Blut in die Haut zu lernen,

untersuchten wir die Oberflächenexpression von CLA, CD62L und dem

Chemokinrezeptor CXCR3.

Bemerkenswerterweise zeigten pDZ ein äußerst ähnliches Profil hinsichtlich des

Moleküls CLA, das für die Einwanderung in die Haut zuständig ist. PDZ aus dem Blut

waren zu 95% positiv für CLA, pDZ aus der Haut zu 80%. D.h. die aus dem Blut

-CD123 -BDCA-2 -CD45RA -MHCII -CD68

-CD1c -CD11b -CD11c -MHCII -XIIIa

-CD1a -Langerin -Birbeck granules

immature pDZ

mature pDZ

DDZ

LZ

IDDZ

IDEZ

Dermis

Epidermis

-CD1a -CD1c -CD1b -FcεεεεRI -MHCII


- 77 -

entnommenen pDZ haben unter inflammatorischen Bedingungen die Möglichkeit, die

Haut zu betreten, indem sie an E-Selektin auf den Endothelzellen der Blutgefäße

binden und schließlich den Zielort in der Haut über Interaktion mit Chemokinen

erreichen. Zusätzlich tragen die peripher isolierten pDZ von Nickelallergikern zu 100%

CD62L, ein Selektin, das an HEV bindet und somit den Eintritt in den LK erleichtert.

Interessanterweise haben pDZ in der Haut eine deutlich reduzierte

Oberflächenexpression von CD62L.

Dieses Phänomen wurde bereits im LK beobachtet, wo pDZ nach dem Eintritt in den

LK via HEV kein CD62L mehr aufweisen [63].

Eine weitere Beobachtung zeigt, dass ein Teil der infiltrierenden pDZ im ECT den

Chemokinrezeptor CXCR3 trägt. Die Liganden dieses Rezeptors, die Chemokine

CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP-10) und CXCL11 (ITAC) werden u.a. von Keratinozyten

gebildet und sind in entzündlicher Haut verstärkt zu finden. Die Bindung von CXCR3 an

die entsprechenden Liganden könnte ein weiterer Mechanismus der DZ sein, um in die

Haut zu gelangen.

Tatsächlich wurde bereits in einer anderen Studie gezeigt, dass pDZ die Fähigkeit

haben über die Bindung an CXCR3/CXCR4 zu emigrieren [127].

Wie kommen pDZ also in die Haut? Unsere Daten zeigen, dass pDZ prinzipiell

mehrere Möglichkeiten haben, in die Läsionen einzudringen. Adhäsion an

Endothelzellen via Interaktionen von CLA/E-Selektin und CD62L/PNAd, wie zuvor

beschrieben wurde [117], [128] ist denkbar. Unser Nachweis von PNAd und E-Selektin

in inflammierter Haut unterstützt diese Theorie.

In früheren Studien wurde bereits gezeigt, dass pDZ, ähnlich wie LZ und DDZ,

durchaus fähig sind, potente T-Zellantworten zu provozieren [129], [130]. Da es

Beweise gibt, dass die Maturations-/Aktivierungszustand der DZ wichtig für die

entstehende Art der T-Zellantwort ist [131], untersuchten wir auch das Maturationsprofil

der aus Haut und Blut isolierten pDZ.

Anhand durchflußzytometrischer Analysen zeigte sich, dass 50% der Haut-

infiltrierenden pDZ die Maturations- bzw. Aktivierungsantigene CD83 und CD86 an

ihrer Oberfläche tragen. Die entsprechenden Zellen aus dem Blut hingegen wiesen

keinerlei Anzeichen von Maturation oder Aktivierung auf. Dies bedeutet, dass pDZ,

nachdem sie das Blut verlassen haben, zumindest zum Teil Maturationssignalen

ausgesetzt sind und sich dadurch die Fähigkeit erwerben, T-Zellen zu stimulieren. Ob

diese Stimuli allerdings bereits auf dem Weg in die Haut oder erst in der Läsion gesetzt

werden, ist derzeit nicht beurteilbar. Da die Zellen bereits nach 6 Std in der Haut zu


- 78 -

finden sind, unsere Analyse der Einzelzellsuspensionen aber auf der Untersuchung

einer 72 Std ECT Läsion beruht, könnten die 50% der aktivierten pDZ diesen Zustand

durchaus in der Haut erworben haben.

Humane in vitro Studien wiesen nach, dass pDZ je nach Art der Stimulation eine T1

oder T2 Antwort auslösen können. Wenn pDZ mit viralen Produkten stimuliert werden,

tendieren T-Zellen eher zu einer T1 Antwort, um den Eindringling möglichst effektiv

bekämpfen zu können. Im Falle einer IL-3/CD40L (Ligand) Aktivierung, wird eher eine

T2 Antwort ausgebildet [132], [133].

Es ist vorstellbar, dass pDZ im KE mit IL-3, welches von Mastzellen produziert wird,

und mit CD40L in Berührung kommen, welches auf T-Zellen vorhanden ist. Eine

weitere wichtige Studie zeigte, dass in der Maus pDZ, die mit CD40L stimuliert werden,

eine regulatorische CD8+ T-Zellantwort auslösen können [134].

Welche Rolle die pDZ in den ECT Läsionen einnehmen, sei es im immaturen oder

auch maturen Zustand, muss zum jetzigen Zeitpunkt offen bleiben.

T-Zellen

Die von uns analysierten CD3+ Zellen exprimieren vorwiegend den αβ TZR, was auch

zuvor in anderen bereits Studien gezeigt wurde [76], [135]. Tatsächlich zeigen nur

wenige der infiltrierenden T-Zellen den γδ TZR.

Wir fanden ein massives T-Zellinfiltrat in den ECT-Läsionen, welches eindeutig von

CD4+ T-Zellen dominiert wurde. Die CD4+:CD8+ T-Zellratio betrug etwa 2:1. Aufgrund

dieser zahlenmäßigen Überlegenheit der CD4 T-Zellen ließe sich leicht schlussfolgern,

dass die CD4 T-Zellen zu den Effektorzellen und KE-auslösenden Zellen zählen. Bis

vor etwa 10 Jahren war dies das vorherrschende Erklärungsmodell für Beteiligung der

T-Zellen in der Überempfindlichkeitsreaktion. Allerdings konnte mittlerweile in einigen

Studien gezeigt werden, dass vermutlich trotz der geringeren Quantität die CD8+ T-

Zellen im KE die Effektoren darstellen, während CD4+ Zellen die Immunreaktion

regulieren könnten [78], [77], [84].

Interessanterweise entdeckten wir tatsächlich eine CD4+ T-Zellpopulation, die

regulatorische T-Zellmarker, nämlich CD25 und CTLA-4, in der läsionalen Haut

aufwies. Diese Population konnten wir in der normalen Haut nicht finden. Nähere

Analysen zeigten, dass auch FOXP3+ Zellen im ECT vorhanden sind, ein weiterer

wichtiger Hinweis auf das Vorliegen einer reg T-Zellpopulation.

Diese Zellen konnten wir relativ spät im Entzündungsverlauf in der Haut detektieren: 24


- 79 -

Std nach Haptenprovokation zeigten sich vorwiegend CD4+/CD25- T-Zellen, nach 48

Std jedoch waren CD4+/CD25+ Zellen vorhanden. Dies könnte entweder bedeuten,

dass diese Zellen tatsächlich später aus dem Blut in die Haut rekrutiert werden oder

dass sie sich aus der CD4+/CD25- Population, die schon früh in den Läsionen

nachweisbar ist, umwandeln. Eine in situ Proliferation der CD4+ T-Zellen findet nicht

statt, wie wir anhand von Ki-67 Färbungen nachweisen konnten.

Es ist nicht eindeutig zu sagen, ob diese CD4+/CD25+ T-Zellen Effektorzellen oder

eher die bereits beschriebenen Allergen-spezifischen reg T-Zellen darstellen [78]. Eine

weitere Möglichkeit wäre, dass diese Zellen unspezifische (nicht-Hapten spezifische)

Suppressor T-Zellen sind, wie bereits zuvor in anderen Erkrankungen beschrieben

wurde [85], [136].

Damit könnten diese CD4+/CD25+ T-Zellen die Fähigkeit haben, die allergen-

spezifische Entzündung zu beenden.

Zellen des angeborenen Immunsystems in ECT Läsionen

Neben den Zellen des erworbenen Immunsystems spielen die Zellen der angeborenen

Immunität eine quantitative Rolle im KE. Wir charakterisierten eine unterschiedlich

große Anzahl von eosinophilen und neutrophilen Granulozyten, NK-Zellen, Mastzellen

und Makrophagen in der Dermis der ECT Läsionen (72 Std nach Haptenprovokation).

Die Anzahl der Zellen war durchaus vergleichbar mit der Zahl der infiltrierenden pDZ

oder LZ. Die Funktion dieser Zellen muss komplett offen bleiben: spekulativ könnte es

eine für die Pathogenese des KE ‚unwichtige’ reflektorische Alarmreaktion des

Organismus sein, der lediglich auf die proinflammatorischen Zytokine reagiert, die von

den Keratinozyten als sofortige Reaktion auf die Haptenprovokation ausgeschüttet

werden. Als Folge könnten die von uns beobachteten Zellen der angeborenen

Immunabwehr in die Haut gelockt werden [102], [137]. Interessant wäre in diesem

Zusammenhang die zelluläre Analyse eines chronischen KE, da es sich hier um einen

langandauernden Prozess handelt und nicht, wie beim ECT, um eine akute Reaktion

des Immunsystems.

NK-Zellen

Aufgrund des deutlichen Vorkommens von NK-Zellen in den Läsionen, untersuchten

wir das Einwanderungsverhalten dieser bei Bedarf wichtigen Effektorzellen in den ECT.

Es zeigte sich, dass NK-Zellen, ähnlich wie pDZ, sehr früh in den Läsionen zu finden

sind (nach 6 Std). Außerdem auffällig war die Tatsache, dass sich pDZ und NK-


- 80 -

Zellen innerhalb des entzündlichen Infiltrats in direkter Nachbarschaft befinden. Diese

Situation lässt auf eine Kommunikation zwischen diesen beiden Zellarten in der

Effektorphase des KE tippen. Tatsächlich wurde bereits in der atopischen Dermatitis

ein sogenannter ‚Crosstalk’ zwischen NK-Zellen und DZ nachgewiesen [138].

Durch ihre bekanntermaßen große Produktion von IFN-α können pDZ nicht nur einen

autokrinen Bogen erzeugen, der ihr eigenes Überleben verlängert [133], sondern auch

zur Aktivierung und Stimulation von NK-Zellen beitragen [139].

Vergleich des Infiltrats nach unterschiedlicher Hap tenapplikation

Von Relevanz war die Frage, ob dieses von uns charakterisierte Infiltrat spezifisch für

ein bestimmtes Hapten ist, oder ob die Auslösung des KE immer nach einem ähnlichen

Schema abläuft.

Wir untersuchten zwei unterschiedliche Gruppen von Kontaktallergikern, die entweder

eine Überempfindlichkeit auf Ni oder auf Duftstoff aufwiesen.

Nach genauer und umfassender Analyse der infiltrierenden Zellpopulationen zeigte

sich, dass die Immunreaktion in ECT Läsionen nicht von der Art des Haptens abhängig

ist.

Unterschiede hinsichtlich Bindung der Haptene an Peptide oder MHC-assoziierte

Bindungsstellen an den LZ lösen somit im Endeffekt keine Unterschiede der

Immunantwort auf zellulärer Ebene aus.

Wir untersuchten weiterhin, ob bei einem Nicht-Allergiker nach Applikation von Ni eine

frühzeitige Immunreaktion ausgelöst wird, die sich in Form von Einwanderung der

Zellen des angeborenen Immunsystems wie NK-Zellen oder pDZ zeigen würde. Dies

war nicht der Fall, was bedeutet, dass entweder ein starkes Irritans (z.B. Dodecyl-

Sulfat) [140], [141] oder eine bereits erfolgte Sensibilisierung auf ein Hapten notwendig

sind, um das von uns untersuchte Infiltrat auszulösen. Unsere Versuchsperson war

erwiesenermaßen bereits zuvor mit Ni in Kontakt gekommen, doch eine

Sensibilisierung wurde verhindert. Auf welcher Ebene die Sensibilisierung mit einem

Hapten verhindert wird bzw. ob eine Sensibilisierung überhaupt verhindert werden

muss, ist bislang unklar. Hapten-spezifische reg T-Zellen, die eine Immunantwort

unterdrücken können, findet man bei Nicht-Allergikern [82]. Diese Zellen sind aber

beim ersten Hautkontakt des Haptens noch nicht in der Haut zu finden und können

auch nicht die Akutreaktion der Keratinozyten auf ein Hapten beeinflussen. Es könnte

aber sein, dass diese Zellen beim Gesunden nach Kontakt mit einem beliebigen

Hapten und entsprechender Antigen-Präsentation im regionären LK proliferieren und

bereits im LK eine weitere Immunreaktion unterdrücken.


- 81 -

Hypothese/Fazit

Nach unserem Wissen ist dies die erste Studie, die eine detaillierte und umfassende

Analyse über die zelluläre Komposition und Kinetik des inflammatorischen Infiltrats im

KE liefert.

Anhand der detaillierten deskriptiven Analyse des zellulären Infiltrats in ECT Läsionen

können wir die folgende Hypothese zum Ablauf/zur Pathogenese der Effektorphase

aufstellen:

Eine nach Sensibilisierung erneut durchgeführte Haptenapplikation, entweder mit Ni

oder Duftstoff, führt (wahrscheinlich nach der Ausschüttung proinflammatorischer

Zytokine durch Keratinozyten) zur raschen Einwanderung von Zellen der angeborenen

Immunität wie NK-Zellen und auch pDZ. Beide Zellarten können in normaler Haut nicht

gefunden werden. PDZ tragen in ECT Läsionen verschiedene Oberflächenmoleküle

(CXCR3, CLA, CD62L), die ihnen unter diesen entzündlichen Bedingungen die

Bindung an Endothelzellen oder HEVs ermöglicht und somit den Zutritt in die Haut.

Eine Entwicklung aus Haut ansässigen Vorläuferzellen ist unwahrscheinlich, da die

pDZ nicht in der Haut proliferieren. In ECT Läsionen gehören sie der zweitgrößten

Gruppierung von DZ an und haben rein quantitativ das Potential, entscheidend zum

Ablauf der Immunreaktion beizutragen. Durch ihren frühen Eintritt in die Haut und

durch ihre Fähigkeit TNF-α und IFN-α zu produzieren, sichern sie ihr eigenes

Überleben und aktivieren gleichzeitig NK-Zellen, die in ihrer direkten Nachbarschaft im

KE-Infiltrat zu finden sind.

Etwa die Hälfte der pDZ sind in den ECT Läsionen in einem reifen Zustand,

wahrscheinlich durch die Stimulation mit CD40L (von T-Zellen) und IL-3 (von ebenfalls

vermehrten Mastzellen). Aufgrund der Expression von MHCII und BDCA-2 ist eine

Haptenaufnahme im immaturen Zustand denkbar, der nach Maturation der Zellen die

Antigenpräsentation der T-Zellen (in der Haut oder im LK) folgt. Die pDZ erreichen

ihren quantitativen Höhepunkt nach 72 Std im Infiltrat.

Die von den pDZ aktivierten NK-Zellen schütten ihrerseits IFN-γ aus, das zur weiteren

Amplifizierung der Immunreaktion beiträgt.

Die in der Haut ansässigen DZ, wie LZ und DDZ, verändern sich ebenfalls nach

Haptenapplikation. Stimuliert durch die Keratinozyten-Zytokine IL-1β oder TNF-

α regulieren LZ ihre Adhäsionsmoleküle an der Zelloberfläche hinunter und beginnen,

die Epidermis zu verlassen.

Eine rezente Studie zeigte, dass in vergrößerten regionären LK, die von Patienten mit

chronisch entzündlichen Hautkrankheiten entnommen wurden, viele LZ, die man in


- 82 -

einem afferenten Lymphgefäß oder auch in der T-Zellzone der LK fand, in einem

unreifen Zustand sind, da nur wenige CD1a+Langerin+ Zellen das Maturationsmolekül

CD83 tragen [142]. Bis zu dieser Studie waren Maturation und Migration der LZ ein

aneinander gekoppeltes Ereignis.

Im dermalen Infiltrat der ECT Läsionen zeigen die Hälfte der LZ eine positive

Reaktivität für CD83. Es ist denkbar, dass einige LZ bereits durch den lokalen Kontakt

mit CD40L, während oder vor der T-Zell-Haptenpräsentation, zu reifen Zellen

gewachsen sind. Vielleicht verbleiben diese LZ in der Dermis, um dort Hapten zu

präsentieren, während sich die immaturen LZ auf den Weg in den LK machen. Kürzlich

erschienene Berichte legen den Schluss nahe, dass LZ im KE weder eine essentielle

Rolle in der Sensibilisierungsphase noch in der Effektorphase des murinen KE spielen

[55].

Aufgrund ihrer Quantität und der epidermalen Haptennähe, ist eine komplett passive

Rolle der LZ im humanen KE jedoch schwer vorstellbar. Denkbar ist, dass diese Zellen

an der Amplifizierung der Effektorphase durch dermale Antigenpräsentation beitragen.

Die größte DZ Population bilden die DDZ. Diese Zellen bleiben vorwiegend in einem

immaturen, CD83- Zustand und sind vor allem in der Dermis anzutreffen.

Mit der Literatur durchaus vereinbar ist die These [55], [142], dass die DDZ unreif zu

den LK wandern (beladen mit dem Haptenmolekül), um dort den T-Zellen das Antigen

zu präsentieren. Denkbar wäre auch, dass durch den vorwiegend immaturen Status

dieser Zellen eher Hapten-spezifische reg T-Zellen ausgebildet oder nur noch zur

Proliferation angeregt werden, die sich dann auf den Weg in die Haut machen, um die

Immunreaktion zu beenden.

Eine weitere DZ Population, die wir charakterisieren konnten, sind IDEZ/IDDZ. Diese

Zellen sind CD1a+/CD1c+ und bislang lediglich in der atopischen Dermatitis

beschrieben [57]. Allerdings ist nicht sicher, ob es sich bei unseren Zellen tatsächlich

um IDEZ handelt, da wir auf die Oberflächenmoleküle CD1a/CD1c beschränkt waren

und diese Merkmale z.B. auch auf aktivierten LZ zu finden sind. Die Frage nach der

tatsächlichen Anwesenheit von IDEZ muss demnach offen bleiben.

Makrophagen zählen ebenfalls zu Zellen der angeborenen Immunität und sind in ECT

Läsionen nach 72 Std überraschenderweise nicht sehr zahlreich vertreten. Weiterhin

weist etwa die Hälfte aller CD14+ Makrophagen in den Läsionen auch eine

Oberflächenexpression von CD1c auf. Es ist gut vorstellbar, dass es sich um die in

humaner Haut beschriebenen DZ Vorläuferzellen handelt, die je nach

Stimulationsmodus in LZ oder DDZ transformiert werden können (TGF-β1: LZ; IL-

4+GM-CSF: DDZ) [37], [122].


- 83 -

Schlussendlich spielen T-Zellen eine wesentliche Rolle im KE. CLA+ T-Zellen

patrouillieren die Haut auf der Suche nach Gefahrensignalen. Nach Haptenapplikation

beginnt eine Kaskade von Ereignissen, die im Endeffekt alle das Ziel haben, die T-

Zellen zu aktivieren und somit eine erworbene Immunreaktion in Gang zu setzen, die

auf Basis von Gedächtnis T-Zellen abläuft.

CD4+/CD3+ T-Zellen gelangen bereits wenige Std nach Haptenapplikation in die

‚Gefahrenzone’. Eine lokale Proliferation der Zellen findet nicht statt, sondern sie

werden über CLA/E-Selektin Bindung in die inflammierte Haut gelockt. Erst über 24 Std

später sind zusätzlich CD4+/CD25+ Zellen in der Haut vorhanden. Falls die

CD4+/CD3+ T-Zellen in der Haut von DZ das Hapten präsentiert bekommen, könnten

sie sich im Anschluss in CD4+/CD25+ reg T-Zellen umwandeln. Diese reg T-Zellen

sind wahrscheinlich Hapten-spezifisch und tragen zur Beendigung der Immunantwort

bei.

Zahlenmäßig unterlegen sind die CD8+/CD3+ T-Zellen. Diese Zellen stellen die

Effektorzellen im KE dar [77]. Hapten-spezifische CD8+ T-Zellantworten können nur

bei Allergikern ausgelöst werden. Durch ihre Zytotoxizität werden Keratinozyten in

Apoptose getrieben [108] und die Immunreaktion aggraviert. Auch CD8+/CD3+ T-

Zellen sind bereits nach 24 Std in den ECT Läsionen detektierbar. Eine 2006

veröffentlichte Studie in einem Mausmodell für Kontakthypersensitivität konnte zeigen,

dass es nach Sensibilisierung der Mäuse mit DNFB zur Ausbildung von CD8+

Effektorzellen kommt, die IL-17 produzieren. Neutralisiert man dieses Zytokin, kommt

es zur Unterdrückung des KE [143].

Th17-Zellen spielen eine wichtige Rolle in unterschiedlichen allergisch bedingten oder

Autoimmunerkrankungen, die man bislang T1 oder T2 Zellen zugeschrieben hat. Die

Daten von He et al deuten auf eine Rolle dieser Zellen auch im allergischen KE hin.

Ob die CD8+ T-Zellen im humanen KE ebenfalls IL-17 produzieren, muss leider

unbeantwortet bleiben. In den letzten 20 Jahren haben sich viele Theorien zur

Entstehung des allergischen KE gebildet. Einige konnten im Laufe der Zeit bestätigt

werden, andere wurden verworfen.

Ob die von uns aufgestellte Hypothese der Wahrheit nahe kommt, kann nur in einigen

Folgestudien, die auf das von uns akquirierte Wissen aufbauen, evaluiert werden.

Zusammenfassung Ch. Bangert

- 84 -

6. ZUSAMMENFASSUNG

In der Effektorphase des allergischen KE reagiert das Immunsystem allergen-

spezifisch, mit dem Ziel, das auslösende Hapten durch eine entsprechende

Entzündungsreaktion zu eliminieren. In der frühen Effektorphase dominiert das

Eindringen von Zellen des angeborenen Immunsystems, wie z.B. neutrophilen

Granulozyten und NK-Zellen. Erst im Anschluss kommt es zur Einwanderung von

CLA+, aktivierten Hapten-spezifischen T- Lymphozyten sowie von unspezifisch

rekrutierten Lymphozyten in das betroffene Hautareal. Eine wichtige Rolle in dieser

Phase wird den dendritischen Zellen durch ihre Möglichkeit der Antigenpräsentation

und Verstärkung der Entzündungsreaktion zugedacht.

Während in der Sensibilisierungsphase des allergischen KE der LZ die Rolle der

maßgeblich beteiligten APZ zugewiesen werden konnte, ist die Natur einer solchen

Zelle in der Effektorphase bislang noch nicht eindeutig identifiziert.

Um herauszufinden, ob unterschiedliche Haptene Einfluss auf die quantitative und

qualitative Zusammensetzung des entzündlichen Infiltrats im KE haben, analysierten

wir sowohl Biopsien von positiven ECT auf Ni (n=5) und Duftstoff (n=5) nach 72 Std als

auch von NH (n=5) und stellten Vergleiche hinsichtlich des Phänotyps und der Menge

der infiltrierenden Leukozyten an. Des Weiteren konzentrierten wir uns auf die

Charakterisierung des Infiltrats im ECT zu unterschiedlichen Zeitpunkten und richteten

hierbei unser Augenmerk vor allem auf T-Zellen und DZ, um Hinweise auf die Natur

der zentral involvierten APZ zu erhalten.

Im Gegensatz zur NH zeigten die positiven ECT auf Ni und Duftstoff einen deutlichen

Anstieg der Leukozytenzahl in der Epidermis und Dermis. Detaillierte numerische und

phänotypische Vergleiche der Zusammensetzung des entzündlichen Infiltrats in Ni-

bzw. Duftstoff-Allergikern ergaben keine signifikanten Unterschiede, so dass man

einen einheitlichen Wirkmechanismus vermuten kann, den die Haptene nach Kontakt

in der Effektorphase auslösen. Die meisten der infiltrierenden Leukozyten

repräsentierten T-Zellen oder DZ, allerdings gab es auch ein vermehrtes Vorkommen

von Mastzellen, neutrophilen sowie eosinophilen Granulozyten und NK-Zellen.

Die überwiegende Mehrheit in den positiven Testungen waren T-Zellen, wobei zwei

Drittel aus CD4+ und ein Drittel aus CD8+ T-Zellen bestanden. Fünf Prozent der T-

Zellen zeigten interessanterweise eine positive Reaktivität für CD4/CD25/CTLA-4 und

repräsentierten damit den Phänotyp von aktivierten oder reg T-Zellen. Die kinetischen

Zusammenfassung Ch. Bangert

- 85 -

Analysen der ECT nach 24, 48 und 72 Std zeigten, dass beinahe die Hälfte der

gesamten CD4+/CD3+ T-Zellen bereits innerhalb von 24 Std einwandern, während

CD4+/CD25+ T-Zellen erst nach 24 Std im Infiltrat erscheinen. Dies könnte bedeuten,

dass CD4+/CD25+ Zellen sich entweder aus den bereits eingewanderten Zellen

entwickeln oder tatsächlich zu einem späteren Zeitpunkt in die Läsion einwandern.

Die dominante Zellpopulation unter den APZ in der Dermis läsionaler Haut waren

CD1c+ DDZ. LZ zeigten eine Abnahme in der Epidermis und eine Zunahme in der

Dermis von ECT im Vergleich zur NH. Dies lässt sich mit der Wanderung der LZ zum

regionären LK nach ihrer Haptenaufnahme erklären. Überraschenderweise

identifizierten wir eine große Anzahl CD123+/BDCA-2+/CD45RA+ pDZ in der Dermis

läsionaler Haut. Während sie in der NH nicht detektierbar waren, zeigte sich bereits 6

Std nach Haptenkontakt eine Infiltration der Zellen in die Dermis. Eine lokale

Proliferation von pDZ konnten wir durch Färbungen mit einem Proliferationsmarker (Ki-

67) ausschließen.

Durchaus interessant war auch die Tatsache, dass NK-Zellen als Zellen des

angeborenen Immunsystems ebenfalls bereits nach 6 Std in ECT zu finden und häufig

in der Nähe von pDZ angesiedelt waren. Eine Interaktion dieser beiden Zellarten wäre

denkbar, da pDZ IFN-α und TNF-α produzieren, dadurch NK-Zellen aktiviert und zur

Produktion von IFN-γ angeregt werden können.

Unsere Studie gibt eine umfassende und detaillierte Übersicht über das entzündliche

Infiltrat und dessen Kinetik in der Effektorphase des KE. Dieses Wissen bildet die Basis

für weitere Untersuchungen, in denen die Funktion der unterschiedlichen Zellarten

ermittelt werden sollte, um so endgültig die Mechanismen verstehen zu können, die für

das Entstehen und die Auflösung des KE verantwortlich sind.

Literatur Ch.Bangert

- 86 -

7. LITERATURVERZEICHNIS

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2002. 169(11): p. 6079-83.

128. Lechleitner, S., et al., Peripheral lymph node addressins are expressed on skin

endothelial cells. J Invest Dermatol, 1999. 113(3): p. 410-4.

129. Kohrgruber, N., et al., Survival, maturation, and function of CD11c- and CD11c+

peripheral blood dendritic cells are differentially regulated by cytokines. J

Immunol, 1999. 163(6): p. 3250-9.

130. Cella, M., et al., Plasmacytoid dendritic cells activated by influenza virus and

CD40L drive a potent TH1 polarization. Nat Immunol, 2000. 1(4): p. 305-10.

131. Steinman, R.M., D. Hawiger, and M.C. Nussenzweig, Tolerogenic dendritic

cells. Annu Rev Immunol, 2003. 21: p. 685-711.

132. Rissoan, M.C., et al., Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell

differentiation. Science, 1999. 283(5405): p. 1183-6.

133. Kadowaki, N., et al., Natural interferon alpha/beta-producing cells link innate

and adaptive immunity. J Exp Med, 2000. 192(2): p. 219-26.

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ligand-activated plasmacytoid dendritic cells. J Exp Med, 2002. 195(6): p. 695-

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is due to differential tissue immigration. Br J Dermatol, 1990. 123(1): p. 59-64.

136. Shevach, E.M., CD4+ CD25+ suppressor T cells: more questions than answers.

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dermatitis skin--Malassezia-influenced cell interaction. J Invest Dermatol, 2002.

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tissues. Nat Rev Immunol, 2002. 2(12): p. 957-64.

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experimental toxic contact dermatitis. Acta Derm Venereol, 1980. 60(3): p. 239-

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141. Sjogren, F. and C. Anderson, The spectrum of inflammatory cell response to

dimethyl sulfoxide. Contact Dermatitis, 2000. 42(4): p. 216-21.

142. Geissmann, F., et al., Accumulation of immature Langerhans cells in human

lymph nodes draining chronically inflamed skin. J Exp Med, 2002. 196(4): p.

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143. He, D., et al., CD8+ IL-17-producing T cells are important in effector functions

for the elicitation of contact hypersensitivity responses. J Immunol, 2006.

177(10): p. 6852-8.

Danksagung Ch. Bangert

- 97 -

8. DANKSAGUNG Mein Dank richtet sich in erster Linie an Herrn Prof. Dr. Georg Stingl, Vorstand der

Abteilung für Immundermatologie und Infektiöse Hautkrankheiten an der Klinik für

Dermatologie an der Medizinischen Universität Wien für die Ideengebung und

Überlassung des Themas sowie die hervorragende wissenschaftliche Betreuung,

Unterstützung, Freundschaft und große Geduld während der Anfertigung der

vorliegenden Arbeit.

Besonders danke ich auch Frau Prof. Dr. Tamara Kopp, Abteilung für

Immundermatologie, Klinik für Dermatologie, Medizinischen Universität Wien, für die

kompetente wissenschaftliche Betreuung und Ideengebung, die Lehre

unterschiedlichster wissenschaftlicher Techniken, die Hilfe bei der statistischen

Auswertung und vor allem auch für ihre konstante Freundschaft und Kollegialität

während der letzten Jahre.

Außerdem bedanke ich mich bei Herrn Prof. Dr. Jürgen Grabbe für die freundliche

Übernahme der Dissertationsbetreuung.

Für die sehr gute Zusammenarbeit möchte ich Herrn Dr. Georg Stary und Frau Sabine

Kohlhofer, Abteilung für Immundermatologie, Klinik für Dermatologie, Medizinischen

Universität Wien, danken.

Weiterhin war der wissenschaftliche Austausch mit Dr. Ernst Kriehuber und Prof. Dieter

Maurer, Abteilung für Immundermatologie, Klinik für Dermatologie, Medizinischen

Universität Wien, bei der Fertigstellung dieser Arbeit von großer Bedeutung.

Für die Darstellung und Anfertigungen der Abbildungen sowie für die kompetente

Beratung bei auftretenden Problemen im EDV Bereich möchte ich Herrn Andreas

Ebner danken.

Meinen Eltern danke ich besonders für die seelische Unterstützung und das allzeit

vorhandene Verständnis.

Lebenslauf Ch. Bangert

- 98 -

9. LEBENSLAUF Persönliche Daten:

Name Christine Bangert

Geburtsort Mosbach, Deutschland

Nationalität Deutsch

Schulische Ausbildung:

1980-1984 Müller-Guttenbrunn Grundschule, Mosbach

1984-1993 Nikolaus-Kistner Gymnasium, Mosbach

10.05.1993 Abitur

Studium:

09/93-11/2000 Studium der Humanmedizin an der Medizinischen

Universität zu Lübeck

14.11.2000 Beendigung des Studiums mit dem 3. Staatsexamen

bis 09/2001 Promotionssemester

04/2002-09/2003 AiP (Arzt im Praktikum), Klinik für Dermatologie,

Medizinische Universität Wien, Österreich

05.09.2003 Approbation

Berufliche Ausbildung:

02/2001-09/2003: wissenschaftliche Mitarbeiterin, Klinik für Dermatologie, AKH,

Medizinische Universität Wien, Österreich

seit 09/2003 Assistenzärztin, Klinik für Dermatologie, AKH, Medizinische

Universität Wien, Österreich

Publikationen:

Bangert C , Friedl J, Stary G, Stingl G, Kopp T: Immunopathologic features of allergic

contact dermatitis in man: participation of plasmacytoid dendritic cells in the

pathogenesis of the disease? (J. Invest Dermatol, 121:1409-1418; 2003)


- 99 -

Stary G, Bangert C , Stingl G, Kopp T: Dendritic cells in atopic dermatitis: expression of

FcepsilonRI on two distinct inflammation-associated subsets. (Int Arch Allergy

Immunol, 138:278-290; 2005)

Streit M, Ecker RC, Osterreicher K, Steiner GE, Bischof H, Bangert C , Kopp T,

Rogojanu R: 3D parallel coordinate systems-A new data visualization method in the

context of microscopy-based multicolor tissue cytometry. (Cytometry A 69:601-611;

2006)

Stary G, Bangert C , Tauber M, Strohal R, Kopp T, Stingl G: Tumoricidal activity of

TLR7/8 –activated inflammatory dendritic cells. (J Ex Med, 204:1441-1451; 2007)

Stary G, Meyer T, Bangert C , Kohrgruber N, Gmeinhart B, Kirnbauer R, Jantschitsch

C, Rieger A, Stary A, Geusau A: New chlamydia trachomatis L2 strains identified in a

recent outbreak of lymphogranuloma venereum in Vienna, Austria. (Sex Transm Dis,

35: 377-382; 2008)

C. Bangert , B. E. Strober, M. Cork, J.-P. Ortonne, T. Luger, T. Bieber, A. Ferguson,

R.C. Ecker, T.Kopp, S. Weise-Riccardi, A. Guettner, G. Stingl: Clinical and cytological

effects of pimecrolimus cream 1% after resolution of active atopic dermatitis lesions by

topical corticosteroids: a randomized trial (eingereicht im März 2009)

Buchkapitel:

Fitzpatrick’s Dermatology in General Medicine, 7th Edition; Klaus Wolff, Lowell A.

Goldsmith, Stephen I. Katz, Barbara A. Gilchrest, Amy S. Paller, David J. Leffell

Part 2. Disorders presenting in skin and mucous membranes

Section 4, Chapter 10: Innate and adaptive immunity in the skin

Robert L.Modlin, Jenny Kim, Dieter Maurer, Christine Bangert, Georg Stingl

Präsentationen

C. Bangert , G. Stingl, T. Kopp: CD123+/CD4+ cells – a predominant dendritic cell

population in allergic contact dermatitis (Poster, 32nd Annual Meeting der ESDR,

September 2002, Genf, Schweiz)


- 100 -

C. Bangert , G. Stingl, T. Kopp: CD123+/CD4+ cells – a predominant population in

allergic contact dermatitis (Poster, 7th International Symposium on Dendritic Cells,

September 2002, Bamberg, Deutschland)

C. Bangert , G. Stingl, T. Kopp: Detection of BDCA-2+CD123+MHCII+ plasmacytoid

dendritic cells in allergic contact dermatitis. (Poster, XXX. Jahrestagung der ADF,

Februar 2003, Frankfurt, Deutschland)

C. Bangert , G. Stingl, T. Kopp: Dendritic cells in allergic contact dermatitis-the

widening spectrum. (Poster, 4. gemeinsamer Jahrestag der ESDR, JSID und SID, Mai

2003, Miami Beach Florida, U.S.A.)

C. Bangert, G. Stary, G. Stingl, T. Kopp: Preferential occurrence of different

inflammatory dendritic cell subsets in contact hypersensitivity and atopic dermatitis

(Poster, 8th International Workshop on Langerhans Cells, September 2003, Tokyo,

Japan)

C. Bangert, S. Graffi, S. Altrichter, G. Stingl, T. Kopp: Plasmacytoid dendritic cells

induce hapten-specific T-cell proliferation (Poster, 65th Meeting of the SID, April 2004,

Providence, Rhode Island, USA)

C. Bangert, S. Graffi, S. Altrichter, G. Stingl, T. Kopp: Mature, but not immature

plasmacytoid dendritic cells induce hapten-specific T-cell proliferation (Poster, 34th

Annual ESDR Meeting, September 2004, Wien, Österreich)

C. Bangert, S. Altrichter, G. Stary, G. Stingl, T. Kopp: Presence of lytic proteins in

myeloid and plasmacytoid dendritic cells (Poster, 9th International Workshop on

Langerhans Cells, September 2005, Funchal, Madeira)

N. Kohrgruber, C. Bangert , P. Mastan, G. Stingl, A. Rieger: Bazilläre Angiomatose bei

einem HIV-infizierten Patienten (Vortrag, Jahrestagung 2005 der Österreichischen

Gesellschaft für Dermatologie und Venerologie, November 2005, Wien, Österreich)


myeloid and plasmacytoid dendritic cells (Poster, 35th Annual ESDR Meeting,

September 2005, Tübingen, Deutschland)


- 101 -


myeloid and plasmacytoid dendritic cells (Poster, XXXIII. Jahrestagung der ADF, März

2006, Aachen, Deutschland)

C. Bangert , S. Schlehner, D. Mechtcheriakova, G. Stingl, T. Kopp. TLR-mediated

inflammatory responses in keratinocytes: expression of TSLP and IL-31 (Poster, 36th

Annual ESDR Meeting, September 2006, Paris, Frankreich)

C. Bangert , S. Kohlhofer, R. Kunstfeld, N. Selenko-Gebauer, F. Karlhofer, G. Stingl, T.

Kopp. Effective treatment of recalcitrant disseminated granuloma annulare with the

TNF-α-inhibitor infliximab (Vortrag, Jahrestagung 2006 der Österreichischen

Gesellschaft für Dermatologie und Venerologie, November 2006, Salzburg, Österreich)

C. Bangert , B. Strober, M. Cork, T. Luger, T. Bieber, S. Weise-Riccardi, A. Guettner,

A.G. Schmidt, T. Hultsch, G. Stingl: The effects of pimecrolimus 1% cream on the

recurrence of atopic dermatitis exacerbation following treatment with a mid-potent

topical corticosteroid (Poster, 16th Congress of EADV, June 2007, Wien, Österreich)

C. Bangert , S. Kohlhofer, R. Kunstfeld, N. Selenko-Gebauer, F. Karlhofer, G. Stingl, T.

Kopp: TNF-α-bearing macrophages: a target for TNF-α inhibitors in non-infectious

granulomatous diseases? (Poster, 37th Annual ESDR Meeting, September 2007,

Zürich, Schweiz)

Preise:

ESDR Travel Award (4. gemeinsamer Jahrestag der ESDR, JSID, SID, Miami Beach,

FL, USA, Mai 2003)

Theodor-Billroth Preis der Ärztekammer für Wien 2004

ESDR Poster Preis 2007 (37th Annual ESDR Meeting, September 2007, Zürich,

Schweiz)

Anhang Ch.Bangert

- 102 -

10. ANHANG

Abbildung I. Isotyp zu Ergebnisse S.68 Abbildung 4.3.5.3.: Aufnahme mit

konfokalem Lasermikroskop. Die dargestellte Isotyopkontrolle repräsentiert alle IgG1

Isotypkontrollen in TRITC/FITC Doppelfärbungen, die in der vorliegenden Arbeit

gezeigt wurden.

Ki-67 CD3 Überlappung

Überlappung CD3 Ki-67

Anhang Ch.Bangert

- 103 -

Abbildung II zu Ergebnisse Seite 42: 4.2.1. Typisierung der T-Zellen im dermalen

Infiltrat. Doppelfärbungen mit dem Proliferationsmarker Ki-67 (rot) und CD3 (grün)

zeigen keine doppelt gefärbten Zellen, d.h. keineÜberlappung (gelb).

Abbildung III A zu Ergebnisse S.45: 4.2.2. Charakterisierung der CD4+/CD25+ T-

Zellsubpopulation. Dreifachfärbungen mit CD25 (TRITC, rot), CD4 (FITC, grün) und

FOXP3 (Cy5, blau) im dermalen Infiltrat von ECT Läsionen nach 72 Std zeigen

dreifach positive reg T-Zellen in einer weißlichen Farbe (Pfeil).

Die einzelnen Isotypkontrollen für die angegebenen Antikörper werden in den

darauffolgenden Abbildungen dargestellt (III B-D). Es wurde immer ein Antikörper

durch den Isotyp ersetzt und die Einstellungen des konfokalen Lasermikroskops an die

Kontrolle angepaßt.

Alle in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Dreifachfärbungen wurden mit dem

entsprechenden Kontrollantikörper durchgeführt. Die Abbildungen sind repräsentativ

für alle gefärbten und analysierten IgG1 Isotypkontrollen bei Dreifachfärbungen.

CD25 CD4

FOXP3 Überlappung

Anhang Ch.Bangert

- 104 -

Abbildung III B: mIgG1 Isotyp für CD4 FITC

Abbildung III C: mIgG1 Isotyp für FOXP3 Cy5

CD25

FOXP3

Überlappung

mIgG1

CD25

mIgG1 Überlappung

CD4

Anhang Ch.Bangert

- 105 -

Abbildung III D: mIgG1 Isotyp für CD25 TRITC

mIgG1 CD4

FOXP3 Überlappunggg

Anhang Ch.Bangert

- 106 -

Tabellen mit Einzelwerten zu den im Resultatteil ge zeigten Graphen

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis

CD4+/CD3+ CD8+/CD3+ KE 20 25,3 696,8 KE 20 9 199,2 KE 21 18 432,3 KE 21 5,9 115,3 KE 23 17,3 407,4 KE 23 4,4 142 KE 25 16,4 483,9 KE 25 0,5 194,6 KE 26 17,2 430,1 KE 26 13 363,4 KE 30 9,8 274,2 KE 30 7,5 329 KE 32 29,2 218,3 KE 32 14 125,8 KE 33 6,2 137,6 KE 33 8,5 119,4 KE 34 8,1 386 KE 34 4,3 92,5 KE 35 3,2 83 KE 35 0,5 26,3 MW 15,07 354,96 MW 6,76 170,75 STW 8,300609081 181,1159187 STW 4,602945917 104,9247164 NH 5 2,7 20,4 NH 5 0,6 44,4 NH 6 0 2,4 NH 6 0,5 3,2 NH 15 0,6 14 NH 15 0,6 5,3 NH 16 2,3 36,3 NH 16 0,3 12,3 NH 17 2,9 45,2 NH 17 0,9 8,6 MW 1,7 23,66 MW 0,58 14,76 STW 1,313392554 17,17317676 STW 0,216794834 16,92374072

CD3+/CD4/CD8- CD3+ KE 20 0,3 13,7 KE 20 34,6 909,7 KE 21 6,1 15 KE 21 30 562,6 KE 23 1 17,2 KE 23 22,7 566,6 KE 25 0 24,7 KE 25 16,9 703,2 KE 26 1 17,2 KE 26 31,2 810,7 KE 30 0 8,8 KE 30 17,3 612 KE 32 0 16,6 KE 32 43,2 360,7 KE 33 4,1 11,3 KE 33 18,8 268,3 KE 34 0 9,1 KE 34 12,4 487,6 KE 35 0,5 7,6 KE 35 4,2 116,9 MW 1,3 14,12 MW 23,13 539,83 STW 2,0939065 5,18519259 STW 10,496324 219,65295 NH 5 0 0 NH 5 3,3 64,8 NH 6 0 0 NH 6 0,5 5,6 NH 15 0 0 NH 15 1,2 19,3 NH 16 0 1 NH 16 2,6 49,6 NH 17 0 0,8 NH 17 3,8 54,6 MW 0 0,36 MW 2,28 38,78 STW 0 0,49799598 STW 1,13929803 20,5132803

Anhang Ch.Bangert

- 107 -

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis

CD1c+ Langerin+ KE 20 15,7 105,9 KE 20 20,7 16,15 KE 21 16,7 80,25 KE 21 16,25 18,9 KE 25 9,75 117 KE 25 17,75 13,6 KE 26 18,05 132,25 KE 26 18,2 19,7 KE 30 21,65 128,45 KE 30 18,9 5,15 KE 23 13,95 101,5 KE 23 13,25 18,75 KE 32 14,2 77,1 KE 32 21,5 28,1 KE 33 18,35 76,85 KE 33 15,6 3,9 KE 34 20,95 115,95 KE 34 24 19,8 KE 35 7,75 72,55 KE 35 14,6 1,1 MW 15,705 100,78 MW 18,075 14,515 STABW 4,24767289 21,5121849 STABW 3,00516601 7,74822707 NH 5 4,95 17,75 NH 5 21,4 0 NH 6 4,6 18,3 NH 6 14,4 0 NH 15 4,75 42,65 NH 15 34 2,85 NH 16 5,7 23 NH 16 30,2 3,55 NH 17 1,6 41,3 NH 17 29,3 0,4 MW 4,32 28,6 MW 25,86 1,36 STABW 1,57821101 12,3881496 STABW 6,43107041 1,39265933

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis

CD1a+ CD123+/CD45RA+ KE 20 10,4 73,4 KE 20 5,95 36,45 KE 21 10 40,3 KE 21 4,4 37 KE 23 17,2 48,7 KE 23 6,5 36,1 KE 25 13,4 68 KE 25 2,5 72,25 KE 26 20,3 95,7 KE 26 6 85,75 KE 30 4,1 23,1 KE 30 2,6 58 KE 32 17,3 28,7 KE 32 4,3 44,85 KE 33 14,6 25,8 KE 33 0,85 22,35 KE 34 10,8 51 KE 34 2,35 42,55 KE 35 8,3 20,6 KE 35 0 14,55 MW 12,64 47,53 MW 3,1375 47,05 STABW 4,86191549 24,9958241 STABW 2,30662865 24,0949461 NH 5 16,4 10,9 NH 5 0 1,4 NH 6 18,7 1,62 NH 6 0 0,8 NH 15 14,1 13,5 NH15 0 2,55 NH 16 22,8 31,4 NH 16 0 2,8 NH 17 24,3 23,7 NH 17 0 0 MW 19,26 16,224 MW 0 1,51 STABW 4,27352314 11,5676653 STABW 0 1,17707264

Anhang Ch.Bangert

- 108 -

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis

CD1a+/CD1c+ CD83+/CD1a+ KE 20 7,9 19,4 KE 20 4,3 29,8 KE 21 5,6 4,3 KE 21 2,3 5,6 KE 23 4,8 30 KE 23 2,6 15,8 KE 25 7,8 36,6 KE 25 4,8 25 KE 26 5,9 43,5 KE 26 5,5 40,9 KE 30 3,2 18,3 KE 30 1,8 14 KE 32 2,6 35,5 KE 32 6,4 10 KE 33 1,4 11,3 KE 33 1,6 7,7 KE 34 8,2 8 KE 34 4,4 23,2 KE 35 4,5 4,8 KE 35 1 9 MW 5,19 21,17 MW 3,47 18,1 STABW 2,12237003 12,9854499 STABW 1,84213041 11,3787326 NH 5 0,4 5,6 NH 5 1,6 1,8 NH 6 0 1,1 NH 6 0 0 NH 15 0,5 1,6 NH 15 1,3 0 NH 16 0,7 2,3 NH 16 0,7 1 NH 17 0 14,7 NH 17 0 0,9 MW 0,32 5,06 MW 0,72 0,74 STABW 0,25429641 4,6276704 STABW 0,73280284 0,76026311

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis

CD83+/CD1c+ CD123+/BDCA-2+ KE 20 1,23 12,4 KE 20 1,4 22,6 KE 21 0,7 11,4 KE 21 2,56 28 KE 23 0,8 3,7 KE 23 2,7 58,1 KE 25 1 6,9 KE 25 0,8 117,7 KE 26 1,9 14,8 KE 26 4,2 68,8 KE 30 1,5 14,2 KE 30 0,5 28 KE 32 2,3 5,8 KE 32 1,8 21,5 KE 33 2,3 5,7 KE 33 0 23,7 KE 34 1,8 16,6 KE 34 2 89,2 KE 35 0,8 10,6 KE 35 0 37,6 MW 1,433 10,21 MW 1,596 49,52 STABW 0,5854921 4,21080752 STABW 1,2689145 31,485133 NH 5 1 1,6 NH 5 0 2,6 NH 6 2,2 17,2 NH 6 0 0 NH 15 0 1,6 NH 15 0 0 NH 16 1,6 5,9 NH 16 0 7,5 NH 17 0,3 11,3 NH 17 0 4,3 MW 1,02 7,52 MW 0 2,88 STABW 0,8109254 6,01178842 STABW 0 2,8294169

Anhang Ch.Bangert

- 109 -

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis

CD123+/CD68+ CD123+/CD62L+ KE 20 3,5 29,8 KE 20 0,3 10 KE 21 2,9 22,9 KE 21 0 1,9 KE 23 4,2 17,7 KE 23 0,6 12,3 KE 25 2,7 39,2 KE 25 0,9 20,7 KE 26 5 32,8 KE 26 0,7 13,4 KE 30 1,8 25,2 KE 30 0,2 10,2 KE 32 1,6 16,9 KE 32 0,4 1,3 KE 33 1,6 15,2 KE 33 0,7 6,9 KE 34 1,8 36,6 KE 34 0,3 5,9 KE 35 0,8 11,8 KE 35 0,2 5,2 MW 2,59 24,81 MW 0,43 8,78 STABW 1,2549502 9,50642473 STABW 0,26851443 5,54306774 NH 5 0 6,5 NH 5 0 0,5 NH 6 0 8 NH 6 0 0 NH 15 0 7,7 NH 15 0 2,2 NH 16 0 16,9 NH 16 0 0 NH 17 0 4,3 NH 17 0 0 MW 0 8,68 MW 0 0,54 STABW 0 4,31110195 STABW 0 0,85229103

Originaldaten der gezeigten Kinetik-Experimente

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm2 Dermis

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis

CD4+/CD3+ CD25+/CD4+ Kinetik Patient 1

Kinetik Patient 1

NH 0,5 35,5 NH 0 5,8 KE 24h 15,8 259,1 24h 0,3 9 KE 48h 20,6 321,5 48h 10,9 68,8 KE 72h 28,7 363,4 72h 3,5 34,4 Kinetik Patient 2

Kinetik Patient 2

NH 1,3 11,8 NH 0 4,3 KE 24h 1,5 130,1 24h 0,3 4,5 KE 48h 6 278,5 48h 6,8 30,6 KE 72h 5,4 284,9 72h 2,4 35,5 Kinetik Patient 3

Kinetik Patient 3

NH 3,2 72 NH 0 1 24h 4,8 123,7 24h 0 4,3 48h 7,2 151,3 48h 0 15,6 72h 13,9 174,2 72h 0 11,8

Anhang Ch.Bangert

- 110 -

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis

Zellen/mm Epidermis

Zellen/mm 2 Dermis

CD56+ CD45RA+/CD123+ Kinetik Patient 1

Kinetik Patient 1

NH 0 7,9 NH 0 4 KE 24h 1,3 21,2 KE 24h 1,6 19,4 KE 48h 2,5 36,6 KE 48h 4,3 28,4 KE 72h 0,8 51,6 KE 72h 4,4 46,3 Kinetik Patient 2

Kinetik Patient 2

NH 0 3,9 NH 0 0 KE 24h 0 13,7 KE 24h 0,7 17,4 KE 48h 0 21,8 KE 48h 1,2 28,2 KE 72h 1,2 20,4 KE 72h 1,6 23,3 Kinetik Patient 3

Kinetik Patient 3

NH 0 9,2 NH 0 1,1 24h 0 20,4 24h 0 22,6 48h 0 24,4 48h 0 26,7 72h 0,5 30,1 72h 0 20,4

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Immunpathologische Veränderungen in der Effektorphase des ... · Im dichten inflammatorischen Infiltrat der papillären Dermis finden sich u.a. eosinophile Granulozyten, die durch