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Impiego del lavaggio bronco-alveolare (BAL) per la diagnosi delle sindromi respiratorie del bovino e studio della farmacosensibilità degli isolati attraverso la determinazione della minima concentrazione inibente (MIC) Bano Luca 1 , Schiavon Eliana 2 , Catania Salvatore 2 , Berto Giacomo 1 , Mottaran Davide 2 , Bizzarri Davide 3 , Valla Giorgio 3 1 Laboratorio di Batteriologia Speciale, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie – Treviso 2 Laboratorio di Diagnostica Clinica, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie - Padova 3 CEVA Salute Animale, Agrate Brianza, Milano Corte Benedettina, 11 Novembre 2015

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Impiego del lavaggio bronco-alveolare (BAL) per la diagnosi delle sindromi respiratorie del bovino e studio della

farmacosensibilità degli isolati attraverso la determinazione della minima concentrazione inibente (MIC)

Bano Luca1, Schiavon Eliana2, Catania Salvatore2, Berto Giacomo1, Mottaran Davide2,

Bizzarri Davide3, Valla Giorgio3

1 Laboratorio di Batteriologia Speciale, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie – Treviso

2 Laboratorio di Diagnostica Clinica, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie - Padova

3 CEVA Salute Animale, Agrate Brianza, Milano

Corte Benedettina, 11 Novembre 2015

L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5

Liquido di lavaggio raccolto dalle vie

respiratorie profonde

Esecuzione: introduzione di catetere rino-

tracheo-bronchiale

Cos’è il lavaggio bronco-alveolare (BAL)?

Lunghezza (cm)

Ø interno (mm)

Ø esterno (mm)

Fisiologica(ml)

Aspirato(ml)

Vacca da latte 240 3 11 60 3-10

Vitellone 200 2 8 60 3-10

Vitello 150 2 8 30 2-5

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Perché usare lavaggio bronco-alveolare come matrice diagnostica di BRD?

Rispetto al tampone nasale:

1. Assente o ridotto livello di contaminazione microbica inquinante

(mancano terreni selettivi per Pasteurellacee)

2. Fornisce informazioni diagnostiche sui patogeni batterici presenti

nelle vie aeree profonde

3. Consente di ottenere informazioni sulla farmacosensibilità di specie

batteriche responsabili d’infezione delle vie aeree profonde (quelle

in cavità nasale potrebbero non essere responsabili della clinica)

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MATERIALI E METODI

1. CAMPIONAMENTO• Tampone nasale• Organi (trattamento?)

2. ESAME BATTERIOLOGICO• Identificazione biochimica

3. TEST DI FARMACOSENSIBILITA’• Antibiogramma

1. CAMPIONAMENTO• Lavaggio bronco-alveolare

2. ESAME BATTTERIOLOGICO• MALDI TOF MS: identificazione

rapida e attendibile anche di specie difficili da id. con bioch

3. TEST DI FARMACOSENSIBILITA’• MIC in brodo

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— Materiali e metodi (2) —

N° gruppi N° soggetti

Vitellone da carne 22 66

Vacca da latte 15 50

Vitelli a carne bianca 8 29

Bovini a duplice attitudine 4 8

TOT. 49 153

CAMPIONAMENTO

Soggetti sintomatici: 3-4 per gruppo/allevamento

Non trattati, non vaccinati con vaccino vivo da < 30 gg

Gennaio/giugno 2015

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N° gruppi N° soggetti

Frisona italiana 19 68

Charolaise 10 30

Limousine 5 18

Charolaise X Saler 1 3

Aubrac 1 1

Garonnaise 3 6

Blanc bleu belge X FI 3 6

Bruna 1 3

Pezzata rossa 2 5

Piemontese 1 3

Altri incroci 3 10

TOT. 49 153

— Materiali e metodi (3) —RAZZE BOVINE CAMPIONATE

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— Materiali e metodi (4) —ACCERTAMENTI DIAGNOSTICI SU BAL

Virus: IBR, BVD, RSVB, BRCoV

Ricerca micoplasmi: esame colturale (IZS PD)

Batteriologico:

• terreni non selettivi (AS, AC)

• da 51 soggetti eseguito parallelamente il tampone nasale

P. multocida, M. haemolytica, H. somniDeterminazione della minima concentrazione inibente (MIC) (IZS TV)

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MIC

1 ceppo per specie microbica e per partita

30 P. multocida, 15 M. haemolytica, 10 H. somni

Metodo: microdiluizione in brodo (CLSI VET01-A4, 2013)

Break-points: CLSI VET01-S2, 2013

— Materiali e metodi (5) —

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Molecole:

• Betalattamine: penicillina, amoxicillina, ceftiofur

• Aminoglicosidi: streptomicina

• Tetracicline: tetraciclina

• Macrolidi: tilmicosina

• Fluorchinolonici: enrofloxacina

• Amfenicoli: florfenicolo

• Sulfamidici: sulfametossazolo + trimethoprim

— Materiali e metodi (6) —

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RISULTATI

ESAME VIROLOGICO

Gruppi con almeno un positivo per virus: 26/49 (53%)

Soggetti positivi: 47/153 (30,7%)

N° gruppi

positivi (%)

N° soggetti

positivi (%)

Vacca da

latte (%)

Vitellone

(%)

Duplice

attitudine

Vit. carne

bianca (%)

IBR 2 (4,7) 3 (2,2) - 3 (4,5)* - -

BVD 10 (18,8) 14 (9,2) 3 (6) b 4 (6) a - 7 (24,3)b

BRCoV 16 (30,2) 26 (16,9) 13 (26) 7 (10,6) c 1 5 (17,2)

RSVB 6 (11,3) 11 (7,1) 5 (10) 5 (7,5) d - 1 (3,8)

*: charolais; a: 2 limousine, 1 charolais, 1 garronaise; b: frisona italiana; c: 6 charolais, 1 frisona italiana; d: 4 charolais, 1 charolais x saler.

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RICERCA MICOPLASMI

Gruppi con almeno un positivo per Mycoplasma spp.: 33/49 (67,3%)

Soggetti positivi: 92/153 (60%)

N° gruppi

positivi (%)

N° soggetti

positivi (%)

N° Vacche

da latte (%)

Vitelloni

(%)

Vit. carne

bianca (%)

M. bovis 29 (59) 61 (39,8) 13 (26) 36 (54,5) 9 (31)

M. dispar 6 (12,2) 9 (5,8) 5 (10) 2 (3) 2 (6,9)

M. bovirh. 12 (24,4) 24 (15,6) 8 (16) 12 (18) 3 (10)

Sporadici isolamenti di: M. arginini (4 gruppi), M. alkalescens (3 gruppi)

4/61 positivi solo a M. bovis

3/9 positivi solo a M. dispar

— Risultati (2) —

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ESAME BATTERIOLOGICO — Risultati (3) —

Gruppi con almeno un positivo per PM, MH, HS: 45/49 (91%)

Soggetti positivi per PM, MH, HS: 93/153 (60,7%)

N° gruppi

positivi (%)

N° soggetti

positivi (%)

N° Vacche

da latte (%)

N° Vitelloni

(%)

Vit. carne

bianca (%)

Pm 30 (61,2) 68 (44,4) 23 (46) 29 (44) 13 (44,8)

Mh 15 (30,6) 29 (19) 4 (8) 18 (28) 7 (24)

Hs 10 (20) 20 (13) 4 (8) 12 (18) 2 (6,8)

Altre specie: Trueperella pyogenes (6), Bibersteinia trehalosi (3), Branhamella ovis

Polimicrobismo (9), Bacillus spp.; Enterococcus spp., E. coli, muffe

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ESAME BATTERIOLOGICO – BAL vs TAMPONE NASALE— Risultati (4) —

BAL T. nas Concordanza

PM 28 16 12

MH 13 15 9

HS 12 3 3

Concordanza assoluta per patogeni primari sugli stessi soggetti: 13/42

Polimicrobismo: 1 (BAL) vs 14 (T. nasale)

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— Risultati (4) —RISULTATI AGGREGATI (gruppi)

16

14

5

3

3

3

2

1

1

1

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

V+B+M

B+M

V

Trueperella pyog.

B

M

B+V

M+V

B. trehalosi/H. parainfluenzae

NEG

V: positivo almeno a 1 agente virale indagatoM: positivo a M. bovis e/o M. disparB: positivo a P. muotocida e/o M. haemolytica e/o H. somni

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0

2

4

6

8

10

12

14

16

P. multocida

M. haemolytica

H. somni

Penicillina

PM MH HS

MIC 50 0,032 0,063 ≤ 0,032

MIC 90 0,063 0,5 (I) ≤ 0,032

% S 93,3 80 100

cep

pi

µg/ml

— Risultati (4) —

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0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

P. multocida

M. haemolytica

H. somni

Amoxicillina

PM MH HS

MIC 50 0,125 0,125 ≤ 0,032

MIC 90 0,125 0,125 ≤ 0,032

% S 93,3 100 100

cep

pi

µg/ml

— Risultati (5) —

L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5

0

5

10

15

20

25

30

P. multocida

M. haemolytica

H. somni

Ceftiofur

PM MH HS

MIC 50 ≤ 0,016 ≤ 0,016 0,063

MIC 90 ≤ 0,016 0,032 0,063

% S 100 100 100

cep

pi

µg/ml

— Risultati (6) —

L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

≤ 0,016

0,032 0,064 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8

P. multocida

M. haemolytica

H. somni

Enrofloxacina

PM MH HS

MIC 50 ≤ 0,016 0,032 0,032

MIC 90 1 (I) 0,25 0,063

% S 93,3 100 100

cep

pi

µg/ml

— Risultati (7) —

L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

P. multocida

M. haemolytica

H. somni

Florfenicolo

PM MH HS

MIC 50 0,25 1 0,25

MIC 90 0,5 2 0,5

% S 100 100 100

cep

pi

µg/ml

— Risultati (8) —

L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 > 256

P. multocida

M. haemolytica

H. somni

Streptomicina

PM MH HS

MIC 50 16 (I) > 256 32

MIC 90 > 256 > 256 32

% S 46,6 13,3 0

cep

pi

µg/ml

— Risultati (9) —

L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5

0

2

4

6

8

10

12

≤ 0,125

0,25 0,5 1 2 4 8 16 > 32

P. multocida

M. haemolytica

H. somni

Tetraciclina

PM MH HS

MIC 50 0,25 0,5 0,5

MIC 90 8 8 2

% S 70 86,6 90

cep

pi

µg/ml

— Risultati (10) —

L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5

0

2

4

6

8

10

12

14

16

P. multocida

M. haemolytica

H. somni

Tilmicosina

PM MH HS

MIC 50 8 16 32

MIC 90 ≥ 128 ≥ 128 64

% S 60 40 0

cep

pi

µg/ml

— Risultati (11) —

L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5

0

2

4

6

8

10

12

14

P. multocida

M. haemolytica

H. somni

PM MH HS

MIC 50 0,125 ≤ 0,063 0,125

MIC 90 0,5 ≤ 0,063 0,125

% S 96,6 100 100

cep

pi

µg/ml

— Risultati (12) —Sulfametossazolo + Trimethoprim

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Discussione e conclusioni

La BRD si conferma una malattia poli fattoriale

Il BRCoV è l’agente virale più frequente nelle forme respiratorie del

bovino

BVD è prevalente nelle pezzate nere (vacca da latte e vitelli carne

bianca)

BAL vs TAMPONE: scarsa concordanza. BAL più sensibile per H.

somni (12 vs 3)

L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5

Farmaci di vecchia generazione (penicilline, FFC, SXT) si

confermano sostanzialmente ancora efficaci «in vitro» (…uso

razionale del farmaco)

Tilmicosina: in vitro scarsa efficacia sul MH e HS…altro

meccanismo?

— Discussione (2) —

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Tilmicosinaaccumulo nei neutrofili (40 X siero)

Apoptosi di neutrofili infetti da MH*

Riduzione «in vivo» di fattori pro-

infiammatori (LTB4)*

Riduzione «in vitro» della produzione di PGE da macrofagi

alv. e COX2*

+

Scarso danno tissutale e infiammazione

autolimitante

Miglioramento della sintomatologia

clinica

*effetto osservato anche con eritromicina, claritromicina, azitromicina, tulatromicinama non con antibiotici di altre famiglie