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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
IMPLEMENTACIÓN Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE ASTAXANTINA MEDIANTE LA TÉCNICA DE
HPLC
TRABAJO ESCRITO CORRESPONDIENTE A LA OPCIÓN DE TITULACIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE:
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
INGENIERA BIOTECNOLÓGICA
PRESENTA:
ILSE BUZZO GARCÍA
DIRIGIDA POR: M. EN C. LAURA SÁNCHEZ HERNÁNDEZ IBI. JORGE VIVAS ARELLANO
CIUDAD DE MÉXICO, A JUNIO DEL 2016
2
3
CARTA DE SESIÓN DE DERECHOS En la Ciudad de México el día 6 de junio del 2016, el que suscribe Ilse Buzzo
García, alumna del Programa Académico Ingeniería Biotecnológica, con número de boleta
2012620507, de la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología, manifiesta que
es autor intelectual del presente trabajo escrito bajo la Dirección del IBI. Jorge Vivas
Arellano, cede los derechos del trabajo titulado Implementación y validación de un método
analítico para la cuantificación de astaxantina mediante la técnica de HPLC, al Instituto
Politécnico Nacional para su difusión con fines académicos que desarrolla.
Los usuarios de la información no deben reproducir el contenido textual, gráficas o datos
del trabajo sin el permiso expreso del autor. Este trabajo puede ser solicitado en la
siguiente dirección de correo electrónico:
Sí el permiso se otorga, el usuario deberá citar la fuente dar el agradecimiento
correspondiente.
Ilse Buzzo García
------------------------------------------ Nombre y Firma
4
AGRADECIMIENTOS
Gracias a todas las personas que han colaborado en el presente trabajo, en
especial a mis Directores que me brindaron orientación, seguimiento y supervisión
durante todo el proyecto.
Quiero hacer extensiva mi gratitud a mis compañeros del Departamento de HPLC,
que durante mi estancia, me permitieron aprender profesionalmente y personalmente de
cada uno de ellos, pero sobre todo por la motivación y el apoyo recibido durante esa
etapa.
También quiero dar las gracias a mis profesores, que fueron parte fundamental en
mi formación como Ingeniero en Biotecnología, por todo el aprendizaje transmitido y
brindarme diversas herramientas para realizar el sueño de terminar mi carrera.
Especial reconocimiento merece la comprensión, paciencia y el animo recibidos de
mis padres y hermanos, que son mi motivación principal para querer alcanzar nuevas
metas en mi vida.
Un agradecimiento muy especial merece el interés, colaboración , motivación y la
confianza depositada en mi durante todo este proceso, a mi novio y amigos.
Finalmente Agradezco al Instituto Politécnico Nacional y a la Unidad Profesional
Interdisciplinaria de Biotecnología, porque fueron mi cuna para formarme como
profesionista, por las gratas experiencias vividas en sus alúas y por prepararme para
lograr el éxito.
A todos ellos, mis mas sincero agradecimiento.
5
Índice
Resumen 8
Introducción 9
Justificación 12
Objetivos 12
1 Colorante 13
1.1 Carotenoides 15
1.2 Astaxantina 18
2 Cromatografía 21
2.1 Tipos de cromatografía liquida 22
2.2 Instrumentación de un sistema de HPLC 24
2.2.1 Sistema de Bombas 25
2.2.2 Sistema de Inyección 27
2.2.3 Columnas 28
2.2.4 Detectores 32
2.2.5 Cromatograma 34
2.2.6 Fase móvil 38
3 Método de HPLC para la cuantificación de astaxantina 40
3.1 Alcance 40
3.2 Materiales 40
3.3 Solventes/ Reactivos 41
3.4 Condiciones de HPLC 41
3.5 Preparación de muestras 42
3.6 Preparación de estándar 44
3.7 Cálculos 45
4 Protocolo de validación 47
4.1 Objetivos 47
6
4.2 Responsabilidades 47
4.3 Alcance 48
4.4 Introducción 48
4.5 Conceptos y Definiciones 51
4.6 Método Analítico 52
4.7 Plan de Validación 52
4.7.1 Linealidad 52
4.7.2 Exactitud 53
4.7.3 Límite de Cuantificación (LC) 53
4.7.4 Límite de Detección (LD) 54
4.7.5 Precisión 54
4.7.6 Intervalo 55
4.7.7 Especificidad 56
5 Reporte de Resultados 56
5.1 Linealidad del sistema 56
5.2 Exactitud 57
5.3 Límite de Detección (LD) 58
5.4 Límite de Cuantificación (LC) 61
5.5 Precisión 61
5.6 Intervalo 63
5.7 Especificidad 64
6 Conclusión 65
Referencias 66
7
Índice de tablas
TABLA 1. COLORANTES SINTÉTICOS PERMITIDOS EN LA UNIÓN EUROPEA Y FDA ........................................ 14
TABLA 2. CARACTERÍSTICAS DE DISTINTOS TIPOS DE COLUMNA ............................................................... 30
TABLA 3. PROPIEDADES DE ALGUNOS RELLENOS COMERCIALES BASADOS EN SÍLICE…………………………………...31
TABLA 4. CARACTERÍSTICAS A EVALUAR DE ACUERDO A CADA MÉTODO ANALÍTICO, SEGÚN SU NATURALEZA .... 50
TABLA 5. RESULTADOS DE LA PRUEBA DE LINEALIDAD .......................................................................... 57
TABLA 6. RESULTADOS DE LA PRUEBA DE EXACTITUD ........................................................................... 57
TABLA 7. RESULTADOS DE LAS CURVAS DE CALIBRACIÓN. ....................................................................... 59
TABLA 8. PROMEDIOS DE RESULTADOS DE LAS CURVAS DE CALIBRACIÓN. .................................................. 59
TABLA 9. RESULTADOS DE LA PRUEBA DE REPETIVIDAD. ....................................................................... 62
TABLA 10. RESULTADOS DE LA PRUEBA DE PRECISIÓN INTERMEDIA. ........................................................ 63
TABLA 11. ÁREAS Y TIEMPOS DE RETENCIÓN PARA EVALUAR PRUEBA DE ESPECIFICIDAD. ............................. 64
Índice de figuras
FIGURA 1. ORGANIGRAMA FERMIC S.A DE C.V ................................................................................... 11
FIGURA 2. FUNCIONES BIOLÓGICAS DE CAROTENOIDES ......................................................................... 16
FIGURA 3. ESTRUCTURA BÁSICA DE LOS CAROTENOIDES ........................................................................ 17
FIGURA 6. ESTRUCTURA QUÍMICA DE LA ASTAXANTINA (3S,3’S)............................................................. 20
FIGURA 7. TIPOS DE CROMATOGRAFÍA ............................................................................................... 24
FIGURA 8. SISTEMA BÁSICO DE UN HPLC ........................................................................................... 25
FIGURA 9. SISTEMA DE BOMBA ALTERNANTE. ..................................................................................... 26
FIGURA 10. VÁLVULA DE INYECCIÓN PARA HPLC ................................................................................. 28
FIGURA 11. PARTES DE UNA COLUMNA PARA HPLC ............................................................................ 29
FIGURA 12. PARTES DE UNA COLUMNA PARA HPLC ............................................................................. 32
FIGURA 13. PARTES DE UN CROMATOGRAMA .................................................................................... 35
FIGURA 14. DEFINICIÓN DE LA RESOLUCIÓN DE UNA SEPARACIÓN ENTRE DOS PICOS CROMATOGRÁFICOS. ...... 38
FIGURA 15. ÁREA DE LA CURVA A LOS DIFERENTES NIVELES DE CONCENTRACIÓN. ...................................... 56
8
Resumen
El presente trabajo surge de la necesidad de implementar y validar un método
analítico para cuantificar astaxantina en el laboratorio de control de calidad de una
industria fármoquímica para demostrar que los procedimientos analíticos son aptos para
obtener datos confiables, satisfactorios y reproducibles. Además de cumplir con los
requerimientos de Agencias Regulatorias que garanticen la inocuidad del producto.
Para lograr imprentar el método de cuantificación de astaxantina, se realizan
pruebas descritas en un método no normalizado, utilizando un equipo de Cromatografía
de Alta Resolución (HPLC) para determinar la concentración de astaxantina presentes en
la muestra de interés, la cual se sometió a extracciones con solventes orgánicos para
recuperar el colorante y posteriormente cuantificar los miligramos de astaxantina por cada
kilogramo de muestra.
La validación del método analítico se realizó bajo los parámetros descritos en la
Guía de Validación de Procesos Analíticos propuestos por Conferencia Internacional
sobre armonización de requisitos técnicos para el registro de productos farmacéuticos
para uso humano (ICH, por sus siglas en inglés), este es un organismo que reúne a las
autoridades reguladoras de fármacos en Europa, Japón y Estados Unidos de América en
la cual se discuten los aspectos científicos y técnicos en el registro de formas
farmacéuticas. Utilizando estos parámetros dentro de la ICH se logra homologar los
requerimientos de las diferentes Agencias Regulatorias con las que la industria cuenta
para implementar y aprobar los procesos de producción.
9
Introducción Fermic S.A de C.V es una empresa privada dedicada a la manufactura de
materias primas para la elaboración de medicamentos o productos biológicos para uso
humano. Inició operaciones en la Ciudad de México en el año de 1968 con una capacidad
instalada en fermentación de 60 para la fabricación de antibióticos.
Actualmente cuenta con una capacidad de fermentación aproximada a 200 y ha
diversificado las operaciones a la fermentación de Ingredientes Activos Farmacéuticos
(API´s) y otros productos sin actividad farmacéutica.
Es una empresa aprobada por las Autoridades Mexicanas y organismos
internacionales para la manufactura de API’s, enzimas grado alimenticio y de interés
industrial. Lo cual garantiza que los productos fabricados cumplen con los requerimientos
del cliente. Algunas aprobaciones con las que cuenta Fermic S.A de C.V para su
funcionamiento son:
Comisión Federal de Protección de Riesgo Sanitario (COFEPRIS)
Secretaria de Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT)
Secretaria del Medio Ambiente del Distrito Federal (SMA-DF)
Food and Drug Administration (FDA)
European Feed Additives and Premixtures Quality System (FAMI-QS)
Misión: El compromiso fundamental de Fermic S.A de C.V. es satisfacer las
necesidades y expectativas de nuestros clientes proporcionando valor agregado a sus
productos, contribuyendo al desarrollo de la industria farmacéutica, alimentaria y otras de
interés.
Visión: Que los productos Fermic S.A de C.V. sean la primera opción en materia prima
para la industria farmacéutica, alimentaria y otras áreas, comprometiéndonos a satisfacer
sus necesidades, excediendo sus expectativas a través de productos inocuos y de calidad
constante.
10
Política de calidad
En Fermic S.A de C.V consideramos a la calidad e inocuidad como factores
esenciales para el éxito de la organización; para lograrlo cada departamento es
responsable de asegurar que los productos procesados satisfacen las expectativas de
nuestros clientes, con estricto apego a las Buenas Prácticas de Manufactura, procurando
también a través de toda la cadena productiva la seguridad de los productos considerando
el grado requerido (alimenticio, farmacéutico, y otros) siempre en busca de la mejora
continua, mediante la auto critica objetiva para identificar las oportunidades de mejora de
los procesos.
Para lograr lo anterior propuesto, sin dejar de lado el cumplimiento de las
necesidades de nuestros clientes, los requisitos legales y reglamentarios que apliquen,
se considera imprescindible cumplir con los siguientes objetivos de calidad e inocuidad de
nuestros productos:
Controlar las etapas de nuestros procesos de tal manera que asegure que los
productos obtenidos cumplan con los criterios de calidad e inocuidad para la
aceptación de nuestros clientes además de otros requisitos aplicables.
Lograr la satisfacción de nuestros consumidores finales mediante la gestión de
recursos que nos permitan cumplir con los plazos de entrega acordados; al mismo
tiempo, dar seguimiento eficaz y un resultado satisfactorio a cualquier queja
recibida.
Mantener la mejora continua de los procesos a través del análisis de la
información generada mediante la revisión periódica al sistema de gestión de
calidad e inocuidad implementado.
Garantizar que los productos fabricados, satisfacen y exceden las expectativas de
nuestros clientes mediante la implementación de programas anuales de
capacitación a todos los niveles de la organización, con el cual se asegura la
11
competencia del personal y el seguimiento de las Buenas Prácticas de
Manufactura en los procesos, obteniendo productos seguros y adecuados al uso
dirigido o intencionado.
Evaluar la mejora continua de los procesos a través de la autocrítica permitiendo
identificar áreas de oportunidad en las líneas de producción.
Organigrama
Fermic S.A de C.V está organizado por departamentos con funciones y líneas
de autoridad definidas en el siguiente organigrama:
Figura 1. Organigrama Fermic S.A de C.V (dentro del área de Control de Calidad se
desarrolló el presente trabajo)
Dirección General
Dirección de Planta
Control de Calidad
Ingeniería
Investigación y Desarrollo
Garantía de Calidad
Seguridad y Ecología
Planta Piloto
Dirección de Producción
Extracción
Almacén
Enzimas
Fermentación
Destilación Síntesis
Ventas Administración
y Finanzas
12
Justificación
La astaxantina es uno de los principales carotenoides que brinda coloración de
tonalidades que van del naranja hasta el rojo, empleadas para proveer pigmentación en
crustáceos y salmónidos que carecen de la fuente natural de color, además, puede
emplearse como componente nutricional, dado que favorece un adecuado crecimiento y
reproducción de estos animales. También, este compuesto es ampliamente usado en la
industria alimentaria y farmacéutica, debido a sus propiedades que disminuyen el estrés
oxidativo de las células y que actúan como provitamina A, además de actuar como
colorante natural.
Por otra parte, la industria fármaco-química desarrolla procesos para la síntesis de
este caroteno, con alto grado de pureza y garantizando la inocuidad del producto
mediante la validación de métodos y procesos que satisfagan los requerimientos en los
distintos mercados industriales.
Objetivos
Implementar el método analítico para cuantificación de Astaxantina en el
Laboratorio de HPLC.
Evidenciar el cumplimiento del método analítico mediante su validación.
Documentar la validación del método analítico para aprobar su reproducibilidad.
13
1 Colorante
El color puede ser definido como aquella parte de la energía radiante que el ser
humano percibe mediante la estimulación de la retina del ojo a longitudes de onda entre
380 y 780 nm. El color de un objeto no es una propiedad del mismo ni de la luz que incide
sobre este, es el efecto de un estímulo sobre la retina que el nervio óptico transmite al
cerebro, donde este último lo integra. El estímulo, a su vez, consiste en una luz reflejada o
transmitida por el objeto, a partir de una iluminación incidente (Cheftel, 1992).
De acuerdo a la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos
(FDA, por sus siglas en inglés), un colorante o pigmento es aquel compuesto obtenido por
la síntesis o artificio similar o extraído, aislado o derivado, con o sin intermediarios del
cambio final de identidad a partir de un vegetal, animal o mineral u otra fuente, y que
cuando es añadida o aplicada a alimentos, medicamentos o cosméticos, por sí misma es
capaz de impartir color (Hayward, 1992; Tafoya y García, 1993).
Por otra parte, en México la Secretaría de Salud enfoca la definición de pigmento
al origen de las sustancias pigmentantes, caracterizándolas como aquellas obtenidas de
los vegetales, animales, minerales o por síntesis química, y que es empleada para
impartir o acentuar el color, sin especificar su uso o aplicación (Diario Oficial, 1995).
En Estados Unidos, desde 1938 el uso de colorantes está controlado por la FDA,
organismo que reconoce dos categorías de colorantes: los certificados y los exentos de
certificación. La certificación consiste en realizar análisis químicos, bioquímicos,
toxicológicos y médicos a los colorantes que garanticen la salud de los consumidores. La
designación “certificados FD&C” significa que el colorante cumple con las normas
gubernamentales. Los colorantes certificados se engloban en cuatro clases químicas:
compuestos tipo azo, trifenilmetano, xantana e índigo. La lista actual de colorantes
certificados permitidos (Tabla 1) contiene productos sintéticos y naturales de uso general,
todos ellos condicionados a buenas prácticas de elaboración.
14
Tabla 1. Colorantes Sintéticos permitidos en la Unión Europea y FDA (U.S. Food and Drug
Administration, 2015)
Nombre Clave Unión
Europea
Año de Aprobación
Uso
Colorantes naturales
Aceite de zanahoria -- 1967 Alimentos en general
Azafrán E164 1966 Alimentos en general
Carbonato de calcio -- 1976 Fármacos en general
Cantaxastina E161g 1969 Alimentos en general, alimentación de ganadería avícola
Caramelo E150a-d 1963 Alimentos en general
β-Caroteno E160a 1964 Alimentos en general
-- 1964 Fármacos ingeridos en general
Carmín E120 1967 Alimentos en general
-- 1967 Fármacos ingeridos y aplicados externamente
Clorofilina de sodio de cobre E141 2002 Base seca para bebidas a base de cítricos
Guanina -- 1977 Fármacos aplicados externamente
Jugo de fruta -- 1966 Alimentos en general
-- 1995 Aditivo de color
Jugo vegetal -- 1966 Alimentos en general
-- 1995 Aditivo de color, infusión de agua
Lactato Ferroso -- 1996 Aceitunas maduras
Riboflavina E101 1967 Alimentos en general
Dióxido de Titanio -- 1966 Fármacos en general
Colorantes sintéticos
FD&C Azul No.1 E133 1969 Alimentos en general, Fármacos en general
-- 1982 Fármacos aplicados externamente
FD&C Verde No.3 -- 1982 Alimentos en general, Fármacos en general
Naranja B -- 1966 Revestimiento de embutidos
FD&C Naranja No.5 -- 1984 Fármacos aplicados externamente
FD&C Rojo No.3 E127 1969 Alimentos en general, Fármacos ingeridos
D&C Violeta No. 2 -- 1976 Fármacos aplicados externamente
FD&C Rojo No.40 E129 1971 Alimentos en general
-- 1994 Fármacos usados en área ocular
D&C Rojo No.17 -- 1976 Fármacos aplicados externamente
FD&C Amarillo No.5
E110 1969 Alimentos en general
-- 1985 Fármacos aplicados externamente
-- 1994 Fármacos usados en área ocular
15
1.1 Carotenoides
Los carotenoides son un grupo amplio de pigmentos difundidos en la naturaleza,
responsables del color amarillo, naranja y rojo de diversos productos como frutas y
verduras (jitomate, naranja, melón), raíces (zanahoria), flores (cempasúchil y tulipanes),
semillas (achiote), músculo de algunos peces (salmón y trucha), invertebrados (camarón,
langosta) y plumaje de algunos flamencos y canarios. También se han encontrado en
algas (Haematococcus sp), bacterias (Corynebacterium poinsetiae) y levaduras (Phaffia
rhodozyma), aunque en este caso, se producen cuando se encuentran sujetos a
condiciones extremas (Meyers, Bligh, 1981).
La importancia de los carotenoides va más allá de su rol como pigmentos naturales.
La principal función fisiológica de los carotenoides es su actividad como provitamina A,
función que por causas estructurales sólo puede desarrollar algunos carotenoides. Junto a
esta función, se han atribuido a estos compuestos, funciones y acciones biológicas
importantes. En la Figura 1 se muestran algunas de las principales funciones biológicas
de los carotenoides.
16
Figura 2. Funciones biológicas de carotenoides (Mosquera, Pérez, Hornero, 2005)
La implicación de los carotenoides en la inhibición o reducción del estrés oxidativo,
participando como antioxidantes sería el principal mecanismo de acción de estos
compuestos y la caracterización de ellos como anticancerígenos e inmunoactivadores. Sin
embargo, este no es este el único mecanismo de acción posible. La proliferación celular
está controlada mediante la comunicación que se establece entre las células de un mismo
tejido. En caso de proliferación anómala, el restablecimiento o la estimulación de la
comunicación es fundamental para controlarla, y este sería el sistema mediante el que los
carotenoides pueden regular la proliferación y actuar como anticancerígenos (Mosquera,
Pérez, Hornero, 2005).
Se ha encontrado que tienen mayor actividad biológica los que presentan nueve o
más dobles enlaces conjugados y grupos en los extremos de su estructura, siendo los
estudiados el β-caroteno, el licopeno, la luteína y la zeaxantina.
Carotenoides
Actividad Provitamina A
Actividad antioxidante
Disminución de riesgo de
enfermedades maculares
Actividad anticancerígena
Activador del sistema inmune
17
Es por ello que las funciones y acciones de los carotenoides están determinadas
por sus propiedades físicas y químicas, y estas a su vez están definidas por su estructura
molecular (Britton, 1995).
Debido a la modificación de la estructura básica, se han descubierto y descrito
más de 600 compuestos de este tipo. La estructura básica de los carotenoides es un
tetraterpeno de 40 carbonos, simétrico y lineal formado a partir de ocho unidades
isoprenoides de 5 carbonos (Figura 2), unidas por enlaces covalentes, de tal manera que
la disposición de las unidades de isopreno se encuentran invertidas desde el centro de la
molécula.
Figura 3. Estructura básica de los carotenoides (Rodríguez Amaya, 1999)
Las modificaciones en la estructura química pueden ser debidas a reacciones de
hidrogenación, isomerización o migración del doble enlace, entre otras, dando como
resultado una gran diversidad de estructuras (Figura 3).Esto originaría un elevado número
de isómeros. Sin embargo, en la naturaleza solamente se encuentra una pequeña
cantidad de estos isómeros. La mayoría de los carotenoides se encuentran
predominantemente en su forma trans, siendo algo más estables termodinámicamente
que los isómeros cis. Así los carotenoides se dividen en carotenos (compuestos
hidrocarbonados) y xantofilas (compuestos derivados de los carotenos que contienen uno
o más oxígenos).
18
Figura 4. Estructura básica y esquema numerado de un caroteno acíclico (licopeno), un caroteno
dicíelico ( y una xantofila (violaxantina) (Ramírez-Córdova J.J. 2000).
Las propiedades de absorción de cada carotenoide dependen del grado de
conjugación de los dobles enlaces, se necesita un mínimo de siete dobles enlaces
conjugados para la absorción de luz en la región visible del espectro. Además el
incremento del número de dobles enlaces conjugados en un carotenoide acíclico hace
que su color cambie del amarillo, vía naranja y rojo brillante, al rojo oscuro, en una
molécula de 40 átomos de carbono con la máxima desaturación posible (15 dobles
enlaces conjugados): al aumentar su número, aumenta la longitud de onda de la luz
absorbida, con lo que el compuesto adquiere una coloración más rojiza.
1.2 Astaxantina
Las xantofilas son derivados oxigenados de los carotenos. Las funciones
oxigenadas más comunes son los grupos hidroxilo (OH) en luteína y zeaxantina; ceto
(C=O) en cantaxantina, o ambos como en astaxantina . También se pueden encontrar los
grupos aldehído (CHO), carboxi (CO2H), metoxi (OMe) y epoxi (epóxidos 5,6 ó 5,8);
ejemplos de estos compuestos son la fucoxantina, la luteína y la violaxantina. Las
xantofilas son solubles en metanol, etanol y éter de petróleo. Las xantofilas son las más
abundantes en la naturaleza, aunque el β-caroteno es el más utilizado como colorante en
alimentos (Rodríguez-Amaya, 1999). En la Figura 4 se muestran algunas estructuras de
xantofilas.
19
Figura 5. Estructura de algunas xanofilas. (Johnson, An, 1991)
La astaxantina (3,3’-dihidroxi-β,β’-caroteno-4,4’-diona, figura 5.) es un pigmento
que pertenece a la familia de las xantofilas. Es uno de los principales pigmentos presentes
en el medio marino, contribuyendo a la coloración típica del caparazón de muchos
crustáceos (camarón, quisquilla, gamba, langosta, etc.), de la carne de salmónidos y de
las plumas de algunas aves (flamenco). Este compuesto de coloración rosa-anaranjada
fue aislado e identificado por primera vez a partir de langostas.
20
Figura 6. Estructura química de la astaxantina (3S,3’S) (Kühn y Sorensen, 1938)
La fórmula de este carotenoide es C40 H52 O4, con un peso molecular
aproximado de 596.85 Da. Este caroteno se distingue por tener una cadena polínica de
once dobles enlaces conjugados proporcionando un intenso color rojo-naranja
característico (Higuera-Ciapara, 2006); en forma pura se presenta como cristales de color
violeta obscuro. Su punto de fusión de 215°C, es insoluble en soluciones acuosas pero
solubles en diclorometano, cloroformo, acetona, dimetilsulfoxido y otros solventes polares.
Su utilización dentro de la industria de la acuicultura es muy importante puesto que
provee la coloración rojiza-anaranjada a los animales, al carecer de la fuente natural de
este pigmento. También, este compuesto es esencial como componente nutricional dado
que favorece un adecuado crecimiento y reproducción de los salmónidos y crustáceos.
Además de su color, la astaxantina tiene un gran valor debido a sus propiedades
antioxidantes, las cuales han demostrado ser superiores a las del β-caroteno e incluso a
las del α-tocoferol (Miki, 1991).
Hoy en día la mayor cantidad de astaxantina es producida por síntesis química y es
vendida a un precio aproximado a los US $2500/k . El alto precio y el incremento en la
demanda para este compuesto, especialmente de origen natural, en las diferentes
industrias, hace que sea de gran interés la producción astaxantina (Camacho, Gonzales,
Bernadette, 2013).
21
2 Cromatografía
La cromatografía es un método en el cual los componentes de una mezcla son
separados en una columna adsorbente en una fase móvil (Weston y Brown 1997). La
técnica fue desarrollada por el botánico ruso M.S Tswett (1872-1919) en sus
experimentos para la separación de pigmentos en plantas. En 1906, Mikhail Tswett
formalizó el uso de la cromatografía en estudios científicos, aplicándola a la separación de
los pigmentos naturales que se encuentran en las plantas (conocidos como carotenoides
y clorofilas). Además le dio ese nombre a la técnica. Tswett empacó una columna de
vidrio vertical (de unos cuantos centímetros de diámetro) con material adsorbente. Luego,
por la columna vertical vertió una solución que contenía la mezcla de pigmentos
provenientes de las hojas molidas de una planta. Pasados unos minutos, el material
empacado en la columna había adquirido una coloración diferente por segmentos. Es
decir, había logrado la separación de los pigmentos naturales de la planta. En cada
segmento de color definido había un pigmento diferente.
En 1936 se publica el primer libro dedicado a la cromatografía, dos años más tarde
aparece la primera descripción de cromatografía en capa fina sobre un vidrio. En 1939
Brown utilizó la cromatografía circular en papel, en 1941 Martin y Synge introducen la
cromatografía por partición en columna. En 1952 James y Martin desarrollaron de la
cromatografía de gases. En 1959 aparece el primer artículo relativo a cromatografía en
gel. No es hasta la década de los sesenta, cuando nace el HPLC que ha jugado un papel
fundamental en los laboratorios analíticos como de química orgánica y bioquímica. HPLC
son las iniciales de High Performance Liquid Chromatography que ha sido traducido en
formas diversas al castellano: Cromatografía Líquida de alta resolución (CLAR) y
Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (CLAE) entre las más conocidas. (Cela, Lorenzo,
2002)
La Cromatografía Liquida de Alta Eficacia se encuentra dentro de la cromatografía
de elución ya que en esta, un líquido (fase móvil) circula en intimo contacto con un sólido
u otro liquido inmiscible (fase estacionaria); al introducir una mezcla de substancias
(analitos) en la corriente de fase móvil, cada analito avanzara a lo largo del sistema con
22
una velocidad diferente. Al final del proceso los componentes separados emergen en
orden creciente de interacción con la fase estacionaria. El componente menos retardado
emerge primero, el retenido más fuertemente eluye al último. El reparto entre las fases
aprovecha las diferencias entre las propiedades físicas y/o químicas de los componentes
de la muestra, como lo es: la solubilidad (tendencia a disolverse), adsorción (tendencia a
ser retenidos en solidos finamente divididos), volatilidad (tendencia a pasar a un estado
gaseoso), tamaño, carga, reactividad química o bioquímica, etc. La mezcla a separar se
coloca en una situación experimental donde observamos la solubilidad de los
componentes en dos líquidos diferentes y los componentes del sistema empleado deben
de estar en íntimo contacto entre sí, dónde el equilibrio establecido entre estos
componentes debe ser lo más completo posible. (Valcárcel y Gómez 2003).
Las razones de que esta técnica sea ampliamente usada son: su sensibilidad, su
fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la
separación de especies no volátiles o termolábiles y sobre todo, su gran aplicabilidad a
sustancias que son de primordial interés en la industria, en muchos campos de la ciencia
y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los
carotenos, aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos,
drogas, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas y una
cierta variedad de sustancias inorgánicas.
2.1 Tipos de cromatografía liquida
Los diferentes tipos de cromatografía liquida se pueden clasificar de diferentes
maneras y una de las formas más habitual de clasificación es la realizada en base a la
naturaleza de la fase estacionaria, ay que es ésta la que impone fundamentalmente el
mecanismo de separación, de este modo se tienen cinco tipos de cromatografía:
Cromatografía de adsorción.
La fase estacionaria solida adsorbe al componente que inicialmente se encuentra
en la fase móvil (liquido- solido).
23
Cromatografía de intercambio iónico.
Este tipo de cromatografía se da cuando la fase estacionaria presenta en su
superficie aniones como o cationes como el –
, capaces de retener
selectivamente a iones de signo contrario que circulan en la fase móvil.
Cromatografía de exclusión.
La fase estacionaria, en este caso, es un material poroso de tamaño de poro
controlado, que permite la entrada de ciertas moléculas de manera selectiva, las
moléculas de mayor tamaño pasan más rápidamente que las de menor tamaño.
Cromatografía de afinidad.
Es un tipo especial de cromatografía, emplea interacciones específicas entre una
clase de moléculas de soluto y una segunda molécula que esta covalentemente unida en
la fase estacionaria.
Cromatografía de reparto.
Utiliza una fase estacionaria (líquido o gas) sobre una superficie de soporte sólido,
el soluto está en equilibrio entre el líquido estacionario y la fase móvil.
En la figura 6 se pueden observar los 5 tipos de cromatografía dentro de esta
clasificación.
24
Figura 7. Tipos de cromatografía (Harris, 2007)
2.2 Instrumentación de un sistema de HPLC
La cromatografía líquida en columna, se desarrolla en instrumentos llamados
cromatógrafos, que estos están constituidos por diferentes componentes que
proporcionan las características específicas para esta técnica. La instrumentación básica
consta de: depósitos para la fase móvil, sistema de bombeo, sistema de inyección de
muestra, columna cromatográfica, detector y sistema de adquisición de datos. Para poder
controlar la temperatura y mantener condiciones específicas de la columna, esta suele
25
estar en un horno termostatizado. El esquematización de estos instrumentos se muestra
en la Figura 8.
Figura 8. Sistema básico de un HPLC (Hernández, Claudio, 2002)
El depósito de la fase móvil contiene los elyuntes a emplear, la bomba que mueve
el eluyente y la muestra a través del sistema, el inyector de la muestra toma un volumen
determinado para analizar y la columna provee el soluto de separación, al final un
detector permite visualizar la separación de los componentes y pasa al sistema de
adquisición de tatos que proporciona una representación gráfica de la señal del detector
en función del tiempo, donde cada una de las bandas del soluto separadas toma un lugar
a un pico en esta representación llamada cromatograma.
2.2.1 Sistema de Bombas
Los equipos de HPLC utilizan al menos una bomba para forzar el paso de la fase
móvil a través de la columna cuyo relleno, muy compacto, es responsable de una
sobrepresión muy importante a nivel del inyector, esta presión puede alcanzar 20,000 KPa
(200 bares) según el caudal de la fase móvil, su viscosidad y el tamaño de partículas en la
fase móvil (Skoog, Trujillo, 2005). Se utilizan bombas de alta presión diseñadas para
mantener un caudal sin pulsos y estable, incluso cuando la composición de la fase móvil
varia, estas bombas pueden ser de un solo pistón o bien llevar dos pistones que
26
funcionan en oposición y situados en serie para evitar las interrupciones de caudal que
resultan de la fase de relleno. Para regular el caudal, el desplazamiento de los pistones se
controla por un motor de pasos asociado a una leva de forma particular.
Figura 9. Sistema de bomba alternante (un pistón).
Dependiendo de su diseño, los cromatógrafos pueden incluir una o varias bombas,
situada en la entrada o en la salida, estas están asociadas a una cámara de mezcla. Las
bombas permiten liberar un eluyente de composición fija (modo isocrático), o de
composición variable para hacer un gradiente de elución. Para un sistema por gradiente
se debe de tener en cuenta que la composición de la mezcla no se modifique por acción
de la presión. (Figura 9).
Dependiendo de su diseño, los cromatógrafos pueden incluir una o varias bombas,
situada en la entrada o en la salida, estas están asociadas a una cámara de mezcla. Las
bombas permiten liberar un eluyente de composición fija (modo isocrático), o de
composición variable para hacer un gradiente de elución. Para un sistema por gradiente
se debe de tener en cuenta que la composición de la mezcla no se modifique por acción
de la presión.
27
2.2.2 Sistema de Inyección
La inyección de un volumen preciso de muestra debe hacerse a la entrada de la
columna en un corto periodo de tiempo para perturbar lo menos posible el régimen de
circulación establecido por columna y el detector, para ello se utiliza una válvula de alta
presión de varias vías manual o automatizada. Esta válvula funciona en dos tiempos:
Posición de carga
La bomba y la columna están conectadas, la muestra es introducida a presión
atmosférica, con la ayuda de una jeringa en un depósito tubular denominado bucle, este
puede ser de diferentes volúmenes, puede ser exterior o puede estar integrado en el
bloque de la válvula
Posición de inyección
La muestra es introducida en el flujo de la fase móvil por una rotación de la
palanca de 60°que permite invertir el sentido de circulación del bucle, el volumen
inyectado debe de ser unas 5 a 10 veces mayor que la del bucle.
Estas posiciones se representan en la Figura 10, se consideran presiones que
puedan sobrepasar los 30,000KPa en el caso de tener inyectores automáticos.
28
Figura 10. Válvula de inyección para HPLC (Harris, 2007)
2.2.3 Columnas
La columna es la parte esencial del cromatógrafo, ya que en ella a través de
diferentes mecanismos (absorción, partición, intercambio iónico exclusión, etc.), tiene
lugar la separación o discriminación entre analitos.
29
Figura 11. Partes de una columna para HPLC (Rodríguez Amaya, 1999)
Las partes de una columna de cromatografía liquida se esquematizan en la Figura
11, las columnas más utilizadas en HPLC son las de relleno; estas columnas consisten en
un tubo, generalmente de acero inoxidable, relleno de una fase estacionaria adecuada a
tipo de separación que se pretende realizar. El diámetro interior pueda variar entre 20 y 60
nm dependiendo de su utilización y su longitud oscila entre 5 y 30 cm (García de Marina,
de Castillo, 1988). Se puede realizar una clasificación de tipos de columna de acuerdo a
su capacidad de carga (microgramos de muestra) y diámetro interno (mm) que se pueden
visualizar en la Tabla 2.
30
Tabla 2. Características de distintos tipos de columna (Hernández, 2005)
Las características de la columna que influyen sobre su capacidad de separación
son: diámetro interno, longitud, relleno y tamaño de partícula de relleno.
Diámetro interno.
El diámetro interno es un aspecto crítico que determina la cantidad de muestra que
se puede cargar en la columna y también influye en el flujo y la sensibilidad. Cuanto
mayor es el diámetro interno, mayor es la capacidad de carga (microgramos de muestra)
y el flujo a emplear, pero también aumenta la dilución del pico disminuyendo la
sensibilidad. Las columnas analíticas de más amplio uso suelen tener 4.6 mm de
diámetro.
Longitud.
La longitud afecta tanto la eficacia como a la velocidad de la separación. El tiempo
de análisis aumenta con la longitud de la columna, pero también puede mejorar la
eficacia. Estas relaciones se adecuaran al tipo de análisis; el rango de longitud varía
desde los 20 a 300 nm.
31
Relleno.
Todas las separaciones cromatográficas tienen lugar sobre la fase estacionaria.
Las fases están constituidas generalmente por partículas de materiales rígidos o
semirrígidos, y en la gran mayoría de los rellenos se suelen utilizar sílice, aunque también
es posible encontrar rellenos basado en polímeros sintéticos. La calidad de un gel de
sílice para cromatografía depende de varios parámetros como por ejemplo la estructura
interna, el tamaño de los granos, la porosidad abierta (dimensión y distribución de los
poros), la superficie efectiva, la resistencia a la compresión y la polaridad. Sin embargo
los grandes avances técnicos en la preparación de sílices de estructura conocida, con
modificaciones químicas en la superficie, con poros y formas controladas y rangos
amplios de pH, han permitido que este material se al relleno as utilizado en columnas de
cromatografía de líquidos, desplazando así a los rellenos de polímeros sintéticos. Algunas
propiedades de sílice más comerciales, se reportan en la Tabla 2.
Tabla 3. Propiedades de algunos rellenos comerciales basados en sílice. (Valcárcel, Gómez 2003)
Tamaño de partícula de relleno.
El tamaño de partícula está directamente relacionado con la eficacia de separación
ya que determina el número de platos teóricos. Las columnas con partículas de 3.5 micras
son las más utilizadas en los equipos de HPLC convencionales. Las partículas más
pequeñas ofrecen mayor superficie y mejor separación, consiguiendo una mejor
resolución.
32
Los mayores avances se han realizado el reducir los tamaños de partícula de
relleno (relleno pelicular) a unos niveles en los que se consiguen grandes incrementos en
la eficacia de la columna sin que se generen presiones excesivamente elevadas que
hagan inviable el análisis en los equipos. (Figura 12)
Figura 12. Partes de una columna para HPLC (Gómez, 2010)
2.2.4 Detectores
El sistema de detección se trata de un módulo del cromatógrafo de líquidos situado
a la salida de la columna, que proporciona de forma continua información acerca de la
composición del flujo que circula a través de él. Generalmente origina una señal eléctrica
continua, que debidamente amplificada y registrada, constituye el cromatograma, del que
se extrae información cualitativa y cuantitativa de la muestra inyectada. Un detector debe
de reunir ciertas características para su empleo: alta sensibilidad, lo que implica un bajo
ruido de fondo, la respuesta universal a todos los solutos, amplio rango lineal de
concentración y debe de operar continuamente durante largo tiempo ser asequible a la
automatización (García de Marina, 2008). Los modos de detección más utilizados se
basan en las propiedades ópticas de los compuestos (absorción, fluorescencia e índice de
refracción).
33
Detectores de absorbancia ultravioleta con filtros.
Los detectores de absorción UV más simples son los fotómetros de filtros con una
lámpara de mercurio como fuente. Lo más común en estos casos es aislar la línea intensa
a 254 nm por medio de filtros; en algunos equipos también se pueden utilizar las líneas a
250, 313, 334 y 365 nm empleando otros filtros.
Detectores de absorbancia ultravioleta con monocromadores.
La mayoría de los fabricantes de instrumentos de HPLC ofrecen detectores que
consisten en un espectrofotómetro de barrido con óptica de red. Algunos se limitan a la
radiación ultravioleta; mientras que otros abarcan la radiación ultravioleta y la visible. Se
pueden elegir varios modos operacionales.
Los detectores espectrofotométricos de ultravioleta más potentes son los instrumentos de
series de diodos. Algunos fabricantes ofrecen este tipo de instrumentos, que permiten
recoger los datos de un espectro completo en aproximadamente un segundo. De esta
forma, los datos espectrales para cada pico cromatográfico se pueden recoger y
almacenar a medida que van saliendo de la columna.
Detectores de fluorescencia.
Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseño a los
fluorímetros y espectrofluorímetros. En la mayoría de ellos, la fluorescencia se detecta por
medio de un detector fotoeléctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de
excitación. Los detectores más sencillos utilizan una fuente de excitación de mercurio, y
uno o más filtros para aislar la radiación fluorescente. Los futuros desarrollos en los
detectores de fluorescencia probablemente se basarán en el uso de fuentes de láser
sintonizables, las cuales permiten una mayor sensibilidad y selectividad. Una ventaja
inherente a los métodos de fluorescencia es su alta sensibilidad, que resulta ser más de
un orden de magnitud mayor que la de los sistemas de absorbancia. En cromatografía de
líquidos se ha aprovechado esta ventaja para la separación y determinación de los
componentes fluorescentes de las muestras.
34
Detectores de índice de refracción.
Estos detectores miden la diferencia de índice de refracción, entre el disolvente
que en su camino hacia la columna pasa a través de una mitad de la cubeta y el efluente
de la columna que pasa por la otra mitad. Los dos compartimentos están separados por
una placa de vidrio montada a un ángulo de modo que si las dos disoluciones difieren en
el índice de refracción se produce una desviación de un haz de luz incidente.
Los detectores de índice de refracción tienen la ventaja de que responden a casi
todos los solutos. Es decir, son detectores universales análogos a los detectores de llama
en cromatografía de gases. Además, son fiables y no dependen del caudal. Sin embargo,
son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una
temperatura constante en unas pocas milésimas de grado centígrado. Por otra parte, no
son tan sensibles como la mayoría de los otros detectores, y por lo general no se pueden
utilizar en la elución con gradiente.
2.2.5 Cromatograma
Un cromatograma representa la respuesta o señal del sistema de detección que se
traduce visualmente en una pantalla o en un papel, la evolución de un parámetro que
depende de la concentración instantánea del soluto a la salida de la columna, en función
del tiempo, volumen de eluyente o distancia en el lecho cromatográfico.
El cromatograma contiene la información analítica relativa a la muestra (número
de picos, detección cualitativa o cuantitativa de uno o varios componentes) o del
funcionamiento del sistema cromatográfico. Los aspectos termodinámicos y cinéticos de
la separación cromatográfica quedan reflejados en el cromatograma, es decir, en la
situación y forma del pico correspondiente a cada soluto analito. La muestra se introduce
por la parte superior de la columna en forma de una banda estrecha, a medida que se
desplaza por la columna, los solutos comienzan a separarse y sus bandas individuales se
ensanchan, desarrollando un perfil gaussiano (Figura 13).
35
Figura 13. Partes de un cromatograma (Hernández, Claudio, 2002)
La situación de un pico esta especificada por la retención que se define como el
retraso que sufre un analito en la columna cromatográfica en relación con una sustancia
inerte, no retenida, que está sometida a las mismas condiciones de la muestra introducida
en el sistema. Se denomina tiempo muerto (tm) al intervalo de tiempo que trascurre desde
que el trazador es insertado al principio del lecho cromatográfico hasta que sale del
mismo, este tiempo se puede calcular si se conoce la velocidad media de la fase móvil (U)
y la longitud de la columna (L), entonces tm=-L/U.
Los picos cromatográficos se caracterizan por el tiempo de retención (tR), que es
el tiempo que transcurre desde la inyección de la muestra hasta el punto máximo del pico,
y por la anchura de la base del pico (W), que depende de la intersección con la base de
las líneas tangentes trazadas a través de los puntos de inflexión de cada pico. Tiempo de
retención ajustado (t’ R) mide el tiempo que el componente permanece en fase
estacionaria, se calcula de la siguiente forma:
36
Con base a los parámetros de retención descritos, se define el factor de capacidad
como k’ , que define la velocidad de migración de un analito en una columna determinada.
Eficacia
El modelo del plato teórico supone que la columna cromatográfica contiene gran
número de capas separadas, llamadas platos teóricos. Los equilibrios para la separación
de la muestra entre la fase estacionaria y la fase móvil tienen lugar en estos supuestos
platos. El analito se mueve en la columna por transferencia de fase móvil equilibrada
desde un plato hasta otro. Los platos son un concepto imaginario que ayuda a entender
cómo funcionan los procesos de separación en la columna. El modelo proporciona una
medida de la eficiencia de la columna, que se puede expresar como el número de platos
teóricos de una columna (N), cuántos más platos la columna será más eficiente. O como
lo que mide cada plato (HEPT, altura equivalente del plato teórico), cuánto más pequeño
mayor eficiencia. Siendo (L) la longitud de la columna, estos conceptos quedan
relacionados de la siguiente forma:
El número de platos teóricos que posee una columna real se puede calcular a
través del pico
cromatográfico de un compuesto dado después de su elución. El compuesto es,
generalmente, un compuesto de prueba con buena separación que producirá un buen
pico cromatográfico. (N) se definido como:
37
Selectividad y resolución
Se define como selectividad (α) a la capacidad de separación de dos analitos en la
columna, considerando el tiempo de retención (o volumen de retención) de los máximos
de los picos para cada analito.
Normalmente, se puede controlar la selectividad variando las características del
sistema, tales como la composición de la fase móvil (pH, fuerza iónica, solvente orgánico
modificador), la forma de elución (constante o en gradiente) o el tipo de columna.
La resolución (Rs) es el parámetro que indica la calidad de una separación, como
una medida numérica de la separación entre dos compuestos, y se define como:
Donde (Vi) es el volumen de retención de cada compuesto y (Wi) la anchura de
cada pico (Figura 14). Hay tres parámetros fundamentales que influyen en la resolución
de una separación cromatográfica: la eficiencia de la columna (expresada en número de
platos teóricos), la selectividad y el factor de retención:
(√
) (
)(
)
En general, es recomendable intentar maximizar estos tres parámetros, existiendo
varias estrategias para ello:
Aumentar el número de platos teóricos reduciendo el tamaño de las partículas de
la fase estacionaria. Los picos se estrecharán (menor ancho de banda) y los
tiempos de retención no variarán pero se resolverán.
Aumentar el factor de retención modificando la composición de la fase móvil o la
superficie de interacción de la fase estacionaria o la temperatura de elución. Los
tiempos de retención cambiarán y los picos serán también más anchos.
38
Aumentar la selectividad modificando la fase móvil o la fase estacionaria,
modificando la temperatura de la columna, o añadiendo sustancias químicas que
se unen con alguno de los solutos en la fase estacionaria. La selectividad puede
ser manipulada de modo muy similar al factor de retención porque depende de él,
la diferencia es que mientras éste contempla las características termodinámicas de
un pico la selectividad lo hace de los dos a separar.
Figura 14. Definición de la resolución de una separación entre dos picos cromatográficos.
(Hernández, 2005)
2.2.6 Fase móvil
La Fase móvil, es la que se mueve en una dirección definida que para esta
técnica de HPLC es un líquido. La muestra que está siendo analizada (formada de
analito/s y el disolvente) se inyecta en la fase móvil que se mueve a través de la columna.
La fase móvil puede ser un disolvente no-polar como el hexano (fase normal) o bien algún
disolvente polar (fase reversa).
Fase normal, se basa en la hidrofilia y la lipofilia usando una fase estacionaria
polar y una fase móvil menos polar. Así, los compuestos hidrofóbicos eluyen más
rápidamente que los hidrofílicos. La fase está constituida por una matriz de sílica a la que
se unen grupos silanol, amino y nitrilo que le confieren polaridad relativa respecto a la
fase móvil (Hernández, 2005).
39
Fase reversa, también se basa en la hidrofilia y la lipofilia. La fase estacionaria
consiste en una matriz de sílica empacada que lleva unida covalentemente una cadena
alquílica de n-carbonos (por ejemplo, C-8 significa que se incorpora una cadena octil y C-
18 una octadecil). La más hidrofóbica es, en este caso, la fase estacionaria, eluyendo los
compuestos hidrofílicos más rápidamente que los hidrofóbicos, que interaccionan con la
fase estacionaria. También hay empaquetamientos poliméricos alternativos a la sílice que
ofrecen similares características con mayor resistencia dinámica y más amplio rango de
estabilidad de pH.
En función de la composición de la fase móvil inyectada a la columna, la elución de
moléculas puede ser de dos tipos: isocrática y en gradiente. También existen casos en los
que se cambia totalmente la fase móvil en el transcurso de la cromatografía y se conoce
como elución politíptica (Hernández, Claudio, 2002)
Para la elución isocrática, los compuestos eluyen usando una fase móvil de
composición constante durante toda la cromatografía. Todos los compuestos acaban
migrando a través de la columna hasta el final. Sin embargo, cada uno migra con una
velocidad diferente, resultando en una relación de elución más rápida o más lenta. Este
tipo de elución es bastante simple y barato, pero la resolución de algunos compuestos es
cuestionable y el eluido puede no ser obtenido en un plazo de tiempo adecuado.
A diferencia de elución por gradiente, los diferentes compuestos son eluidos
modificando gradualmente la composición de la fase móvil durante el transcurso de la
cromatografía (aumentando la fuerza iónica, modificando la polaridad, etc.). El resultado
sobre la elución es un acortamiento de los tiempos de retención, el factor de retención
disminuye conforme aumenta la variación de flujo del gradiente y el compuesto eluye.
Este gradiente puede llevarse a cabo de forma lineal o escalonada o linealmente
escalonada.
40
3 Método de HPLC para la cuantificación de astaxantina
3.1 Alcance Este método es usado para la determinación de Astaxantina total usando solventes
orgánicos para la extracción, seguido de separaciones en cloruro de metileno. (Bjerkeng,
Folling, et al; 1997)
3.2 Materiales
Equipo de HPLC. Marca: Shimadzu CLASS-VP ,Version 7.4 SP3
Detector UV-VIS: SPD-10AV
Degasificador: DGU-14A
Auto inyector: SIL-10A
Bomba: LC-10AT
Horno de columna: CTO-10AS
Controlador del sistema: SCL-10A
Software de integración: CLASS-VP
Pipetas volumétricas de vidrio de 1, 2 y 5 mL (resistentes a diclorometano, hexano
y acetona)
Mezclador vortex. Marca Scientific Industries, modelo:G-560
Sonicador con tina de agua. Marca: Branson, modelo: 8510
Sonicador punta de lápiz. Marca: B. Braun Melsungen, modelo: Braun-sonic 1510
Jeringas desechables de polietileno o polipropileno de 5 mL
Filtro para jeringas de 0.45 micras
Espectrofotómetro (UV). Marca: Thermo Scientific,modelo: Genesy 6.
Matraces volumétricos con tapones de 25 mL
Balanza analítica. Marca: Mettler Toledo, modelo: AB135-S
Centrifuga. Marca: Vulcon Technologies, modelo:clinaseal.
Microcentrifuga de 14,000 rpm. Marca: eppendorf , modelo: 5418
Micropipetas de 1000 µL (P1000) y 200 µL (P200). Marca : Fisherbrand, modelo:
Baño maría a 40 °C
41
Secador a vacío. Marca: Labconco, modelo: rapidvap.
Bomba de vacío. Marca:Welch, modelo:dry vaccum - 2023 .
Tubos de centrifuga de 15 mL y 50 mL con tapas
3.3 Solventes/ Reactivos
Solvente orgánico 1
Solvente organico 2
Solvente organico 3
Solvente organico 4
Sulfato de sodio anhídrido
Marca: J.T Baker
Lote: L38C18
Pureza: 99.0 %
Estándar Primario, Astaxantina
Marca: Sigma Aldrich
Lote: A93335
Pureza: 98.0 %
3.4 Condiciones de HPLC
Fase móvil: Solvente 1/Solvente 2 85.5:14.5 (mezclar y sonicar 5 minutos antes de su
utilización)
Tiempo de corrida: 16 minutos
Columna, marca: Phenomenex Luna-silica 3 micras, 4.6 mm x150 mm. Modificándola
mediante una solución de ácido fosfórico (1 g/150 mL) a través de la columna por 1 hora a
1mL/min. Este tratamiento se necesita hacer al utilizar la columna por primera vez.
Temperatura: 25 °C
Flujo: 1.2 mL/min
42
Volumen de inyección: 50 µL
Longitud de onda del detector: 475 nm.
3.5 Preparación de muestras
1. Muestra en polvo: Pesar la cantidad indicada de la muestra, dentro de un tubo
tarado de centrifuga de 50 mL y registrar peso de la muestra para 5 decimales.
Muestra de clarificado: pesar 1 mL de muestra dentro de matraz tarado de 25 mL y
proceder al paso número 5.
Muestra de fermentado: pesar 250 µL de muestra dentro de matraz tarado de 25
mL y proceder sal paso número 5.
2. Para la muestra en polvo: agregar 25 mL de agua al tubo. Registrar el peso de la
mezcla para 5 decimales.
3. Utilizar el equipo de sonicación, para mezclar la suspensión, hasta que no hay
grumos dentro de la misma. Utilizar el Sonicador por lapsos de 30 segundos por 4
veces como mínimo cada tubo.
4. Usar micropipeta P1000 y tomar 1 mL de la suspensión mencionada anteriormente
en matraces tarados de 25 mL. Tapar los matraces. Registrar peso de la muestra
para 5 decimales.
5. Adicionar solvente 4 previamente calentando en baño maría a temperatura de 40
°C, en cada matraz hasta que el líquido alcance el cuello del matraz.
6. Tapar los matraces y mezclar vigorosamente (usando vortex) por 2 minutos cada
matraz.
7. Dejar enfriar cada muestra hasta temperatura ambiente (25 º C aproximadamente).
8. Agregar solvente 4 a temperatura ambiente hasta llegar a la marca del aforo de
cada matraz y mezclar perfectamente, invirtiendo de posición (verticalmente) cada
matraz por al menos 5 veces.
43
NOTA: La eficiencia de la extracción puede ser verificada en este paso:
a) Centrifugar 1.5 mL del extracto por un minuto a 14,000 rpm, en un tubo de
microcentrigufa.
b) Decantar el sobrenadante del tubo y adicionar agua hasta la marca de 1.5
mL del tubo.
c) Repetir la centrifugación bajo las mismas condiciones antes mencionadas y
volver a decantar el sobrenadante al finalizar la centrifugación.
d) El pellet debe ser tan colorido sin ningún indicio de color amarillo o naranja
en él. Si no es así, mezclar en vortex el matraz con el extracto, por 3
minutos y repetir la prueba centrifugando 1.5 mL del mismo. No proceder al
siguiente paso hasta que la extracción es comprobada mediante esta
prueba.
9. Usando un pipeta volumétrica de 1 mL transferir 1 mL del extracto en los
matraces, a un tubo de centrifuga de 15 mL. El Solvente 4 con el extracto
remanente puede ser almacenado en frio en dado caso que la prueba necesite ser
repetida.
10. Enjuagar la pipeta con 4 mL de agua (en el tubo de 15 mL) para eliminar la
totalidad de la muestra en la pipeta.
11. Adicionar 1 mL de la solución de sulfato de sodio.
12. Usando una pipeta volumétrica de 5 mL, agregar cloruro de metileno.
13. Agregar agua hasta la marca de 13 mL del tubo.
14. Mezclar en vortex vigorosamente por 2 minutos hasta que las pariciones del
pigmento estén en toda la muestra, evitando la formación de dos fases.
15. Centrifugar por 1 minuto para separar las fases de la mezcla.
16. Remover el agua a la marca de 7 mL del tubo. Ser cuidadosos de no remover el
pigmento contenido en la capa baja de cloruro de metileno.
17. Adicionar agua hasta la marca de 13 mL. Mezclar en vortex por 30 segundos.
18. Repetir la secuencia de pasos del 15 al 17, tres veces posteriormente para tener
un total de 4 lavados. Los 4 lavados son necesarios para remover completamente
el Solvente 4 de la muestra.
19. Remover toda la capa superior de agua utilizando una micropipeta P1000. Ser
cuidadosos de no dejar residuos de agua en la fase inferior de cloruro de metileno.
44
20. Usando una pipeta volumétrica de 2 mL, transferir fase de diclorometano a un
tubo de centrifuga de 15 mL.
21. Secar la muestra utilizando un secador de vacío (durante 15 minutos,
aproximadamente), hasta que la muestra este completamente seca.
22. Resuspender la muestra seca con 2 mL de fase móvil (Hexano: Acetona)
23. Tapar los tubos, mezclar en vortex brevemente (30 segundos cada uno) y meter
en sonicador con tina de agua, por 1 minuto.
24. Filtrar la muestra resuspendida a través de filtro para jeringa (0.45 µm) dentro de
un vial HPLC.
3.6 Preparación de estándar
1. En un tubo de centrifuga de 15 mL, transferir 1 mL de cloruro de metileno usando
una pipeta volumétrica de 1 mL.
2. Tomar una cantidad mínima de estándar primario de astaxantina cristalina, con
uso de una espátula, aproximadamente 0.5 mg. Tapar el tubo y usar vortex por 15
segundos, sonicar por 5 minutos en sonicador con tina de agua. Esta es la
solución estándar.
3. Para 6 tubos de centrifuga de 15 mL, pipetear 150, 125, 100, 75, 50 y 25 µL de
solución estándar respectivamente y secar cada muestra con vacío.
4. Agregar 5 mL de Hexano/Acetona (fase móvil) a cada estándar seco y tapar
inmediatamente. Llevar a sonicador con tina de agua y sonicar. ESTE PASO ES
CRÍTICO Y PUEDE TOMAR DE 10-15 MINUTOS. Enfriar el agua del sonicador
para evitar calentar la solución.
5. Usando jeringas de plástico de 5 mL, filtrar 2 mL de cada solución a través de un
filtro de 0.45 µm dentro de viales HPLC. Con la solución remanente leer la
absorbancia de cada una a 475 nm en el espectrofotómetro iniciando con un
blanco conteniendo fase móvil. Registrar las absorbancias para el cálculo de la
curva estándar.
3.7 Cálculos
Para cada muestra, determinar el área total corregida (atc) para Astaxantina usando la
siguiente formula:
Estos cálculos toman en cuenta que los coeficientes de extinción para di-cis, 9-cis, 13-
cis y 15-cis Astaxantina son 1900, 2100, 1750 y 1350 respectivamente a 475 nm.
Para el estandar, determinar el área del pico para el pico de trans-astaxantina y el
porcentaje del área de la trans-astaxantina para cada dilución del estandar.
Determinar concentración (ppm) de los 6 puntos de estandar usando la siguiente
formula:
Dónde:
El % área es un decimal, por ejemplo si él % área de trans-astaxantina es 70%, usar
0.70
Y dónde:
(
) (
) (
)
(
)
Graficar el área respecto a la concentración (ppm) para cada uno de los puntos y
establecer una curva estándar. Aplicar el ajuste regresión lineal para determinar una
línea recta que asemeje el comportamiento de los 6 puntos.
Con los valores de la ecuación del ajuste de la regresión lineal, determinar la
concentración de la muestra con la siguiente formula:
Dónde:
Dónde:
Factor de concentración son 4.375 mL; es el volumen final que se obtiene de
diclorometano después de los lavados.
25= es el volumen utilizado de DMSO para la extracción
2/2= son 2 mL de diclorometano evaporado y 2 mL de fase móvil en la que se
resuspende la muestra.
46
Para la muestra en polvo la concentración es:
( )
Dónde:
(
)*
Para la muestra de fermentación y clarificado, la concentración se calcula como:
Dónde:
Peso de muestra son los 0.250 mL y 1 mL, respectivamente para la muestra de
fermentación y clarificado.
47
4 Protocolo de validación
4.1 Objetivos
o Demostrar que los análisis realizados en el laboratorio con el método analítico
para la Cuantificación de Astaxantina, empleando la técnica de HPLC, son
exactos, precisos y confiables.
o Documentar el cumplimiento de la regulación correspondiente, para evidenciar
que el método analítico es confiable y robusto.
4.2 Responsabilidades
Responsable Sanitario:
Revisar y aprobar el presente protocolo.
Dar su aprobación al reporte final y conclusiones de la validación del
método analítico.
Supervisar y dar seguimiento el desarrollo de la validación y los
resultados obtenidos.
Aprobar la validez técnica del protocolo.
Supervisor de Laboratorio:
Proporcionar la dirección para el desarrollo del presente protocolo para
la validación del método analítico y su implementación en el laboratorio.
Supervisar que la validación se desarrolle conforme a lo establecido en
el presente protocolo.
Proporcionar los consumibles y el soporte técnico necesario para llevar
a cabo la validación del método analítico.
Verificar los datos obtenidos y dar la dirección para generar el reporte
final.
Asegurar el registro de todos los hallazgos encontrados durante la
validación.
48
Químico analista:
No afectar o violar los derechos de autorales, secretos industriales e
información confidencial de acuerdo con el artículo 27 de la Ley
Federal del derecho de Autor.
Apegarse a las políticas, procedimientos y buenas prácticas de
Laboratorio de HPLC.
Participar en el desarrollo del protocolo de validación del método
analítico y su implementación en el laboratorio.
Llevar a cabo la validación conforme a lo establecido en el presente
protocolo.
Solicitar el soporte técnico necesario para llevar a cabo la validación del
método analítico.
Utilizar de acuerdo a procedimiento los instrumentos de laboratorio.
Antes de utilizar cualquier instrumento, verificar que este cumpla con
mantenimiento, calificación y los controles necesarios para ser utilizado.
Documentar en tiempo real todos los datos obtenidos.
Redactar el reporte final.
Registrar todos los hallazgos encontrados durante la validación.
Informar al Jefe de Laboratorio y documentar cualquier error de
laboratorio o desviación encontrada.
4.3 Alcance
El presente protocolo aplica a las mediciones de concentración de Antoxantina
fabricada en Fermic S.A de C. V
4.4 Introducción
La astaxantina es uno caroteno que proporciona coloración rojiza-anaranjada y
su utilización dentro de la industria de la acuicultura es muy importante puesto que
provee esta coloración a los animales, al carecer de la fuente natural de este
pigmento. También, este compuesto es esencial como componente nutricional dado
que favorece un adecuado crecimiento y reproducción de los salmónidos y crustáceos.
Además de su color, la astaxantina tiene un gran valor debido a sus propiedades
49
antioxidantes, las cuales han demostrado ser superiores a las del β-caroteno e incluso
a las del α-tocoferol (Higuera-Ciapara, 2006). Es por ello que la industria alimenticia y
de acuicultura está interesada en la implementación de este pigmento para dar valor
agregado a los productos destinados a consumo humano. Esto implica un mercado
muy exigente para la industria fármaco-química siendo productor de colorantes, tales
como astaxanina. La industria debe garantizar el cumplimiento de los requerimientos
de calidad, mediante un método de cuantificación validado que brinde resultados
satisfactorios, confiables y reproducibles en su implementación.
Los métodos analíticos se pueden clasificar de acuerdo a su naturaleza
cuantitativa o cualitativa en (ICH Q2A: Steering Comity; Text on Validation of Analytical
Procedures, 1994):
I. Pruebas de identidad (cualitativa)
II. Determinación de impurezas (cuantitativa) o prueba límite (semicuantitativa)
III. Contenido o potencia (cuantitativa)
Las pruebas cualitativas tienen como objetivo identificar la presencia o
propiedades del analito en la muestra, mientras que las cuantitativas son para
determinar con precisión y exactitud el contenido o potencia del analito o de las
impurezas.
Las características a evaluar para cada método analítico pueden variar de
acuerdo a su naturaleza, la siguiente tabla muestra las pruebas normalmente
evaluadas en cada caso.
50
Tabla 4. Características a evaluar de acuerdo a cada método analítico, según su naturaleza.
(ICH Q2B: Validation of analytical procedures methodology,1995.)
Tipo de procedimiento
analítico
Características
Identificación
Pruebas de impurezas
Cuantitat. Limite
Ensayo
- Disolución (medición
única)
- Contenido / potencia
Exactitud
Precisión
-Repetitividad
-Precisión
intermedia
Especificidad (2)
Límite de detección
Límite de cuantificación
Linealidad
Intervalo
-
-
-
+
-
-
-
-
+ -
+ -
+ -
+(1) +
+ +
-(3) -
+ -
+ -
+
+
+(1)
+
-
-
+
+
- Significa que esta característica no es normalmente evaluada
+ Significa que esta característica es normalmente evaluada
(1) En los casos en que se ha realizado la reproducibilidad, no es necesaria la precisión
intermedia
(2) Falta de especificidad de un procedimiento analítico podría ser compensada por otro
procedimiento analítico de apoyo
(3) Puede ser necesario en algunos casos
El método de cuantificación de Astaxantina es considerado en la clasificación
de Ensayo. Ya que dentro de esta clasificación, los procedimientos de ensayo están
destinados a medir el analito presente en una muestra dada. El ensayo representa una
medida cuantitativa del componente principal (s) en la sustancia farmacológica y las
mismas características de validación también pueden aplicarse a los ensayos
asociados con otros procedimientos analíticos (por ejemplo, disolución).
51
Sin embargo, se determina que también las características de Límite de
detección y Límite de cuantificación serán realizadas para fines específicos dentro de
este método.
4.5 Conceptos y Definiciones
Analito.-Componente específico de una muestra a medir
Exactitud.-Concordancia entre un valor obtenido empleando el método y el valor de
referencia
Intervalo.-Concentraciones incluidas entre la concentración superior e inferior del
Analito (incluyendo éstas), para las cuales se ha demostrado que el método es
preciso, exacto y lineal.
Límite de cuantificación.-Concentración mínima del analito que se puede determinar
con precisión y exactitud aceptables.
Límite de detección.-Concentración mínima del analito que puede ser detectada, pero
no necesariamente cuantificada.
Linealidad.-Habilidad para asegurar que los resultados obtenidos directamente o por
una transformación matemática, son proporcionales a la concentración del analito.
Muestra.-Porción del material a evaluar.
Muestra analítica.-Porción del material a evaluar de acuerdo al método analítico.
Parámetros de desempeño.-Parámetro específico a estudiar en un protocolo de
validación
Precisión.-Grado de concordancia entre resultados analíticos individuales, cuando el
procedimiento se aplica repetidamente a diferentes porciones de una muestra
homogénea.
52
Precisión intermedia.-Precisión de un método analítico, expresada como la
concordancia relativa obtenida entre determinaciones independientes realizadas en un
mismo laboratorio, por diferentes analistas, en distintos días.
Procedimiento Analítico.- S refiere a la forma de realizar el análisis. Debe describir
en detalle los pasos necesarios para llevar a cabo cada prueba analítica. Esto puede
incluir pero no se limita a: la muestra, el patrón de referencia y las preparaciones de
reactivos, el uso del aparato, la generación de la curva de calibración, el uso de la
fórmula para el cálculo, etc.
Protocolo de validación.- Descripción de pruebas específicas para demostrar que un
proceso da resultados que cumplen con los criterios preestablecidos de manera
consistente
Repetitividad.-Precisión de un método analítico, expresada como la concordancia
obtenida entre determinaciones independientes realizadas por un solo analista,
usando los mismos instrumentos y métodos.
Sustancia de referencia (estándar de referencia).-Sustancia de uniformidad
reconocida destinada a utilizarse en comprobaciones analíticas físicas, químicas o
microbiológicas en el transcurso de las cuales se comparan con la sustancia en
evaluación.
4.6 Método Analítico
Este se llevara a cabo de acuerdo al procedimiento Método de HPLC para
determinación de Astaxantina en Fermic S.A de C.V
4.7 Plan de Validación
4.7.1 Linealidad La linealidad del método analítico es su capacidad para obtener resultados
directamente proporcionales a la concentración del analito en la muestra.
53
La linealidad del sistema se determinara mediante la ejecución de una curva
estándar a 6 diferentes niveles de concentración utilizando un estándar de referencia.
Criterio de aceptación r2 ≥ 0.98
4.7.2 Exactitud
Para evaluar la exactitud del método analítico, se evaluaran por triplicado los 3
niveles de concentración utilizando adiciones estándar a matriz utilizando un estándar
de referencia certificado y como matriz una muestra con concentraciones conocidas
del analito.
Criterio de aceptación CV ≤ 5.0 % calculado de concentraciones totales
Recobro 100 ± 10 %
Dónde:
4.7.3 Límite de Cuantificación (LC)
Se utilizaran los resultados de la prueba de Linealidad para generar una curva
de calibración y se realizan dos curvas adicionales para promediar valores y con
estos datos se determinará el límite de cuantificación de acuerdo con la formula
recomendada por la ICH:
El límite de cuantificación (LC) puede expresarse como:
Dónde:
54
Criterio de aceptación r2 ≥ 0.98
4.7.4 Límite de Detección (LD)
Se utilizaran los datos de la prueba de Límite de Cuantificación para generar
una curva de calibración y determinar el Límite de Detección, de acuerdo con la
formula recomendada por la ICH:
El límite de detección (LD) puede expresarse como:
Dónde:
Criterio de aceptación
r2 ≥ 0.98
4.7.5 Precisión
La precisión del método analítico expresa el grado de concordancia entre una
serie de resultados obtenidos del muestreo múltiple de la misma muestra homogénea
en condiciones controladas. La precisión se puede medir como el grado de
repetividad, precisión intermedia y reproducibilidad.
A. Repetividad
La Precisión evaluada como Repetitividad, se realizara con un analista ensayando
seis veces una muestra al 100% de la concentración de ensayo.
55
Criterio de aceptación
CV ≤ 5.0 %
B. Precisión intermedia
La Precisión evaluada como Precisión Intermedia, se realizara con dos diferentes
analistas en días diferentes ensayando seis veces una muestra al 100% de la
concentración de ensayo.
Criterio de aceptación
CV ≤ 5 .0 % calculado de concentraciones
CV ≤ 5 .0 % calculado de áreas totales
4.7.6 Intervalo
El rango de un procedimiento analítico es el intervalo entre la concentración más
alta y la más baja del analito disponible en la muestra, para el cual se ha demostrado
que el método analítico tiene un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad.
Para la evaluación del intervalo se utilizaran los valores obtenidos de la prueba
de Límite de Cuantificación y Exactitud para determinar la concentración superior.
Criterio de aceptación
r2 ≥ 0.98
CV ≤ 5.0 %
Recobro 100 ± 10 %
56
4.7.7 Especificidad
La especificidad es la capacidad de evaluar inequívocamente el analito en
presencia de otros componentes de características similares , presentes en la
muestra.
La especificidad del método se evaluara comparando áreas del analito y los
tiempo de retención, entre el estándar primario y la muestra.
Criterio de aceptación
CV ≤ 5.0 % calculado de áreas
CV ≤ 5.0 % calculado de tiempos de retención
5 Reporte de Resultados
5.1 Linealidad del sistema
Se realiza una curva estándar a 6 niveles de concentración diferentes utilizando
un estándar de referencia certificado: Astaxanthin de Sigma Aldrich con Lote: A93335.
El comportamiento de los 6 niveles de concentración se observa en la Figura 15,
donde se aplica el arreglo de regresión lineal para determinar el coeficiente de
correlación de esta tendencia.
Figura 15. Área de la curva a los diferentes niveles de concentración.
R² = 0.99736
0
500,000
1,000,000
1,500,000
2,000,000
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Ára
ea
tra
ns-
ast
ax
an
tin
a
Concentracion (ppm)
Título del gráfico 2.000
1.500
1.000
0.50
57
Las concentraciones en ppm para cada punto de la curva y el valor de
absorbancia obtenido se reportan en la Tabla 5.
Tabla 5. Resultados de la prueba de Linealidad
Nivel Absorbancia
(%) Concentración estándar (%)
Respuesta trans-astaxantina
1 25.30 25.16 419.96
2 42.37 42.36 719.69
3 54.49 54.46 923.31
4 69.01 69.11 1,255.85
5 82.93 82.80 1,518.63
6 100 100 1,787.13
Pendiente 273297
Factor de correlación (R^2) 0.997
Conclusión.
La linealidad del sistema es aceptable conforme al criterio de aceptación
establecido, dónde R^2 debe ser mayor o igual a 0.980 y se obtiene un valor de 0.997
5.2 Exactitud
Se evalúa la exactitud con adición de estándar primario de Astaxantina:
Astaxanthin de Sigma Aldrich con Lote: A93335; a tres niveles de concentración por
triplicado. En la Tabla 6, se reportan los valores obtenidos reales de concentración
para cada replica y el valor obtenido del Coeficiente de variación entre replicas.
Tabla 6. Resultados de la prueba de Exactitud
Nivel
Valor esperado
(%)
Replica 1 Replica 2 Replica 3 Promedio
(%) % C.V % Recobro
1 100 92.26 95.78 87.00 91.68 4.81 91.68
2 211 195.74 198.93 207.37 200.68 3.00 95.06
3 602 602.53 613.24 588.69 601.48 2.05 99.90
Se preparan estándar primario de astxantina en 25 mL de Solvente orgánico 4,
posteriormente se toma una alucita de 1 mL y se afora a 25 mL con el mismo solvente.
58
De esta dilución se adicionan 2 mL a la muestras del segundo nivel y 5 mL para el
tercer nivel. La concentración esperada de la segunda dilución del estándar son 1, 000
ppm por cada mililitro adicionado.
La muestra problema tiene un valor de 2700 pmm, la cual corresponde al
primer nivel para esta prueba y a la cual se adiciona el estándar para los dos niveles
posteriores.
Conclusión.
Se cumple con el valor de recobro establecido del 100 10 %. Es decir, la
concentración adicionada de estándar en cada muestra, que se logra cuantificar
respecto a la concentración esperada teóricamente, oscila del 90 al 110%
Dónde:
El coeficiente de variación entre replicas cumple con el criterio establecido,
siendo valores menores al , de acuerdo a los valores obtenidos se determina la
prueba de Exactitud aceptable.
5.3 Límite de Detección (LD)
Se utilizaran los datos de la prueba de Linealidad y dos curvas adicionales para
generar la curva de calibración y determinar el LD. Se obtiene el valor de la pendiente
con el ajuste de mínimos cuadrados, de 14039245.3. En la tabla 7 se reportan los
valores para la curva de calibración.
59
Tabla 7. Resultados de las curvas de calibración.
Curva 1 Curva 2 Curva 3
Concentración Respuesta Concentración Respuesta Concentración Respuesta
0.79 419.961 0.65 345.374 0.81000 572.463
1.33 719.690 1.14 606.914 1.37000 926.318
1.71 923.312 1.57 826.592 2.31000 121.840
2.17 1,255.85 2.03 1,074.324 2.31000 1,571.89
2.6 1,518.69 2.64 1,397.198 2.68000 1,826.468
3.14 1,787.13 3.05 1,607.853 3.26000 2,203.176
En la Tabla 8 se reportan los valores obtenidos de los promedios entre las
curvas, así como los valores de x^2 , y^2 y xy para el ajuste por mínimos cuadrados.
Tabla 8. Promedios de resultados de las curvas de calibración.
Para determinar el valor de la pendiente, coeficiente de correlación del ajuste
de mínimos cuadrados y el valor de la ordenada al origen, se tienen las siguientes
formulas:
Concentración Respuesta x
2 y
2 x*y
x y
0.75000
19,337.22
0.56 373,928,309,375,076 14,502,920
1.28000
31,319.48
1.64 980,910,057,146,600 40,088,939
1.86333
41,196.74
3.47 1,697,172,018,311,010 76,763,273
2.17000
53,173.25
4.71 2,827,394,728,255,500 115,385,957
2.64000
61,854.25
6.97 3,825,949,397,675,250 163,295,245
3.15000
74,570.88
9.92 5,560,816,839,969,300 234,898,287
Σ = 11.853333 281,451.853 27.27 15,266,171,350,732,700 644,934,620
60
(
√ )
Los valores de b, m y r^2 y el de la desviación estándar para este ajuste ( ,
son:
b = 1,368,415.1
m = 23,051,858.5
r2 = 0.993
= 1,876,618.37
Donde la desviación es calculada como:
√
Y el valor de n, representa el número de niveles de concentración que forma la
curva de calibración (n=6).
El criterio de aceptación para determinar LD es un coeficiente de correlación
para la curva y se obtiene un valor de 0.993, por lo que se termina la prueba
de LD aceptable.
El límite de detección se calcula de la siguiente forma:
Dónde:
= desviación estándar de diferentes áreas de la curva de calibración
= Pendiente de la curva de calibración
Conclusión.
61
La prueba de Límite de Detección es aceptable con un valor de 0.3 ppm.
5.4 Límite de Cuantificación (LC)
Para calcular el LC se utilizan los datos de la prueba de Límite de Detección.
Donde el criterio de aceptación se cumple, con un valor esperado de coeficiente de
correlación para la curva de calibración: y el valor obtenido es 0.993. Se
procede a calcular el LC con la siguiente formula:
Dónde:
= desviación estándar de diferentes áreas de la curva de calibración
= Pendiente de la curva de calibración
Conclusión.
Se obtiene un LC de 0.81 ppm, dejando como valor próximo a 0.8 ppm como
parámetro para poder cuantificar áreas a partir de este valor.
5.5 Precisión
A. Repetividad
Se realiza la prueba de repetividad, pesando 6 veces la muestra en polvo de
Astaxantina Lote: 50C-ASX-008. En la Tabla 9 se reportan las concentraciones en
ppm para cada replica.
62
Tabla 9. Resultados de la prueba de Repetividad.
Prueba Resultados
Repetividad
Replica Concentración (%) Respuesta (%)
1 99.27 99.91
2 100.21 98.95
3 103.00 102.59
4 101.27 100.26
5 102.69 99.45
6 101.30 99.23
Conclusión.
La repetividad del método es aceptable, de acuerdo al criterio de aceptación
establecido:
C.V = 1.40 % calculado de concentraciones.
C.V = 1.32 % calculado de áreas totales.
B. Precisión Intermedia
Para determinar la Precisión intermedia, se realiza el análisis de 6 pesadas de
la muestra en polvo de Astaxantina Lote: 50C-ASX-008, por dos analistas diferentes
los días 18 de Abril y 20 de Abril respectivamente, del presente año. Se reportan las
concentraciones (ppm) de cada replica, por cada uno de los analistas en la Tabla 10.
63
Tabla 10. Resultados de la prueba de Precisión Intermedia.
Prueba Muestra Resultados
Precisión Intermedia
50C-ASX-008
Analista 1, Fecha: 18/04/16 Promedio concentración
(%)
Promedio respuesta
(%) Replica Concentración (%)
Respuesta (%)
1 99.27 99.91
104.93 99.19
2 100.21 98.95
3 103.00 102.59
4 101.27 100.26
5 102.69 99.45
6 101.30 99.23
Analista 2, Fecha: 20/04/16
Replica Concentración (%)
Respuesta (%)
1 109.10 98.38
2 106.67 96.24
3 108.87 98.55
4 106.97 97.33
5 110.44 99.10
6 109.29 100.27
Conclusión.
La precisión intermedia del método es aceptable, no hay efecto de los analistas y los
días de evaluación. Los criterios de aceptación son:
C.V = 1.84 %calculado de concentraciones.
C.V = 1.60 % calculado de áreas totales.
5.6 Intervalo
Se toman los datos de la prueba de Límite de Cuantificación y Exactitud para
determinar el intervalo de áreas superiores e inferiores del analito disponible en la
muestra. En la prueba de Precisión, Exactitud y Limite de Cuantificación se obtienen
valores para las curva de calibración, dentro del mismo intervalo de la prueba de
Linealidad. Por lo que se determina el método lineal, preciso y exacto entre estos
valores.
64
El valor inferior del intervalo corresponde a 0.8 ppm, este valar determinado
como el Límite de Cuantificación y un valor superior de 7700 ppm, siendo el valor
aproximado a 7693 ppm obtenido de la prueba de Exactitud.
Conclusión.
Los criterios de aceptación para calcular el intervalo son:
r2 ≥ 0.98 de la prueba de Límite de cuantificación
CV ≤ 5.0 % de la prueba de Exactitud y Precisión
Por lo que el cálculo de esta prueba se considera aceptable y corresponde a
valores de concentraciones entre 0.8 y 7700 ppm donde el método es preciso, lineal y
exacto.
5.7 Especificidad
Se evalúa esta prueba mediante la comparación de áreas y tiempos de retención
para trans-astaxantina de la muestra y el estándar primario. Considerando que el
estándar primario cuenta con 3 isómeros del trans-astaxanitna y la identificación de
estos no debe afectar al analito de interés.
En la Tabla 11 se reportan los coeficientes de variación entre áreas y tiempos
de retención respectivamente. Se estableció el criterio de aceptación para C.V .
Tabla 11. Áreas y tiempos de retención para evaluar prueba de Especificidad.
Análisis Respuesta
trans-astaxantina
Tiempo de retención (min)
Estándar primario 588.925 8.49 Muestra 606.875 8.5 % C.V 2.12 0.08
Conclusión.
Se determina la prueba de especificidad aceptable con valores de 2.12 y 0.08
para él % de coeficiente de variación entre áreas y tiempos de retención,
respectivamente.
65
6 Conclusión
Como resultado de la validación del método en el presente trabajo, es posible
concluir que existe una relación directamente proporcional entre la concentración del
analito y el área obtenida, por lo tanto se cumple con el comportamiento lineal para
una curva de calibración con un valor de 0.997 para el coeficiente de correlación.
Por otro lado, se demuestra la precisión del método a través de la variación que
existe entre analistas y entre los diferentes días de análisis, ya que los resultados no
se ven afectados significativamente y tiene una repetividad con un coeficiente de
variación menor al 5%.
Mediante las adiciones de estándar primario a la matriz conocida, se obtiene un
porcentaje de recuperación del analito entre valores del 90 y 100 % para los tres
niveles de concentración y se concluye que el método es exacto. Por otra parte, es
importante resaltar el cumplimiento de los pasos en la extracción del analito de interés
para obtener una cuantificación completa del mismo.
Cuando los valores obtenidos de concentraciones totales se encuentran entre 0.8
y 7700 ppm se demuestra que el método es lineal, preciso y exacto, aun cuando la
muestra de interés contiene el analito y otros componentes de características similares
como lo son los isómeros de trans-astaxantina. El método de extracción es especifico
y la identificación del analito no se ve afectada con la presencia de estos isómeros.
Debido a estos resultados se logra realizar la validación exitosamente del método
analítico para la cuantificación de astaxantina mediante la técnica de HPLC.
66
Referencias Bjerkeng B., Folling M., Lagocki S., Storebakken T., et al. (1997). Bioavailability of all-E-astaxanthin and Z-isomers of astaxanthin in rainbow trout. Oncorhyncus mykiss. Aquaculture. Bridlingmeyer B.A. , Warren F.V. (2000). Column efficiency measuremnt. San Diego: Anal chem. Britton G. (1983). Corotenoids. The Biochemestry of natural pigments. Cambridge: Cambridge University Press. Britton G. (1995). Structure and properties of carotenoids in relation to fuction. Cambridge: FASEDJ. Cela R., Lorenzo R.A. (2002). Técnicas de separación en química analítica. Madrid: Síntesis. Camacho J.E, Gonzales G., Bernadette K,. (2013). Producción de Astaxantina en Haematococcus pluvialis bajo diferentes condiciones de estrés. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, Colombia: NOVA.
Cheftel J.C, Cheftel. H, Basecon P. (1992). Introducción a la Bioquímica y Tecnología de los alimentos. Zaragoza, España: Acribia. Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos México A.C. (2011). Guía de validación de métodos analíticos. México. Diario Oficial de la Federación. (1995). Gobierno Federal. Ciudad de México. Femema O.R (1995). Química de los Alimentos. Zaragoza, España: Acribia. Francis F.S. (1999). Colorants Betalains. Practical Guides for the Food indutry. American Association of Color Chemist. St Paul, Minessota, USA: Eagan Press Handbook. García de Marina A., de Castillo B. (1988). Cromatografía liquida de alta resolución. México: Limusa. García de Marina B. (2008). HPLC fundamental. Universidad Politécnica de Valencia, Valencia. Harris C.D. (2007). Análisis químico cuantitativo. Barcelona: Reverté. Haywars P.M. (1992). Colorantes. Tecnología de alimentos. 58-73. Hernández H.L, Claudio G.P. (2002). Introducción al análisis instrumental. España: Ariel. Hernández Pérez J.M. (2005). Cromatografia liquida de alta eficacia. Hospital universitario Germans Tiras i Pujol, Barcelona. Higuera-Ciapara I., Felix-Valuenzuela L., Goycolean F.M. (2006). Astaxanthin. A review of its chemestry and aplications: Critucal Reviews in food science and nutrition.
67
ICH Steering Comity(1994).Text on Validation of Analytical Procedures Q2A.ICH Harmonised Tripartite Guideline.
ICH Steering Comity(1996). Validation of Analytical Procedures: Metodology Q2B.ICH Harmonised Tripartite Guideline. Johnson E.A., An G.H. (1991). Astaxanthin from microbial sources. USA: Rev. Crit. Kühn R., Sorenson N.A. (1938). Ulber astaxanthin and overdin. Ber. Dscth chem. Meléndez-Martinez J, Heredid F.J. (2004). Importancia nutricional de los pigmentos carotenoides. Área de nutrición y Bromología. Facultad de Farmacia. Universidad de Sevilla. España. Meyers S., Bligh D. (1981). Characterization of astaxanthin from heat-processed craw fishwaste. Journal of Agicultural and Food Chemestry. Miki W. (1991). Biological fuctions and activiti of animal carotenoids. Epaña: Pure and Applied Chemestry. Miller M.W., Phaff H.S. (1998). Phaffia. The teasts, ataxonomic, study.(4th etidion). Amsterdam: Elsevier. Mínguez M.I., Pérez A., Hornero D. (2005). Pigmentos carotenoides en frutas y vegetales: mucho mas que simples colorantes naturales. Grupo de química y bioquímica de pigmentos. Departamento de Biología de alimentos. Sevilla: Instituto la Grasa. Ramírez-Córdova J.J. (2000) Generación de productos con alto valor agregado a partir de la levadura Phaffia rhodzyma mediante un proceso de producción de astaxantina. Proyecto CONACYT. Ciudad de México: Grupo piloto alcance ultima milla. Rodríguez-Amaya D. (1999). Carotenoides y preparación de alimentos. Departamento de Ciencia de Alimentos. Universidad de Campinas, Brasil: OMNI. Skoog D.A., Trujillo E.T. (2005). Fundamentos de química analítica. Madrid: Thomson. Synder L.R., stadalius M.A.(2002). Gradient elution in reversed-phase HPLC separation of macromolecules. San Diego: Anal chem. Tafoya A., García H.A. (1993). Colorantes. Biotecnología alimentaria. Ciudad de México: Limusa. Varcácel C.M, Goméz H.A. (2003). Técnicas analíticas de separación. España: Reverté. Yoshimura S, Ranbjar R, Inoue R, Katsuda T, Katoh S. Effective utilization of transmitted light for Astaxanthin production of Haematococcus pluvialis. Journal of Bioscience and Bioengineering. Weston A., Brown P.R. (1997). HPLC and CE principles and practices. San Diego: Academic
Press. 0
