Importancia de la Calidad Genetica en Animales de Laboratorio Ana_Genética en animales de...– Segments cortos de DNA con una sequencis repetitiva – La longitud de la sequencia

Importancia de la Calidad Genetica

en Animales de Laboratorio

GENETIC SCIENCES & COMPLIANCE

ANA V. PEREZ, Ph.D.

Objetivos de la Presentacion-1ra Parte

© TACONIC BIOSCIENCES 2

• Quien es Taconic

• Que es Calidad Genetica

• Por que es importante la calidad Genetica

en animales de laboratorio

• Animales geneticamente modificados como

modelo animal de enfermedades humanas

• Ejemplos de generacion de modelos

geneticamente modificados

– Tecnicas Usadas

• Lider Mundial en roedores de laboratorio y servicios cientificos - 60 years en 2012

• Proveedor Global de ratas y ratones de alta calidad con el mismo perfil genetico, fenotipico y de salud

• Lider Mundial en generar ratones geneticamente modificados

• Lider Mundial en producir camadas de animales geneticamente modificados para estudios de investigacion

Taconic Biosciences

3

Historia-Taconic Biosciences


• Fundada en 1952

• Primer Productor comercial de animales de laboratorio que obtuvo acreditacion AALAC-1969

• Primer Productor Commercial que implemento la Barrera de aislamiento en 1981 para mantener los animales de laboratorio con los mas altos niveles de Bioseguridad

• Proveedor de servicios de crianza a pedidos del cientifico investigador desde 1995

• Adquisicion de nuestra subsidiaria en Colonia, Alemania 2007– Lider en diseno y generacion de animales rodeores geneticamente modificados

Taconic Biosciences

• Compania Privada – >600 empleados mundialmente

– Produciion de mas de 200,000 cajas

– AAALACi, ISO 9001+ ISO 14001

(TacBio-DK+ TacBio DE)

• Expertos Cientificos – Veterinarios certificados, Microbiologos, Biologos

Moleculares, Embriologos, Genetistas, Patologo veterinario, Biologo Celular

• Clientes – Companias Framaceuticas, Companias de

Biotecnologia, Universidades, y Organizaciones Gubernamentales

5

Albany, NY

Hudson, NY

Germantown, NY

Cambridge City, IN

Oxnard, CA

Ejby, Denmark

Bomholt, Denmark

Borup, Denmark

Laven, Denmark

Cologne, Germany

Tokyo, Japan

Chungbuk, South Korea

Gyeonggi-do, South Korea

Centros, Singapore

Taconic Biosciences Distribuidores

Presencia Global

Hyderabad, India

Importancia de la Calidad

Genetica

Pureza

Validez

Reproducibilidad

7

Calidad Genetica

“Scientists go to tremendous lengths to ensure that reagents are pure and the glassware is clean. They should pay equal attention to the purity of the animals they use.”

- Festing Lab Animal 1974

“In animal research validity and reproducibility are critically influenced by three important variables: genetic background, physical environment, microbial status…”

- Lab An Sci 1998

“Do scientists, veterinarians, animal care personnel and facility managers know that the specific strains of research animals they develop, use, care for and house are genetically sound and truly representative of their assumed genotype or genetic background?”

- Mam Genome 2013 (ICLAS)

Ratones y Ratas Consanguineos o

Endogamicos

• Apareamiento hermano x hermana por 20

generaciones

• Todos los genes alelos son homozygotos

• No hay segregacion de genes de manera que la siguiente generacion es equivalente a la anterior

• Cada cepa es aproximadamente copia multiple de un solo individuo. Cada cepa tiene caracteristicas definidas

– C57BL/6, FVB, 129S6, etc

Colonias Heterogeneas –

Apareamientos No consanguineos

• Outbred Stocks • Maxima variedad genetica

– Tamano deseables, pesos, fecundidad, etc.

– A veces se desarrolla el fenotipo not observado en una cepa consanguinea

– Permite el mantenimiento de mutaciones que produce un efecto severo en cepas consanguineas

• Maxima heterogeneidad por alelo – Segregacion de alelos

– Pequenas colonias de exogmicos se tienen que reemplazar frecuentemente

– Derivaciones pueden ocacionar deriva genica

– Monitoreo genetico consiste en chequear la frecuencia de alelos*

Inbred Genetic Background

C57BL/6NTac

aaBBCCDDPP

129S6/SvEvTac

AwAwBBCCDDPP DBA/2JBomTac

aabbCCddPP

A/a = Agouti locus (a; Chr 2) (banded black/yellow [A] vs. black [a] vs. white-bellied [Aw])

B/b = brown locus (Tyrp1; Chr 4) (black vs. brown pigment)

C/c = albino locus (Tyr; Chr 7) (pigment vs. no pigment)

D/d = dilute locus (Myo5a; Chr 9) (intense pigment vs. diluted pigment)

P/p = pinked-eyed dilution locus (p; Chr 7)

Cual es el Color de Fenotipo que estos

genotipos representan

C57BL/6NTac

Genotipo aaBBCCDDPP

Fenotipo BLACK

129S6/SvEvTac

Genotipo AwAwBBCCDDPP

Fenotipo AGOUTI

DBA/2JBomTac

Genotipo aabbCCddPP

Fenotipo DILUTE BROWN

Open Field Activity (first exposure)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

129P

3/J

129S

1/S

vlm

J

129S

6/S

vE

vT

ac

129T

2/S

vE

msJ

129X

1/S

vJ

A/J

CrT

ac

B6129F

1T

ac

BA

LB

/cA

nN

Tac

C3H

/HeN

Tac

C57B

L/6

J

C57B

L/6

NT

ac

DB

A/2

NT

ac

FV

B/N

Tac

NO

D/M

rKT

ac

SJL

/JC

rNT

ac

M

F

Tota

l D

ista

nce (

cm

)

Taconic -G. Bothe et al. 2005

Nomenclatura

B6.SJL-Ptprca/BoyAiTac

Inbred

Partner Donador

Linea

Congenica

Gen de

Interes

Subcepa

Por que la Integridad Genetica es

importante?

1

4

Impuridades geneticas o Deriva Genica

pueden arruinar un estudio costando

innecesario tiempo y dinero…..y tu ni te das

cuenta

Que es Monitoreo Genetico?

• Monitoreo Genetico es un programa de pruebas geneticas establecido como manera de verificar que la produccion de animales es de la cepa deseada y del genotipo correcto

• Monitoreo Genetico en Taconic es ejecutado de una de las

siguientes maneras dependiendo del modelo animal – Verificacion del genotipo-verificar la presencia de la mutacion deseada

– Verificacion de la Cepa

– Observando o ensayando el fenotipo

Cual es

el raton

C3H?

Verificacion de Cepas – Tecnicas

usadas

• Pruebas Bioquimicas – Pruebas proteicas

• ADN de Microsatelite

• Polimorfismo de Nucleotido – Single Nucleotide

Polymorphisms or SNPs

Genetic Markers from Tissue Proteins-

“Biochemical Polymorphisms”

Jorde et al, 1995

“Medical Genetics”

Genetic Markers from Tissue Proteins-

“Biochemical Polymorphisms”

Electric field

+

-

Historically, RTI has tested 19 such proteins from blood and kidney for mice

Panel de Marcadores Geneticos-

Bioquimicos

b a a b b a b b a ? b d a a c b b a s DBA/1JBom

a a a b a a a b b a b d b b c b b a s CBA/JBom

b a a b b a b b a a b s a b c b b b s SJL/JCrNTac

b a a b b a b b b a a d a b c b b a s NZM/AegTac

b a a b b a a b b a a s a b c a b a s NOD/MrkTac

b a a b b a a b a b a d b b c a b b s FVB/NTac

b a a b b a b b a a b d a b c b b b s DBA/2NTac

b a a b b a b b a a a d b b c b b b s C3H/HeNTac

b a a b b b a a b a a s b a a a a a f C57BL/6NTac

b a a b a a a a a a a d a b a a b b s BALB/cAnNTac

b a a b a a a b a a a d a b c a b b s A/JCrTac

b a a b b a b b a a a d c a c b b a s 129S6/SvEvTac

Strain

Tr

f

Sod

1

Pn

p

Mpi

1 Gus-s

Gg

c Pgm1

Pep

c Mod1 Ldr1

Idh

1

Hb

b Gpi1

H6p

d Es3

E

s

d

Es

1

Car

2 Acy1 Marker

ADN y Cromosomas

…TGCTAGCTGTACGTACTGAC…..

Jorde et al, 1995

“Medical Genetics”

Encoded information for

a specific function

Specific PCR

primers based on

known gene

sequence

PCR-Reaccion en Cadena de

Polimerasa


Microsatelite de ADN

• ADN microsatelites – Segments cortos de DNA con una sequencis repetitiva

– La longitud de la sequencia repetitiva varia de cepa a cepa

– Es un poco inestable con una tasa de mutacion un poco alta

– Presenta problemas de ensayo cuando se amplifica, presenta

problemas tecnicos

– Es dificil de correr un ensayo con cientos de muestras

Marcadores Geneticos- Microsatelite

de ADN

Polimorfismos de Nucleotidos

• Single Nucleotide Polymorphisms or SNPs

– Son variaciones en la secuencia del ADN que ocurre cuando un unico nucleotido es alterado (A,T,C,or G) en el genoma

– Es mas estable que los microsatelites

– Se pueden correr muestras en el orden de los miles

AAGGCTAA to

ACGGCTAA

– Un Panel de SNPs nos permite diferenciar claramente las cepas

Caracterizacion del Fondo

Genetico

Name Chr 129S6 C57BL/6NTac 1 2 3 4 5 7 8 9

Index1245 16 BB BB BB BB BB BB BB BB BB BB

Index1246 16 AA BB BB BB BB AB BB AB BB BB

Index1247 16 AA BB BB BB BB BB BB BB BB BB



Index1250 16 AA BB BB AB BB AB BB AB BB AB

Index1251 16 BB AA AA AB AA AB AA AB AA AB

Index1252 16 BB BB BB BB BB BB BB BB BB BB

Index1253 16 BB AA AA AA AA AA AA AA AA AA

Index1254 16 AA BB BB AB BB AB BB AB BB AB

Index1255 17 BB AA AA AA AA AA AA AA AA AA

Que es Deriva Genica?

• Es un Proceso Natural que es el resultado de la

replicacion de ADN

• Es la acumulacion de mutaciones espontaneas

en un organismo a lo largo del tiempo

• Deriva Genica se puede fijar en una colonia de

ratones/ratas inadvertidamente

26

Como Evitar la Deriva Genica

• Con Criopreservacion – Proteccion del ADN

– Reduccion de riesgo

– Extension de la vida

Reproductiva de la colonia

• Con Recuperacion de cepas congeladas – Refresco de la colonia

– Obtener nuevo Stock

27

Objetivos de la Presentacion- 2da Parte


• El rol de los animales geneticamente modificados

• Importancia del origin del modelo – Como se genero?

• Ejemplos del uso de modelos animales

• Modelos de raton humanizados

Historia de Modelos Animals- Raton


• Modelos animales como vehiculos de modelos de enfermedades humanas

• Modelos animales para encontrar la medicina-curacion apropiada en humanos

• Modelos Animales para entender el mecanismo biologico/metabolico de la enfermedad humana

• Modelos animales para usarlos como vehiculos de produccion de reactivos

Modelo de Obesidad


• En 1950 se publico el primer modelo animal de

obesidad en raton

– Mutacion genetica recesiva espontanea

– No se sabe cual es el gen responsable de la mutacion

– Los adultos obesos son esteriles

• En 1995 se publico la mutacion

– La mutacion trunca la molecula de Leptina que regula

el metabolismo de tejidos

Modelo Lepob de obesidad


• Regulacion del metabolismo de tejidos perifericos y funcion de la leptina

• Secrecion y Accion de la Leptina

Cual es el origen del Modelo animal

Geneticamente modificado que tiene?


• Inyecciones Pronucleares

• Recombinacion Homologa

• Modelos de gen editacion-CRISPR

Biologia del Desarrollo


• En 1950 se publico el primer modelo animal de obesidad en raton – Mutacion genetica recesiva espontanea

– No se sabe cual es el gen responsable de la mutacion

– Los adultos obesos son esteriles

• En 1995 se publico la mutacion – La mutacion trunca la molecula de Leptina que regula el metabolismo de tejidos

Origen de Modelos Animales

Geneticamente Modificados


• En los anos 1960s, Brinster desarrollo el sistema de cultivo in

vitro de embriones de raton

• En los 1970, Brinster empezo a injectar celulas de

teratocarcinomas dentro del blastocisto y obtuvo ratones

chimera

• En los 1980 Brinster and Palmiter hicieron experimentos para

introdujendo ADN en huevos fertilizados de raton y este AND

se incorpora este en el genoma del raton

• En 1985-Smithies, Bradley, Capecchi lograron generar

mutaciones por recombinacion homologa

Injecciones Pronucleares


Characteristicas del Animal Transgenico


• Insercion del ADN en el genoma es al azar

• Integracion del ADN injectado es en el mismo sitio de integracion

• Utiliza para manipular reporteros genes, sobre-expresion, exprsesion de proteinas en tejidos especificos

• Nomenclature is: Tg(Prom-YYY)#Zzz

Tg(PB-Wnt1)1Hev B6.Cg -Tg(PB-Wnt1)1Hev

Mutaciones Dirigidas de Recombinacion

Homologa


Caracteristicas del Raton de Mutacion

Dirigida

© TACONIC BIOSCIENCES

• La insercion del ADN en el genoma es por recombinacion homologa, hay homologia entre el ARN injectado y el gen que se quiere mutar y requiere de celulas madre embrionarias

• Es un lugar unico de insercion en el genoma

• El animal chimaera tiene 2 cepas de raton en un solo especimen (dos genomes)

• La nomenclatura es: YYYtm#Zzz

Bmp1tm1Blh B6.Cg –Bmp1tm1Blh

CRISPR-Clustered Regularly Interspaced Short

Palindromic Repeats


NHEJ HDR

Knockout by frame shift Knockin Point mutation

* * Gene/PM

Doble rotura de

cadena de ADN

SpCas9

DSB

DNA

Microinjection

Wildtype Mutant mutagenesis

sgRNA

Caracteristicas del Metodo CRISPR


• Insercion de la modificacion genetica ocurre por homologia de RNA y DNA- es inicialmente especifica

• Ocurre por reparcion de alta fidelidad o recombinacion no-

homologa del sistema de reparacion por excision

• Hay off-target integrations y variacion en la secuencia de AND en el lugar de integracion

• Se puede utilizar un huevo fertilizado o celulas madre embrionarias

• La nomenclature es: YYYem#Zzz Bmp1em1Blh B6.Cg –Bmp1em1Blh

Haoyi Wang , Hui Yang , Chikdu S. Shivalila , Meelad M. Dawlaty , Albert W. Cheng , Feng Zhang , Rudolf Jaenisch

One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering

Cell, Volume 153, Issue 4, 2013, 910 - 918 http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2013.04.025

CRISPR-Cas9

Tiempo de Generacion del Modelo

Como Mantener la Calidad Genetica

Sistemas de apareamiento definidos

Mantenimiento de datos de la cepa o Stock

Monitoreo del Fondo Genetico

Verificacion del Genotipo

Evitar Deriva Genica

Cuidadoso Diseno Experimental cuando se usa animales geneticamente modificados

4

3

Diseno Experimental cuando se usan

animales geneticamente modificados

44

C57BL/6NTac-Tyrtm1Arte

• Mutante de un sola base - G a C, base 369

C57BL/6NTac-Atm1.1Arte

• Considerar el fondo genetico

•Verificar que los animales controles

del experimento son geneticamente

equivalentes

•Verificar todos los alelos presentes

• Mutante generada sacando un provirus del

genoma


Importance del Fondo Genetico cuando

se introduce una mutacion

C57BL/6NTac

aaBBCCDDPP

BLACK

Tg(APPSWE)

129S6/SvEvTac

AwAwBBCCDDPP

AGOUTI

Tg(APPSWE)


• Enfermedad de Alzheimer es un desorden cronico neurodegenerativo caracterizado:

– Disminucion progresiva del conocimiento

– Perdida de la memoria

• Acumulacion de proteina beta amyloide cracteristica importante de la patologia

• APPSWE (Apolipoproteina SWE) es el precursor de la proteina amiloide que contiene la mutacion Sueca (Swedish=SWE) que codifica una doble substitucion de aminoacidos asociada con la suceptibilidad al Alzheimer

• Este modelo no recapitula completamente la enfermedad de Alzheimer pero se usa para investigar los procesos especificos intracelulares de la enfermedad

Modelo APPSWE Transgenico


• Taconic’s colony was established by transfer of embryos resulting from breeding a hemizygous transgenic male to a C57BL/6NTac female. The resultant male progeny were bred to SJL/JcrNTac

females. The model 001349 colony is now maintained by breeding hemizygous transgenic male mice with female B6SJLF1/Tac mice.

• To generate model 002789, mice from Founder Line 2576 were backcrossed sixteen generations (N16) to 129S6. Taconic received stock in September 2003.

• The mice were derived by embryo transfer and are maintained by backcrossing hemizygous male mice with 129S6/SvEvTac female mice.

…cont Origin of APPSWE Model


• Early and progressive accumulation of beta amyloid and development

of plaques

• Behavioral deficits that correlate with degree of amyloid deposition

• Neuritic dystrophy and altered synaptic efficacy of plaque-associated

neurons

• No evidence of neuronal loss

• Expression of inflammatory mediators by plaque-associated

microglial cells and astrocytes

• Gender differences in some aspects of physiology and behavior

• Age-correlated elevation in brain levels of apoE and cholesterol

• Deposition of amyloid in cerebral blood vessel walls

Caracteristicas del Modelo APPSWE

Transgenico


Beta amyloid expression in APPSWE


Learning Problems in APPSWE

Model


• Modelo 1349 esta en un background mixto B6;SJL

• Modelo 2789 esta en la cepa 129S6

• En la cepa C57BL/6 la mutacion is letal

• Pink eyed animals, associated with certain coat colors, and the

Pde6brd1 retinal degeneration mutation can cause light sensitivity

and/or blindness in some animals. This may impact the results of

behavioral testing.

• The mixed genetic background of model 001349 can result in pink

eyed animals or homozygosity for the Pde6brd1 retinal degeneration

mutation.

• The 129S6 background of model 002789 does not carry the Pde6brd1

retinal degeneration mutation, and this strain has pigmented eyes.

Diferencias Geneticas que

dependen del Fondo Genetico

Inducible Knockouts via CreER

© TACONIC BIOSCIENCES PROPRIETARY & CONFIDENTIAL 52

Historia de Modelos de

Immunodeficiencia

• Hasta s.19 -cancer contagioso

• 1950’s and 60’s, reconocio que el sistema imunologico

tiene un rol en el cancer

• 1968 se descubre el raton desnudo– critico para

transplantes de tumor

• Raton Scid- Severe combined Immunodeficiency-

descubierto en 1983 en Fox Chase Cancer Center

Composicion del Systema

Immunologico

• Adaptive - B cells produce antibodies. When you are

sick once, your body ‘remembers’ the next time and

produces more of the specific antibody

• Innate - T cells (neutrophils and macrophages) do a lot

of the clean up of foreign matter and are non-specific

• Immunocompromised is the lack of one or both

components of the immune system

Investigacion de Cancer-Oncologia

• Xenoinjerto/transplante – Since they can not reject tissue implants, researchers can put

human tumors in them

• Tumor Take Rates – High Tumor take rates increase speed of research while

reducing number of animals needed

• Study of the infectious disease process – Scid mice

• Autoimmunity

Otros Modelos Immunodeficientes

• Roedores Desnudos – carecen de pelo

• Nude Mutation: Foxn1nu

– Atrofia del crecimiento de pelo y del desarrollo del timo

– El timo nunca es colonizado de celulas T progenitoras

– Es una proteina de union de ADN que se expresa en piel y timo

durante el desarrollo embrionario

• Varios Models – NCr nude, NMRI nude, NIH Swiss, BALB/c, Black 6

– NIH Nude Rat

Rata NIH desnuda

• Lower T cell development compared to other vendors with better take

rates (as presented by Pfizer researchers at AALAS 2008)

• Better suited for imaging studies

• Larger tumor endpoints

• Longer life

• Not always completely

‘nude’

Portafolio de Modelos de

Immunodeficiencia

• Ratones SCID –Deficientes en Celulas T y B algunos

forman anticuerpos incipientes-leaky

– Defective recombination of antigen receptor genes

– Arrest in T and B lymphocyte development

• Several Genetic Backgrounds

– C.B.-17 scid and ICR-scid

– NOD scid-reduced NK cells

– Scid-beige-NK cell deficient

Importancia del Fondo Genetico en el

Modelo SCID

• Mutacion SCID – Prkdcscid (Protein Kinase DNA activated

catalytic polypeptide)

• Endogamico – respuesta consistente

• Exogamico – resistente, animal un poco mas grande puede tolerar

tumores mas grandes

• “Leakiness” de anticuerpos dependera del fondo genetico.

Animales “Leaky” producen niveles bajos de anticuerpos no-

especificos. De menos leaky a mas leaky: Rag2

ICR/SCID

NODSC

CBSCBG

CB17SC

Modelo Rag2 KO

• Rag 2- Recombinant Activating Gene 2 – B and T lymphocytes present a highly variable region that allows

them to recognize different antigens

– This variable region is assembled by joining several genes together

– This is done by two genes Rag1 and Rag 2

• Generated Rag2 KO model

• Fail to generate mature B and T lymphocytes

Immune-Deficient Taconic

Transgenic Models™

• Rag2

– Lacks T and B cells

• Pfp

– Perforin deficient, impaired NK cell function

• Pfp/Rag2

– T, B and NK cell deficient

• Abb & β2M

– MHC class I & II deficient

• CIEA NOG mouse® – Superimmunedeficient

• Jh

– B cell deficient

• Stat1

– Immune response to alpha and

gamma interferon deficient

• Fcer1g & Fcgr2b

– FcγRIII, FcεrI, & FcγRIIβ deficient

CIEA NOG mouse®

• Do you routinely have low take rates for certain cell lines

or primary tumor types?

• Use of a model with superior engraftment rates can

result in more successful xenograft studies and reduce

your overall animal usage, as well as labor costs


• Modelo animal geneticamente modificado que expresa una proteina

humana y/o injertado celulas humanas o combinacion de estas

• Estos modelos se estan usando en varias aplicaciones:

– Candidatos de drogas

– Analysis de proteinas involucradas en metabolismo de drogas

– Sistema immunologico

– Hematopoiesis

– Enfermedades de infeccion

– Medicina regenerativa

– Cancer

Modelos Humanizados


Modelos de raton immunodeficientes


• Animales geneticamente modificados que sustituyen el gen de raton por humano

• Animales que poblan el sistema immunologico con celulas madre hematopoieticas o

celulas mononucleares de la sangre periferica humana o tejidos fetales humanos

Sistema Immunologico Humanizado

© TACONIC BIOSCIENCES PROPRIETARY & CONFIDENTIAL 67

Conclusiones

• La Calidad Genetica es critica para los estudios cientificos y su reproducibilidad

• Los Animales geneticamente modificados juegan un papel critico en la investigacion cientifica

• La ciencia esta en constante avance y mejoramiento de modelos animales

PREGUNTAS

Documents

Importancia de la Calidad Genetica en Animales de Laboratorio Ana_Genética en animales de...– Segments cortos de DNA con una sequencis repetitiva – La longitud de la sequencia