Imunitní systém jako informační soustava

CytokinyM.Průcha

Imunitní systém - úkoly Zachování homeostázy Zachování integrity

makroorganismu Rozpoznání cizího a vlastního

Imunitní systém - signální systém

Solubilní faktory – vysokomolekulární ( cytokiny, chemokiny, růstové faktory) - lipidové – eikosanoidy - nízkomolekulární - NO

Imunitní systém – signální systémy

Membránové interakce - receptory - adhezní molekuly - kostimulační molekuly - akcesorní molekuly

Hráči v přenosu signálu Imunokompetentní buňky Trombocyty, erytrocyty Endotelové buňky Epitelové buňky Keratinocyty, fibroblasty Buňky nervové a endokrinní

soustavy Molekuly mezibuněčné hmoty

Cytokiny - funkce Aktivační signály, které se podílejí

na buněčné aktivaci, regulaci buněčného cyklu

Autokrinní, parakrinní a systémové působení

Regulace exprese povrchových, kostimulačních a akcesorních molekul

Cytokiny - funkce Změny buněčného cytoskeletu Indukce apoptózy Regulace zánětu Regulace proliferace a diferenciace

buněk imunitního systému

Cytokiny – receptory 5 rodin receptorů pro cytokiny Receptory pro hematopoetinové

cytokiny Receptory pro interferony α,β,γ a IL-10 Receptory pro TNFα Receptory pro IL-1, M-CSF a další Transmembránový receptor –

serpentinová molekula – vazba chemokinů

Cytokiny – nitrobuněčný přenos aktivačního signálu

Vazba ligandu na receptor –aktivace Janusových kináz(JAK – Janus Activated Kinase) – ty fysforylují receptorové podjednotky a umožňují vazbu cytoplasmatických molekul – STAT (Signal Transducers and AcTivators – ty přecházejí do jádra a váží se na regulační sekvence genů – to vede k přepisům genů, popř. k indukci buněčné proliferace a diferenciace

Caspase Cascade

Fas

Calcium

Channel

Ca2+

Ca2+

TNFRTNF

RAIDD RIP2

FADD

TRADD

TRADD

Caspase10

Caspase2

ER Stress

Activated Tissue Transglutaminase

CRMA

Cell Survival

Rb

ApoptosisApoptosis

RICK TRAF2

GRB

ICADCleaved

GranzymeB

CytoC

Caspase9

PerforinPerforin

PAK1 BAD

D4-GDI ICAD CADLamin-A

Caspase8

BID

tBID

CytoC

Caspase1

Caspase3,6,7

Caspase2

TRADD

Kinase

JNK

Casp

ase1

2

CalpainSphingo-myelinase

GRB

Ceramide

CIAP

Fa

sL

Procaspase8

Caspase8

RAIDD

Caspase2

FADD

CIAP

NIK

NF-B

Daxx

Lamin-B1Lamin-B2

Lamin-A

APAF1

PARP

CLEAVAGE OF DEATH SUBSTRATES

DNA-PK

CAD DNAFragmentation

SMAC/DIABLO

2009ProteinLounge.comC

Regulace koncentrace cytokinů

Nutnost lokální regulace Neutralizace vazbou na přirozené

inhibitory (IL-1Ra) a solubilní formy receptorů

Vazba na makromolekuly buněčných povrchů a mezibuněčné hmoty

Uvolňování z lokálních rezervoárů (mezibuněčná hmota- matrixové metaloproteinázy, elastázy, aktivátory plasminogenu, heparanázy

Cytokiny – regulace koncentrace

Degradační enzymy rozloží mezibuněčnou hmotu a a umožní prostup buněk imunitního systému do tkání, kde pak uplatní svou vlastní produkci

DARC (Duff Antigen Receptor for Chemokines, CD234) na ery a endotelových bb.

Vazba CXC a CC chemokinů a odstranění z oběhu

Cytokiny - členění Charakteristika na molekulové

úrovni Aminokyselinové složení a

struktura, lokalizace genu odpovědného za produkci

Klonace genu Zdroj cytokinů, buněčný substrát

Cytokiny - členění Růstové faktory krvetvorby Interferony I. a II. třídy Interleukiny – stimulující

hematopoezu, pluripotentní - prozánětlivé a regulující kooperaci Ta B lymfocytů, protizánětlivé

Chemokiny Rodina TNFα Rodina TNFβ

Cytokiny regulující krvetvorbu STF (Stem Cell Factor) IL-3 – produkovaný T ly a NK bb.

(pluripotentní kolonie stimulující faktor)

Kolonie stimulující faktory (G-CSF, GM-CSF a M-CSF)

Klinické použití – léčba neutropenií po indukci cytostatickou léčbou

Interferony Interferony I. typu – α,β,ω Stimulátor – virová infekce Antiproliferativní, cytostatický účinek IFN α – leukocyty

(chron.akt.hepatitida B, C, leukemie z vlasatých buněk

IFN β – léčba RS IFN γ – Th ly , obrana – intracelulární

parazité (M.tuberculosis)

Cytokiny regulující T a B lymfocytární systém

Heterogenní skupina Prototypem je IL-2 Th0, Th1 a Th2 subsety Rozdílný profil produkovaných

cytokinů Th1 – buňkami zprostředkovaná

specifická imunita Th2 syntéza protilátek a diferenciace

eosinofilů

Pluripotentní prozánětlivé cytokiny

IL – 6 a IL-1 Produkce aktivovanými monocyto-makrofágovými bb IL- 1 – endogenní pyrogen Aktivace T ly Produkce RAF

Rodina tumor nekrotizujících faktorů

LPS jako podnět Aktivace přes LBP a CD14 Úloha v regulaci zánětu Klinické aplikace –diagnostické i terapeutické – inhibitory TNF

Transformující růstové faktory

TGFβ Růstový aktivátor, růstový inhibitor Chemoatraktant fibroblastů Protizánětlivý účinek Aktiviny a inhibiny

Chemokiny M.h. < 10 000 Regulace pohybu buněčných populací Prozánětlivé účinky Produkovány všemi jadernými buňkami Stimulace endo i exogenně Členění do skupin podle přítomnosti

cysteinových zbytků IL-8

Metody stanovení cytokinů

In vivo, ex vivo, in vitro In vivo – uplatnění – septické stavy Ex vivo – septické stavy, funkční

stav při onemocnění, stimulace in vivo a produkce in vitro

Metody stanovení Chemiluminiscence – IL-10, IL-6 Bead Array Systém – průtoková

cytometrie ELISA ELISPOT mRNA – klidový stav, aktivace

Indikace vyšetření Sérum – IL-6,8,10 – SIRS, trauma,

sepse Ex vivo produkce TNF – sepse Lokálně – zánětlivá onemocnění

Metody stanovení Produkce v supernatantu – ELISA ELISPOT Enzyme – linked

Immunospot Assay Principem metody je vazba

cytokinu produkovaného specifickou buňkou na protilátku vázanou na destičku

ELISPOT Použití periferních mononukleárních buněk Specifická stimulace studovaných buněk

odpovídajícím stimulem po dobu, která je nutná pro prezentaci antigenu

Inkubace PBMC s antigenem(bílkovina, peptid), poté přenos aktivovaných T lymfocytů na mikrotitrační destičky

Po inkubaci (6-24 hodin) jsou buňky lyzovány, odmyty a přidána biotinem značená druhá protilátka proti testovanému antigenu

Detekce pomocí streptavidinu konjugovaného s křenovou peroxidázou

ELISPOT Vyhodnocení – inverzní mikroskop ELISPOT reader – digitální analýza

obrazu Detekce a kvantifikace specif. T

lymfocytů v periferní krvi Sledování průběhu nemoci Sledování vlivu léků na produkci

cytokinů in vitro Autoimunita, transplantace