Imunochemické metody

Metody využívající vazbu mezi antigenem a protilátkou

Vytášek 2008

Vazba mezi antigenem a protilátkou

• Je nekovalentní a podílí se na ní vodíkové můstky a iontové interakce stejně jako van der Waalsovy síly či interakce dipol-dipol

• Sílu interakce (vazby) mezi antigenem a protilátkou vyjadřuje afinitní konstanta

KA = [Ab-Ag] / [Ab].[Ag]

• Afinitní konstanta, tj. síla vazby, je závislá na pH, iontové síle, přítomnosti detergentů či chaotropních činidel

Hlavní imunochemické metody

1) Imunoeseje

2) Imunoblotování

3) Imunoprecipitace

4) Imunoafinitní chromatografi

5) Imunosensory

ImunoesejePrincip metody je založen na přidání malého

množství značené protilátky nebo antigenu k studované směsi antigen-protilátka a stanovení této značené komponenty ve výsledném imunokomplexu. Množství značené komponenty v imunokomplexu je závislé na koncentracích výchozích neznačených komponent.

Nezbytnou podmínkou využití těchto metod pro analýzu antigenů je, aby antigen byl rozpustný v pufru zhruba fysiologického pH, osmolarity a bez detergentů rušících vazbu antigen-protilátka.

ImunoesejeDle provedení :

• Homogenní

• Heterogenní – jedna z komponent (Ag nebo Ab) je navázána na pevnou fázi

Dle značení :

• Značení radioisotopem (RIA)

• Značení enzymem (EIA)

• Značení fluoreskujícími barvičkami

Značení přímé

Značení nepřímé – často využívané pro značení protilátky (primární protilátka je neznačena a pak se použije druhá protilátka ,která je druhově specifická a nese značku (tento typ značené protilátky je běžně komerčně dostupný)

Imunoesej s ukotveným antigenem

V základní podobě se využívá pro stanovení specifických Ab proti ukotvenému antigenu (obvykle s nepřímým značením)

Imunoesej s ukotvenou protilátkou

Sandvičová imunoesej

Opláchnutí a inkubace se sekundární protilátkou vhodně značenou (enzymem či radioisotopem)

Stanovení antigenu kompetetivní EIA s ukotveným antigenem

Koncentrace antigenu

Kompetetivní EIA na ukotveném antigenu

Imunoblotování (Western blotting)

• kombinuje separační účinnost gelové elektroforesy se specifitou detekce na basi vazby antigen-protilátka

• semikvantitativní metoda

• umožňuje sledovat i antigeny nerozpustné v běžných pufrech

Imunoblotování – princip metody• separace jednotlivých vzorků gelovou

elektroforesou (obvykle SDS-PAGE)• přenos rozdělených polypeptidů z gelu na vhodnou

membránu (nitrocelulosu)• blokování nespecifických vazebných míst

membrány • inkubace membrány se specifickou protilátkou

(primární protilátkou)• inkubace s druhou protilátkou vhodně značenou

(tzv. sekundární Ab) proti imunoglobulinům zvířecího druhu primární protilátky

• detekce specifických antigenů pomocí značení

Mapování epitopu. Imunobloty tryptických štěpů COMP

0 mmol/l Ca2+

0°C, 30 min12.5 mmol/l Ca2+ 37°C 6hod 12.5 mmol/l Ca2+

0°C, 30 min

Densitometrické hodnocení imunoblotů COMP ze synoviální tekutiny s třemi různými monoklonálními protilátkami

Tvorba precipitujícího imunokomplexu

Heidelbergerova precipitační křivka

Imunosensory• princip je podobný heterogenní EIA, ale

stanovení imunokomplexu se provádí bez značené komponenty měřením elektrických či optických změn na sensoru s navázaným imunokomplexem

• QCM (quartz crystall microbalance) - pokles frekvence oscilátoru s křemenným krystalem je úměrný hmotě navázané na povrch křemenného krystalu

• SPR (surface plasmon resonance) - optického jev vznikajícího na tenkých vrstvách nebo na nanočásticích je úměrný celkové adsorbované hmotě na povrchu tenké vrstvy či nanočástic