Imunohistochemické metody

Embed Size (px)

DESCRIPTION

Imunohistochemické metody. stanovení Ag či Ab Reakce: Ag + Ab → IK - imunokomplex - jeden z reaktantů nese značku: radioaktivní (Ria) - fluorescenční (Fia) - enzymatickou (Eia) a další. EIA, IMUNOENZYMOVÉ METODY. - PowerPoint PPT Presentation

Text of Imunohistochemické metody

  • Imunohistochemick metody

    stanoven Ag i Ab

    Reakce: Ag + Ab IK- imunokomplex - jeden zreaktant nese znaku: radioaktivn (Ria) -fluorescenn (Fia) -enzymatickou (Eia)a dal

  • EIA, IMUNOENZYMOV METODYPodstata: tyto metody pracuj tak santigenem a protiltkou, kter vak stanovuj na zklad oznaen jednoho zreaktant enzymem.Vhody: ekonomitj (levnj ne RIA), asov mn nron, citlivost (nap. Ag sMr 10 000 lze urovat u pi koncentraci 10pg/ml, 10-12 mol/l), vysok specifita). Jsou vhodn pro automatizaci a vyhodnocen pes pota, bezpenj, del doba expirace, lep kontrolovatelnost reakce

  • Dlen EIA:podle toho, zda aktivita enzymu vkonjugtu zstane nezmnn nebo jestli se zmn, oddlovn znaench sloek, stanoven ltekhomogenn EIA: katalytick aktivita vkonjugtu (AgE,HE, AbE) ve vazb (po vazb) sAb (Ag) se mnheterogenn EIA: katalytick aktivita vkonjugtu sAb (Ag) se nemn

  • Homogenn EIA ( enzyme immunoassay technique): pi tto metod se nemus oddlovat voln znaen reaktant od zn. reaktantu vzanho v vimunokomplexu metoda m 1 krok je homogennenzymov aktivita konjugtu se po vazb na Ab me snit nebo zvitStanoven nzkomol. ltekPrincip: enzymov aktivita volnho konjugtu enzymu je jin ne aktivita komplexu konjugt-protiltka (nebo AgE,HE), i konjugt-Ag.

  • Nechme-li zreagovat sms znmho zn mnostv enzymem znaenho haptenu (AgE,HE) a neznmho mnostv neoznaenho haptenu (Ag,H) slimitovanm mnostvm Ab, aktivita enzymu je pmo mrn mnostv konjugtu navzanho na protiltku.

    HEzn + H + Ab HE-Ab + H-Ab + HEzn +H limit.mno. aktivita E je mrn mnostv konjugtu navzanho na Ab

  • Schma homogenn EIA-varianty reaktivity a nereaktivityA)Enzymov aktivita konjugtu po vazb na Ab se inhibuje:substrt se me vzat na katalytick msto enzymu a lze tuto aktivitu mitE + H + S aktivita

  • protiltka se navzala na konjugt E + H. Zabrnila tak pstupu substrtu ke katalytickmu mstu enzymu. E aktivitu nelze mit (inhibice).EH + Ab = EH-Ab bez aktivity

  • Pidan voln H vytsn zvazbovch mst protiltky konjugt EH a tm se uvoln katalytick msto pro Sa Enzymov aktivita se obnov EH Ab + H EH + H Ab aktivita se obnov

  • B) Enzymov aktivita konjugtu po vazb na Ab se aktivujesubstrt se neme navzat na katalytick msto enzymu, nebo vazbou H vznikly vmolekule enzymu tak konforman zmny, kter znemouj vazbu. E aktivita je nemiteln.

  • Vazbou haptenu na Ab vznikly opt konforman zmny, kter umouj pstup substrtu ke katalytickmu mstu. E aktivita je miteln.

  • Pouit enzym: lysozym, maltdehydrogenza, glukzo-6-fosftdehydrogenza.Pouit: na kvantitativn stanoven pedevm nzkomolekulrnch ltek (hapten), nap. uren koncentrace antibiotik, omamnch ltek, hypnotik, sedativ, kardiotonik, cytostatik a hormon jako tyrozin, trijdtyronin, kortizol aj.Vhoda: jednoduchost, rychlost (trv nkolik minut) heterogenn trv nkolik hodin.Nevhoda: ni citlivost, sloit pprava reagencDal vlastnoti homogenn EIA

  • Heterogenn EIAZde se mus oddlit voln reaktant od znaenho reaktantu vzanho vkomplexu sAb. Technika je dvoustupov heterogenn.Zpsob oddlen:1. precipitac imunokomplex polyetylenglykolem 2. pomoc druh sekundrn Ab3. nejastj: imobilizac jedn zdvojic reaktant navznm na tuh nosi (stna zkumavky, jamka destiky). Oddlen voln a vzan oznaen sloky se uskuteuje promytm. Jde o princip imunoadsorbentov analzy = ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY = ELISAPoadovan vlastnosti enzym: mal Mr, vysok stabilita a enzymov aktivita, kovalentn vazba na Ab, hapteny, Ag, produkt enzymov reakce mus bt dostaten barevn i jinak detekovateln, levn , dostupn.Pouvan enzymy: peroxidza (kenov), alkalick fosfatza, -D-galaktozidza

  • Zkladn sloky systmu ELISAImunosorbn povrch (pevn fze): pouv se upraven polystyrn ve form mikrotitranch destiek, kuliek, heben, pruh. Dleit je vhodn polymerizan teplota a dlka polymerizace. Pi pehnan vysokch sorbnch vlastnostech by dochzelo knavzn nedoucch ltek, a tm ke snen citlivosti a specifity reakce. Pi nzkch sorbnch vlastnostech by nezabezpeovalo dostaten souvisl a stabiln imunosorbn povrch (nestabilita a nespolehlivost systmu vede ksnen citlivosti a reprodukovatelnosti). Pouv se koncentrace 1 10mikrogram/ml proteinu v karbontovm pufru o ur. pHImobilizace antigenu na pevn nosiAntigen se ve pasivn adsorpc, proces se nazv coating-koutovnPouvaj se destiky s plochm dnem kvli fotometrickmu stanoven

  • Vazba protein je ovlivnna: kapacitou adsorpce, povahou protein, teplotou a pH vazebnho roztoku, dobou adsorpce a koncentrac vazebnho proteinuPromvn-elem je oddlit navzan a nenavzan reagenty, promv se 3x, nesm vzniknout bubliny-brn kontaktu promvacho roztoku s povrchem bunkBlokovn- k eliminaci nespecifickch vazeb mezi proteiny a volnmi vazebnmi msty, blokovac roztoky obsahuj: hovz srov albumin nebo kasein, elatina, suen mlko atdKonjugt: specifick Ab (mono- nebo polyklonln) s vhodnm navzanm enzymem.Ten pak reaguje se substrtem a vytv vptomnosti vhodnho chromogenu dostaten intenzvn barevnou reakci. Zastaven reakce: v dob, kdy se vztah mezi enzymem, substrtem a produktem nachz v linern fzi silnou kyselinou i zsadou. Zpsob denaturaci enzym. Pidnm zastavovacho roztoku se mn absorbn spektrum produktu

  • Substrt: pi pouit konjugtu speroxidzou jako chromogen slou (ortofenyln- diamin hydrochlorid = OPD, kyselina aminosalicylov, atd) kter vptomnosti peroxidu vodku jako substrtu katalyztoru vyvolaj barevnou reakci.Pstroje: ELISA reader je spektrofotometr upraven na odetn absorbance vreaknch jamkch. Filtry jsou nastaven svolitelnou vlnovou dlkou optimln pro urit ELISA systm (obvykle mezi 405 a 570 nm) vzvislosti na typu pouitho konjugtu a substrtovo - chromogennm roztoku.

  • Hodnocen a standardizace testNesledujeme absolutn hodnotu absorbance, ale jej prustek k blankuVzorky meme testovat kvalitativnm i kvantitativnm zpsobemKvalitativn: je teba znt pozitivn, negativn kontroly a hranin hodnotu (cut off). Za pozitivn lze povaovat hodnoty statisticky odliiteln od vzorku s nulovou koncentrac vyetovanho agens.V praxi se hranin vzorek stanov vyetenm nkolika destek hraninch kontrol, 1. pak se uvauje hodnota X +3sd (X je hodnota negativn kontroly) (sd smrodatn odchylka), 2. neg. kontrola se nsob slem2,1 3. hodnoty de vlo do grafu a vypotaj se intervaly podle prmru hodnot

  • Kvantitativn: vyuvaj se kalibran kivky vzorku. Vzorek je nutn vyetovat ve dvou nebo vce zednch, aby bylo jist, e se koncentrace Ag ve vzorku nachz v oblasti kalibran kivkyIndex pozitivity: IP

  • Typy ELISA:sendviov ELISA pro Ag (kompetitivn a nekompetitivn)kompetitivn ELISA pro Ag nebo haptenypm ELISA pro Agsendviov ELISA pro Ab = nepm pro AbELISA pro zachycen IgMPouit: Stanoven pi prkazu neinfeknch Ag, na kvantitativn stanoven nzko- i vysokomol. ltek (stanoven hormon: tyrozin, trijdtyrozin, prolakton, inzulin - fetoprotein atd, lk: teofylin, dioxin aj., a protein: IgE, AFP alfa fetoprotein, CEA cefalosporin AStanoven autoprotiltekPrkaz vir, bakteri a parazitickch nkazPi diagnostice onemocnn vyvolanch obtn kultivovatelnmi pvodci (viry hepatitidy, borrelie, mykoplazmata atd.)

  • Sendviov ELISA pro antigenyNa tuhou fzi se nave Ab. Na ni se potom navazuje znm nebo neznm mnostv antigenu. Promyt.Pid se voln enzymem znaen Ab, kter reaguje svolnmi hapteny antigenu imobilizovanho vazbou do komplexu sAb. Inkubace, promyt, pidn S. Pid se substrt na detekci enzymov aktivity.

  • Legenda:Znamench hodnot standardnch vzork se sestroj analytick ra (kalibran kivka), podle kter se vyhodnot vzorky sneznmou koncentrac zkoumanho Ag.Vhoda: nemus bt kdispozici znaen ist Ag. Sta jen standardn Ag teba i ve sloit smsi jinch Ag (napklad lidsk srum). Mus vnm vak bt pesn znm obsah analyzovanho Ag. Ab se me oznaovat enzymem vdy tou stejnou konjugan reakc.Nutnost: ob Ab mus mt stejnou specifickost. Ag mus mt nejmn 2 determinanty (reaguj snm 2 molekuly Ab).

  • Kompetitivn pm ELISA pro Ag a nebo hapteny stanoven AgNa tuhou ltku se nave Ab specifick pro Ag, kter se m stanovit Pak se pid znm mnostv enzymem znaenho Ag (AgE) a bu znm (standardn) mnostv nebo neznm (analyzovan) mnostv neoznaenho Ag (Ag) V prbhu inkubace sout znaen sneoznaenm (standardnm zkoumanm) Ag. Po promyt zstvaj jen Ag vzan na Ab.Pak se pid roztok substrtu, kter enzym ptomn vimunokomplexech rozlo za vzniku barevnho produktu

  • Legenda:Intenzita (absorbance) zbarven roztoku sproduktem enzymov reakce se m spektrofotometricky. Zhodnot absorbanc namench vjamkch se znmm (standardnm) mnostvm Ag se sestroj analytick ra (kalibran kivka), pomoc kter se ur koncentrace analyzovanch roztok Ag.

  • Pm ELISA pro antigeny, (kompetitivn), uren % inhibiceAg se nave na tuhou fzi a reakn prostor se promyje. Pokud jde o mal Ag, nave se pedem na vt nosi, nap. BSA. Zkouman roztok, ve kterm se pedpokld ptomnost Ag, se mch se specificky znaenou Ab a sms se inkubuje simobilizovanm Ag. Inkubace, promyt a pidn substrtu, m se vyvol barevn reakce.

  • Legenda:Rozdl namen absorbance ve vzorku svolnm Ag a vkontroln jamce (bez volnho Ag) uruje mnostv Ag ve zkoumanm vzorku. Je to kompetitivn ELISA, ve kter o vazbov msta Ab sout Ag ve zkoumanm vzorku (voln) a Ag imobilizovan. m vc Ag bude ve vzorku, tm mn Ab se me navzat na imobilizovan Ag a tm men barevn intenzita bude vreaknm roztoku. Nejvce zbarven roztok bude vkontroln jamce, kde reakn sms neobsahovala voln Ag. Modifikace: msto oznaen Ab se pouije neoznaen Ab (nap. krli IgG) a imobilizovan Ag se detekuj pomoc oznaenho Ig ve funkci sekundrn Ab (nap. praseho IgG proti krlimu IgG).Ag + (srum+Ag) +AbE + S barevn reakcevirus + (IgG + Ag)+anti IgGE + S barevn reakceVhoda: monost pouit komern dostupn oznaen Ab.

  • Sendviov ELISA pro protiltkyNeboli nepm ELISA na detekci Ab slou na dkaz neboli titraci Ab specifickch pro urit Ag. Pouit: na titraci Ab tdy IgG + IgM.Antigen se nave na tu