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IMUNOLOGIA
Margherita Anna Barracco
Laboratório de Imunologia Aplicada a Aquicultura, Departamento de Biologia Celular,
Embriologia e Genética (BEG), Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC).
Patrícia Mirella da Silva
Université de Bretagne Occidentale; Institut Universitaire Européen de la Mer, LEMAR-
Laboratoire des Sciences de l'Environnement Marin (UMR 6539), Brest – França.
Título curto: Hemolinfa e sistema imune de Perna perna
Palavras –chave: sistema imune; hemolinfa; hemócitos; parâmetros hemato-imunológicos;
reações imune celulares; reações imune humorais; moluscos; bivalves; Perna perna.
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1. INTRODUÇÃO
Assim como outros invertebrados, o mexilhão Perna perna apresenta um sistema
imune inato e natural, diferentemente dos vertebrados que além deste, possuem ainda um
sistema imune adaptativo altamente específico e com memória imunológica. Este último
envolve a produção de uma infinidade de anticorpos e receptores celulares específicos,
capazes de reconhecer uma surpreendente variedade de antígenos (epítopos) e desencadear
respostas de defesa altamente complexas e eficientes. Por outro lado, a produção de células de
memória durante uma infecção primária garante uma proteção específica e eficaz contra uma
re-infecção pelo mesmo agente patogênico e constitui a base do mecanismo de vacinação nos
vertebrados. A ausência de memória imunológica em invertebrados inviabiliza, assim,
qualquer iniciativa de desenvolvimento de vacinas, na concepção clássica da palavra,
limitando sobremaneira a possibilidade de se prevenir e controlar infecções, neste vasto grupo
zoológico que representa mais de 95% das espécies animais viventes.
Embora os bivalves marinhos, incluindo o mexilhão P. perna, não possuam o sistema
imune adaptativo altamente específico dos vertebrados, estes são um grupo filogeneticamente
antigo e bem sucedido, capaz de sobreviver em equilíbrio e harmonia em um ambiente
aquático rico em microrganismos variados, incluindo bactérias, fungos, protozoários e
microalgas. Alguns destes microrganismos podem viver como comensais, outros fazem parte
de sua microbiota trazendo-lhes benefícios fisiológicos e outros, ainda, considerados
parasitas, podem ser nocivos provocando infecções e ameaçando sua sobrevivência. Os
bivalves marinhos devem, portanto, ter desenvolvido, durante a evolução, estratégias
eficientes de discriminação de microrganismos benéficos dos potencialmente nocivos e de
proteção contra estes últimos. Estas estratégias estão relacionadas à presença de concha, que
funciona como uma barreira mecânica muito eficiente e ao sistema imunológico, que assegura
a integridade corpórea dos bivalves quando estes são invadidos por microrganismos e
parasitas patogênicos e/ou oportunistas.
A hemolinfa dos bivalves e seu papel no sistema imune vêm despertando recentemente
grande interesse, devido principalmente às explosões epidêmicas, muitas vezes devastadoras.
O objetivo deste capítulo foi o de apresentar uma revisão do conhecimento sobre os aspectos
imunológicos do mexilhão P. perna, embora, em muitas ocasiões, houve a necessidade de se
compilar informações descritas para outras espécies de bivalves, principalmente mitilídeos,
devido a ausência das mesmas em P. perna.
2. SISTEMA CIRCULATÓRIO E CÉLULAS IMUNOCOMPETENTES
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O sistema circulatório dos moluscos bivalves, entre eles o de Perna perna, está
representado por um coração, artérias, veias e pelo líquido circulante ou sangue, denominado
hemolinfa. O coração está encerrado em uma cavidade pericárdica localizada na parte dorsal
do corpo e se compõe de um ventrículo e duas aurículas laterais. A hemolinfa é bombeada do
ventrículo para duas artérias principais, que se ramificam e que conduzem a hemolinfa através
de sub-ramos até espaços abertos, denominados seios, localizados nos tecidos e órgãos,
constituindo assim um sistema circulatório aberto. A hemolinfa pode retornar dos seios
hemolinfáticos ao coração através de um sistema venoso que passa primeiro pelos rins e
depois pelas brânquias, alcançando, em seguida as aurículas (Fig. 1).
A hemolinfa é composta de células circulantes ou hemócitos, que são os principais
efetores imune celulares, e o plasma, que contém uma série de moléculas, muitas das quais
participam das respostas imune humorais. Embora muitos dos mecanismos imunes celulares
nos quais participam os hemócitos já estejam caracterizados, falta ainda elucidar, com
precisão, em que local se dá a hematopoiese nos bivalves. A hipótese mais aceita, embora
ainda não confirmada, é a de que os hemócitos se formariam a partir da diferenciação de
células do tecido conjuntivo (Cheng, 1981; Hine, 1999). Por outro lado, a ontogênese dos
hemócitos também é um processo pouco elucidado.
A classificação dos hemócitos de bivalves é um tema particularmente controverso.
Dentre as classificações propostas, destacam-se as de Cheng (1981) e Hine (1999). De modo
simplificado, os autores reconhecem duas populações básicas de hemócitos em bivalves:
hemócitos granulares (HG), que apresentam grânulos em seu citoplasma e hemócitos hialinos
(HH) com poucos ou nenhuns grânulos no seu interior. O único grupo de bivalves que, até o
momento, parece ser uma exceção é o dos pectinídeos que não apresentam HG (Auffret,
1988; Vargas-Albores & Barracco, 2001). Os HH podem compreender dois subtipos
celulares: células indiferenciadas ou blásticas, com uma alta relação núcleo-citoplasma e
células basófilas maiores, semelhantes aos macrófagos. Já os HG formam um grupo celular,
que compreende vários subtipos, que são definidos de acordo com as características
morfológicas e tintoriais de seus grânulos. Alguns autores consideram os HH e os HG como
duas linhagens celulares distintas (Cheng, 1981; Auffret, 1988), enquanto outros sugerem que
os HH sejam originariam os HG por maturação (Hine, 1999).
Como esperado, a hemolinfa dos mexilhões Mytilus edulis e M. galloprovincialis
contém as duas categorias de hemócitos, HH e HG. Em M. edulis se reconhecem dois
subtipos de HG, um com grânulos pequenos e basófilos e outro com grânulos grandes e
acidófilos (Pipe et al., 1997). Estas células diferem ainda quanto às suas características
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ultraestruturais (Pipe et al., 1997), tipos de enzimas hidrolíticas e antígenos de superfície
(Hine, 1999). Da mesma forma, em M. galloprovincialis, foram identificados HG acidófilos,
basófilos e um terceiro tipo celular com os dois tipos de grânulos (Carballal et al., 1997a).
Estes resultados parecem indicar a existência de sub-populações distintas de HG ou que os
diferentes tipos de HG representem fases distintas de maturação de um mesmo tipo celular.
No que se refere ao mexilhão P. perna, Barracco et al. (1999) caracterizaram pela
primeira vez morfológica e funcionalmente os hemócitos desta espécie. Os autores também
distinguiram os dois tipos de hemócitos descritos nos outros mitilídeos. Os HG de P. perna
são células arredondadas ou ovóides (6-14 µm) com um núcleo excêntrico que se aderem e
espraiam sobre o vidro emitindo finos pseudópodos (Fig. 2C) e apresentam abundantes
grânulos citoplasmáticos acidófilos na coloração Giemsa (Fig. 2F, H). Ao contrário das outras
espécies de mexilhões, os autores não observaram HG com grânulos basófilos em P. perna. Já
os HH, são células que não contêm grânulos e cujo citoplasma é basófilo na coloração Giemsa
(Fig. 2D, E, G, H). Também emitem finos pseudópodos quando aderidos ao vidro (Fig. 2A,
B). Distinguem-se dois tipos de HH na hemolinfa de P. perna, células pequenas e
indiferenciadas (5-7 µm), com alta relação núcleo-citoplasma e células maiores (7-12 µm)
com um citoplasma mais abundante e núcleo geralmente polimórfico (Fig. 2H).
3. REAÇÕES IMUNE CELULARES: FAGOCITOSE E ENCAPSULAMENTO
Quando agentes infecciosos passam pela barreira externa do corpo do bivalve (concha
e epitélio), desencadeia-se um processo inflamatório onde os hemócitos movem-se em direção
ao estímulo, resultando em uma intensa infiltração hemocitária no tecido conjuntivo adjacente
às áreas infectadas. A resposta de defesa desencadeada pelos hemócitos contra os invasores
varia de acordo com seu tamanho. No caso de parasitas grandes ou metazoários, a reação
denomina-se encapsulamento. Neste caso, os hemócitos se depositam em várias camadas em
volta do parasita, formando cápsulas celulares onde o parasita aprisionado é posteriormente
destruído. No caso de microorganismos como bactérias e protozoários, a resposta é
geralmente a fagocitose. A fagocitose, primeira linha de defesa nos organismos metazoários,
envolve o reconhecimento do corpo estranho, o contato entre a superfície de ambas células e a
ingestão e degradação intracelular do microorganismo invasor. Os diversos mecanismos que
participam na sua destruição ou neutralização estão descritos abaixo. Dentre as células da
hemolinfa, os HG são, as de maior capacidade fagocítica (Vargas-Albores & Barracco, 2001).
O processo de fagocitose foi comprovado em várias espécies de bivalves, incluindo os
mexilhões M. edulis (Noël et al., 1993) e M galloprovincialis (Carballal et al., 1997b).
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No mexilhão P. perna, Barracco et al. (1999) confirmaram a capacidade dos hemócitos
em fagocitar leveduras Saccharomyces cerevisiae e zimosan (fragmentos da parede de
leveduras, ricos em ß-1,3-glicanas). Os HG foram mais eficientes na fagocitose que os HH,
em ambos casos, e foram capazes de manter uma alta capacidade fagocítica, mesmo quando
os animais eram expostos à altas concentrações de óleo diesel (Pires et al., 2003).
A formação de cápsulas em torno de parasitas metazoários foi descrita nos mexilhões,
M. edulis infectados pelos trematódeos Proctoeces maculatus (Feng, 1988) e Prosorhynchus
crucibulum (Santos & Coimbra, 1995) e em M. galloprovincialis infectados por P. maculatus
(Villalba et al., 1997).
Em P. perna infectados naturalmente pelo trematódeo Bucephalus sp. não houve
encapsulamento, nem destruição dos esporocistos deste parasita pelos hemócitos (Lima et al.,
2001; da Silva et al., 2002) (Fig. 3A). No entanto, em infecções severas e avançadas, foi
possível observar uma resposta inflamatória intensa, com aumento significativo da
porcentagem de hemócitos infiltrados no tecido conjuntivo (da Silva et al., 2002). Por outro
lado, quando os hemócitos de P. perna foram desafiados in vitro com cercárias e outras
formas intermediárias de Bucephalus sp., liberadas pelos esporocistos e fixadas com
formaldeído, os hemócitos foram capazes de aderir e encapsular estas formas larvais,
circundando-as com várias camadas celulares (Fig. 3B, C). Estes resultados parecem indicar
que em mexilhões naturalmente infectados por Bucephalus sp., as larvas do parasita poderiam
liberar fatores imunosupressores capazes de inibir o processo de encapsulamento, o que não
ocorreria nos ensaios in vitro com larvas fixadas. Ainda em P. perna, foram observados
ocasionalmente metazoários encapsulados, correspondendo aparentemente ao metacestódeo
Tylocephalum sp., tanto nas brânquias (Lima et al., 2001) como nas gônadas (Fig. 3D).
4. PROCESSOS LÍTICOS E MICROBICIDAS:
4.1 Enzimas degradativas e espécies reativas de oxigênio (ERO) e de nitrogênio
Dentre os processos de neutralização e degradação dos microrganismos em bivalves,
destacam-se as enzimas hidrolíticas lisossomais e outras classes de enzimas presentes
principalmente nos grânulos dos HG (Chu, 2000). Durante a fagocitose, pode ainda ocorrer a
liberação do conteúdo enzimático dos lisossomos para o plasma, a partir da degranulação dos
HG. Uma das enzimas liberadas é a lisozima, capaz de romper os polissacarídeos complexos
de paredes bacterianas.
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Além do vasto conjunto de enzimas degradativas, existem ainda em bivalves, outros
mecanismos de neutralização de organismos invasores. Quando microrganismos e parasitas
são fagocitados ou encapsulados pelos hemócitos, estas células sofrem um processo de
ativação e aumentam consideravelmente seu consumo de oxigênio, num processo chamado de
choque respiratório. Neste processo, que ocorre tanto nos vertebrados como nos
invertebrados, verifica-se a grande produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e de
nitrogênio, que são moléculas transitórias altamente tóxicas e microbicidas. Estes
oxidoradicais podem assim reagir com qualquer estrutura/molécula que esteja próxima,
funcionando como agentes microbicidas potentes, mas podendo também provocar danos
celulares importantes aos próprios fagócitos (Anderson, 1996). A produção de ERO inicia-se
com a ativação de um sistema enzimático, denominado NADPH oxidase, que está associado
às membranas dos fagócitos e catalisa a redução do oxigênio molecular para ânion superóxido
(O2-). Este, por sua vez, pode ser convertido espontaneamente ou através da enzima
superóxido dismutase (SOD) em peróxido de hidrogênio (H2O2) ou pode reagir com o óxido
nítrico (NO), produzindo peroxinitrito (ONOO-), composto extremamente tóxico, capaz de
provocar danos importantes às membranas celulares, proteínas e DNA. Já, o peróxido de
hidrogênio, sob a ação da enzima mieloperoxidase e em presença de cloro, pode gerar o ácido
hipocloroso (HOCl-) que é, por sua vez, um agente microbicida potente. Além destes
compostos, podem ainda ser geradas outras ERO, como o radical hidroxila (.OH) e o oxigênio
singlet (1O2) que também apresentam efeitos citotóxicos e microbicidas. Cabe, contudo,
salientar, que paralelamente a sua ação microbicida potente, estes oxidoradicais, podem
também acarretar danos importantes aos tecidos do próprio hospedeiro. Para neutralizar este
efeito, existem mecanismos de defesa antioxidantes, que podem ser tanto enzimáticos como
não enzimáticos e atuam na eliminação das ERO ou na transformação destes radicais em
produtos menos tóxicos. Os antioxidantes não enzimáticos, como as vitaminas C, E e o β-
caroteno, são exógenos, ou seja, necessitam ser absorvidos via alimentação. Já, os
antioxidantes enzimáticos são sintetizados pelo próprio organismo e incluem uma série de
enzimas, como a glutationa-peroxidase, a catalase e a já mencionada SOD (Anderson, 1996).
Em bivalves, a produção de ERO foi particularmente bem demonstrada nos mexilhões
M. edulis e M. galloprovincialis (vide revisão de Vargas-Albores & Barracco, 2001).
No que diz respeito ao mexilhão P. perna, a produção de ERO foi estudada nos
hemócitos deste bivalve durante o processo de fagocitose in vitro de zimosan (Barracco et al.,
1999) e após exposição destes animais a diferentes concentrações de óleo diesel (Pires et al.,
2003). Foi possível demonstrar uma surpreendente capacidade dos hemócitos em fagocitar
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estas partículas e de produzir espécies reativas de oxigênio (Fig. 4A-C). Por outro lado, a
exposição dos mexilhões a altas concentrações de óleo diesel não resultou em uma diminuição
significativa do índice fagocítico ou da capacidade de gerar O2- (Pires et al., 2003).
4.2 Peptídeos antimicrobianos (PAMs) .
Proteínas e peptídeos antimicrobianos constituem um dos componentes do sistema
imune inato dos vertebrados e invertebrados que vem recentemente despertando grande
interesse. Estes efetores imunológicos apresentam uma grande diversidade estrutural e de
propriedades biológicas, podendo apresentar uma atividade antimicrobiana rápida e potente
contra um amplo espectro de microrganismos. Podem atuar contra bactérias, fungos,
leveduras e, em alguns casos, até contra vírus e protozoários (vide revisão de Bulet et al.,
2004). Atualmente mais de 700 PAM foram descobertos em plantas, vertebrados e
invertebrados, sendo a maioria proveniente de insetos (vide revisão de Bachère et al., 2004;
Bulet et al., 2004). Os PAM são moléculas catiônicas e anfipáticas, sendo usualmente de
baixo peso molecular (abaixo de 10 kDa). Seu efeito microbicida manifesta-se geralmente por
uma ação sobre a membrana dos microrganismos, resultando na formação de poros, ou numa
desestabilização mais ampla da bicamada lipídica, sendo que ambos processos levam a um
desequilíbrio iônico ou ao extravasamento do conteúdo citosólico, causando a morte do
microrganismo. Alguns PAM podem ainda ser interiorizados, num processo mediado por
receptor, e interferir em alguns processos metabólicos, levando a morte do microrganismo
(Bachère et al., 2004; Bulet et al., 2004). Nos invertebrados, onde não existe um sistema
imune adaptativo com a alta especificidade e memória dos vertebrados, os PAM assumem,
assim, uma função crucial na prevenção e controle de infecções.
Em moluscos, os PAM foram descritos, apenas, muito recentemente, na hemolinfa dos
mexilhões M. edulis (Charlet et al., 1996) e M. galloprovincialis (Hubert et al., 1996; Mitta et
al.,1999a,b; 2000a,b). Nesta última espécie, a caracterização bioquímica, molecular e
funcional destes peptídeos foi realizada em grande detalhe. Foram identificados 3 grupos de
PAMs em M. galloprovincialis por abordagem bioquímica e clonagem molecular: defensinas,
mitilinas, miticinas. Todos são peptídeos catiônicos, ricos em cisteína e foram isolados a
partir dos hemócitos. Além destes, foi ainda identificado um outro peptídeo no plasma de M.
edulis, com atividade estritamente antifúngica, denominado mitimicina (Charlet et al., 1996).
As defensinas e miticinas atuam principalmente contra bactérias Gram(+) e fungos
filamentosos, enquanto as mitilinas apresentam um maior espectro de atividade, incluindo
também bactérias Gram(-) e vibrios marinhos (Mitta et al., 2000a). Os PAM de M.
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galloprovincialis são produzidos de forma constitutiva, não ocorrendo uma indução e resposta
sistêmica durante as infecções. São sintetizados nos hemócitos, sob forma de peptídeos
precursores e armazenados nos grânulos até o momento de atuar nas infecções. Cabe ainda
ressaltar, que até o momento não existem relatos de PAM isolados, ou seqüências gênicas
determinadas, em outras espécies de moluscos.
Um outro aspecto de crucial importância, também estudado por Mitta et al. (2000a),
refere-se ao estabelecimento da fase do desenvolvimento ontogenético em que se inicia a
produção destes fatores antimicrobianos em M. galloprovincialis. Os autores demonstraram
que sua produção inicia-se durante (mitilinas) ou após (defensinas) a metamorfose, sugerindo
que as larvas deste mitilídeo não dispõem de um sistema imune maduro, devendo ser mais
susceptíveis a infecções bacterianas. Efetivamente, a susceptibilidade de larvas a infecções
bacterianas, principalmente a vibrioses, é um fenômeno bem conhecido em bivalves, podendo
ocasionar grandes mortalidades e perdas econômicas importantes. As mitilinas, cuja síntese
inicia-se apenas durante a metamorfose, são muito potentes contra diferentes espécies de
vibrios patogênicos (V. harveyi, V. alginolyticus, V. vulnificus e V. splendidus) e sua ausência
em larvas poderia explicar sua especial facilidade em contrair vibrioses (Mitta et al., 2000a).
No que se refere ao mexilhão P. perna, não existem, até o momento, relatos sobre a
presença de PAM em seus hemócitos. Numa avaliação da atividade antimicrobiana da
hemolinfa deste bivalve, encontramos uma ação antibacteriana, tanto da sua fração celular
quanto da plasmática, contra bactérias Gram(+) (Micrococcus luteus e Aerococcus viridans) e
Gram(-) (Enterobacter cloacae), mas não contra vibrios marinhos (V. alginolyticus e V.
harveyi) e fungos filamentosos (Microsporum canis e Tricophyton mentagrophytes) (dados
não publicados). Frente a estes resultados, fizemos uma tentativa de identificar mitilinas e
defensinas nestas células, por imunomarcação e por abordagem genômica (RT-PCR). Na
imunomarcação, os hemócitos de P. perna foram tratados com anticorpos monoespecíficos,
produzidos contra defensinas e mitilinas de M. galloproviancialis. Os resultados foram
positivos para ambos peptídeos, evidenciando a presença de moléculas semelhantes a estes
PAMs nos hemócitos de P. perna (Fig. 5A-C). Por outro lado, através de abordagem
genômica, utilizando-se oligonucleotídeos desenhados a partir das seqüências codificadoras
de mitilinas e defensinas de M. galloprovincialis, não foi possível amplificar nenhuma
sequência que correspondesse a estes peptídeos em P. perna até o momento. Em contraste,
utilizando-se os mesmos oligonucleotídeos, encontramos curiosamente seqüências
codificadoras para ambos peptídeos na ostra do mangue Crassostrea rhizophorae (dados não
publicados). Estes resultados surpreendem, uma vez que P. perna é filogeneticamente mais
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próximo de M. galloprovincialis do que a ostra C. rhizophorae. Todavia, a busca de PAM em
P. perna continua sendo tema de pesquisa em nosso laboratório e outras tentativas estão
sendo realizadas.
5. PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO
As proteínas de choque térmico (HSPs: do inglês heat shock proteins) são assim
denominadas porque a temperatura foi o primeiro fator descoberto que induziu a sua síntese
em larvas de Drosophila (Ritossa, 1962). Existem atualmente diferentes famílias de HSPs,
classificadas basicamente pelos seus pesos moleculares. Dentre estas, as HSP70 (68-72 kDa)
são as mais bem conservadas durante a evolução e as mais estudadas nos diferentes
organismos. Existem isoformas de HSPs que são induzidas em situações de estresse e
isoformas não-induzíveis (constitutivas) referidas como chaperonas. As isoformas
constitutivas estão presentes na célula em condições normais e estão envolvidas no transporte,
dobramento e montagem de proteínas sintetizadas pelas células. No entanto, sob condições
ambientais adversas a síntese de certas HSPs é aumentada para reparar e proteger as proteínas
celulares, facilitando seu dobramento correto e minimizando a agregação protéica. Uma
ampla variedade de fatores abióticos foi reconhecida como indutora da expressão de HSPs,
como temperatura, salinidade, anóxia e diferentes xenobióticos (Sanders, 1993). Desta forma,
as HSPs podem ser consideradas como biomarcadores potenciais de estresse ambiental.
Nos mexilhões M. edulis e M. galloprovincialis, a síntese de HSP70 e a indução de
termo-tolerância já foram referidas (Sanders, 1993; Snyder et al., 2001). Em M.
galloprovincialis, Snyder et al. (2001) demonstraram ainda a indução de HSP70 em animais
expostos ao cádmio e a hidrocarbonetos aromáticos policíclicos.
A grande maioria dos trabalhos sobre HSPs em bivalves refere-se a indução da síntese
de HSPs por fatores abióticos, em diferentes tecidos como brânquias e manto mas não em
hemócitos. Portanto, não se conhece ainda o efeito de infecções na produção de HSPs e sua
associação com a capacidade de defesa dos hemócitos. Dentre os poucos trabalhos existentes,
destaca-se o de Tirard et al. (1995) que estudou o efeito da temperatura sobre as HSP70 dos
hemócitos de C. virginica e do parasita Perkinsus marinus, verificando que o limiar de
temperatura para induzir a síntese de HSP nas células de P. marinus foi maior que para
induzi-la nos hemócitos, indicando que o parasita estaria funcionalmente capacitado mesmo
em condições de hipertermia, o que favoreceria sua estratégia de estabelecimento no
hospedeiro. Por outro lado, Encomio et al. (2005) estudaram a expressão de HSP70 em duas
populações distintas de C. virginica, uma resistente e outra suscetível à P. marinus e não
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encontraram variação significativa entre as populações ou entre as intensidades de infecção
por P. marinus. No entanto, é importante salientar que neste estudo, os autores utilizaram
brânquias e não hemócitos, o que poderia revelar resultados diferentes.
No que se refere a P. perna, nenhum estudo deste tipo foi realizado até o momento.
6. REAÇÕES IMUNE HUMORAIS E MECANISMOS DE RECONHECIMENTO
O mecanismo de reconhecimento do não-próprio é um processo crucial no
desencadeamento da resposta imune. Como descrito acima, os invertebrados não possuem as
moléculas de reconhecimento altamente específicas dos vertebrados. Possuem, contudo,
outras moléculas imunológicas (proteínas plasmáticas e receptores celulares) capazes de
reconhecer, com grande eficiência, padrões moleculares específicos e repetitivos, expressos
na superfície de diferentes microrganismos e parasitas, como as peptidoglicanas (PG) e
lipopolissacarídeos (LPS) da superfície de bactérias Gram(+) e Gram(-) respectivamente e as
β-1,3-glicanas da parede de fungos. Dentre estas moléculas de reconhecimento destacam-se
os receptores Toll, descritos em insetos (vide revisão de Ferrandon et al., 2004), as lectinas, o
sistema de ativação da pró-fenoloxidase (proPO) e o sistema de coagulação (vide revisão de
Vargas-Albores & Barracco, 2001).
6.1. Aglutininas e Lectinas.
Lectinas e/ou aglutininas são proteínas ou glicoproteínas com capacidade de se ligar
especificamente a açúcares expressos na superfície de diferentes células (padrões
moleculares), causando sua aglutinação. Esta propriedade deriva do fato destas moléculas,
assim como os anticorpos dos vertebrados, possuírem pelo menos dois sítios de ligação
(moléculas bivalentes), sendo assim capazes de aglutinar células que expressem determinados
açúcares na sua superfície. As lectinas foram inicialmente identificadas em plantas, mas hoje
se sabe que são de ocorrência ubíqua, sendo encontradas em todos os seres vivos, desde vírus
até mamíferos. Devido à sua propriedade de aglutinar células e de estarem envolvidas no
reconhecimento do não-próprio, as lectinas dos invertebrados foram inicialmente
consideradas análogas funcionais dos anticorpos dos vertebrados. No entanto, hoje é sabido
que são estrutural e funcionalmente distintas das imunoglobulinas dos vertebrados (Marques
& Barracco, 2000). Considera-se, atualmente, que as lectinas, tanto de vertebrados como de
invertebrados, sejam moléculas capazes de reconhecer e se ligar a padrões moleculares
específicos (açúcares), comumente expressos na superfície de microrganismos e parasitas,
sendo melhor definidas como pattern-recognition proteins ou PRP.
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Além da propriedade de reconhecimento e aglutinação, algumas lectinas de
invertebrados também foram descritas como capazes de aumentar a fagocitose dos
microrganismos com os quais reagiram, funcionando como opsoninas. O primeiro relato sobre
o aumento de fagocitose de bactérias (Vibrio anguillarum e Escherichia coli) pré-tratadas
com lectinas purificadas, foi na ostra Crassostrea gigas (Hardy et al., 1977). Além do mais, a
atividade aglutinante da hemolinfa de C. gigas foi ainda capaz de aumentar, após inoculação
de bactérias (Hardy et al., 1977; Olafsen et al., 1992). Também no mexilhão M. edulis, as
lectinas da hemolinfa mostraram-se capazes de estimular a fagocitose de leveduras pelos
hemócitos deste animal (Renwrantz, 1983).
No que diz respeito ao mexilhão P. perna, tal como esperado, sua hemolinfa também
apresenta uma atividade aglutinante contra diferentes tipos de eritrócitos (Barracco et al.,
1999; Pires et al., 2003), embora nenhuma lectina tenha sido bioquimicamente purificada
neste mexilhão até o momento. A atividade das lectinas plasmáticas de P. perna é cálcio-
dependente e específica para açucares N-acetilados, principalmente sialoglicoproteínas. Sua
atividade é inibida pelos LPS de Salmonella abortus e Pseudomonas aeruginosa, mas não
pelos LPS de Escherichia coli. Além do mais, a incubação do plasma de P. perna com as
bactérias P. aeruginosa e Serratia marescens levou a uma diminuição parcial da atividade
aglutinante (Couto, 2001). Estes resultados sugerem o envolvimento das lectinas de P. perna
no processo de reconhecimento e na resposta imune destes animais. Por outro lado, a injeção
de eritrócitos no músculo adutor de P. perna não levou a um aumento da expressão da
atividade aglutinante, sugerindo que estas moléculas não sejam induzíveis (Couto, 2001),
como referido em C. gigas (Hardy et al., 1977; Olafsen et al., 1992).
Cabe ainda salientar que a indução destas moléculas, principalmente em bivalves de
interesse econômico, como as espécies cultivadas, poderia ser de grande relevância, uma vez
que o aumento de seus níveis plasmáticos poderia conferir uma maior proteção a estes
animais e auxiliar na prevenção de infecções.
6.2. Cascatas proteolíticas - Sistema de coagulação
Tanto em vertebrados quanto em invertebrados, a invasão por microorganismos pode
desencadear um sistema de amplificação de resposta, representado por cascatas proteolíticas,
que levam a uma reação de defesa generalizada. Nos vertebrados, a principal cascata deste
tipo é o sistema complemento, que pode ser ativado direta ou indiretamente por
microorganismos, resultando na sua fagocitose ou destruição por formação de poros
membranosos. Nos invertebrados, a presença de componentes da parede de microorganismos
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também pode desencadear cascatas proteolíticas, sendo que duas delas foram particularmente
bem estudadas em artrópodes. A primeira corresponde ao sistema de coagulação, que foi
extensivamente estudada em limulídeos (vide revisão de Theopold et al., 2004). Neste
sistema, a presença de ß-1,3-glicanas, provenientes da parede de fungos e principalmente de
lipopolissacarídeos (LPS) da parede das bactérias Gram(-), provocam uma intensa
degranulação dos HG, liberando para o plasma uma série de fatores que desencadeiam uma
cascata proteolítica, que culmina com a formação de um gel de coagulação cujo principal
objetivo é de limitar a infecção.
Deve-se, no entanto, salientar que em outros artrópodes, como insetos e crustáceos,
ocorre um sistema distinto de coagulação, que não envolve cascatas proteolíticas e onde a
polimerização das proteínas de coagulação se dá através de enzimas transglutaminases
dependentes de cálcio (Theopold et al., 2004).
Em bivalves, um sistema de coagulação propriamente dito, levando a uma gelificação
do plasma não ocorre. A hemolinfa de bivalves, incluindo P. perna, permanece sempre fluida
mesmo após decorrido muito tempo de sua extração. Em contrapartida, imediatamente após a
coleta da hemolinfa, verifica-se uma intensa e imediata agregação dos hemócitos, em
conseqüência de uma forte ativação celular e que leva à formação de agregados hemocíticos
extremamente densos (vide revisão de Vargas-Albores & Barracco, 2001). Esta agregação
forma-se mesmo em presença de anticoagulantes tradicionais a base de quelantes de cálcio,
como EDTA e citrato de sódio, o que dificulta sobremaneira o estudo in vitro das respostas
imune celulares de bivalves.
6.3. Cascatas proteolíticas – Sistema pró-fenoloxidase (proPO).
Uma outra cascata proteolítica, também essencialmente estudada em artrópodes,
refere-se ao sistema de ativação da pró-fenoloxidase ou sistema proPO. Esta via culmina
com a produção do pigmento melanina, que confere um aspecto caracteristicamente escuro
nas regiões onde se deposita. Várias respostas celulares de defesa em artrópodes, como a
formação de cápsulas hemocíticas e cicatrização de feridas, são usualmente acompanhadas
por uma reação de melanização (vide revisões de Ashida & Brey, 1998; Söderhäll &
Cerenius, 1998). A biossíntese da melanina é um processo complexo, que envolve uma
série de reações proteolíticas em cascata, cuja enzima chave é a fenoloxidase (PO). As POs
podem catalisar dois tipos de reações: a oxigenação de monofenóis como a tirosina, para
difenóis (L-DOPA) e a oxidação de difenóis (DOPA e DOPAMINA), para quinonas
(DOPAQUINONA e DOPAMINOQUINA). Dentre as famílias de POs, existe um grupo
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com propriedade de catalisar os dois passos descritos acima (tirosinases), enquanto outro
grupo catalisa apenas o segundo passo (lacase), ou seja, a oxidação de difenóis. (Ashida &
Brey, 1998). A PO de artrópodes existe geralmente sob uma pró-forma inativa (proPO) que
é ativada por componentes da superfície de microrganismos, tais como os LPS da parede
de bactérias Gram(-), as peptidoglicanas (PG) de bactérias Gram(+) e as β-1,3-glicanas da
superfície de fungos, o que sugere que este sistema esteja relacionado ao reconhecimento
do não-próprio e ao sistema imune destes animais. Estes compostos parecem induzir a
ativação de serino-proteases endógenas, que por sua vez promoveriam a clivagem
proteolítica da proPO em PO (vide revisões de Ashida & Brey, 1998; Söderhäll &
Cerenius, 1998). Na maioria dos artrópodes, a proPO localiza-se preferencialmente nos
hemócitos, sendo liberada para o plasma por ocasião de injúrias e infecções (vide revisão
de Vargas-Albores & Barracco, 2001). O papel preciso da melanina nas respostas imune
dos artrópodes ainda não é bem compreendido. No entanto, é sabido que esta via gera
transitoriamente moléculas tóxicas, como as quinonas e ERO (Nappi & Vass, 2001), que
podem funcionar como potentes destruidores de parasitas e microrganismos invasores. Por
outro lado, o composto final melanina é descrito como fungistático (Söderhäll & Cerenius,
1998) e funciona ainda como scavenger de radicais livres auxiliando, assim, a eliminar
estes compostos altamente reativos, que podem danificar também aos tecidos internos dos
hospedeiros.
Apesar da reação de melanização ter sido muito estudada em artrópodes, este processo
foi ainda muito pouco investigado em moluscos, principalmente no que se refere ao seu
envolvimento no sistema imune. A presença da enzima PO na hemolinfa de moluscos não
parece ser tão generalizada como nos artrópodes. Em bivalves, por exemplo, esta enzima foi
referida na hemolinfa de algumas espécies de mexilhões, como o M. edulis (Coles & Pipe,
1994; Renwrantz et al., 1996), M. galloprovincialis (Carballal et al., 1997c), Geukensia
demissa (Deaton et al., 1999) e Perna viridis (Asokan et al., 1997; 1998). Contudo, em
alguns bivalves (vide revisão de Vargas-Albores & Barracco, 2001), incluindo P. perna
(Barracco et al., 1999), a PO não foi encontrada na hemolinfa.
Pode-se dizer que o primeiro estudo detalhado sobre o sistema proPO de bivalves e
sua ativação por componentes da superfície de microorganismos foi realizado no mexilhão
Perna viridis (Asokan et al., 1997; 1998), através de ensaios experimentais semelhantes
aos usados em artrópodes. Neste mexilhão, a PO foi encontrada principalmente nos
hemócitos, mas também em pequena quantidade no plasma, e sua atividade foi induzida
por serino-proteases, β-1,3-glicanas e diferentes tipos de LPS, sugerindo uma atuação no
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reconhecimento imunológico. Estes resultados assemelham-se aos descritos em artrópodes,
mas diferem dos descritos em outros bivalves onde a ativação da proPO por componentes
de microrganismos não ocorre ou mostra resultados contraditórios (Deaton et al., 1999).
A ocorrência de um sistema proPO em P. viridis e sua aparente ausência em P. perna
(Barracco et al., 1999), a partir de uma metodologia semelhante, nos levou a aprofundar a
busca deste sistema em P. perna, através de diferentes técnicas e ensaios alternativos. Após
um exaustivo estudo, pudemos efetivamente constatar a ocorrência de PO na hemolinfa
desta espécie (Pires, 2002). Esta enzima mostrou ser do tipo lacase (oxidação apenas de
difenóis) e sua atividade foi detectada tanto nos hemócitos (Fig. 6B-C) quanto no plasma
deste mexilhão. Contudo, a atividade desta enzima em P. perna não foi induzida por
componentes da superfície de microrganismos (LPS e β-1,3-glicanas), nem por serino-
proteases, diferindo dos resultados descritos em P. viridis. Além do mais, pequenos
ferimentos provocados experimentalmente na região do manto não resultaram em uma
reação de melanização da região ferida, diferentemente do que ocorre em artrópodes. Desta
forma, o envolvimento da PO no sistema imune de P. perna permanece pouco conclusivo e
demanda uma maior elucidação. Seria, contudo, interessante, investigar se a atividade
desta enzima de P. perna é capaz de variar em situações de estresse, tanto fisiológico
(infecções) como ambiental (xenobiontes) e assim constituir um parâmetro indicador de
condição de saúde para P. perna.
7. PARÂMETROS HEMATO-IMUNOLÓGICOS COMO BIOINDICADORES
Os bivalves, destacando-se os mexilhões, são animais essencialmente sésseis e de
ampla distribuição geográfica, o que os torna excelentes modelos biológicos para o estudo de
contaminação ambiental, podendo funcionar como organismos-sentinela. A presença de uma
quantidade elevada de poluentes no meio ambiente produz usualmente um efeito imunotóxico
aos bivalves, conferindo aos hemócitos e suas funções, a possibilidade de serem utilizados
como biomarcadores de contaminação ambiental. Por outro lado, estes poluentes podem ainda
causar um efeito imunossupressor importante, contribuindo para aumentar a susceptibilidade
dos bivalves a infecções, o que poderia acarretar prejuízos importantes aos cultivos. Vários
parâmetros hemato-imunológicos de bivalves vêm sendo utilizados para expressar sua
condição de saúde e qualidade ambiental. Dentre estes parâmetros destacam-se os
hemogramas, representados pelo número total (THC: do inglês total hemocyte count) e
diferencial de hemócitos circulantes (DHC: do inglês differential hemocyte count), a atividade
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fagocítica e produção de ERO. Sabe-se, por exemplo, que a THC pode sofrer variações
correlacionadas a fatores abióticos (Carballal et al., 1998) e fisiológicos (período de
reprodução) (vide revisão de Vargas-Albores & Barracco, 2001). A presença de agentes
patogênicos também acarreta a alteração deste parâmetro, como conseqüência da migração
dos hemócitos para os tecidos afetados. Contudo, esta modulação da THC nem sempre resulta
numa alteração simultânea da DHC. Carballal et al. (1998) observaram um aumento da THC
em mexilhões M. galloprovincialis infectados pelo protozoário Marteilia refringes, mas a
DHC permaneceu inalterada. Por outro lado, Santarém et al. (1994) observaram uma
diminuição de HG em M. galloprovincialis no período de mais alta prevalência do copépodo
Mytilicola intestinalis.
Com relação à presença de xenobiontes, como regra, os hemogramas mostram
resultados variáveis, mas em geral, ocorre um aumento da THC quando os animais são
expostos a poluentes. Alterações na THC foram descritas em M. edulis expostos a metais
pesados e outros xenobiontes (vide revisão de Anderson & Anderson, 2000).
A maioria dos trabalhos refere o efeito de diferentes poluentes sobre o sistema imune
dos mexilhões em condições experimentais, mas poucos trabalhos avaliam o efeito in situ,
aproveitando-se de alterações ambientais efetivas. No caso do derramamento de óleo do navio
Sea Empress, que ocorreu em 1996 na costa do Reino Unido, o efeito mais severo sobre o
sistema imune de M. edulis foi constatado dois meses após o desastre, com um aumento
significativo da THC (Anderson & Anderson, 2000), enquanto que o efeito a longo prazo foi
menor coincidindo com a diminuição dos níveis de contaminação (Dyrynda et al., 2000).
Sabe-se que a fagocitose representa um dos principais mecanismos de defesa em
bivalves. A sensibilidade desta reação à presença de xenobióticos faz deste imunoparâmetro
uma ferramenta útil para monitorar a saúde dos bivalves e a qualidade ambiental. Em
mexilhões, a fagocitose pode ser inibida por poluentes, como se observou em M. edulis de
áreas afetadas por derramamento de petróleo (Anderson & Anderson, 2000; Dyrynda et al.,
2000) ou por efluentes de indústria de papel (St-Jean et al., 2003), ou ainda em M.
galloprovincialis de zonas industriais (Cajaraville et al., 1996). No entanto, a fagocitose pode
não ser afetada pela exposição a metais pesados (Anderson & Anderson, 2000).
No que se refere ao mexilhão P. perna, da Silva et al. (2002) observaram uma
diminuição da THC e da porcentagem de HG em mexilhões infectados pelo trematódeo
Bucephalus sp., o que provavelmente resultou da migração dos hemócitos da hemolinfa para
os tecidos afetados. Por outro lado, Pires et al. (2003) avaliaram a alteração de vários
parâmetros hemato-imunológicos (THC, DHC, viabilidade celular, fagocitose e produção de
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ERO, concentração de lectinas e proteínas plasmáticas) em animais expostos a diferentes
concentrações de óleo diesel, mas surpreendentemente não houve diferenças significativas
destes parâmetros em relação aos animais não expostos ao óleo. Ainda em P. perna, os
mesmos parâmetros acima mencionados foram analisados em animais expostos, por vários
meses, a efluentes domésticos com níveis muito altos de coliformes fecais, sem que houvesse
uma alteração significativa de seus valores (dados não publicados). Abessa et al. (2005)
estudaram duas populações de P. perna provenientes de uma zona pouco alterada pela ação
humana (Ponta Grossa – Ubatuba) e outra afetada por efluentes industriais e domésticos (Ilha
de Palmas – Santos). Os autores não encontraram diferenças na retenção de vermelho neutro
(indicador de estabilidade da membrana lisossomal) pelos hemócitos das populações de
ambas localidades, mas verificaram que quando os mexilhões foram transferidos de Ponta
Grossa para Palmas, os hemócitos sofreram uma redução da capacidade de retenção do
vermelho neutro; indicando que cada população encontrava-se adaptada ao seu meio.
Estes resultados parecem indicar que P. perna, diferentemente de M. edulis e M.
galloproviacialis, não é uma espécie muito sensível a poluentes, não produzindo uma resposta
imunológica rápida e confiável que contribua para indicar e predizer com precisão uma
situação de estresse ambiental. No entanto, é importante considerar que os resultados obtidos
até o momento sobre imunomarcadores em bivalves apresentam geralmente uma variação
muito ampla, o que limita sua utilização para esta finalidade. No caso de P. perna, os estudos
realizados até o momento são insuficientes para se chegar a uma conclusão definitiva, sendo
necessária uma maior investigação para definir os melhores imunoparâmetros na indicação de
saúde e qualidade ambiental, antes de descartar esta espécie para esta finalidade.
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