Upload
kyros
View
73
Download
9
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Imunológia –praktické cvičenie č. 1. bunky imunitného systému. Použité zdroje. Buc,M. a kol.,: Praktické cvičenia z imunológie, vysokoškolské skriptá, PALAESTRA, Bratislava 1993, ISBN 80-88718-01-5 http://www.vpl.sk/zc/img/3_Kossarova_Imunodeficientne_stavy.pdf - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Imunológia –praktické cvičenie č. 1.
bunky imunitného systému
Použité zdrojeBuc,M. a kol.,: Praktické cvičenia z
imunológie, vysokoškolské skriptá, PALAESTRA, Bratislava 1993, ISBN 80-88718-01-5
http://www.vpl.sk/zc/img/3_Kossarova_Imunodeficientne_stavy.pdf
Bunky imunitného systému dostupné na https.ics.upjs.sk~paulikovaimufilestahajimu2.p
df
hematopoéza• Bunky imunitného systému
• -rôzne dlhý čas života
• - úbytok je dopĺňaný hematopoézou
• Hematopoéza
• - formovanie a vývoj červených a bielych krviniek z kmeňovej pluripotentnej bunky
• -u dospelého jedinca prebieha najmä v kostnej dreni (medulárne)
• -základom hematopoézy je
• pluripotentná kmeňová bunka, ktorá sa diferencuje na lymfoidné a myeloidné kmeňové bunky
Hematopoéza -z kmeňových buniek vznikajú progenitorové bunky, ktoré sú nasmerované k diferenciácii na základné typy krvných buniek: Erytrocyty lymfocyty trombocyty monocyty Granulocyty -Hematopoéza je regulovaná najmä cytokínmi:
IL-3 (multilineage-CSF) GM-CSF M-CSF G-CSF erytropoetín IL-4, IL-5, IL-6, IL-7,IL-8,IL-9
klasifikácia• prítomnosť membránových
znakov(rozpoznávacie glykoproteíny) na povrchu bunky
• CD (na všetkých leukocytoch)
• expresia receptorov na rozpoznávanie antigénov (len na T a B –Ly)
• MHC antigény
Systém bunkových znakov CD –znak (marker)
CD = cluster of differentiation
CD znak – jedinečná molekula alebo komplex molekúl,ktoré bunka exprimuje
Tieto molekuly pomáhajú diferencovať typ (subtyp) bunky, jej maturačné štádium, stupeň aktivácie...
Názov pozostáva z písmen CD a číslic (napr.:CD3,CD8,...)
CD znaky• CD3 –len naT –Ly (na všetkých subtypoch)• CD4 –TH• CD8 –TC• CD19 –len naB –Ly• CD64 –monocyty• CD66 –PMNLs• CD68 –makrofágy• CD16 –NK bunky• CD40 –dendritické bunky• CD33 –všetkymyeloidné bb.
Polymorfonukleárne lekocytyPMNLViaclaločnaté jadro a granuly v cytoplazmeNa základe rozdielneho farbenia granúl rozlišujeme
3 typy granulocytov:Neutrofily–nefarbia sa ani bázickymi ani kyslými farbivami
Eozinofily–farbia sa kyslými farbivami na červeno
Bazofily–farbia sa bázickými farbivami na tmavomodro
neutrofily• 60% z leukocytov (4,3–11x109/1lkrvi)• Veľkosť: 15μm
– Nezrelé –tyčka (tvar jadra)– Zrelé – segmentované jadro
Vcytoplazme:• -granuly s baktericídnymi látkami –primárne (azúrofilné)
obsahujú hydrolázy, myeloperoxidázu• Sekundárne – obsahujú laktoferín, lyzozým, alkalickú
fosfatázu, kolagenázu...• Glykogén –zdroj glukózy pri anaeróbnej glykolýze → PMNL
môžu zostať v poškodenom tkanive s nízkym obsahom O2, napr. vmiestebakteriálnejinfekcie
Bunková membrána:• Receptory (Fc R pre IgG, CR), adhezívne molekuly
(integríny, selektíny
neutrofilyFUNKCIA:• Základné bunky 1. obrannej línie proti
patogénom, cudzorodým bb. • Profesionálne fagocyty
• enzýmy sekundárnych granúl rozkladajú antigén (Ag)
• Dôležitá úloha v zápalovom procese (rýchla mobilizácia, uvoľnenie
mediátorov zápalu)
eozinofily• 4% zo všetkých PMNL• 18 μm
V cytoplazme:• okolo 200 granúl – hlavný bázický proteín (MBP), kyslá
fosfatáza, arylsulfatáza, eozinofilná peroxidáza, kationický proteín eozinofilu
• -MBP pôsobí toxicky na parazity a nádorové bb., väzbou na bazofilné bb. z nich uvoľňuje histamín
Na membráne: - receptory pre IgE a zložky komplementu - dôležitá úloha pri
alergických reakciáchFUNKCIA:• proti parazitárnym infekciám (hlavne proti helmintom v črevnom
trakte) • proti nádorovým bunkám • Účasť pri zápalových reakciách ( sú aktivované lymfocytmi)• alergické reakcie• schopnosť fagocytózy
bazofily• <0.2% z Leu
• Morfologicky sa podobajú tkanivovým mastocytom, • ochrana mukóznych povrchov tela
Cytoplazma:• Granuly – veľké množstvo zápalových mediátorov
(heparín,histamín...);• Neobsahujú peroxidázuMembrána:
– Receptory FcRε (pre IgE)
FUNKCIA:• -alergické reakcie• -nefagocytujú
mastocyty• Tkanivové bunky• 30μm• Mononukleárne bunky s metachromaticky zafarbenýmig
ranulami• Relatívne maléj adro - v spojivovom tkanive, hlavne pri krvných, lymfatických cievach a pri periférnych nervoch - blízko epitelových povrchov(dýchací, tráviaci systém a
koža)
Cytoplazma:• granuly : zápalové mediátory (heparín,histamín...), neobsahujú peroxidázuMembrána:• -receptory FcRε (preIgE)Funkcia : hlavné bunky pri alergických reakciách
Mastocyty
monocyty• 6-8% – mononukleárne bb.• Okrúhly tvar, veľa cytoplazmy, veľké, excentricky uložené
jadro Cytoplazma : vakuolizovaná, farbí sa slabo bazofilne (sivo-
fialovo) .• (Monocytóza so zvýšením množstva leukocytov je aj
priaznivým symptómom pri septických procesoch a infekčných ochoreniach)
FUNKCIA:• Profesionálne fagocyty• APC
• *Zrelé monocyty putujú z kostnej drene do krvi, kde zostávajú cca15-30 hodín Potom adherujú na cievny endotel a opúšťajú krvné riečište diapedézou, premiestňujú sa do tkanív, kde sa premieňajú na makrofágy.
Monocyty
Antigén prezentujúce bunky = APC(Antigen Presenting Cells)
• DENDRITICKÉ BUNKY (DC)• MAKROFÁGY • B -LYMFOCYTY
• FUNKCIA:• vychytanie Ag • spracovanie Ag• prezentácia Ag peptidov špecifickým T -Ly
makrofágy• Determinačné povrchové znaky: CD54, CD68, MHC, Fc receptory, C receptoryMonocyt z krvi →prechod do tkaniva →premena na makrofág
– mononukleárne fagocyty– dĺžka života 75 dní– antigén prezentujúce bb. = APC– Tkanivové makrofágy –1. obranná línia hostiteľa
• VÝSKYT:-• Alveolárne v pľúcach
• Kupfferove bb. v pečeni• histiocyty v spojivovom tkanive• mikroglia v CNS• osteoklasty v kostiach• peritoneálne a pleurálne v seróznych dutinách• Intravaskulárne v endoteli kapilár
makrofágy• FUNKCIE:
– Schopnosť rozpoznať, vychytať, spracovať a prezentovať antigén
– fagocytóza– Expresia MHC molekúl II. triedy– Produkcia imunoregulačných látok– Schopnosť odovzdávať nešpecifické
stimulačné signály– Produkcia reaktívnych molekúl
Dendritické bunky DCv nelymfatických periférnych tkaniváchLangerhansove bb.(koža, dlaždicový
epitel ústnej dutiny, pažeráku a pošvy)intersticiálne DC (srdce, obličky)v cirkulácii : DC v periférnej krvi (0,4 %)závojnaté bb.(aferentné lymfatické cievy)v sekundárnych lymfatických tkanivách :
vmedzerené DCv medule týmusu týmusové DC
• Dendritické bunky (DC)• FUNKCIA:• najvýkonnejšie APC• schopnosť aktivovať naivné
T –Ly• fagocytóza (častice a
mikróby)• makropinocytóza (solubilné
Ag)
• Závojnatá DC + Ly
lymfocyty• Ly : malý, stredný, veľký• Malý 8-12μm.Jadro: - okrúhle alebo oválne tvorené masami
chromatínu Cytoplazma:- úzky lem, svetlomodrá
• T–lymfocyty (65–75%)• B–lymfocyty(20–30%)
lymfocyty
lymfocytyLymfocyty - vyvíjajú sa z hematopoetickej
kmeňovej bunky v kostnej dreni T lymfocyty migrujú do thymusu, B lymfocyty zostávajú v kostnej dreni
B lymfocyty - zodpovedné za humorálnu časť (Ab)
T lymfocyty - celulárna časť imunitnej reakcie
• B-lymfocyty: produkujú a secernujú Ab do telesných tekutín, zastupujú preto humorálnu imunitu
• T-lymfocyty: reagujú priamo s cieľovými bunkami (napr. ktoré boli napadnuté vírusmi alebo tumorózne zvrhnuté), preto reprezentujú bunkovú imunitu
• Obidve populácie majú na svojom povrchu odlišné glykoproteíny, ktoré môžu byť dokázané pomocou monoklonálnych protilátok
T lymfocytyTH(helpery) CD4:
- Regulujú humorálne aj bunkami sprostredkované imunitné odpovede
– pomáhajú
TS(supresory) CD8 :
- Môžu potláčať imunitnú odpoveď
TC(cytotoxické) CD8: - Efektorové bb. S cytolytickým účinkom- TDH(delayed-type hypersensitivity reaction)-- sprostredkujúoneskorenýtyphypersenzitivity
• TH a TS majú odlišné vlastnéa ntigény, podľa ktorých sa identifikujú
T lymfocyty• Dozrievanie v týmuse je sprevádzané
identifikáciou provrchových označení CD (cluster of differentiation – diferenciačných antigénov)
• CD3- prenášač signálu z antigénneho receptoru do vnútra bb, vedie k aktivácii b
• CD4, CD8 prítomné pôvodne u spolu všetkých ly, umožňujú rozdeliť T-lymf.
• CD4 - prítomný u T helper bb, komunikuje s molekulami HLA II
• CD8 - prítomný u cytotoxických buniek, komunikuje s molekulami HLA I
Špecifická imunita sprostredkovaná bunkami• T bunky - po stimulácii sa stávajú efektorovými
bunkami (priamo napádajú a eliminujú bb napadnuté
vírusmi alebo tumorózne zmenené) - riadia spoluprácu rôznych imunitných bb (syntetizujú molekuly, ktoré pomáhajú iným
bunkám zničiť patogéna)
B lymfocyty• B-bb dozrievajú v prostredí kostnej drene• Zrelé B-lymf nesú na svojom povrchu
molekuly imunoglobulínov, ktoré slúžia ako špecifický receptor pre antigén.
• V prítomnosti Ag (týmusindependentné Ag) alebo aj v spolupráci s T-lymf (týmusdependentné Ag) sa menia B-lymf na plazmatické bunky, ktoré produkujú veľké množstvo špecifických Ab
Plazmatické bunky
NK bunky• CD16, CD56,CD57 5–15% , slezina• Nulové bb.=non–B,non–T• Majú Fc receptory• Bunková zložka vrodenej imunity
Funkcie: -lýza nádorových a vírusom infikovaných bb. (nešpecifická cytotoxicita bez predchádzajúcej
senzibilizácie) - produkcia cytokínov zapájajúcich sa do regulácie
iných procesov - rozpoznávajú cieľové bb. bez MHC restrikcie - IL-2; IFN zvyšujú proliferáciu a cytotoxickú aktivitu NKcytopl. Granuly obsahujú perforín, serínovú esterázu
Izolácia mononukleových bb• Z periférnej krvi• Za fyziol podm. : z 1 ml krvi....1-2x 106 mononukl.
bb.(lymfocyty a monocyty v pomere 80% : 10%)CIEĽ : oddelenie ery a granulocytovMETÓDA: diskontinuálna gradientová centrifugáciaPOSTUP: krv +heparín (konc. 10j./1 ml krvi) -premiešať + fyziol.roztok (1:1) - do skúmavky s 5 ml zriedenej krvi
navrstviť 2,5 ml separačného roztoku (verografín) - 20 min. centrifugácia
Izolácia mononukleových bbVÝSLEDOK : po centrifugácii sa nad separačným roztokom
utvorí belavý prstenec mononukleových bb., ktoré odsajeme pipetou
Získané bb. centrifugujemeSediment 2x premyjeme vo fyziolog. roztokubb. spočítame v Bürkerovej komôrke (1x106 )
Separácia T aB lymf. Na základe tvorby rozietT a B lymf. : rôzne membránové receptory
pre väzbu s ery iných živočíšnych druhovT lymf. : receptor pre baranie ery – tvorba E-
rozietB lymf. : receptor pre myšie ery – tvorba M-
rozietEry sa opracúvajú chemicky
(neuraminidázou) – pevnejšia väzba s lymf.
Separácia T aB lymf. Na základe tvorby roziet• POSTUP: • Suspenzia mononukleových bb. + premyté a
resuspendované baranie ery (1:1), centrifugácia • Inkubácia 30 min. pri 4b C, navrstvenie
separačného roztoku (verografín), centrifugácia• CIEĽ : • nad separač. roztokom ostanú nerozetujúce bb.
(odsatie)• Rozetujúce bb. Sedimentujú na dno skúmavky• VÝSLEDOK: • Získanie suspenzie lymfocytov (T lymf.- E-rozety)
(95% čistota)
Rozetové testyAktívne rozety – vyššia avidita receptorov pre
baranie ery (aj pri ich malom počte)Celkové rozety – po 18 – 24 hod inkubácii pri
nadbytku ery.
Aktívne rozety lepšie odrážajú imunitný stav pacienta
Rozetové testy• POSTUP :- 5ml krvi do heparínu izolácia lymfocytov- Pridať suspenziu ovčích ery ( pre aktívne rozety v c
0,2%, pre celkové rozety 0,1%)- Pri stanovení celkových roziet – na 24 hod do ľaduCIEĽ : - počítanie lymfocytov a roziet v Bürkerovej komôrkeVÝSLEDOK : - Rozeta : lymf. + najmenej 3 ery- Aktívne r. : 25 +/- 10%- Celkové r. : 65 +/- 10%
Pod mikroskopom počítame počiet roziet a čistých lymfocytov do 100, počet roziet udáva % počet B alebo T lymfocytov
Morč.ery
rozety
Lymfocyt