dr Danijela Koji

UNIVERZITET U NOVOM SADU

PRIRODNO-MATEMATIKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

IMUNOLOKE TEHNIKE U KLINIKOJ BIOHEMIJI

Antigen: svaki strani element imunom sistemu (bakterija, virus, polen itd.)

Antitela: proteini koje sintetie imuni sistem u odbrani od stranog antigena

Pet tipova tekih lanaca: , , , i Klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM

Dva tipa lakih lanaca: i

www.sfaf.org/aids101/ immunology.html

Aktivacija humoralnog imunog odgovora

Poliklonska antitela Produkti multiplih B-elijskih linija Smea imunoglobulinskih molekula kao

odgovor na specifian antigen, svaki prepoznaje specifian epitopepitopepitopepitop

Izvor serum imunizovanih eksperimentalnihzivotinja (zec, pacov, koza...)

U imunohemijskim metodama sada antiserum

Monoklonska antitela Identina meusobno Proizvod su klonova jedne parentalne elije (tehnika

hibridoma-hibridizacija B elije i elije mijeloma)

Antitela koja se upotrebljavaju u imunohemijskim Antitela koja se upotrebljavaju u imunohemijskim Antitela koja se upotrebljavaju u imunohemijskim Antitela koja se upotrebljavaju u imunohemijskim tehnikamatehnikamatehnikamatehnikama

Metode detekcije ove reakcije mogu biti:

Direktne: detekcija precipitacijom, iliobeleavanjem antitela fluorescentnom, radioaktivnom ili enzimskom probom

Indirektan: aglutinacijom ili merenje reakcije Ag-At fiksacijom komplementa

Osnova svih iminoloOsnova svih iminoloOsnova svih iminoloOsnova svih iminolokih tehnika je u kih tehnika je u kih tehnika je u kih tehnika je u specifispecifispecifispecifinoj reakciji antigennoj reakciji antigennoj reakciji antigennoj reakciji antigen----antiteloantiteloantiteloantitelo

TEHNIKE KOJE SE ZASNIVAJU NA PRECIPITACIJI TEHNIKE KOJE SE ZASNIVAJU NA PRECIPITACIJI TEHNIKE KOJE SE ZASNIVAJU NA PRECIPITACIJI TEHNIKE KOJE SE ZASNIVAJU NA PRECIPITACIJI KOMPLEKSA ANTIGENKOMPLEKSA ANTIGENKOMPLEKSA ANTIGENKOMPLEKSA ANTIGEN----ANTITELOANTITELOANTITELOANTITELO

Precipitacija- koncept ekvivalencijekoncept ekvivalencijekoncept ekvivalencijekoncept ekvivalencije

Precipitat- nerastvorni kompleks Ag-At

Precipitacija na gelu

ImunodifuzijaDvostruka imunodifuzija Radijalna imunodifuzija

Identifikacija antitela povezanih sa imunim bolestima

Imunoelektroforetske tehnikeImunoelektroforetske tehnikeImunoelektroforetske tehnikeImunoelektroforetske tehnike(kretanje atigena i/ili antitela ubrzano primenom struje)(kretanje atigena i/ili antitela ubrzano primenom struje)(kretanje atigena i/ili antitela ubrzano primenom struje)(kretanje atigena i/ili antitela ubrzano primenom struje)

Imunoelektroforeza

Dvodimenzionalna imunoelektroforeza

Raketna imunoelektroforeza

Imunofiksacija

Konkurentna imunoelektroforeza

ImunoelektroforezaImunoelektroforezaImunoelektroforezaImunoelektroforeza (Immunoelectrophoresis- IEP)

- Gel difuzija + elektroforeza- Elektroforeza proteina seruma (antigena), nakon elektroforeze u specijalno napravljen kanal u gelu ubacuje se atitelo/a (antiserum)- Antigen i antitelo difunduju kroz agar

U zoni ekvivalencije formiraju se luni precipitatiVeliina lunog precipitata zavisi od koliine antigena- Monoklonalna gamapatija

DDDDvodimenzionalna imunolektroforezavodimenzionalna imunolektroforezavodimenzionalna imunolektroforezavodimenzionalna imunolektroforeza

-prva dimenzija: elektroforeza proteina seruma (antigena)na agaroznom gelu

-druga dimenzija: elektroforeza predhodno razdvojenih proteina na agaroznom gelu sa antiserumom

Raketna imunoelektroforezaRaketna imunoelektroforezaRaketna imunoelektroforezaRaketna imunoelektroforeza

Slina RID, elektroforezom se ubrzava formiranje precipitataProcedura

Gel sa antitelom (antiserum)Antigen se ubacuje u bunari u geluStandardi u drugim bunariimaStrujom se ubrzava migracija antigena u geluPrecipitati se formiraju u vidu raketaVisina rakete odreena koliinom antigena

ImunofiksacijaImunofiksacijaImunofiksacijaImunofiksacija

-elektroforeza proteina + imunoprecipitacija-koristi se za klasifikaciju monoklonalne gamapatije (odreivanje tekog i lakog lanca)

- Procedura-postaviti uzorak na 6 pozicija na agaroznom gelu-elektroforetsko razdvajanje proteina- Primena monospecifinog antiseruma u 5 paterna, 6. slui

kao referenca-ako je antigen prisutan, kompleks Ag-At pada kao precipitat

Konkurentna imunoelektroforezaKonkurentna imunoelektroforezaKonkurentna imunoelektroforezaKonkurentna imunoelektroforeza

Procedura- Formirati dva bunaria u agaroznom gelu- Sipati antigen u jednom, antitelo u drugom bunariu- Pod dejstvom elektrine struje Ag i At migriraju jedan prema drugom - Precipitacija u zoni ekvivalencije pri susretu odgovarajueg Ag i At

TEHNIKE KOJE KORISTE TEHNIKE KOJE KORISTE TEHNIKE KOJE KORISTE TEHNIKE KOJE KORISTE SPECIFISPECIFISPECIFISPECIFINO OBELENO OBELENO OBELENO OBELEENA ANTITELAENA ANTITELAENA ANTITELAENA ANTITELA

YYYYFLUORESCENTNO OBELEENO ANTITELO

YYYYBIOTIN

STREP.

ANTITELO OBELEENO BIOTINOM

YYYY .ANTITELO OBELEENO ENZIMOM

YYYYRADIOAKTIVNO OBELEENO ANTITELO

Radioimmunoassay (RIA)

Veoma senzitivna i specifina

Moe se koristiti i za detekciju antigena ili antitela (sledea objanjenja su u vezi detekcije antigena, ali moe se detektovati i antitelo u serumu korienjem poznatog antigena)

Kompetitivni esej

Antigen pacijenta (neobeleeni antigen) i obeleeni antigen kompetuju za vezivanje za odreenu koliinu antitela

Izmerena radioaktivnost na gama brojau se poredi sa standardnom krivom

RezultatManja radioaktivnost, vea koncentracija neobeleenog antigena

Primena:Testovi antigena i antitela za hepatitisRadioimmunosorbent Test (RIST) merenje ukupnih IgERadioallergosorbent Test (RAST) merenje IgE za specifian alergen

Direktna Indirektna

Antitelo Antigen

From Environmental Microbiology, Maier et al

+uzorak + uzorakantigena antitela

Dodavanje enzimom obeleenog antitela antitela antitela antitela

Dodavanje enzimom obeleenog antiglobulinantiglobulinantiglobulinantiglobulinasekundarno antitelosekundarno antitelosekundarno antitelosekundarno antitelo

Dodavanje supstrata za enzim

Primena:HIV test, Serum HCG (trudnoa),Testovi za antigene hepatitisa i antitela, Antigeni bakterija

IMUNOHISTOLOIMUNOHISTOLOIMUNOHISTOLOIMUNOHISTOLOKE TEHNIKEKE TEHNIKEKE TEHNIKEKE TEHNIKE---- vizuelizacija antigena uvizuelizacija antigena uvizuelizacija antigena uvizuelizacija antigena utkivutkivutkivutkivu

Control

Infected

Showing positive staining of ovary & brain tissues

of infected organs

PROTOPROTOPROTOPROTONA CITOMETRIJANA CITOMETRIJANA CITOMETRIJANA CITOMETRIJA----sortiranje, brojenje i sortiranje, brojenje i sortiranje, brojenje i sortiranje, brojenje i karakterizacija karakterizacija karakterizacija karakterizacija elija u uzorkuelija u uzorkuelija u uzorkuelija u uzorku

Direktna aglutinacijaDirektna aglutinacijaDirektna aglutinacijaDirektna aglutinacija

Indirektna aglutinacija Indirektna aglutinacija Indirektna aglutinacija Indirektna aglutinacija antigen vezan na povrantigen vezan na povrantigen vezan na povrantigen vezan na povrini eritrocita (red blood cellsini eritrocita (red blood cellsini eritrocita (red blood cellsini eritrocita (red blood cells----RBC)RBC)RBC)RBC)

Reakcija vezivanja antigena i antitela u prisustvu komlementa

Ako je komplement fiksiran u odgovarajuoj reakciji, nije vie dostupan indikatorskoj reakciji

Fiksiranje komplementa (Complement fixation -CF)

Complement Fixation Test (CFT)

PotrebniPotrebniPotrebniPotrebniOvOvOvOvji eritrociti ji eritrociti ji eritrociti ji eritrociti ((((sheep red blood cells sheep red blood cells sheep red blood cells sheep red blood cells SRBCSRBCSRBCSRBC)))),antiantiantianti-SRBC aSRBC aSRBC aSRBC antitelantitelantitelantitela i ki ki ki komplementomplementomplementomplement,,,, kao i specifikao i specifikao i specifikao i specifian antigen (ako se dokazuje an antigen (ako se dokazuje an antigen (ako se dokazuje an antigen (ako se dokazuje antitelo) ili specifiantitelo) ili specifiantitelo) ili specifiantitelo) ili specifino antitelo (ako se ispituje prisustvo antigena)no antitelo (ako se ispituje prisustvo antigena)no antitelo (ako se ispituje prisustvo antigena)no antitelo (ako se ispituje prisustvo antigena)

Reakcije inhibicije ili neutralizacije

Princip metoda:

Vezivanje antitela

serumska antitela vezuju (nutralizuju) odgovarajui poznati antigen u uzorku

Posle vezivanja, antitela nisu dostupna za indikatorsku reakciju

Rezultata:

NEMA aglutinacije ili NEMA hemolize = pozitivna reakcija

Aglutinacija ili hemoliza = negativna reakcija (antitela nisu potroena u predhodnoj

reakciji i dostupna su za reakcije sa infdiikatorskim elijama)

Obavezne pozitivna i negativna KONTROLA

Primeri:

Test za rubelu (inhibicija hemaglutinacije)

antistreptolizinski O test (ASO, primer za test neutralizacije)

VAVAVAVANO!NO!NO!NO!Spisak tehnika je mnogo dui....

Hvala na paHvala na paHvala na paHvala na panjinjinjinji!!!!