Imunoloski praktikum - Spiroski

8/15/2019 Imunoloski praktikum - Spiroski

1/240

Institut za imunobiologija i humana genetika 1

Spiroski M, Trajkov D, Petli~kovski A, Arsov T, Strezova A,

Efinska-Mladenovska O, Hristomanova S, Spiroska E,

Sibinovska O, Petrov J

IMUNOLO[KIPRAKTIKUM

- laboratoriska imunodijagnostika -

Institut za imunobiologija i humana genetika,

Medicinski fakultet, Univerzitet "Sv. Kiril i Metodij"

Skopje, 2006


2/240


3/240


4/240

Institut za imunobiologija i humana genetika4

Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM

Vo tekot na 1994 godina bea raspi{ani izbori i beaizbrani prviot nastavnik i prvite asistenti popredmetot imunologija. Na 02.03. 1995 godina e konsti-tuirana prvata Katedra za imunologija na Medicin-skiot fakultet vo Skopje. Od 2001? predmetot Imuno- logija se slu{a{e vo ~etvrtiot semestar (vtora godina)

so fond na ~asovi 15+15 i so dopolnitelni 15 ~asoviseminari. Od u~ebnata 2005/06 zapo~na Evropskiotkreditniot transfer sistem (EKTS) na Medicinskiotfakultet vo Skopje, spored koj predmetot Imunologijase slu{a so fond na ~asovi 24+21 (45) vo tretiot semestar(vtora godina).

Vo juni mesec 1995 godina izleze od pe~at prviot u~ebnikpo imunologija, odnosno knigata Osnovni imunolo{ki metodi nameneta za prakti~nata nastava od ovoj predmet. Vo 2005 izleze od pe~at knigata Imunolo{kipraktikum za prakti~nata nastava od predmetotimunologija vo izdanie na Institutot za imunobiologija

i humana genetika. Vrabotenite od Institutot sezafatija so zada~a da napi{at Imunolo{ki praktikum- imuno-dijagnostika spored programata za EKTS i daim go stavat na raspolagawe na studentite.

Vo ovoj praktikum se vneseni sedum blokovi od ve`bi odimunodijagnostikata vo imunologijata. Sekoj blok esotaven od tri ve`bi, od koi prvite dve se laboratoriski metodi za imunodijagnostika, a tretata ve`ba etolkuvawe na rezultatite od soodvetanata oblast naimunologijata. Kon ovie sedum blokovi, odnosno 21 ve`base ponudeni dopolnitelni materijali vo oblik na videoise~oci (na kompakt disk) za polesno sovladuvawe na

materijalot. Kon sekoja ve`ba za tolkuvawe na imunolo{kite rezultati dodadeni se analizi na slu~ai so celstudentite da gi povrzat imunolo{kite rezultati soidnite klini~ki disciplini vo koi }e go primenatsteknatoto znaewe od imunologijata.

Studentite treba da gi sovladaat predvidenite materijali pred da prisustvuvaat na ve`bi za da osvojatnajgolem broj poeni i so toa povisoka ocenka.

Se nadevam deka praktikumot }e im bide od korist nastudentite i deka }e pretstavuva dobra osnova zadonesuvawe na novata nastavna programa od ovoj predmet.

Prof. d-r Mirko Spiroski

Skopje, noemvri 2006 godina


5/240


SODR@INA

SODR@INA

PREDGOVOR .....................................................................................................................................................................................3

SODR@INA .................................................................................................................................................................................... 5

BLOK 1- VRODEN IMUN SISTEM ................................ .................................... ................................... ....................................9VE@BA 1: ISPITUVAWE KLETO^EN VRODEN IMUN SISTEM .......................................... ................................... 11

1.1. Ispituvawe imunolo{kata funkcija na fagocitite ...........................................................................................................111.2. Kvalitativen NBT test ...................................................................................................................................................... 121.3. Kvantitativen NBT test ..................................................................................................................................................... 121.4. Zada~a ...................................................................................................................................................................................... 15

VE@BA 2: ISPITUVAWE HUMORALEN VRODEN IMUN SISTEM ..................................................................... 172.1. Proteini na akutna faza (PAF) ...................................................................................................................................... 172.1.1. Akutno fazen odgovor ................................................................................................................................................. 172.1.2. Regulacija na akutno faznite promeni .................................................................................................................... 18 2.1.2.1. Indukcija na proteinite od akutna faza so citokini i drugi signalni molekuli ............................ 20 2.1.2.2. Regulacija na drugite akutno fazni promeni so vospalitelno asociranite citokini ......................... 21

2.1.3. Funkcii na akutno fazniot odgovor ........................................................................................................................ 222.2. Opredeluvawe koncentracija na akutno fazni proteini so imunoturbidimetrija............................................... 23

2.2.1. Principi na imunoturbidimetrija........................................................................................................................... 232.2.2. Kalibracija ................................................................................................................................................................... 242.2.3. Sistem za temperaturna kompenzacija ..................................................................................................................... 252.2.4. Procedura ...................................................................................................................................................................... 25

2.3. Zada~a .................................................................................................................................................................................... 26VE@BA 3: ANALIZA NA VRODEN IMUN SISTEM .................................................................................................... 27

3.1. Tolkuvawe rezultati od vroden imun sistem ................................................................................................................ 273.1.1. Normalni vrednosti od ispituvawe kleto~en vroden imun sistem ................................................................... 273.1.2. Klini~ka primena na akutno faznite proteini ................................................................................................... 29

BLOK 2 - IMUNI KLETKI .................................................................................................................................................... 31VE@BA 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM .................................................................................................................. 33

4.1. Dvoewe limfociti i monociti od periferna krv ..................................................................................................... 334.1.1. Op{ti napomeni ........................................................................................................................................................... 334.1.2. Postapka za dvoewe limfociti od periferna krv ............................................................................................... 344.1.3. Broewe kletki so hemocitometar ............................................................................................................................. 354.1.4. Ispituvawe `ivi i mrtvi kletki ............................................................................................................................. 37

4.2. Imunofluorescencija ....................................................................................................................................................... 384.2. 1. Fluorescentna mikroskopija ................................................................................................................................... 39

4.2.1.1. Fluorescentna mikroskopija so propusno svetlo .................................................... .................................... 394.2.1.2. Fluorescentna mikroskopija so pa|a~ko svetlo ............................................................... ........................... 40

4.2.2. Dobivawe kowugirani protivtela ........................................................................................................................... 414.2.3. Podgotovka na tkiva i kletki ................................................................................................................................... 42

4.2.3.1. Tkivni preparati .................................................................................................................................................. 424.2.3.2. Parafinski preparati ......................................................................................................................................... 434.2.3.3. Kleto~ni preparati ............................................................................................................................................ 43

4.2.4. Boewe, ot~ituvawe i dokumentirawe ...................................................................................................................... 444.2.4.1. Direktna imunofluorescencija (DIF) ............................................................................................................ 444.2.4.2. Indirektna imunofluorescencija (IIF) ...................................................................................................... 454.2.4.3. Sistemot biotin-avidin ................................................................................................................................... 454.2.4.4. Kvantitativna imunofluorescencija ............................................................................................................ 464.2.4.5. Gre{ki i la`no pozitivni rezultati............................................................................................................. 47 4.2.4.6. Dokumentirawe na rezultatite (fotografirawe) .................................................................................... 47

4.3. Zada~a .................................................................................................................................................................................... 48VE@BA 5: PROTO^NA CITOMETRIJA ........................................................................................................................... 495.1. Sistem za proto~na citometrija........................................................................................................................................ 49

5.1.1. Proto~na citometrija ................................................................................................................................................. 505.1.2. Te~ni sistemi ................................................................................................................................................................ 505.1.3. Opti~ki sistem ............................................................................................................................................................... 515.1.4. Analiza na podatocite .................................................................................................................................................. 53 5.1.4.1. Analiza ................................. ..................................... ...................................... ..................................... ....................... 53 5.1.4.2. Nadomest (kompenzacija) ...................................... ..................................... ...................................... ...................... 56 5.1.4.3. Skladirawe podatoci ................................ ..................................... .................................... .................................... 56

5.1.5. Proto~no sortirawe kletki ....................................... ....................................... ...................................... .................... 575.2. Funkcionalen test za kletki prirodni ubijci (KPU) ................................................................................................ 57

5.2.1. Osnovi na testot ............................................................................................................................................................. 575.2.2. Protokol za rabota ...................................................................................................................................................... 58


6/240


Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 5.2.2.1. Op{ti podgotovki ................................. ...................................... ..................................... .................................... 58 5.2.2.2. Izolacija na efektornite kletki .................................. ...................................... ....................................... ..... 58 5.2.2.3. Odmrznuvawe na K562 kleto~nata linija ............... ..................................... ....................................... .............. 59 5.2.2.4. Priprema na primerokot za merewe ......... ..................................... ...................................... ............................... 59 5.2.2.5. Merewe i analiza na podatocite dobieni so proto~niot citometar ......................................... ........... 60

5.3. Zada~a .................................................................................................................................................................................... 60VE@BA 6: TOLKUVAWE REZULTATI OD KLETO^EN IMUNITET ..................................................................... 61

6.1. Normalni vrednosti na beli kletki ............................................................................................................................... 616.2. Imunofenotipizirawe ...................................................................................................................................................... 62

6.2.1. Voved ................................................................................................................................................................................. 626.2.2. Dijagnoza na hematolo{ki maligniteti ..................................................................................................................... 636.2.3. Ostanati klonalni/genetski hematolo{ki i imunolo{ki zaboluvawa............................................ .................. 656.2.4. Transplantacija ............................................................................................................................................................. 656.2.5. Dijagnoza i sledewe na infektivnite zaboluvawa i imuni nedostatoci ................................................ .......... 66

6.3. Tolkuvawe rezultati od funkcionalni testovi vo kleto~en imunitet .......................................................... ........ 676.3.1. Funkcionalen test za kletki prirodni ubijci ....................................................................................................... 67

6.3.1.1. O~ekuvani rezultati ............................................................................................................................................. 68

BLOK 3 - IMUNOGLOBULINI ....................................................................................................................................... 69VE@BA 7: TALO@NI PROTIVTELA - IMUNOPRECIPITACIJA ..................................................................... 71

7.1. Precipitacija vo te~na sredina ................................................................................................................................. 717.2. Dvojna imunodifuzija na agar...................................................................................................................................... 727.3. Edine~na (radijalna) imunodifuzija na agar .......................................................................................................... 747.4. Imunoelektroforeza.................................................................................................................................................... 777.5. Zada~i .................................................................................................................................................................................... 77

VE@BA 8: PROTIVTELEN ODGOVOR ............................................................................................................................... 798.1.Broewe protivtela sekretira~ki B limfociti ..................................................................................................... 798.2.Imunonefelometrisko opredeluvawe imunoglobulinski klasi i potklasi ......................................................... 81

8.2.1. Princip na imunonefelometrija............................................................................................................................... 818.2.2. Opti~ki pateki na svetlinata .................................................................................................................................... 818.2.3. Principi na imunoturbidimetrisko merewe .......................................................................................................... 82

8.2.4. Predreakcii ................................................................................................................................................................... 848.2.5. Proveruvawe turbiditet .............................................................................................................................................. 858.3. Zada~i .................................................................................................................................................................................... 85

8.3.1. Izbroj IgM sekretira~i splenociti od gotova plo~a ........................................................................................... 858.3.2. Izmeri koncentracija na Ig klasi so imunonefelometar .................................................................................... 86

VE@BA 9: ANALIZA NA HUMORALEN IMUNITET ................................................................................................. 919.1. Normalni vrednosti od ispituvaweto humoralen imunitet ...................................................................................... 919.2. Klini~ko zna~ewe na imunoglobulinskite klasi i potklasi ................................... ....................................... ........ 92

9.2.1. Hipogamaglobulinemii ................................................................................................................................................ 929.2.1.1. Prvi~ni imunonedostatoci ................................................................................................................................ 939.2.1.2. Vtori~ni imunonedostatoci ............................................................................................................................. 99

9.2.2. Poliklonski i oligoklonski gamopatii ................................................................................................................. 999.2.3. Monoklonski gamopatii .............................................................................................................................................. 100

BLOK 4 - KOMPLEMENTEN SITEM I CITOKINI .................................................................................................. 101VE@BA 10: KOMPLEMENTEN SISTEM .......................................................................................................................... 103

10.1. Opredeluvawe CH50 na komplementot ........................................................................................................................ 10410.2. Ispituvawe koncentracija na K3, K4 i K1inh .......................................................................................................... 107

10.2.1. Radijalna imunodifuzija (RID) ............................................................................................................................. 10710.2.2. Odreduvawe na K3 komponentata od komplementot so radijalna imunodifuzija ................................ ........ 10910.2.3. Odreduvawe na K4 komponentata od komplementot so radijalna imunodifuzija .................. ....................... 11010.2.4. Odreduvawe na K1 inhibitor komponentata od komplementot so radijalna imunodifuzija ..................... 11010.3. Zada~a ................................................................................................................................................................................. 111

VE@BA 11: CITOKINI ......................................................................................................................................................... 11311.1. Zasituva~ki metodi ........................................................................................................................................................ 113

11.1.1. Op{ti principi na zasituva~kite metodi ..................................................... ...................................... .................. 11311.2. Imunoenzimski odreduvawa (ELISA) ........................................................................................................................ 114

11.2.1. Podgotovka na imunoatsorbentot .......................................................................................................................... 11411.2.2. Kowugirawe ....................................... ....................................... ....................................... ....................................... ..... 11511.2.3. Spojuvawe enzim so protivtelo ili protivgen .................................................................................................... 11511.2.4. Odvivawe na reakcijata ............................................................................................................................................. 11511.2.5. ^itawe na rezultatot ................................................................................................................................................. 116

11.3. Odreduvawe koncentracija na citokini ................................. ..................................... ........................................ ....... 11611.3.1. Op{to za odreduvaweto citokini ................................. ....................................... ....................................... .......... 11611.3.2. Izveduvawe na ve`bata (Odreduvawe koncentracija na interleukin 1b) . ........................................ ................ 118

11.3.2.1. Potreben materijal za izveduvawe na ve`bata ............................................... ......................................... .... 11811.3.2.2. Priprema na pufer za plaknewe na bunar~iwata ............................................. ...................................... ..... 11811.3.2.3. Priprema na rabotniot rastvor na citokinskiot standard ............................................................... 11911.3.2.4. Priprema na zasiluva~kiot rastvor Amdex ............................. ................................... ................................. 11911.3.2.5. Standarden rastvor za razreduvawe ............................................................................................................... 11911.3.2.6. Primerok ................................................................................................................................................................. 119

11.3.2.7. Protokol za rabota ............................................................................................................................................ 12011.3.2.7.1. Prigotvuvawe na standardite ............................................................................................................ 12011.3.2.7.2. Izveduvawe na testot ............................................................................................................................ 120

11.3. Zada~a ................................................................................................................................................................................... 123VE@BA 12: ANALIZA NA KOMPLEMENTEN SISTEM I CITOKINI ............................................................ 125

12.1. Normalni vrednosti od ispituvawe komplementen sistem ...................................... .......................................... ..... 12512.2. Tolkuvawe rezultati od komplementen sistem ......................................................................................................... 126

12.2.1. CH50 .............................................................................................................................................................................. 12612.2.2. K3 i K4 .......................................................................................................................................................................... 12712.2.3. K1-inhibitor ............................................................................................................................................................... 12712.2.4. Hiperkomplementemija ............................................................................................................................................. 12712.2.5. Hipokomplementemija ............................................................................................................................................... 128

12.3. Normalni vrednosti od citokini .................................................................................................................................. 13012.4. Dijagnosti~ko zna~ewe na citokinite ........................................................................................................................ 131


7/240


BLOK 5 - TRANSPLANTACIJA..................................................................................................................................... 133VE@BA 13: PRIKA@UVAWE GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS ..................................... ............ 135

13.1. Op{to za HLA ........................................................................................................................................................... 13513.1.1. [to e HLA ............................................................................................................................................................ 13513.1.2. Genomska struktura i polimorfizam ............................................................................................................... 13713.1.3. Metodi za tipizirawe na HLA .......................................................................................................................... 13713.1.4. Serolo{ki metodi ...................................................................................................................................................... 13813.1.5. Nomenklatura ....................................................................................................................................................... 139

13.2. Serolo{ki metodi za tipizirawe na HLA .......................................................................................................... 13913.2.1. Neophodni uslovi .................................................................................................................................................. 14013.2.2. Prigotvuvawe limfocitna suspenzija ............................................................................................................ 14013.2.3. Mikrolimfocitotoksi~en test ....................................................................................................................... 14113.2.4. Rezultati ............................................................................................................................................................... 142

13.3. Zada~a ................................................................................................................................................................................. 143VE@BA 14: GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS ............................... 145

14.1. Genska struktura na GTSK i negovi polimorfizmi ................................................... ..................................... ........ 14514.2. Molekulski metodi za HLA tipizacija ....................................................................................................................... 14614.3. Principi na molekularnite metodi za HLA tipizacija ................................................................ ........................ 146

14.3.1. SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide Probing) ................................. .................................... .............................. 14614.3.2. RLS (Reverse Line Strip) – reverzna hibridizacija ................................................................................................. 14714.3.3. SSP (Sequence Specific Priming) ................................................................................................................................. 14814.3.4. SBT (Sequence Based Typing) ....................................................................................................................................... 148

14.4. Nivoa na HLA tipizacija ............................................................................................................................................... 14914.5. Dvojbenost (ambigvitet) ................................................................................................................................................. 14914.6. Nomenklatura ..................................................................................................................................................................... 15014.7. Izveduvawe na ve`bata .................................................................................................................................................. 152

14.7.1. RLS (Reverse Line Strip) .............................................................................................................................................. 15214.7.2. SSP (SSP-Sequence Specific Priming) ......................................................................................................................... 153

14.8. Zada~i ................................................................................................................................................................................ 15514.8.1. Interpretiraj gi alelite za HLA lokusot od nitroceluloznite lenti dobieni so metodot na reverzna hibridizacija (RLS) ...................................... ...................................... . 155

14.8.2. Interpretiraj gi alelite za HLA lokusot so metodot na SSP na visoko razdelno nivo .................. .......... 157VE@BA 15: ANALIZA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS ........................................................ 15915.1. Normalni vrednosti za glavniot tkivno sovpadliv kompleks .............................................................................. 15915.2. Bolesti povrzani so GTSK ............................................................................................................................................. 16015.2. Analiza na GTSK asocijacija i bolesti ..................................................................................................................... 16015.3. Asocijacija so haplotipovi ........................................................................................................................................... 16215.4. Zna~ewe na HLA sistemot vo transplantacija .......................................................................................................... 162

15.4.1. Barawe daritel ........................................................................................................................................................... 16315.4.2. Tolkuvawe rezultati ................................................................................................................................................. 163

BLOK 6 - PREOSETLIVOST ................................. .................................. ................................... ..................................... ...... 165VE@BA 16: TIP 1 PREOSETLIVOST .................................. ................................... ................................... ..................... 167

16.1. Reakcii na preosetlivost ............................................................................................................................................... 16716.2. Odreduvawe vkupen IgE i specifi~ni IgE protivtela ........................................................................................ 167

16.2.1. Alergeni ...................................................................................................................................................................... 16716.2.1.1. Vdi{eni (inhalatorni) alergeni .................................................................................................................... 16816.2.1.2. Hrani ...................................................................................................................................................................... 16816.2.1.3. Antibiotici, drugi lekovi i hemikalii .................................................................. .................................. 16916.2.1.4. Profesionalni alergeni .................................. ...................................... ..................................... ...................... 17016.2.1.5. Razli~ni rastitelni produkti ................................... ..................................... ..................................... ........ 17016.2.1.6. Kontaktni alergeni .......................................................................................................................................... 17016.2.1.7. Osnovni principi za vkrstena reaktivnost me|u rastitelni alergeni ................................................ 170

16.2.2. IgE posreduvana alergija ......................................................................................................................................... 17116.2.3. Dijagnosticirawe na IgE posreduvana alergija....................................................... ...................................... ..... 17216.2.4. Princip za opredeluvawe specifi~en IgE ................................................. ....................................... ................... 172

16.3. Razlikuvawe atopiski od ne-atopiski bolesti .......................................................................................................... 17316.3.1. UniCap Phadiatop ........................................................................................................................................................... 17316.3.2. UniCap fx5 ....................................................................................................................................................................... 17416.3.3. UniCap vkupen IgE ...................................................................................................................................................... 175

16.4. Dijagnosti~ki pomagala za specifi~ni alergii ........................................................................................................ 17516.4.1. UniCap specifi~en IgE ............................................................................................................................................ 17516.4.2. UniCap specifi~en IgA ............................................................................................................................................ 17716.4.3. UniCap glijadin IgA .................................................................................................................................................. 17816.4.4. UniCap specifi~en IgG ............................................................................................................................................. 17916.4.5. UniCap glijadin IgG ................................................................................................................................................... 18016.4.6. UniCap eozinofilen katjonski protein (EKP) ..................................................................................................... 18016.4.7. UniCap triptaza ........................................................................................................................................................... 181

16.5. Zada~i ................................................................................................................................................................................. 18216.5.1. Odredi vkupen i specifi~en IgE vo serum .......................................................................................................... 182

VE@BA 17: TIP 2 I TIP 3 PREOSETLIVOST ............................................................................................................. 18717.1. Aglutinacija .................................................................................................................................................................... 187

17.1.1. Objasnuvawe mehanizmot na aglutinacija ........................................................................................................ 18917.2. Direkten protivglobulinski test (DPT) ............................................................................................................ 18917.2.1. Zemawe primerok ................................................................................................................................................ 19017.2.2. Materijal ............................................................................................................................................................... 19017.2.3. Metod ...................................................................................................................................................................... 19017.2.4. Zabele{ki ............................................................................................................................................................. 19217.2.5. Titar kaj antiglobulinskite testovi ............................................................................................................... 193

17.3. Indirekten protivglobulinski test ..................................................................................................................... 19517.3.1. Potrebni materijali .......................................................................................................................................... 19517.3.2. Metod ...................................................................................................................................................................... 19517.3.3. Zabele{ki ............................................................................................................................................................. 196

17.4. Opredeluvawe cirkulira~ki imuni kompleksi so precipitacija so polietilen glikol ............................... ... 19617.5. Zada~a ........................................................................................................................................................................... 198

SODR@INA


8/240



VE@BA 18: ANALIZA NA PREOSETLIVOST ............................................................................................................. 19918.1. Normalni vrednosti za vkupen i za specifi~en IgE .................................................. ........................................ ...... 19918.2. Klini~ki simptomi za alergija i nivno dijagnosticirawe ................................................................................... 199

18.2.1. Oddelno ispituvawe alergeni ................................................................................................................................. 20118.2.2. Ispituvawe komplet alergeni .................................................................. ....................................... ...........................20118.2.3. Ispituvawe alergeni spored dijagnoza................................................................................................................... 203

18.3. Tolkuvawe rezultati od protivglobulinski test .................................. ...................................... .............................. 20418.3.1. Direkten protivglobulinski test ......................................................................................................................... 20418.3.2. Indirekten protivglobulinski test ...................................................................................................................... 206

BLOK 7 - AVTOIMUNITET .................................................................................................................................................. 207VE@BA 19: SISTEMSKI AVTOIMUNITET ................................................................................................................. 20919.1. Voved za avtoimunost ...................................................................................................................................................... 209

19.2. Otkrivawe na avtoprotivtela ....................................................................................................................................... 21019.2.1. Indirektna imunofluorescencija .......................................................................................................................... 21119.2.2. Aglutinacija ............................................ ................................................ .................................................... ....................21119.2.3. Imunodifuzija ............................................................................................................................................................. 21119.2.4. Imunoprecipitacija ................................................................................................................................................... 21119.2.5. Imunoblotirawe ........................................................................................................................................................... 21219.2.6. ELISA ......................................................................................................................................................................... 21219.2.7. ELIA ............................................................................................................................................................................ 21319.2.8. Primerok za ispituvawe ........................................................................................................................................... 21319.2.9. Stabilnost na protivtelata ..................................................................................................................................... 213

19.3. Sistemski avtoimuni zaboluvawa ................................................................................................................................. 21319.3.1. Protivtela povrzani so revmatska bolest ............................................................................................................ 213

19.3.1.1. Fosfolipidni protivtela ................................................................................................................................ 21319.3.1.2. Nuklearni protivtela (ANA) ......................................................................................................................... 214

19.3.2. Protivtela kon neutrofilnata citoplazma ........................................................................................................ 21419.3.3. Sistemski lupus eritematozus (SLE) .............................................................. ..................................... ................ 215

19.3.3.1. O{tetuvawe na tkivoto .................................................................................................................................. 21519.4. Zada~a ................................................................................................................................................................................... 216

19.4.1. Opredeluvawe IgM protivkardiolipinski protivtela ...................................................... ............................. 21619.4.1.1. Potreben materjal za izveduvawe na ve`bata ................................ ....................................... ........................ 21619.4.1.2. Priprema na pufer za plaknewe ........................................................................................................................ 217 19.4.1.3. Priprema na rastvor za razreduvawe ............................................................................................................... 217 19.4.1.4. Primerok ................................................................................................................................................................. 217 19.4.1.5. Protokol za rabota............................................................................................................................................ 21819.4.1.6. Presmetuvawe na rezultatite ....................................................................................................................... 21919.4.1.7. Presmetuvawe koncentracija na IgM protivkardiolipinskite protivtela .................................... 219

VE@BA 20: ORGAN SPECIFI^EN AVTOIMUNITET ............................................................................................ 22120.1. Organ specifi~ni avtoimuni zaboluvawa ................................................................................................................ 221

20.1.1. Endokrini avtoimuni bolesti ................................................................................................................................. 221 20.1.1.1. Protivtela kon parietalni gastri~ni kletki ............................................... ...................................... .... 221 20.1.1.2. Protivtela kon intrinzik faktorot . ..................................... ...................................... ............................ 221 20.1.1.3. Avtoprotivtela povrzani so dijabetes ................................ ...................................... ................................. 222 20.1.1.4.Tiroidni avtoprotivtela ................................. ...................................... .................................... .................... 222

20.1.2. Gastrointestinalni avtoimuni bolesti ............................................................................................................... 223 20.1.2.1. Protivtela povrzani so celijakija .................................. ...................................... ...................................... .. 223

20.1.3. Avtoimuna bolest na crniot drob .......................................................................................................................... 22320.1.4. Protivtela povrzani so nevromuskularni bolesti ............................................................................................. 224 20.1.4.1. Protivtela kon acetilholinski receptori ............................... ..................................... ........................... 224

20.1.5. Avtoprotivtela povrzani so bubrè na bolest ....................................................... ..................................... .......... 224 20.1.5.1. Protivtela kon glomerulskata bazalna membrana ............................................. ....................................... . 22420.2. Zada~i ................................................................................................................................................................................ 225

20.2.1. Opredeli koncentracija na tiroidni avtoprotivtela (TG i TPO) ................................. ................................. 225VE@BA 21: ANALIZA NA AVTOIMUNI ZABOLUVAWA ...................................................................................... 229

21.1. Normalni vrednosti za sistemski avtoprotivtela................................................................................................... 22921.2. Normalni vrednosti za organ specifi~ni protivtela ........................................................ .................................... 23021.3. Tolkuvawe sistemski avtoprotivtela .......................................................................................................................... 231

21.3.1. Avtoprotivtela kon dvoveri`na DNK (dvDNK) ................................................................................................. 23221.3.2. U1RNP ........................................................................................................................................................................... 23221.3.3. RNP70 ............................................................................................................................................................................. 23221.3.4. Sm .................................. ...................................... ..................................... ........................................ ............................ 23221.3.5. Ro ................................................................................................................................................................................... 23321.3.6. La ................................................................................................................................................................................... 23321.3.7. CENP ..................................... ....................................... ...................................... ....................................... ................. 23321.3.8. Scl-70 ............................................................................................................................................................................ 23321.3.9. Jo-1 ................................................................................................................................................................................ 23321.3.10. Avtoprotiv tela kon proteinaza 3 (PR3) ..................................... ....................................... .................................. 23321.3.11. Avtoprotiv tela kon mieloperoksidaza (MPO) ............................................................................................... 23321.3.12. Avtoprotiv tela kon alfa3 lanecot na kolagen 4 (GBM) ................................................. ............................... 234

21.3.13. Kardiolipinski protivtela .................................................................................................................................. 23421.4. Tolkuvawe organ specifi~ni avtoprotivtela ......................................................................................................... 23521.4.1. Antitiroglobulinski protivtela (TG) ................................................................................................................ 23521.4.2. TPO ............................................................................................................................................................................... 23521.4.3. Protivtela kon parietalni kletki ........................................................................................................................ 23621.4.4. Test za GBM protivtela ........................................................................................................................................... 23621.4.5. Test za protivspermalni protivtela .................................................................................................................... 23721.4.6. Protivmitohondrijalni protivtela ....................................................................................................................... 23721.4.7. LKM1 protivtela........................................................................................................................................................ 238

22. OSNOVNI LABORATORISKI PRAVILA ................................................................................................................ 239

23. LITERATURA ....................................................................................................................................................................... 240


9/240

9

VE@BA 1: ISPITUVAWE KLETOÊN VRODEN IMUN SISTEM

Institut za imunobiologija i humana genetika

UÊBNI CELI:

VE@BA 1. ISPITUVAWE KLETOÊN VRODEN IMUNSISTEM (1 ~as)

Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da:

go definiraat mestoto na fagocitozata vo vrodeniotimunitet;

ja opredelat fagocitnata sposobnost vo eden fagocit.

VE@BA 2. ISPITUVAWE HUMORALEN IMUNSISTEM (1 ~as)

Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat:

da gi protolkuvaat proteini na akutna faza;

da ja opredelat koli~inata na nekoi proteini naakutna faza vo plazma.

VE@BA 3.ANALIZA NA SLUÂI OD VRODEN IMUNSISTEM (1 ~as)

Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da:

tolkuvaat rezultati od vrodeniot imun sistem;

analiziraat slu~ai od vroden imun sistem.

POENI:

PRISUSTVO 1.5 poeni

ZNAEWE 3.0 poeni

VKUPNO: 4.5 poeni

BLOK 1

BLOK 1 - VRODEN IMUN SISTEM


10/240

10 Institut za imunobiologija i humana genetika



11/240

11



VE@BA 1: ISPITUVAWE KLE-

TOÊN VRODEN IMUN SISTEM

1.1.Ispituvawe imunolo{kata

funkcija na fagocititeFagocitnite kletki, polimorfonuklearnite neutrofilii mononuklearnite fagociti (makrofagi, monociti), imaatmnogu va`na imunolo{ka funkcija vo efektorniot del naimunolo{kiot odgovor i vo vospalitelnata reakcija. Pribakteriska ili fungi~na agresija vrz organizmot prvireagiraat polimorfonuklearite, a potoa se vklu~uvaat imononuklearnite fagociti. Nivnata imunolo{ka funkcija

Slika 1.1: Sedumte fazi od fa-gocitoza na bakterii.

se izrazuva pred s# preku procesot na fagocitoza, kojnajkuso prikaàno, moè da se podeli vo nekolku fazi(Slika 1.1):


12/240



- naso~uvawe na fagocitite kon kletkata cel, tu|iotagens (fenomen na lokomocija) i prilepuvawe do mikro-bite;

- goltnuvawe na mikrobite so fagocitoza;

- sozdavawe fagozom;

- soedinuvawe na fagozomot so lizozomot i sozdavawe

fagolizozom;- digestija na kletkata cel (kleto~no i biohemisko ubivawe) niz procesot na oksidativen metabolizam;

- sozdavawe ostato~no telce koe sodrì nerazgradenmaterijal;

- isfrlawe na ostato~niot materijal.

Pri ispituvawe na imunolo{kata funkcija na fagocititeneophodno e da se postigne procenka vo site fazi od pro-cesot na fagocitoza, za {to denes postojat brojni labo-ratoriski metodi, a del od niv ovde }e bide prikaàn.

1.2. Kvalitativen NBT testVo osnova se opredeluva redukcijata na NBT prekusuperoksid anjon, koj se javuva kako proizvod od aktivi-ranata oksidacija. Reduciraniot NBT ima karakteristikada se taloì vo forma na crni zrnca od formazan. Postojatpove}e modifikacii na metodot, no najkoristeni se cito-hemiskite koi go opredeluvaat procentot na polimorfo-nukleari ili monociti {to sodràt precipitirani zrncaod formazan. Ovaa redukcija ne e specifi~na bidej}i NBTmoè da go reduciraat i drugi reduktazi nezavisno odoksidativniot metabolizam. Sepak, ovoj test e mnogu

pogoden za dijagnoza na steknati ili vrodeni granulopatii.Moè da se koristi polna krv ili ve}e izdvoeni kletki.Na 100 mikrolitri periferna krv se dodava 100 mikrolitrirastvor od NBT (2 mg/mL), se inkubira 15 min/37oC i potoase vr{i stimulirawe na fagocitite so rastvor odendotoksin (15 mkg/mL), ili suspenzija od ubieni bakteriiili phorbol myristate acetate (50 - 100 ng/mL). Povtorno seinkubira 15 min na 37oC i se fiksira so formaldehid.Takase liziraat eritrocitite, a drugite kletki so pomo{ nacitocentrifuga se postavuvaat na predmetno staklence. Sevr{i sprotivno obojuvawe so fuchsine i mikroskopski seopredeluva procentot na kletkite koi sodràt precipi-tiran reduciran NBT.

1.3. Kvantitativen NBT testDodavaweto òlta NBT boja vo plazmata doveduva doformirawe NBT-heparin ili NBT-fibrinogen kompleks{to moè da bide fagocitiran od neutrofilot. Kaj nor-malnite neutrofili moè da se zgolemi fagocitnataaktivnost so dodavawe (stimulirawe) endotoksin. Ovoj

Slika 1.2: [ematski prikaz nakvantitativen nitroblu te-trazolium test (NBT) zaispituvawe fagocitnatasposobnost na imunite kle-tki.

- 5 mL dioksan- 20 min na 70 oC- 10 min na 1000g- se meri na 520 nm

AAAAA BBBBB

- 1.5 mL krv- 15 mkl endotoksin- 0.3 mL NBT- 10 min na 37oC- 2h2 mL SFP- 2 kapki HCL- 2 mL voda


13/240

13



metod moè da se upotrebi za da se izmeri stepenot nastimulacijata na nestimuliranite kletki ili nivniotkapacitet za fagocitoza po stimulacijata. Stimuliraniteneutrofili go vgraduvaat kompleksot na boja vo fagozomi-te i po lizozomalnata fuzija, intracelularnata redukcijadoveduva do formirawe sini nerastvorlivi kristali naformazan. Procentot na fagocitnite kletki moè da bide

opredelen so svetlosen mikroskop, a vkupnata redukcijana bojata moè da bide kvantificirana spektrofo-tometriski po dioksanskata ekstrakcija.

Potrebno za izveduvawe na ve`bata:

Se zema venska krv so heparin (20 IE/mL); destilirana voda;solen fosfaten pufer; endotoksin od escherihia coli 1 mg/mLvo SFP; 4 mmol NBT vo SFP koj sodrì 340 mmol saharoza;dioksan; 0.1 mol HCl; najlonska volna 100 mg vo siliko-nizirani pasterovi pipeti; vodena bawa na 37 i na 70o C;spektrofotometar; pasterovi pipeti ili mikrokoloni(NEN); askorbinska kiselina.

Se prigotvuvaat slednive materijali:

- 340 mmol saharoza. Se merat 11.62 g saharoza, se stavaat vokolba od 100 mL, se dodava destilirana voda do 100 mL.

- Solen fosfaten pufer- KH2 PO

40.20 g, Na

2 HPO

41.44 g,

KCl 0.20 g, NaCl 8.00 g, H2O destilirana do 1000 mL.

- 4 mmol NBT vo solen fosfaten pufer vo 340 mmolsaharoza. Se merat 11.628 g saharoza, 0.29 g NBT,volumenot do 100 mL se dopolnuva so SFP.

- 0.1 mol HCl. Se zemaat 0.83 mL od 37% HCl i se dopol-nuva do 100 mL so destilirana voda.

- 150 mikromoli askorbinska kiselina = 26.4 mg.

- 0.1 mol NaOH so 24 mmol Na2HCO

3. Se merat 400 mg NaOH,

se stavaat vo kolba od 100 mL, se dodavaat 50 mLdestilirana voda za da se rastvori natrium hidroksidoti vo nego se dodavaat 0.201 g Na

2HCO

3i se dopolnuva so

destilirana voda do 100 mL.

- 4 mmol NBT vo 340 mmol saharoza. Se merat 3 mg NBT ise stavaat 1 mL 340 mmol saharoza.

- Najlonska volna.

Najlonskata volna se vari vo destilirana voda i vodata semenuva najmalku tri pati, potoa se ras~e{luva i se su{ina sobna temperatura. Se merat 100 mg i se vnesuvaat vopasterovi pipeti ili vo mikrokoloni (NEN) na ~ie dno senao|a filter disk ili malo koli~estvo staklena volna.Funkcijata na najlonskata volna e da gi zadrì fago-

citnite kletki, koi imaat sposobnost za prilepuvawe(atherencija) za vlaknata od najlonska volna.

Poèlno e da se koristat plasti~ni epruvetki, no do kolkuse raboti so stakleni sadovi, tie treba da se siliko-niziraat za da se spre~i atherencijata na kletkite zanivniot yid. Treba da se zeme predvid deka i neutrofilitei monocitite imaat sposobnost za goltnuvawe (ingestija)na NBT so fagocitoza. Faktorot za konverzija zapresmetuvawe moli od formazan spored koeficientot na

Slika 1.3: Stapkite za izve-duvawe na kvantitativniotnitroblu tetrazolium test(NBT) za ispituvawe fagoci-tnata sposobnost na imunite

kletki. A, stavawe krv vo dveepruvetki (levo nestimulirana, desno stimulirana). B,Nanesuvawe krv vrz najlonskavolna. V, Prefrlawe na najlon-skata volna vo epruvetki sodioksan za nivna ektrakcija.G, kolorimetrisko opredelu-vawe intenzitetot na sozda-deniot formazan.

A

B

V

G


14/240



ekstincija mora da bide presmetuvan za sekoe {i{ence boja,po hemiskata redukcija, opi{ana podolu.

Testot se izvr{uva na sledniov na~in (slika 2):

1. Se zema venska krv so heparin (20 IE/mL) i od neatreba da se napravi diferencijalna krvna slika.

2. Se dodavaat 15 mkL endotoksinski rastvor (1 mg/mLvo SFP) na 1.5 mL krv za stimulacija (A) ili 15 mkLfiziolo{ki rastvor kako kontrola (B) i se inkubirana 37oC, 10 min.3. Se dodava 0.3 mL sve`o podgotven rastvor na NBT ivnimatelno se me{a.4. Se dodava celata krv kapka po kapka vo najlonskitekoloni.5. Otkako krvta }e navleze vo volnata, se mie dva patiso 2 mL SFP, a potoa so 2 mL destilirana voda.Destiliranata voda }e gi lizira crvenite krvni zrnca.6. Se dodavaat po dve kapki 0.1 N HCl za da se prekinenatamo{nata redukcija na vnatrekleto~nata (intra-

celularnata) boja i potoa se mie so 2 mL destiliranavoda.7. Se otstranuva volnata so eza (ili igla za pletewe) ise stava vo 5 mL dioksan (vo staklen sad).8. Se inkubira na 70oC so povremeno pojako tresewedodeka najlonskata volna ne si ja vrati belata boja (stoiokolu 20 min).9. Se centrifugira dioksanskiot ekstrakt za da seotstrani precipitatot ili najlonskite ni{ki (1000 g,10 min na sobna temperatura).10. Se meri ekstincijata na 520 nm so spektrofotome-tar (kako slepa proba se koristi dioksan).

Ekstincioniot koeficient za sekoe {i{ence NBT se opredeluva na sledniov na~in:

1. Se dodavaat 150 mkmol askorbinska kiselina (26.4 mgsupstancija) na 0.2 mL NBT rastvor (4 mmol vo saharoza)i se me{a.2. Se dodava 2.0 mL 0.1 M natrium hidroksid so natriumbikarbonat.3. Se inkubira 10 min na sobna temperatura i se dodavaat5 mL destilirana voda.4. Se centrifugira na 1000 g, 15 min na sobna temperatura.5. Se plakne edna{ so voda i so centrifugirawe kakovo to~ka 4. Se otstranuva supernatantot i se resuspen-dira siniot nerastvoren formazanski precipitat vo

10 mL dioksan.6. Se rastvora 1 mL od suspenzijata vo 9.0 mL dioksan ise inkubira na 70oC, 20 minuti.7. Se ladi do sobna temperatura i se meri ekstincijatana 520 nm so spektrofotometar koristej}i dioksan kakoslepa proba.8. Se presmetuva faktorot na konverzija od vrednostana ekstincijata. Grubo ovoj faktor treba da bide okolu:


15/240

15



1 ekstinciona edinica = 40 nmol formazan

Prika`uvawe i tolkuvawe na rezultatite (Tabela 1):

1. Koristej}i go faktorot na konverzija, se odreduva brojotna moli na formazan ekstrahirani od nestimuliranata istimuliranata krv so endotoksin.

2. Se presmetuva brojot na potencijalni fagociti (% naapsolutniot broj se dol`i na neutrofili i monociti).

3. Rezultatite se izrazuvaat kako femtomoli (10-15M) naformazan po eden fagocit. Normalno rastojanie zanetretirana krv e do 129 femtomoli formazan za sekojfagocit. Normalni granici za stimulirana krv se do 290femtomoli formazan po fagocit.

Za da se presmetaat ovie vrednosti neophodni se diferen-cijalna formula i broj na beli krvni kletki vo 1 mL krv.

1.4. Zada~aIzvadi krv od vena od kole{ka ili kolega i izvedikvantitativen NBT test so nestimulirana i stimuliranakrv i presmetaj gi vrednostite vo Tabela 1.1.

1. So pomo{ na kolorimetar se meri intenzitetot naTabela 1.1: Formular zapresmetuvawe NBT.

Primer Slu~aj

nestimulirana stimulirana nestimulirana stimulirana

Otklon na skalatana kolorimetarot

0.18 (0.01=1EE) 0.4 (0.01=1EE)

Izmereni EE 18 40

Faktor nakonverzija (1EE)

40 nmol formazan 40 nmol formazan

Vkupno sozdadenformazan vo 1.5 mLkrv

720 nmol (18h40)1600 nM formazan

(40h40)

Vkupno sozdadenformazan vo 1 mLkrv

480 nmol formazan1066.7 nmoli

formazan

Broj na belikletki vo 1 mm3

6000

Broj na belikletki vo 1 mL

6000000 (6000h1000)

Broj na fagocitevo 1 mL krv(Ne+Mo)

60% (55%+5%) od 6000000 = 3600000

Sozdaden formazanna eden fagocit

0.0001333 nMformazan/ fagocit

(133.3femtomoli/fagocit)

0.0002963 nMformazan/fagocit

(296.3femtomoli/fagocit)


16/240



Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)

Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at)

______________ ____________________________ __________________________

obojuvawe na stimuliranata i nestimuliranataepruveta.

2. Izmereniot otklon se pretvora vo ekstincioniedinici. Na primer, dokolku za stimuliranataepruveta otklonot na kolorimetarot e 0.4, toa zna~ideka ima 40 ekstincioni edinici (1EE ima otklon na

kolorimetarot od 0.01).3. Ekstincionite edinici se pretvoraat vo nanomoli na

formazan. Imeno 1 EE odgovara na 40 nanomoli naformazan. Vo na{iot primer 40 EE }e odgovarat na1600 nanomoli na formazan (40 EE h 40 nanomoliformazan = 1600 nanomoli formazan).

4. Se presmetuva sozdadeniot formazan vo edenmililitar krv. Presmetanite 1600 nanomoliformazan odgovaraat na 1.5 mL krv. So pomo{ naprosto trojno pravilo }e najdeme kolku nanomoli naformazan ima vo 1 mL krv. Vo na{iot primer, vo 1 mLstimulirana krv }e ima 1066.7 nanomoli formazan.

5. Se brojat belite kletki i se doteruva nivniot broj vo1 mL krv. Na primer, neka so pomo{ na [ilingovataili Nojbauerovata komora vo 1 mm3 se izbrojani 6000beli kletki. Toa zna~i deka vo na{iot 1 mililitarkrv }e ima 6000000 beli kletki.

6. Se brojat fagocitite vo eden mililitar krv. Ne sefagociti site 6000000 beli kletki. Fagociti vokrvta se samo neutrofilite i monocitite. Taka, akoso leukocitarnata formula utvrdime deka vo na{iot1 mililitar krv ima 55% neutrofili i 5% monociti,toa zna~i deka od na{ite 6000000 beli kletki samo3600000 se fagociti.

7. Se presmetuva sozdadeniot formazan na eden fagocit.

Vo na{iot primer imame 1 mililitar krv vo koj ima3600000 fagociti koi sozdale 1600 nanomoli naformazan. Za da utvrdime kolku formazan sozdal 1fagocit treba vkupnata koli~ina na sozdadenformazan da ja podelime so brojot na fagociti (1600nmoli formazan / 3600000 fagociti). Na toj na~indobivame deka eden fagocit sozdal 0.0002963nanomoli formazan. Dokolku nanomolite gi pretvo-rime vo femtomoli, }e dobieme deka eden fagocitsozdal 296.3 femtomoli na formazan.


17/240

17

VE@BA 2: ISPITUVAWE HUMORALEN VRODEN IMUN SISTEM


VE@BA 2: ISPITUVAWEHUMORALEN VRODEN IMUN

SISTEM

2.1. Proteini na akutna faza

(PAF)Prvata reakcija vo organizmot kon imunolo{kiot stres(ili prvata imunolo{ka reakcija) e vrodeniot, nespeci-fi~en odgovor koj mu prethodi na steknatiot imun odgovor.Akutno fazniot odgovor e zna~ajna sistemska reakcija naorganizmot kon lokalnite ili sistemskite naru{uvawa nahomeostazata predizvikani od infekcija, tkivno o{tetu-vawe, neoplasti~en (malignen) rast ili imunolo{kinaru{uvawa.

Na mestoto na navleguvawe na mikroorganizmite i namestoto na tkivnoto o{tetuvawe zapo~nuvaat serija ododgovori na samoto tkivo. Se osloboduvaat vospalitelnicitokini i se aktiviraat vaskularniot sistem i imunitekletki. Vakvite reakcii predizvikuvaat la~ewe na u{tepove}e citokini i drugi vospaliteli medijatori koiminuvaat niz me|ukletkinite prostori, navleguvaat vokrvta i cirkuliraat niz nea.

2.1.1. Akutno fazen odgovorAkutno faznite promeni mo`at da se podelat kako promenivo koncentracijata na mnogu plazmini proteini, poznatikako proteini na akutna faza (PAF) (Tabela 2.1) i vogolem broj promeni vo odnesuvaweto, fiziolo{kiteprocesi, biohemiskite reakcii i ishranata (Tabela 2.2).

Kako protein na akutna faza se definira onoj protein~ija koncentracija se menuva (pozitivno ili negativno)za vreme na vospalitelnoto zaboluvawe . Promenite vokoncentracijata na proteinite se najmnogu zavisni odsintetiziraweto vo crniot drob. Goleminata na promenitevarira od okolu 50% kaj ceruloplazminot i komplementniteproteini do nad 1000 pati vo slu~aite na C-reaktivniotprotein i serumskiot amiloid A (plazmin prethodnik naamiloid A koj sozdava vtori~ni skladi{ta vo tkivata)(Slika 2.1).

Proteini ~ija {to plazmatskikoncentracija se zgolemuva(pozitivni PAF)

Glavni PAF:C-reaktiven proteinAlfa1 kisel glikoproteinSerumski amiloid A

Komplementen sistem:K3K4K9Faktor BC1 inhibitorC4b vrzuva~ki proteinManoza vrzuva~ki protein

Sosiruva~ki i fibrinoliti~ensistem:

Fibrinogen

PlazminogenTkiven plazminogenski aktivatorUrokinazaProtein SVitronektinPlazminogen-aktivatorskiinhibitor 1

Antiproteazi:Alfa1 proteazen inhibitorAlfa1 antihimotripsinPankreati~en sekretorentripsinski inhibitor

Transportni proteini:CeruloplazminHaptoglobinHemopeksin

U~esnici vo vospalitelen odgovor:Izla~ena fosfolipaza A2Lipopolisaharid vrzuva~kiprotein

Interleukin 1 receptorskiantagonistGranulociten koloniistimulira~ki faktor

Proteini ~ija {to plazmatskiakoncentracija se namaluva (negativniPAF):

AlbuminTransferinTranstiretinalfa2-human serum glikoproteinAlfa fetoproteinTiroksin vrzuva~ki globulinInsulinoviden faktor za rast 1Faktor 12

Tabela 2.1: ̂ ovekovi prote-ini na akutna faza (PAF).


18/240



Naj~estite sostojbi koi doveduvaat dozna~ajni promeni vokoncentracijata na proteinite na akutna faza vo plazmatase: infekcijata, traumata, operacijata, izgorenicite,tkivniot infarkt, razli~ni imunolo{ki ostvareni ivospalitelni sostojbi pottiknati so kristali i napred-natiot malignen proces (kancer). Umereni promeninastanuvaat posle: intenzivno ve`bawe, toploten udar iporoduvawe. Mali promeni nastanuvaat posle psiholo{ki

stres i nekolku psihijatriski zaboluvawa.Iako koncentracijata na skoro site proteini na akutnafaza se zgolemuva istovremeno, nivniot porast ne euniformen kaj site pacienti so ista bolest. Zatoa,febrilnite pacienti mo`at da imaat normalna koncen-tracija na C-reaktiven protein, no da imaat promeni vodrugi komponenti od proteinite na akutnata faza.Individualnata razlika vo reguliraweto koncentracijatana proteinite na akutna faza sugerira deka kaj sekojaedinka ima la~ewe na razli~ni citokini vo razli~nikoncentracii vo razli~ni patolo{ki sostojbi.

2.1.2. Regulacija na akutno faznitepromeniAkutno fazniot odgovor e reakcija na organizmot konnaru{uvaweto na homeostazata (vnatre{nata sredina)predizvikana od infekcija, tkivno o{tetuvawe, malignenrast ili imunolo{ko naru{uvawe (Slika 2.2).

Akutno fazniot odgovor se sostoi od lokalna reakcija namestoto na o{tetuvaweto karakterizirano so brojni

Slika 2.1: Karakteristi~enoblik na promeni vo plazmi-nite koncentracii na nekoiproteini na akutna faza posle lesno vospalenie.


19/240

19



Slika 2.2: Stapkite na akut-no fazniot odgovor vo organi-zmot.

reakcii, kako {to se slepuvawe (agregacija) na krvniteplo~ki (trombociti), sozdavawe sosirok (koagulum),pro{iruvawe i propuslivost na krvnite sadovi, kako inasobirawe i aktivacija na ednojadreni kletki (granulo-citi, monociti) koi osloboduvaat citokini. Dopolnitelno,aktiviranite fibroblasti i endotelni kletki se

osposobeni da la~at citokini. Ovie medijatori dejstvuvaatvrz specifi~nite receptori od razli~ni celni kletkidoveduvaj}i do sistemska reakcija obeleèna so treska,zgolemen broj beli kletki (leukocitoza), zgolemenasedimentacija na crvenite kletki, zgolemeno la~eweadreno kortikotropen hormon (AKTH) i glikokortikoidi,aktivacija na komplementnata i sosiruva~kata skala(kaskada), smaleno nivo na èlezo i cink vo plazma,negativna azotna ramnoteà i dramati~ni promeni vo


20/240



koncentracijata na nekoi plazmatski proteini. Ovieproteini se nar~uvaat akutno fazni proteini (Slika2.2).

Krajnata cel na proteinite od akutnata faza e da seotstranat naru{uvawata na homeostazata i da se vospostavizdrava odbrambena funkcija vo organizmot, {to sedefinira kako negativna povratna sprega ili celosnovozobnovuvawe. Nemo`nosta da se otstranat naru{uvawatavo homeostazata doveduvaat do pozitivna povratna sprega,odnosno hroni~no vospalenie (desno na Slika 2.2).

2.1.2.1. Indukcija na proteinite od akutnafaza so citokini i drugi signalni molekuliCitokinite se vnatrekleto~ni signalni polipeptidi koigi sozdavaat aktiviranite kletki. Pove}eto citokiniproizleguvaat od pove}e kletki, vlijaat na pove}e celnikletki i imaat pove}ekratni dejstva. Citokinite koi sesozdavaat za vreme na vospalenieto i u~estvuvaat vovospalitelnite procesi, se glavnite stimulatori na

proteinite na akutnata faza. Vo vospalitelno asociranitecitokini spa|aat interleukin-6, interleukin-1beta, tumornekrozniot faktor alfa, interferonot-gama, transfor-mniot faktor za rast-beta, i verojatno interleukin-8. Tiese sozdavaat od razli~ni vidovi kletki, no niven najvaènizvor se makrofagite i monocitite na mestoto navospalenieto.

Interleukin 6 (IL-6) e glavniot stimulator na sozdavawetona pove}eto akutno fazni proteini, dodeka drugitecitokini imaat vlijanie na oddelni podgrupi od akutnofaznite proteini. Pokraj negoviot efekt vrz crno-dorobnite kletki, IL-6 dejstvuva i vrz nekolku drugi celnikletki (Slika 2.3).

Citokinite dejstvuvaat i kako skala (kaskada) i kako mreàvo pottiknuva~koto dejstvo za sozdavawe proteini na akutnafaza. Mnogu citokini moàt da go reguliraat sozdavawetona drugi citokini i citokinski receptori. Na primer,tumor nekrozniot faktor-alfa e glavniot pottiknuva~ vosozdavaweto interleukin-1 kaj pacienti so revmatoidenartrit (revmatsko vospalenie na zglobovite), a inter-leukin-1beta moè da go zgolemi ili da go namalisozdavaweto na sopstvenite receptori.

Osven toa, citokinite se delovi od edna kompleksnasignalna mreà. Kletkite mnogu retko se izloèni samokon eden citokin. Naj~esto kletkite se izloèni konkombinacija od citokini so razli~ni biolo{ki dejstva.Efektite na citokinite vrz celnite kletki moàt dabidat inhibirani ili stimulirani so drugi citokini, sohormoni, so citokinski receptorski antagonisti i socirkulira~ki receptori. Kombinaciite od citokinitemoàt da imaat adidtivni, inhibitorni ili sinergisti~kiefekti.

Ekspresijata na genite za akutno faznite proteini glavnose regulira na transkripcisko nivo, no u~estvuvaat i post-transkripciskite mehanizmi. Post-translaciskite

Nevroendokrini promeni:Treska, pospanost i gubitokna apetit.Zgolemeno la~ewekortikotropenosloboduva~ki faktor,kotrikotoropin (AKTH) ikortizol.Zgolemeno la~ewe argininvazopresin.

Zgolemeno nadbubre`nola~ewe kateholamini.

Hematopoetski promeni:Slabokrvnost (anemija) oddolgotrajna bolest.Zgolemeni beli kletki(leukocitoza).Zgolemeni krvni plo~ki(trombocitoza).

Metabolni promeni:Gubitok na muskuli inegativen azoten bilans.Smalena glukoneogeneza.Osteoporoza.Zgolemeno sozdavawe mastivo crn drob.Zgolemena lipoliza vomasnoto tkivo.Smalena lipoproteinlipazna aktivnost vomuskulite vo masnototkivo.Kaheksija.

Crnodrobni promeni:Zgolemen metalotionein,inducirana azoten oksidsintetaza, hem oksigenaza,mangan superoksiddizmutaza i tkiven inhibi-tor na metaloproteinaza-1.

Smalena aktivnost nafosfoenolpiruvatkarboksilaza.

Promeni vo neproteinskitedelovi od plazmata:

Hipocinkemija,hipoferemija,hiperkupremija.Zgolemena plazmakoncentracija na retinol iglutation.

Tabela 2.2: Vidlivipromeni kaj lu|eto priakutno fazen odgovor.


21/240

21



promeni vo glikozilacijata na plazmatskite proteini zavreme na vospalitelniot odgovor vklu~uva o{tetuvawe naoligosaharidnite granki, zgolemeno sijalirawe naorozomukoidot i smalena galaktozilacija na IgG.Promenite vo oligosaharidnite granki se pottiknuvat odvospalitelnite citokini, nezavisno od nivnite efektivrz sozdavaweto akutno fazni proteini. Kone~no,

efikasnosta na la~ewe C-reaktiven protein (CRP), procesrazli~en od negovata sinteza, zna~itelno se zgolemuva zavreme na akutno fazniot odgovor.

2.1.2.2. Regulacija na drugite akutno faznipromeni so vospalitelno asociranite citokiniTreskata e izraz na nevroendokrinite promeni koi goobeleùvaat akutno fazniot proteinski odgovor. Iakomoàt nekolku citokini da pottiknat treska, sozdadeniotinterleukin-6 vo mozo~noto steblo e neophoden za krajnitestapki koi predizvikuvaat treska. Me|utoa, citokinite nese edinstvenite pottiknuva~i na treskata. Najnovite naodideka subdijafragmatskata vagotomija ja blokira treskatapredizvikana od vnatreperitonealna (no ne i vnatre-

muskulna) injekcija od lipopolisaharidi ukaùva naneuralen prenos na febrilniot odgovor. Drugitenevroendokrini promeni se odnesuvaat na kompleksnitesoodnosi pome|u citokinite, hipotalamo-hipofizno-nadbubre`nata oska i drugi delovi od nevroendokriniotsistem. Na primer, vospalitelnite citokini go stimuliraatsozdavaweto kortikotropin osloboduva~ki faktor soposledovatelno zgolemeno la~ewe na adreno kortikotropenhormon (AKTH) i kortizol i direktna stimulacija nanadbubre`nata `lezda. Zgolemenoto la~ewe arginin

Slika 2.3: Pleotropnite (po-ve}ekratnite) dejstva nainterleukin-6 vo akutno faz-niot odgovor.


22/240



vazopresin pod dejstvo na interleukin-6 ja objasnuvahiponatriemijata koja se javuva posle nekoi vospalitelnizaboluvawa (Slika 2.4).

Slika 2.4: Regulacija na crno-drobnata sinteza na akutnofaznite proteini so vospali-telnite medijatori.

Promenite vo odnesuvaweto se ~esto pati prisutni vovospalenieto, vklu~uvaj}i go gubeweto apetit (anoreksija),pospanost (somnolencija), i slabost (letargija) i moàt dabidat pottiknati so citokinite.

2.1.3. Funkcii na akutno fazniotodgovorVospalenieto e kompleksen, visoko orkestriran proces vokoj se vklu~eni mnogu vidovi kletki i molekuli, od koiedni zapo~nuvaat, zasiluvaat ili odrùvaat procesi, drugigo spre~uvaat, a treti ovozmoùvaat procesot da sevozobnovi.

Mnogu od akutno faznite proteini imaat potencijal davlijaat vrz eden ili vrz pove}e od stapkite na vospalenie.Glavnata funkcija na C-reaktivniot protein, del od

vrodeniot humoralen imun sistem, e negovata sposobnost dago vrze fosfoholinot i na toj na~in da prepoznae nekoitu|i predizvikuva~i kako i fosfolipidnite strukturi odo{tetenite kletki. C-reaktivniot protein moè da goaktivira komplementniot sistem ako se vrze za nekoj odnegovite ligandi, kako i da se vrze za fagocitnite kletki{to se objasnuva so negoviot istovremen efekt vrzotstranuvaweto na celnite kletki i preku humoralnite ipreku kleto~nite imuni sistemi.


23/240

23



Serumskiot amiloid A e sostaven od familija apolipo-proteini koi brzo se vrzuvaat za lipoproteinite so visokagustina (HDL) posle nivnoto sintetizirawe i vlijaat vrzholesterolskiot metabolizam za vreme na vospalenieto.Serumskiot amiloid A predizvikuva prilepuvawe(adhezija) i hemotaksija na fagocitnite kletki i nalimfocitite i moè da pridonese do vospalenie na

ateroskleroti~nite koronarni arterii so zgolemuvaweoksidacijata na lipoproteinite so niska gustina (LDL).

Nekolku akutno fazni proteini zapo~nuvaat ili odrùvaatvospalenie. Klasi~nite komplementni komponenti, od koipogolemiot del se akutno fazni proteini, imaat centralnaproinflamatorna uloga vo imunitetot, kako {to ima manozavrzuva~kiot protein. Komplementnata aktivacija doveduvado hemotaksija, cedewe na plazminite proteini vovospalenoto mesto, i opsonizacija na vospalnitelnitepredizvikuva~i i o{tetenite kletki.

Sprotivno, drugi akutno fazni proteini moàt da prikaàtprotivvospalitelno dejstvo. Na primer, antioksidansitehaptoglobin i hemopeksin go {titat organizmot odreaktivniot kislorod. Alfa1-proteazniot inhibitor ialfa1-antihimotripsinot ja spre~uvaat aktivnosta naproteoliti~kite enzimi. Lekuvaweto na ranata goovozmoùva fibrinogenot preku prilepuvawe na endotel-nite kletki, rasejka, razrasnuvawe i reparacija na tkivata,dodeka haptoglobinot pomaga vo vozobnovuvaweto natkivata so stimulirawe na angiogenezata (sozdavawe novikrvni sadovi).

2.2. Opredeluvawe koncentracija

na akutno fazni proteini soimunoturbidimetrija

2.2.1. Principi na imunoturbidimetrija

Proteinite na akutna faza vo telesnite te~nosti se meratso pove}e metodi, od koi kaj nas se koristi imunoturbi-dimetrijata so aparatot turbitajmer (Slika 2.5, gore).Merniot sistem na turbidimetrijata bazira na principitena kineti~ka turbidimetrija. Turbitajmerot meri istovre-

meno dva parametri:1. brzinata na maksimalna reakcija (Vmax) na sozdadeniottalog; i

2. vremeto potrebno da se postigne Vmax (tVmax) (Tabela2.3).

Ako se postavat ovie vrednosti nasproti koncentracijata,se dobiva grafikon kako na Slika 2.5.

Slika 2.5 (dolu) pokaùva deka, ako se zemat oddelno, nitu

Slika 2.5: Turbidimetar (Tur-bitajmer) od firmata Bering(gore) i maksimalna brzina na

reakcija i reakciono vremezavisno od koncentracijata naprotivgenot (dolu).

Tabela 2.3: Maksimalna br-zina na reakcija i reakcionovreme za reakcijata IgG/

protivIgG.


24/240



krivata za Vmax nitu za tVmax se precizni (nedvojbeni).Me|utoa, ako se zemat dvata signali zaedno, jasno e deka

samo edna vrednost moè da se dobie vrz osnova na dveteizmereni krivi so Turbitajmerot. Sostavot na reagensitegarantira deka dvete krivi se komplementarni edna nadruga. Merewata se izvr{uvaat na branova dolìna od 340nm (nanometri). Mereweto na kratkite branovi ovozmoùvada se otkrijat mali koncentracii od protivgen/protivtelokompleksi, koi se formiraat samo nekolku sekundi posleme{aweto na reagensot i primerokot. Svetlosniot snop sesozdava vo ksenonski izvor i se prenesuva so dvokanalnakvarcna fibro optika. Svetlosniot snop koj navleguva vokivetata se registrira sekoi 0.1 sekunda i se analizira soprecizna kombinacija od softver i hardver.

Slika 2.7: Opredeluvawe tem-pera-turata (levo), tempera-turnata kompenzacija zapo~-nuva koga }e se vnese {i{en-ceto so reagens (desno).

2.2.2. KalibracijaZa sistemot na Turbitajmer ne e neophodno da se napravikalibraciskata kriva od korisnikot, nitu da se napravikalibracija so merewe na edna to~ka. Reakciskiteparametri Vmax i tVmax za opredelena koncentracija se

Slika 2.6: Tridimenzionalnakalibraciska kriva za imuno-

turbidimetrija (levo). ̂ ita-we kalibraciska kriva zaimunoturbidimetrija od li-niski kod (desno).


25/240

25



merat na razli~ni temperaturi (+18oC do +32oC) za vremena kalibraciskata postapka. Parametrite Vmax, tVmax ikoncentracijata se prika`uvaat vo eden grafikon, kojsozdava tridimenzionalna kriva (Slika 2.6, levo). Ovaakriva ne dozvoluva neprecizni (dvojbeni) rezultati koi sedobivaat od Hajdelberger-Kendalovata (Heidelberger-Kendall)kriva.

Kalibraciskite krivi se utvrduvaat za sekoj reagens i brojna lotot (prozvodstven broj). Tie krivi se pretvoraat voliniski kod (barkod) koi se pe~atat i se vnesuvaat so sekojreagens. Tie treba da bidat pro~itani samo edna{ za sekojreagens i broj na lotot (Slika 2.6, desno).

2.2.3. Sistem za temperaturnakompenzacijaKinetskoto merewe na imunoprecipitaciskata reakcijazavisi od temperaturata. Turbitajmerot koristi novatehnika za da se izbegne periodot na zagrevawe. Toa sepostignuva so avtomatsko merewe na temperaturata voreakciskata smesa (Slika 2.7). Vrz osnova na ovaa postapkakalibraciskata kriva matemati~ki se koregira za realnoizmerenata temperatura. Temperaturata na nosa~ot nakivetata (TBI) i na {i{eto so reagens (TB0) se meratdirektno, dodeka TBI ja dava sobnata temperatura.Reagensnata temperatura (TAS) se presmetuva od TB0.Mereweto temperatura zapo~nuva koga }e se stavi {i{etoso Turbikvant reagens. Aparatot prifa}a temperaturnavarijacija pome|u +18 i +320C.

2.2.4. Procedura

1. Se vnesuva {i{eto Turbikvant vo prostorot zareagensi. Procesot na temperaturna kompenzacijazapo~nuva vedna{ (Slika 2.8).

2. Se prigotuva razreduvawe na primerokot zavisno kojabelkovina na akutna faza ili imunoglobulin merime(Tabela 2.4).

3. Se pipetiraat 50 mkL od prethodno razredeniotprimerok vo kivetata od Turbitajmerot.

4. Se vnesuva kivetata vo instrumentot.5. Se pipetiraat 50 mkL od reagensot. Me{aweto nareagensot i primerokot, kako i mereweto i pe~atewetona rezultatite se ostvaruva avtomatski bez intervencijana korisnikot. Dodeka e mereweto vo tek (okolu 30 sek),se prigotvuva sledniot primerok.

6. Izmerenite rezultati se vnesuvaat vo Tabel

Documents

Imunoloski praktikum - Spiroski