Embed Size (px)
Citation preview
2020
IMUNOSUPRAVEGHERE ŞI
IMUNOEDITARE ÎN LEUCEMIA ACUTĂ
MIELOBLASTICĂ
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-
Coordonator științific
Prof. Univ. Dr. Petru CIANGA
Doctorand,
Ion ANTOHE
Cuvinte cheie: leucemie acută mieloblastică, imunoterapie,
molecule B7, PD-1, ICOS
Teza de doctorat conține:
• Partea teoretică organizată în 4 capitole (40 de pagini)
• Partea personală organizată în 5 capitole (88 de pagini)
• 25 de tabele și 28 de figuri
• Referințe bibliografice (277 de titluri)
Notă: acest rezumat conține referințe bibliografice, imagini și
tabele, respectând numerotarea și conținutul tezei de doctorat.
ii
CUPRINS ABREVIERI………………………………………………...……..ix
MULȚUMIRI...................................................................................xv
STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII.......................................1
Introducere.........................................................................................1
CAPITOLUL 1. Leucemia acută mieloblastică: principii
etiopatogenice și terapeutice..............................................................3
1.1 Generalități.............................................................................3
1.2 Etiopatogenie....................................................................3
1.3 Patogeneză........................................................................4
1.3.1 Originea celulară......................................................4
1.3.1.1 Celula stem hematopoietică.............................4
1.3.1.2 Celula stem leucemică.....................................4
1.3.2 Nișa celulei stem hematopoietice.............................5
1.3.3 Nișa celulei stem leucemice.....................................6
1.3.4 Modelul bistadial al leucemogenezei.......................7
1.3.5 Evenimente genetice în leucemie acută
mieloblastică.....................................................................9
1.3.6 Anomalii moleculare în leucemia acută
mieloblastică...................................................................10
1.4 Clasificarea leucemiei acute mieloblastice.....................11
1.5 Prognosticul leucemiei acute mieloblastice....................12
1.6 Principii terapeutice........................................................14
CAPITOLUL 2. Noțiuni generale de imunitate antitumorală..........15
2.1 Imunitatea antitumorală: generalități....................................15
2.2 Teoria imunosupravegherii...................................................15
2.2.1 Imunosupravegherea în modele experimentale...........15
2.2.2 Observații clinice.........................................................16
2.3 Teoria imunoeditării.............................................................16
2.4 Mecanisme de evadare imună..............................................16
2.5 Ciclul cancer-imunitate antitumorală și set-point-ul imunității
antitumorale................................................................................17
2.6 Profilurile imune în cancer...................................................18
CAPITOLUL 3. Imunoeditare și imunosupraveghere în leucemia
acută mieloblastică...........................................................................19
3.1 Peisajul antigenic al leucemiei acute mieloblastice..............19
3.2 Teoria imunosupravegherii în leucemia acută
mieloblastică...............................................................................21
iii
3.2.1 Efectorii sistemului imun în leucemia acută
mieloblastică.........................................................................21
3.2.2 Observații clinice.........................................................22
3.3 Imunoeditarea și răspunsul imun antileucemic T-mediat în
leucemia acută mieloblastică......................................................23
3.3.1 Observaţii experimentale ce susţin teoria imunoeditării
în leucemia acută mieloblastică............................................23
3.3.2 Observații clinice ce susțin teoria imunoeditării..........23
3.3.2.1 Anomalii ale imunității antitumorale T-mediate la
diagnostic........................................................................23
3.3.2.2 Anomalii ale imunității antitumorale T-mediate la
recădere...........................................................................24
3.3.2.3 Anomalii ale imunității antitumorale T-mediate în
leucemia acută mieloblastică secundară..........................24
3.4 Principii de procesare şi prezentare a antigenului................25
3.4.1 Calea citosolică............................................................25
3.4.2 Calea endocitică...........................................................25
3.4.3 Căi non-clasice de prezentare a antigenului................26
3.4.3.1 Cross-prezentarea................................................26
3.4.3.2 Prezentarea MHC II – mediată a antigenelor
intracelulare.....................................................................26
3.4.4 Co-stimularea...............................................................26
3.4.4.1 Familia moleculelor B7 și roluri în imunitatea
antitumorală....................................................................26
3.5 Procesarea şi prezentarea antigenului în leucemia acută
mieloblastică...............................................................................29
3.5.1 Celule prezentatoare de antigen în leucemia acută
mieloblastică: celulele dendritice..........................................29
3.5.2 Celule prezentatoare de antigen în leucemia acută
mieloblastică: mieloblaştii maligni.......................................30
3.5.3 Relevanţa teoretică şi prognostică a integrităţii şi
funcţionalităţii căii MHC II dependente de prezentare a Ag
de proveniență intracelulară în leucemia acută
mieloblastică.........................................................................30
3.5.3.1 Expresia CIITA...................................................30
3.5.3.2 Expresia CD74....................................................31
3.5.3.3 Expresia HLA-DM, HLA-DO, raportul
DM/DO...........................................................................31
3.5.3.4 Expresia CLIP.....................................................32
iv
3.5.3.5 Autofagia în leucemia acută mieloblastică.........33
3.6 Co-stimularea în leucemia acută mieloblastică....................33
3.6.1 Relevanţa teoretică şi prognostică a expresiei
moleculelor B7 şi a altor molecule co-stimulatorii în
leucemia acută mieloblastică................................................33
3.7 Limfocitele T în leucemia acută mieloblastică.....................35
3.7.1 Conditii esențiale ale priming-ului limfocitelor T CD4+
şi CD8+.................................................................................35
3.7.2 Subseturile funcţionale de limfocite Th.......................35
3.7.3 Subseturile maturative de limfocite Th........................36
3.7.4 Relevanţa prognostică a subtipurilor maturative şi
funcţionale T în leucemia acută mieloblastică......................37
3.7.5 Relevanţa prognostică a expresiei de receptori pentru
molecule co-stimulatorii/co-inhibitorii pe limfocitele
T............................................................................................38
3.7.5.1 Expresia ICOS.....................................................38
3.7.5.2 Expresia PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG3 și
CD200.............................................................................39
CAPITOLUL 4. Perspective în imunoterapia leucemiei acute
mieloblastice....................................................................................41
4.1 Anticorpii monoclonali.........................................................41
4.2 Inhibitorii punctelor de control
imun............................................................................................41
4.3 Activatorii bispecifici ai limfocitelor T................................41
4.4 Limfocitele T cu receptori chimerici pentru antigen............42
4.5 Vaccinuri anti-leucemice......................................................42
4.6 Profilurile imune în leucemia acută mieloblastică și
personalizarea imunoterapiei......................................................42
CONTRIBUȚII PERSONALE........................................................45
CAPITOLUL 5. Material și metode................................................45
5.1 Obiective..............................................................................45
5.2 Design-ul studiului...............................................................45
5.3 Criterii de includere..............................................................45
5.4 Criterii de excludere.............................................................45
5.5 Protocol de evaluare generală a pacienţilor..........................46
5.5.1 Investigaţii standard la diagnostic................................46
5.5.2 Tratament standard de inducție....................................46
5.5.3 Clasificare şi încadrare prognostică.............................47
v
5.6 Protocol de evaluare a capacităţii de celulă prezentatoare de
antigen a mieloblaştilor tumorali şi a disfuncţiei limfocitare
T..................................................................................................47
5.6.1 Investigaţii destinate profilului de celulă prezentatoare
de antigen al mieloblastului tumoral.....................................47
5.6.2 Investigaţii destinate disfuncţiei imune asociate
leucemiei acute mieloblastice...............................................47
5.7 Citometria de flux multiparametrică: principiul metodei.....48
5.8 Considerente teoretice şi tehnice referitoare la design-ul
panelurilor de anticorpi monoclonali fluorocromaţi...................48
5.9 Structura panel-urilor de anticorpi monoclonali
fluorocromaţi..............................................................................49
5.10 Optimizarea tehnicii...........................................................49
5.10.1 Configurarea citometrului: stabilirea voltajelor pentru
detectorii de fluorescenţă......................................................49
5.10.1.1 Configurarea parametrilor FSC/SSC................49
5.10.1.2 Configurarea voltajelor pentru detectorii de
fluorescenţă.....................................................................50
5.10.2 Titrarea anticorpilor monoclonali..............................50
5.10.2.1 Principiu............................................................50
5.10.2.2 Protocol de lucru...............................................50
5.10.3 Corectarea suprapunerii spectrale între detectori.......51
5.10.3.1 Principiu............................................................51
5.10.3.2 Protocol de lucru...............................................51
5.10.4 Controlul intern al strategiei de gating......................51
5.10.4.1 Principiu............................................................51
5.10.4.2 Protocol marcaj de suprafață.............................52
5.10.4.3 Protocol marcaj intracelular..............................52
5.11 Condiții pre-analitice..........................................................53
5.12 Infrastructură necesară........................................................53
5.13 Protocol de lucru................................................................53
5.13.1 Protocol pentru marcaj de suprafață..........................53
5.13.2 Protocol pentru marcaj intracelular............................54
5.14 Strategia de gating și analiză a datelor...............................54
5.14.1 Tub 1 T1-MO.............................................................54
5.14.2 Tub 2 T2-MO.............................................................54
5.14.3 Tub 3 T3- MO............................................................55
5.14.4 Tub 4 T4-SP...............................................................55
5.14.5 Tub 5 T5-SP...............................................................55
vi
5.14.6 Tub 6 M1...................................................................55
5.14.7 Tub 7 M2...................................................................55
5.14.8 Tub 8 M3...................................................................56
5.15 Evaluarea citogenetică și moleculară a pacienților............56
5.16 Analiza statistică a datelor.................................................56
CAPITOLUL 6. Rezultate...............................................................57
6.1 Analiza flow-citometrică a măduvei osoase normale...........57
6.1.1 Obiectivele etapei de studiu.........................................57
6.1.2 Rezultate .....................................................................57
6.1.2.1 Expresia elementelor sistemului MHC II
dependent de prezentare al antigenului în măduva osoasă
normală............................................................................57
6.1.2.1.1 Expresia CD74...........................................58
6.1.2.1.2 Expresia HLA-DM.....................................58
6.1.2.1.3 Expresia CLIP............................................58
6.1.2.2 Expresia moleculelor B7 pe precursorii
CD34+/CD117+/HLA-DR+ din măduva osoasă
normală............................................................................58
6.1.2.2.1 Expresia B7.1.............................................59
6.1.2.2.2 Expresia B7.2.............................................59
6.1.2.2.3 Expresia ICOS-L.......................................59
6.1.2.2.4 Expresia PD-L1.........................................59
6.1.2.2.5 Expresia PD-L2.........................................60
6.1.2.2.6 Expresia B7-H3.........................................60
6.1.2.2.7 Expresia B7-H4.........................................60
6.1.2.3 Populațiile limfocitare T în sângele periferic și
măduva osoasă normală...................................................60
6.1.2.3.1 Subseturile maturative de limfocite T CD4+
în măduva osoasă normală........................................61
6.1.2.3.2 Polarizarea funcțională a subseturilor
maturative de limfocite T CD4+ din măduva osoasă
normală.....................................................................61
6.1.2.3.3 Expresia CTLA-4, ICOS și PD-1 pe
subseturile maturative de limfocite T CD4+ din
măduva osoasă normală............................................62
6.1.2.3.4 Expresia CTLA-4, ICOS și PD-1 pe
subseturile maturative de limfocite T CD4 negative
din măduva osoasă normală......................................62
vii
6.1.2.3.5 Subseturile maturative de limfocite T CD4+
în sângele periferic....................................................63
6.1.2.3.6 Polarizarea funcțională a subseturilor
maturative de limfocite T CD4+ din sângele
periferic.....................................................................63
6.2 Evaluarea clinică, biologică, imunofenotipică, citogenetică
și moleculară a pacienților, încadrarea în clase de risc și
impactul asupra supraviețuirii...................................................64
6.2.1 Evaluarea clinico-biologică........................................64
6.2.2 Evaluarea imunofenotipică.........................................65
6.2.3 Caractere citogenetice și moleculare..........................66
6.2.4 Încadrarea în clasa de risc European Leukemia
Net.......................................................................................67
6.2.5 Evoluția pacienților din lotul de studiu......................68
6.3 Evaluarea status-ului de celulă prezentatoare de antigen a
mieloblaștilor leucemici............................................................69
6.3.1 Obiectivele etapei de studiu........................................69
6.3.2 Expresia elementelor sistemului MHC II dependent de
prezentare a antigenului.......................................................70
6.3.2.1 Expresia HLA-DR...............................................70
6.3.2.2 Expresia CD74.....................................................70
6.3.2.3 Expresia HLA-DM...............................................71
6.3.2.4 Expresia CLIP......................................................71
6.3.2.5 Definirea unor pattern-uri de prezentare deficientă
a antigenului.....................................................................72
6.3.2.5.1 Pattern-ul 1 (HLA-DR+, CLIP+, CD74+,
HLA-DM+low).........................................................73
6.3.2.5.2 Pattern-ul 2 (HLA-DR+, CLIP-, CD74+,
HLA-DM+low) ........................................................74
6.3.2.5.3 Pattern-ul 3 (HLA-DR+, CLIP-,
CD74+low, HLA-DM+low).....................................75
6.3.5.2.4 Pattern-ul 4 (HLA-DR+, CLIP+, CD74+,
HLA-DM+)...............................................................76
6.3.3 Expresia moleculelor B7 în leucemia acută
mieloblastică........................................................................76
6.3.3.1 Expresia B7.1.......................................................77
6.3.3.2 Expresia B7.2.......................................................77
6.3.3.3 Expresia ICOS-L..................................................79
6.3.3.4 Expresia PD-L1....................................................79
viii
6.3.3.5 Expresia PD-L2....................................................80
6.3.3.6 Expresia B7-H3....................................................81
6.3.3.7 Expresia B7-H4....................................................82
6.3.3.8 Definirea semnăturilor moleculare B7.................82
6.3.3.8.1 Co-expresia B7.2/ICOS-L/PD-L1...............86
6.3.3.8.2 Co-expresia B7.2/ICOS-L/PD-L1/B7-H4...86
6.3.3.8.3 Co-expresia B7.2/PD-L2/PD-L1.................88
6.3.3.8.4 Co-expresia B7.2/PD-L1/B7-H3.................88
6.3.3.8.5 Co-expresia B7.2/PD-L2/B7-H3.................88
6.3.3.8.6 Co-expresia PD-L1/B7-H3..........................88
6.3.3.8.7 Co-expresia B7.2/PD-L2/PD-L1/B7-H4.....89
6.3.3.8.8 Co-expresia PD-L2/PD-L1/B7-H4..............90
6.4 Evaluarea disfuncției limfocitare T la diagnostic...............90
6.4.1 Obiectivele etapei de studiu........................................90
6.4.2 Evaluarea globală a limfocitelor T în leucemia acută
mieloblastică........................................................................90
6.4.3 Frecvența subseturilor maturative T helper și citotoxic
în măduva osoasă a pacienților............................................90
6.4.4 Polarizarea funcțională a subseturilor maturative de
limfocite T CD4+ din măduva osoasă a pacienților............91
6.4.5 Expresia CTLA-4, ICOS și PD-1 pe subseturile
maturative de limfocite T CD4+ din măduva osoasă a
pacienților............................................................................91
6.4.6 Expresia CTLA-4, ICOS și PD-1 pe subseturile
maturative de limfocite T CD4 negative din măduva osoasă
a pacienților.........................................................................93
6.4.7 Frecvența subseturilor maturative T helper în sângele
periferic al pacienților.........................................................94
6.4.8 Polarizarea funcțională a subseturilor maturative de
limfocite T CD4+ din sângele periferic al pacienților.........94
6.4.9 Corelarea elementelor disfuncţiei limfocitare T cu
factorii standard de prognostic din leucemia acută
mieloblastică........................................................................95
6.4.9.1 Corelarea elementelor disfuncţiei limfocitare T cu
tipurile OMS de LAM, evaluarea citogenetică și
moleculară și riscul ELN.................................................95
6.4.9.2 Corelarea elementelor disfuncţiei limfocitare T cu
răspunsul la tratament și supraviețuirea...........................97
ix
6.4.10 Corelarea elementelor disfuncţiei limfocitare T cu
pattern-urile de prezentare a antigenului.............................98
6.4.11 Corelarea elementelor disfuncţiei limfocitare T cu
expresia moleculelor B7 și cu semnăturile moleculare
B7........................................................................................98
CAPITOLUL 7. Discuții................................................................101
7.1 Expresia elementelor căii MHC II dependente de prezentare
a antigenului și a moleculelor B7 la nivelul precursorilor
mieloizi și populațiile limfocitare T la indivizii sănătoși........101
7.2 Expresia elementelor căii MHC II dependente de prezentare
a antigenului în leucemia acută mieloblastică........................102
7.2.1 Expresia HLA-DR....................................................104
7.2.2 Expresia CD74..........................................................104
7.2.3 Expresia HLA-DM...................................................105
7.2.4 Expresia CLIP..........................................................105
7.2.5 Pattern-urile de prezentare a antigenului.................106
7.3 Expresia moleculelor B7 la pacienții cu leucemie acută
mieloblastică...........................................................................109
7.4 Semnăturile moleculare B7 în leucemia acută
mieloblastică...........................................................................115
7.5 Polarizarea maturativă a limfocitelor T și pattern-uri de
expresie a receptorilor punctelor de control imun..................119
7.6 Profiluri imune în leucemia acută mieloblastică...............120
CAPITOLUL 8. Elemente de originalitate și perspective pe care le
deschide cercetarea doctorală.........................................................128
CAPITOLUL 9. Concluzii finale...................................................129
BIBLIOGRAFIE............................................................................130
Anexa I. Pattern-uri de expresie ale liganzilor B7, ale receptorilor
punctelor de control imun și a populațiilor de limfocite T helper și
citotoxice în funcție de tipurile OMS de LAM și de riscul
citogenetic ELN..................................................................................I
Anexa II. Consimțământ informat pentru participarea la studiu......III
Anexa III. Avizul comisiei de etică a cercetării............................V
1
Introducere
Deși au trecut mai bine de 40 de ani de la introducerea în practica
curentă a regimului standard de inducție „3+7” în leucemia acută
mieloblastică (LAM), managementul acesteia rămâne problematic
întrucât aproximativ jumătate dintre pacienți prezintă recăderi după
această terapie sau nu prezintă răspuns terapeutic. Din ce în ce mai
multe alternative noi de tratament sunt puse la îndemâna
clinicienilor, incluzând noi strategii de transplant (transplant
haploidentic), terapii moleculare țintite, agenți medicamentoși care
manipulează micromediul tumoral și imunoterapia, reprezentată de
anticorpi monoclonali, inhibitori ai punctelor de control imun,
vaccinuri cu peptide tumorale, celule dendritice sau transfer adoptiv
celular. În pofida acestui fapt, multe alte studii clinice vor fi
necesare pentru a stabili exact indicațiile noilor terapii și
subgrupurile de pacienți care ar beneficia de pe urma lor. Această
întreprindere este una extrem de dificilă, întrucât ne adresăm unei
boli de o complexitate remarcabilă, care nu este surprinsă pe deplin
de actuala clasificare a Organizației Mondiale a Sănătății (OMS).
Aceasta stabilește existența unor subtipuri de LAM cu anomalii
genetice recurente, cu patogenie și prognostic aparte, care nu
reprezintă însă decât o mică parte din totalul pacienților cu LAM.
Aproximativ jumătate dintre pacienți sunt clasificați în subgrupul
LAM- nespecificat prin prisma absenței criteriilor de apartenență la
celelalte categorii OMS. Acest subgrup însumează o serie de entități
heterogene, dintre care o parte sunt încă necunoscute. Complexitatea
inter-pacienţi a bolii este dublată de o complexitate intra-pacient,
fiecare caz de LAM prezentând de fapt multiple subclone tumorale
cu evoluție naturală și postterapeutică diferită. Luând în considerare
de asemenea contribuția micromediului și polimorfismele naturale
ale celulelor implicate în imunitatea antitumorală, putem considera
că fiecare pacient prezintă un subtip propriu de LAM, cu o
disfuncție imună aparte. Astfel, aplicând o strategie similară de
tratament acestor pacienți cu boli foarte diferite, obținerea de
rezultate terapeutice la fel de heterogene este un fapt previzibil, care
justifică astfel necesitatea actualelor clasificări prognostice în
încercarea de a prevedea răspunsul la terapie.
2
Ne aflăm în prezent în momentul în care înțelegerea imunobiologiei
LAM a rămas în urma trialurilor clinice numeroase cu noi molecule
și asocieri între acestea și chimioterapia standard, care tentează
identificarea relativ empirică a medicamentelor care funcționează
cel mai bine la anumite categorii de bolnavi. Pentru design-ul
rațional de trialuri clinice dar și de noi stragetii terapeutice este
astfel indispensabilă o mai bună înțelegere a imunobiologiei LAM.
Imunoterapia în cancer a prezentat progrese remarcabile în ultimii
10 ani: blocada punctelor de control imun a modificat principiile de
tratament ale unor tumori solide, dar și cancere hematologice,
precum limfomul Hodgkin. Mai mult, imunoterapia dirijată anti-
CD19 (prin activatori bi-specifici ai celulelor T- BiTE sau limfocite
T cu receptor chimeric pentru antigen) a produs rezultate
spectaculoase în leucemia acută limfoblastică și limfomul difuz cu
celule mari B, deschizând drumul imunoterapiei în hemopatiile
maligne. În același timp, analiza profilurilor de expresie genică din
micromediul tumoral a revoluționat înțelegerea interacțiunii dintre
cancer și imunitate, permițând identificarea unor profiluri
imunologice pan-cancer care ar putea servi drept biomarkeri pentru
a personaliza imunoterapia și pentru a prezice răspunsul pacienților
la aceasta. Pe scurt, tumorile cu micromediile inflamatorii, bogate în
interferoni de tip I și II, ar putea fi abordate prin blocada punctelor
de control imun, în vreme ce cancerele cu micromedii non-
inflamatorii pot fi abordate terapeutic prin strategii precum
vaccinurile cu peptide tumorale sau transferul celular adoptiv.
Dezvoltarea imunoterapiei în LAM a fost însă încetinită de
remarcabila diversitate genetică, clonală și antigenică a bolii, de
riscul toxicității hematologice semnificative, dar și de lipsa
biomarkerilor de ghidare a imunoterapiei. Cercetări recente au
evidențiat faptul că profilurile imune descrise mai sus pot fi
identificate și în LAM și că acestea prezintă atât relevanță
terapeutică, cât și prognostică. Deși răspunsul imun antitumoral din
LAM împărtășește o serie de trăsături comune cu cancerele solide și
oferă o serie de oportunități pentru imunoterapie, LAM este privită
ca o malignitate cu un fenotip imun deșertic, non-inflamator, în care
imunoeditarea este un fenomen fie absent, fie tardiv. Acest fapt este
datorat originii acestei boli în sanctuarul imunologic al măduvei
osoase, situs bogat în limfocite Treg, încărcăturii mutaționale și
imunogenicității reduse, cu diseminare hematogenă fulminantă.
3
Contrar acestor date, micromediile unor LAM prezintă caracteristici
ce indică existența unui răspuns imun anti-leucemic, inhibat prin
mecanisme de evadare imună precum expresia CTLA-4 (Cytotoxic T
lymphocyte associated protein-4) sau PD-1 (Programmed death-1).
Moleculele B7 sunt structuri cheie care modulează activarea
limfocitelor T. Multiple studii au evidențiat faptul că expresia
moleculelor B7 pe mieloblaștii din LAM este indusă de interferonul
γ (IFN-γ) (1–3), indicator al unui profil imun inflamator. Aceste
puncte de control imun sunt utilizate de celulele leucemice în
procesul de evadare imună (4).
Expresia genelor responsive la IFNγ în micromediul medular a fost
corelată cu LAM primar refractar și a prezis răspunsul terapeutic la
blocada punctelor de control imun sau la flotetuzumab (activator bi-
specific al celulelor T de tip DART® anti-CD3/CD123),
demonstrând faptul că polaritatea imună a micromediului poate fi un
biomarker de predicție a răspunsului la imunoterapie (5,6).
Cercetarea noastră se aliniază acestei direcții de ultimă oră, aducând
câteva idei de absolută noutate în abordul cercetării interrelației
mieloblaști tumorali- limfocite T helper și citotoxice. În paralel cu
recunoașterea facturii heterogene a bolii, studiul nostru se adresează
simultan, conform unor principii solide derivate din imunologia
fundamentală, capacității celulelor tumorale de a-și prezenta
propriile antigene, capacității acestora de co-semnalizare și
capacității limfocitelor T de a reacționa la aceste semnale.
Modalitatea de investigare a co-semnalizării şi de interpretare a
datelor constituie un element de absolută noutate a acestui studiu.
Până la ora actuală, expresia moleculelor co-stimulatorii sau
inhibitorii din familia B7 nu a fost investigată decât individual și nu
a fost corelată cu expresia receptorilor moleculelor B7 pe limfocitele
T sau cu subseturile funcționale și maturative de limfocite T.
Prezentul studiu își propune să îndeplinească toate aceste scopuri și
să depășească stadiul investigării semnificației izolate a moleculelor
B7 pe mieloblaști sau limfocite T. Astfel, ne propunem să
identificăm constelațiile recurente de molecule B7 exprimate de
celulele tumorale din LAM și să le sistematizăm în „semnături”
moleculare B7. Ulterior, vom identifica receptorii B7 de pe
limfocitele T corespondente acestor semnături moleculare și vom
tenta definirea unor axe de semnalizare co-activatorii sau co-
inhibitorii. În cele din urmă, cunoscând și subseturile maturative și
4
funcționale de limfocite T care participă la formarea acestor axe,
vom încerca să integrăm aceste date în contextul profilurilor
imunologice de răspuns imun antitumoral descrise recent în
literatura de specialitate și să apreciem, indirect, eficiența imunității
antitumorale T-mediate la pacienții din lotul de studiu. Vom corela
toate aceste date cu factorii standard de prognostic și cu evoluția
pacienților cu LAM. Vom încerca de asemenea să ilustrăm faptul că
fiecare subtip de LAM prezintă o imunopatogenie aparte.
Considerăm că toate aceste noi date vor reprezenta o contribuție
valoroasă la cunoștințele actuale privitoare la procesul de
imunosupraveghere și imunoeditare în LAM, întrucât stabilirea
tipului de disfuncţie imună pe care îl prezintă un anumit caz de
LAM reprezintă un prim pas logic în definirea unei strategii de
imunoterapie personalizată.
5
CONTRIBUȚII PERSONALE
5 CAPITOLUL 5. Material și metode
Acest studiu reprezintă o cercetare de tip prospectiv adresată
pacienţilor nou diagnosticati cu LAM în Clinica de Hematologie a
Insitutului Regional de Oncologie din Iaşi. Un număr de 30 de
pacienţi au fost incluși în studiu după semnarea consimţământului
informat. Probele de aspirat medular și sânge periferic au fost
recoltate la diagnostic. Diagnosticul de LAM a fost stabilit pe baza
criteriilor Organizației Mondiale a Sănătății (OMS) iar pacienții au
fost clasificați conform sistemului European Leukemia Net (ELN)
2011 revizuit în 2017. Am analizat probele de aspirat medular și
sânge periferic ale unui lot de control compus din patru indivizi
sănătoși, după obținerea consimțîmântului informat.
Mieloblaștii din LAM și limfocitele T au fost analizate prin
citometrie de flux multiparametrică pe probe proaspete de aspirat
medular și sânge periferic, după liza eritrocitelor. Analiza flow-
citometrică a prezentat mai multe etape: 1) confirmarea
diagnosticului de LAM cu ajutorul panelurilor EuroFlow, 2) Analiza
expresiei de suprafață a B7-1, B7-2, PD-L1, B7-H2, PD-L2, B7-H3,
B7-H4, CLIP, și a expresiei intracelulare a HLA-DM și CD74 la
nivelul celulelor blastice din LAM, 3) Analiza procentelor de
limfocite T reg și a subseturilor maturative de limfocite T helper și
citotoxice, 4) Analiza expresiei Programmed Death-1 (PD-1),
Inducible T cell Co-Stimulator (ICOS) și Cytotoxic T lymphocyte
Antigen 4 (CTLA-4) pe aceste subseturi. Moleculele B7 au fost
considerate ca fiind pozitive pe o populație celulară dacă pragul de
expresie a depășit 10%. Achiziția datelor a fost realizată pe un
citometru de flux BD FACS ARIA III iar datele au fost interpretate
cu ajutorul softului FACS DIVA v6.1.3. Un protocol identic de
investigare a fost aplicat indivizilor sănătoși.
Gating-ul blaștilor din LAM a fost realizat pe evenimentele
CD45+/CD34+/CD117+/HLA-DR+. Ulterior, a fost apreciat nivelul
de expresie a fiecărei molecule B7 mai sus menționate. Gating-ul
limfocitelor T a fost realizat pe celulele CD3+/CD4+ și
CD3+/CD8+. În funcție de expresia CD28, CD27 șiCD45RA am
definit următoarele subseturi maturative: naiv, memorie centrală
6
(CM), memroei efector intermediar (iEM), efector memorie tardiv
(late EM). Celulele T reg au fost definite ca fiind
CD3+/CD4+/CD25+/CD127-. O populație limfocitară T a fost
interpretată ca fiind predominantă dacă le depășea pe celelalte din
punct de vedere procentual. În final, procentul expresiei ICOS, PD-1
și CTLA-4 a fost evaluat pe limfocitele T CD4+ și CD8+ totale,
precum și pe fiecare subset maturativ în parte. Datele au fost
corelate cu factorii standard de prognostic din LAM.
Analiza statistică a fost realizată cu ajutorul soft-ului IBM® SPSS
Statistics 21.0. Testele Chi square, Fischer’s Exact Test, Mann
Whitney test, și Student’s t-test au fost utilizate pentru a identifica
asocierile dintre diferite variabile. Coeficientul de corelație Pearson
a fost calculat pentru a analiza relația dintre variabilele numerice.
Testul ANOVA a fost utilizat pentru a analzia diferențele dintre
variabile multiple. O valoare a p sub 0,05 a fost considerată statistic
semnificativă.
6 CAPITOLUL 6. Rezultate
Principalele date clinico-biologice ale pacienților sunt prezentate în
Anexa 1. Mediana vârstei pacienților a fost de 59 de ani (interval
27-83 ani). 23.3% din pacienți au prezentat risc citogenetic ELN
favorabil, în vreme ce 46,7% ,i 30% au prezentat risc intermediar și,
respectiv, advers. Doi pacienți au prezentat mutația FLT3-ITD iar
trei pacienți mutația NPM1. Mutațiile LFT3-ITD și NPM1 nu au co-
existat în lotul de studiu.
6.3 Evaluarea status-ului de celula prezentatoare de antigen a
mieloblaștilor leucemici
Această etapă a studiului are trei obiective principale: 1) evaluarea
expresiei elementelor sistemului MHC II-dependent de prezentare a
antigenului şi a expresiei moleculelor de co-semnalizare din familia
B7 pe celulele leucemice din LAM; 2) sistematizarea variaţiilor de
expresie ale acestora sub forma unor pattern-uri de prezentare
deficientă a antigenului şi, respectiv, sub forma semnăturilor
moleculare B7; 3) corelarea pattern-urilor de prezentare a
antigenului şi a semnăturilor moleculare B7 cu factorii standard de
pronostic din LAM. Evaluarea integrității căii MHC II dependente
de prezentare a antigenului a fost realizată prin investigarea
expresiei a patru componente principale ale acesteia: HLA-DR,
7
CD74, CLIP și HLA-DM. Moleculele de co-semnalizare investigate
au fost B7.1, B7.2, ICOS-L, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4. Inițial
a fost investigată expresia individuală a acestor molecule pe celulele
leucemice. Ulterior, în cazul în care a fost identificată expresia mai
multor molecule pe clona tumorală, respectiva combinație de
markeri a fost considerată ca făcând parte dintr-un sistem mai
complex de co-semnalizare pentru limfocitele T, denumit semnătură
moleculară B7.
6.3.2 Expresia elementelor sistemului MHC-II dependent de
prezentare a antigenului
6.3.2.1 Expresia HLA-DR
Am identificat 7 pacienți (23,3%) cu expresia low a HLA-DR la
nivelul celulelor tumorale CD45+/CD34+/CD117+. Expresia low a
HLA-DR nu a fost identificată la nivelul progenitorilor mieloizi din
măduva osoasă normală. Pe baza nivelului de expresie al HLA-DR
am definit două categorii de pacienți cu LAM: HLA-DR low (n=7)
și cu expresie normală de HLA-DR (n=23), similară cu nivelul de
expresie al monocitelor mature din măduva osoasă a pacienților. Nu
am obiectivat diferențe semnificative statistic referitoare la
distribuția tipurilor OMS de LAM și a claselor de risc ELN la cele
două grupuri de pacienți. În pofida absenței unei asocieri statistic
semnificative, procentul cazurilor cu risc ELN advers a fost mai
redus la pacienții cu HLA-DR normal în comparative cu cazurile
HLA-DR low (21,8% față de 42,9%).
6.3.2.2 Expresia HLA-DM
Expresia HLA-DM a fost investigata comparativ la pacienții cu
LAM HLA-DR normal (n=23), HLA-DR low (n=7) și indivizii
sănătoși (n=4). Nu au fost identificate diferențe semnificative
statistic între grupele de pacienți, însă am obiectivat un nivel al
expresiei HLA-DM de patru ori mai ridicat în LAM decât la
indivizii sănătoși.
6.3.2.3 Expresia CD74
Am investigat expresia intracelulară a CD74 pe celulele
CD45+/CD34+/CD117+ din măduva osoasă. 80,5% din pacienții cu
LAM au exprimat niveluri ale CD74 mai ridicate decât la indivizii
8
sănătoși (p=0,001, Mann Whitney U Test), în pofida nivelurilor
constant crescute ale CD74 la toți subiecții investigați. Nivelurile
CD74 au prezentat o mediană înaltă, de 98,4% și în doar două cazuri
am pus în evidență procente reduse de expresie: 3,1% la un pacient
cu LAM NPM1 pozitiv (cariotip normal) și 39,9% la un caz de
LAM cu cariotip complex, implicând monosomii ale cromozomilor
7, 12, 20, precum și de o deleție interstițială 5q
Expresia HLA-DM a fost puternic corelată cu CD74 (R=0.45,
p=0.012), sugerând faptul că aceste două structure ale căii exogene
de prezentare a antigenului sunt supra-exprimate în LAM.
6.3.2.4 Expresia CLIP
În ansamblu, expresia de suprafață a CLIP a fost extreme de scăzută,
sub 10%, atât la pacienții cu LAM, cât și la indivizii sănătoși. În
doar două cazuri de LAM am identificat niveluri mai mari de 10%
ale CLIP: 12% într-un caz de LAM cu t(1;11) și 14.1% într-un caz
de LAM cu mutația NPM1 și cariotip complex. Cazurile cu nivel
normal de HLA-DR și expresie intracelulară crescută a HLA-DM au
prezentat și niveluri mai scăzute ale CLIP. Pacienții cu HLA-DR
low au prezenat o expresie mai ridicată a CLIP față de cazurile
HLA-DR normale, care a fost asociată cu un risc ELN advers sau
intermediar.
Din punctul de vedere al expresiei liganzilor B7, celulele HLA-DR
low, CLIP+ au prezentat o expresie semnificativ mai ridicată a
moleculei co-stimulatorii ICOS-L (HLA-DR low vs. HLA-DR
normal: p=0.03) și a ligandului co-inhibitor B7.2 (HLA-DR low vs.
HLA-DR normal p=0.014). Pe de altă parte, pacienții cu HLA-DR
normal au prezentat o expresia mai înaltă a PD-L2 (HLA-DR
normal vs. HLA-DR low: p = 0.021) și B7-H3 (HLA-DR normal vs.
HLA-DR low: p = 0.029).
6.3.3 Expresia moleculelor B7 în leucemia acută mieloblastică
Am identificat expresia moleculelor B7 la 18 pacienți (60%) din
lotul de studiu, în vreme ce la indivizii sănătoși am identificat doar
expresia izolată a B7.2 și PD-L1, în două cazuri. Nivelurile de
expresie ale moleculelor B7 din LAM au fost semnificativ mai mari
în comparație cu cele identificate la indivizii din lotul de control
(Figura 6.3-6). Dintre cazurile de LAM B7 pozitiv, 10 pacienți au
prezentat pattern-uri mai complexe de co-expresie, denumite
9
semnături moleculare B7, iar opt pacienți au prezentat o expresie
izolată a moleculelor B7.
Figura 6.3-6. Procentul de celule CD34+/CD117+/HLA-DR+ ce
exprimă moleculele B7 la pacienții B7 pozitivi, B7 negativi și la
indivizii sănătoși (HD). Barele reprezintă media+DS. (***P <
0.001, **P < 0.01, *P < 0.05, ns – nesemnificativ).
B7.2 a fost ligandul cel mai frecvent exprimat pe celulele tumorale
(50% din cazuri, n=15), urmat de PD-L1 (30%, n=9), PD-L2 (15%,
n=5), ICOS-L (12%, n=4), B7-H3 (10%, n=3) și B7-H4 (10%, n=3).
B7.1 a fost exprimat constant la niveluri extrem de scăzute, sub 1%,
și a fost astfel intrepretat ca fiind negativ pe mieloblaștii din LAM.
Dintre moleculele B7, B7.2 a fost exprimat izolat sau în contextul
semnăturilor B7 în proporții egale, în vreme ce restul moleculelor
B7 au fost doar co-exprimate în semnături.
Majoritatea pacienților cu LAM B7 pozitiv (16 din 18, 88,8%) au
prezentat risc citogenetic ELN advers sau intermediar și au fost
încadrate, din punctul de vedere al clasificării OMS, ca și LAM-
NOS (Not Otherwise Specified). 11 din 15 (73.3%) pacienți cu risc
intermediar și 5 din 8 (62.5%) cazuri cu risc advers au exprimat
molecule B7. Dintre aceste cazuri, pacienții cu LAM-NOS cu
cariotip complex au exprimat fie B7 izolat, fie semnătura moleculară
B7.2+/ICOS-L+/PD-L1. Pacienții cu LAM-NOS cu cariotip normal
au prezentat o expresie mai diversă de molecule B7 sistematizate
10
sub formă de semnături, incluzând PD-L2, B7-H3 și B7-H4 pe lângă
B7.2, ICOS-L și PD-L1 (Figura 6.3-12). Indiferent de cariotip,
categoria LAM-NOS a fost corelată cu pozitivitatea B7 (p=0,018,
Chi Square Test). Expresia izolată de molecule B7 a fost egal
distribuită între clasele de risc ELN intermediar și advers: 30% și,
respectiv, 37,5% din cazuri, dar semnăturile moleculere B7 au fost
mai frecevnt întâlnite în clasa de risc intermediar (40% vs. 25%
pentru riscul ELN advers). Cazurile de LAM-NOS cu mutația FLT-
3-ITD au exprimat izolat B7.2.
Figura 6.3-11. Heat-map al modelelor de co-expresie ale
liganzilor B7 la pacienții cu LAM. Coeficientul de corelație
Pearson (R) a fost calculat iar testul ANOVA a fost utilizat
pentru a valida semnificația corelațiilor identificate.
Spre deosebire de cazurile cu risc ELN advers și intermediar,
pacienții cu risc citogenetic favorabil au exprimat mai rar molecule
B7 (2 din 7 cazuri, 28,6%). Din acest tip de LAM, doar cazurile cu
mutația NPM1 au fost B7 pozitive, prezența mutației NPM1 fiind
corelată cu expresia B7-H3 (p=0,2, Chi Square Test). LAM cu
t(8;21)(q22;q22) și t(9;11)(p22;q23) a fost constant B7 negativă,
11
asocierea dintre negativitatea B7 și prezența t(8;21) fiind statistic
semnificativă (p=0.009, Chi Square Test) (Figura 6.3-12). În Anexa
1 se regăsesc informațiile suplimentare referitoare la expresia
fiecărei molecule B7 în funcție de vârstă, tip de LAM, risc ELN, de
populațiile limfocitare T și expresia receptorilor punctelor de control
imun.
Figura 6.3-12. Heat-map al expresiei moleculelor B7 pe
mieloblaștii maligni, în funcție de tipurile OMS de LAM și de
riscul citogenetic ELN. (**p< 0.01, *p < 0.05; two-tailed t-test).
Spre deosebire de cazurile cu risc ELN advers și intermediar,
pacienții cu risc citogenetic favorabil au exprimat mai rar molecule
B7 (2 din 7 cazuri, 28,6%). Din acest tip de LAM, doar cazurile cu
mutația NPM1 au fost B7 pozitive, prezența mutației NPM1 fiind
corelată cu expresia B7-H3 (p=0,2, Chi Square Test). LAM cu
t(8;21)(q22;q22) și t(9;11)(p22;q23) a fost constant B7 negativă,
asocierea dintre negativitatea B7 și prezența t(8;21) fiind statistic
semnificativă (p=0.009, Chi Square Test) (Figura 6.3-12). În Anexa
1 se regăsesc informațiile suplimentare referitoare la expresia
fiecărei molecule B7 în funcție de vârstă, tip de LAM, risc ELN, de
12
populațiile limfocitare T și expresia receptorilor punctelor de control
imun.
Am identificat opt semnături moleculare B7 diferite la un număr de
zece pacienți, cu următoarea distribuție: co-expresia B7.2, ICOS-L,
PD-L1 (3 cazuri); B7.2, ICOS-L, PD-L1, B7-H4 (1 caz); B7.2, PD-
L1, PD-L2 (1 caz); B7.2, PD-L1, B7-H3 (1 caz); B7.2, PD-L2, B7-
H3 (1 caz); PD-L1; B7-H3 (1 caz); B7.2, PD-L1, PD-L2, B7-H4+ (1
caz); PD-L1, PD-L2, B7-H4+ (1 caz). Mediana numărului de liganzi
B7 implicați în co-expresie a fost de trei. PD-L1 și B7.2 au fost
constant co-exprimate (90% și, respectiv, 80% din cazuri), astfel
încât toate semnăturile B7 au prezentat cel puțin o moleculă B7 cu
rol clar definit ca și co-inhibitor (PD-L1) sau cel mai probabil co-
inhibitor (B7.2). 60% din semnăturile B7 au fost identificate la
pacienții cu LAM-NOS cu cariotip normal, 20% la pacienții cu
cariotipuri complexe și 20% la cei cu mutația NPM1 prezentă..
Am identificat corelații semnificative statistic între co-expresia
unora din moleculele B7 implicate în semnături, după cum urmează:
B7.2-ICOS-L (p=0.032), ICOS-L-PD-L1 (p=0.001), PD-L1-B7-H4
(p=0.005). B7.2 a fost co-exprimat mai frecvent alături de ICOS-L
și PD-L1 în semnăturile B7.2/PD-L1/ICOS-L (3 cazuri) și B7.2/PD-
L1/ICOS-L/B7-H4 (un caz), dar expresia B7.2 nu a fost corelată cu
cea a PD-L2, B7-H3 și B7-H4. De asemenea, expresia B7-H3 și B7-
H4 a fost mutual exclusivă (Figura 6.3-11). Semnătura B7.2/ICOS-
L/PD-L1 a fost singurul tip de semnătură B7 identificată la pacienții
cu LAM cu cariotip complex.
6.4 Evaluarea disfuncției limfocitare T la diagnostic
Această etapă a studiului a avut drept scop investigarea exhaustivă a
disfuncției limfocitare T la pacienții cu LAM. Dincolo de aspectele
generale ale evaluării profilului imun al pacienților cu LAM, precum
numărătoarea absolută de limfocite, numărătoarea de limfocite T,
identificarea procentelor de limfocite CD4+ și CD8+, studiul nostru
și-a propus, simultan, analiza populațiilor maturative și funcționale
de limfocite T CD4+ și CD8+, precum și analiza expresiei
receptorilor punctelor de control imun pe acestea. Toate aceste date
au fost ulterior corelate cu expresia molecuellor B7 pe blaștii
mieloizi, în încercarea de a defini un model integrat de evadare
imună specific acestei patologii. Analiza populațiilor limfocitare T a
fost efectuată atât în aspiratul medular, cât și în sângele periferic.
13
Am observat absența unei diferențe semnificative între procentele
populațiilor maturative T helper și citotoxic din aspiratul medualr și
sângele periferic, atât la indivizii sănătoși, cât și la pacienții cu
LAM.
Figura 6.4-1. Expresia receptorilor punctelor de control imun
ICOS și PD-1 pe subseturile maturative T CD4+ și CD8+ din
măduva osoasă a pacienților cu LAM. Barele reprezintă
media+d.s. (n = 30; ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05; two-
tailed paired t-test).
Limfocitele T CD4+ au fost polarizate maturativ predominant ca și
celule T de memorie centrală (80% din cazuri) și doar rareori ca și
celule cu fenotip naiv sau efector. Limfocitele CD8+ au prezentat
frecvențe semnificativ mai mari ale fenotipului lateEM și procente
mai reduse ale celulelor naive și memorie centrală (Figura 6.4-4).
Din punctul de vedere al expresiei receptorilor punctelor de control
imun, CTLA-4 a fost constant exprimat la niveluri reduse, sub 1%,
pe toate populațiile limfocitare T helper și citotoxice. ICOS a fost
exprimat la niveluri semnificativ statistic mai mari pe limfocitele T
14
helper, în vreme ce limfocitele T citotoxice au exprimat procente
mai ridicate de PD-1.
Figura 6.4-4. Procentele populațiilor maturative T CD4+și
CD8+: N, CM, iEM, lateEM, la pacienții cu LAM B7 pozitiv și
B7 negativ (B7+, n = 18, B7-, n = 12) și indivizi sănătoși (HD, n =
4). Valorile individuale sunt reprezentate ca puncte. Barele
reprezinta media+d.s. (**P < 0.01, *P < 0.05; two-tailed t-test,
Mann Whitney test).
La analiza expresiei receptorilor punctelor de control imun pe
subpopulațiile limfocitare T helper și citotoxice am constatat
următoarele variații de expresie: 1) referitor la ICOS, cele mai mari
procente de expresie au fost obiectivate pe limfocitele lateEM helper
și iEM citotoxice; 2) în cazul PD-1, limfocitele T helper au prezentat
o creștere progresivă a expresiei dinspre compartimentul naiv spre
cel efector tardiv, în vreme ce celulele T citotoxice au prezentat cele
mai înalte niveluri de expresie ale PD-1 pe populațiile CM și iEM,
15
populația lateEM prezentând însă cele mai joase niveluri (Figura
6.4-1).
Limfocitele T CD4+ au fost polarizate maturativ predominant ca și
celule T de memorie centrală (80% din cazuri) și doar rareori ca și
celule cu fenotip naiv sau efector. Limfocitele CD8+ au prezentat
frecvențe semnificativ mai mari ale fenotipului lateEM și procente
mai reduse ale celulelor naive și memorie centrală (Figura 6.4-4).
Din punctul de vedere al expresiei receptorilor punctelor de control
imun, CTLA-4 a fost constant exprimat la niveluri reduse, sub 1%,
pe toate populațiile limfocitare T helper și citotoxice. ICOS a fost
exprimat la niveluri semnificativ statistic mai mari pe limfocitele T
helper, în vreme ce limfocitele T citotoxice au exprimat procente
mai ridicate de PD-1.
La analiza expresiei receptorilor punctelor de control imun pe
subpopulațiile limfocitare T helper și citotoxice am constatat
următoarele variații de expresie: 1) referitor la ICOS, cele mai mari
procente de expresie au fost obiectivate pe limfocitele lateEM helper
și iEM citotoxice; 2) în cazul PD-1, limfocitele T helper au prezentat
o creștere progresivă a expresiei dinspre compartimentul naiv spre
cel efector tardiv, în vreme ce celulele T citotoxice au prezentat cele
mai înalte niveluri de expresie ale PD-1 pe populațiile CM și iEM,
populația lateEM prezentând însă cele mai joase niveluri (Figura
6.4-1).
Ulterior, am corelat datele referitoare la expresia liganzilor B7 cu
populațiile maturative T helper și citotoxice, precum și cu expresia
receptorilor punctelor de control imun. Spre deosebire de pacienții
B7 negativi, cazurile LAM B7+ au prezentat procente semnificativ
mai mari de limfocite T CD8+ și mai reduse de limfocite T helper
(Figura 6.4-5).
Deși majoritatea pacienților din lotul de studiu au fost caracterizați
de predominanța fenotipului memorie centrală, cazurile B7 pozitive
s-au individualizat prin două diferențe: 1) procente mnai
semnificativ mai reduse ale limfocitelor T naive și 2) procente mai
crescute ale limfocitelor T efector. Referitor la expresia receptorilor
punctelor de control imun, pacienții B7+ au exprimat niveluri mai
ridicate ale ICOS și PD-1 pe limfocitele T helper, dar nu și pe cele T
citotoxice (Figura 6.4-5).
16
Figura 6.4-5. Expresia receptorilor punctelor de control imun
ICOS și PD-1 pe populațiile limfocitare T CD4+ și CD8+ -
memorie centrală (CM), efector memorie intermediar (iEM) și
efector memorie tardiv (lateEM), la pacienții cu LAM
(clasificați ca B7+, n = 18, sau B7-, n = 12) și indivizii din lotul
martor (HD, n = 4). Valorile individuale sunt reprezentate ca
puncte. Barele reprezintă media+d.s. (***P < 0.001, **P < 0.01,
*P < 0.05, ns – nesemnificativ; two-way ANOVA).
17
7 CAPITOLUL 7. Discuții
Căutarea de noi factori prognostici în LAM, precum și progresele
realizate în ultima decadă în înțelegerea imunobiologiei tumorale în
general au condus la definirea profilurilor imune în această
patologie. Atât în tumorile solide, cât și în cele hematologice, au fost
descrise până la opt profiluri imune diferite cu impact asupra
prognosticului pacienților, acestea pot fi clasificate în profiluri cu
fenotip inflamator și non-inflamator (7). Profilul imun indică etapa
ciclului cancer-imunitate, descris de Chen si Mellman, în care se
găsește micromediul tumoral si care poate oferi informații valoroase
privind atât prognosticul pacientului și este util în alegerea și
personalizarea unei strategii de imunoterapie. Un profil imun
inflamator este caracterizat prin imunogenicitate ridicată a celulelor
tumorale, existența unui proces eficient de prezentare a antigenelor
tumorale, semnalizarea prin intermediul IFN gamma în micromediu,
existența unei capacități adecvate de co-stimulare a limfocitelor T de
către celulele tumorale, priming-ul eficient al acestora și, ulterior,
prin emergența unor mecanisme de rezistență tumorală adaptativă la
presiunea sistemului imun, precum axele de co-semnalizare co-
inhibitorie B7.2-CTLA-4 și PD-1-PD-L1/PD-L2, care conduc la
epuizarea funcțională a limfocitelor T și la evadarea imună (8). Într-
un profil imun non-inflamator se observă imunogenicitatea scăzută a
celulelor tumorale, priming-ul redus al limfocitelor T, absența
celulelor T helper și citotoxice efector cu specificitate anti-tumorală,
cu instalarea toleranței imunologice față de celulele leucemice (7).
Această heterogenitate a profilurilor imunologice din LAM ar putea
explica, cel puțin parțial, eșecul clasificării ELN în a prezice cu
acuratețe prognosticul pacienților cu această patologie.
Studiile efectuate recent au demonstrat faptul că polaritatea
inflamatorie a micromediului tumoral din LAM prezice rezistența
primară la chimioterapia citotoxică, dar și răspunsul terapeutic la
blocada punctelor de control imun sau la alte imunoterapii, precum
flotetuzumab (6–8).
Am identificat două grupuri de pacienți în studiul nostru, în funcție
de expresia moleculelor B7, care au prezentat diferențe în
polarizarea maturativă a limfocitelor T helper și citotoxice și în
18
expresia receptorilor punctelor de control imun pe populațiile
limfocitare T. Aceste diferențe se suprapun pe datele din literatura
de specialitate referitoare la imunopatogeneza profilurilor imune
inflamatorii și non-inflamatorii în cancer.
Grupul B7 pozitiv a fost predominant, reprezentând 60% din lotul
de studiu. A fost caracterizat de expresia de molecule cu rol
predominant co-inhibitor în cancer și inclusiv în LAM (B7.2, PD-
L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4) (4,9) (Figure 1A). Structurile
moleculare cel mai frecvent exprimate au fost B7.2 și PD-L1, fapt
confirmat și în literatura de specialitate (10,11). Ligandul B7.1 nu a
fost exprimat. PD-L1, PD-L2 și ICOS-L au fost însă exprimate
constant în cadrul semnăturilor moleculare într-o serie de combinații
care au dovedit relevanță statistică, ceea ce sugerează faptul că
acestea reprezintă căi esențiale de evadare imună în LAM. Ulterior,
analiza statistică a evidențiat existența unor pattern-uri de co-
expresie ale celorlaltor molecule B7 investigate, indicând astfel
existența unor strategii ușor diferite de evadare imună în diferitele
tipuri de LAM B7 pozitiv. Astfel, expresia PD-L1 a fost corelată cu
B7.2 și ICOS-L, dar nu și cu PD-L2, B7-H3 sau B7-H4 (Figura 6.3-
11).
În LAM-NOS asociind cariotipuri complexe, expresia moleculelor
B7 a prezentat un grad redus de variație, fiind restrictată la expresia
izolată a B7.2 sau la co-expresia B7.2, PD-L1 și ICOS-L. Această
semnătură moleculară a fost și cea mai frecvent întâlnită în lotul de
studiu. LAM-NOS cu cariotip normal a exprimat o varietate mai
mare de liganzi B7, incluzând B7-H4 și PD-L2 (a căror co-expresie
a fost semnificativă din punct de vedere statistic) și B7-H3 (Figura
6.3-12). Întrucât expresia B7-H3 și B7-H4 a fost mutual exclusivă,
putem concluziona că aceste molecule reprezintă căi distincte de
evadare imună în diferite tipuri de LAM, B7-H3 fiind, de exemplu,
corelat cu LAM cu mutația NPM1 (Figura 6.3-12). ICOS-L a fost
unica structură cu rol co-stimulator care a fost identificată în 40%
din semnăturile moleculare B7 (Anexa 1). Rolul său co-stimulator
este însă, cel mai probabil, atenuat de co-expresia liganzilor B7 co-
inhibitori. Pe de altă parte, conform datelor din literatură, expresia
ICOS-L nu este benefică pentru imunitatea anti-leucemică,
determinând expansiunea limfocitelor Treg (12) și promovând
expresia PD-1 pe limfocitele T și epuizarea funcțională a acestora
(13,14). În concluzie, toate cazurile B7 pozitive au fost caracterizate
19
prin prezența B7.2, PD-L1 sau PD-L2 și prin expresia heterogenă a
ICOS-L, B7-H4 și B7-H3 liganzi cel mai probabil implicați într-un
reglaj delicat al procesului de evadare imună în diferitele tipuri de
LAM. De asemenea, în concordanță cu datele din literatură, (8), am
identificat corelația dintre expresia B7 și boala refractară la
chimioterapia de inducție (p=0.017, Chi Square Test).
Pacienții B7 negativi au reprezentat 40% din lotul de studiu și au
fost clasificați în cea mai mare parte ca LAM cu anomalii genetice
recurente, în special LAM asociind t(8;21)(q22;q22) și
t(9;11)(p21;q23) (Anexa 1).
Variațiile de expresie ale moleculelor B7 pe celulele leucemice au
fost dublate de diferențe în polarizarea populațiilor de limfocite T și
în expresia receptorilor punctelor de control imun. Astfel, cazurile
B7 pozitive au prezentat procente mai ridicate ale limfocitelor T
citotoxice și mai scăzute pentru limfocitele T helper, în vreme ce
pacienții B7 negativi au prezentat inversarea acestui raport. Analiza
subseturilor maturative de limfocite T a evidențiat polarizarea
predominantă CM a limfocitelor T helper, în vreme ce limfocitele T
citotoxice au prezentat predominanța subseturilor efector (iEM și
lateEM) față de populația CM (Figura 6.4-2). De asemenea,
pacienții B7 pozitivii au prezentat o frecvență semnificativ mai
redusă a limfocitelor T naive CD4+ și CD8+. Procentele similare de
limfocite T CM helper și citotoxice descrise la pacienții B7+, B7-,
precum și în lotul de control pot fi explicate prin numărul normal
crescut de limfocite T polarizate CM în măduva osoasă normală care
nu prezintă specificitate antileucemică. Analiza populațiilor efector
a evidențiat diferențe semnificative între celulele helper și citotoxice
în funcție de fenotipul B7: limfocitele T helper de la pacienții B7
pozitivi au prezentat procente semnificativ mai mari de celule
efector, în vreme ce, în cazul limfocitelor T citotoxice, nu au
dexistat diferențe semnificative statistic în polarizarea efector între
grupurile B7+ și B7-, deși procentul global de celule efector a fost
mai mare decât cel identificat la limfocitele T helper.
Aceste diferențe sugerează faptul că celulele tumorale din LAM B7
pozitive sunt mai eficiente în a activa limfocitele T CD4+ și a le
transforma în limfocite CD4+ CM și efector. Pe de altă parte,
polarizarea maturativă a limfocitelor T citotoxice sugerează faptul
că acestea ar putea beneficia de activare atât în manieră dependentă,
cât și independentă de limfocitele T helper.
20
Privitor la analiza expresiei receptorilor punctelor de control imun
pe limfocitele T, am identificat niveluri de expresie mai înalte ale
ICOS pe celulele CD4+, în vreme ce limfocitele CD8+ au exprimat
niveluri mai ridicate de PD-1. Cazurile de LAM B7+ au exprimat
ICOS și PD-1 la niveluri mai înalte doar pe limfocitele CD4+
(Figura 6.4-1). Analizând expresia ICOS și PD-1 pe subseturile
maturative de limfocite T helper și citotoxice, am identificat o
creștere progresivă a intensității expresiei PD-1 dinspre
compartimentul TCD4+ naiv înspre cel efector, în vreme ce
expresia ICOS a atins cele mai înalte niveluri pe celulele lateEM.
Pe limfocitele T CD8+, cel mai înalt nivel de expresie al PD-1 a
fost identificat pe limfocitele CD8+ cu fenotip CM, dar nu și pe cele
polarizate înspre un fenotip efector, care au exprimat ICOS la
niveluri mai ridicate (Figura 6.4-5). Deoarece limfocitele T CD4+
promoveaza activitatea antitumorala a limfocitelor T CD8+ și previn
epuizarea funcțională a acestora (15), putem avansa ipoteza conform
căreia epuizarea funcțională PD-1 mediată a limfocitelor T CD4+ o
precede și chiar o condiționează pe cea a limfocitelor T CD8+ în
LAM.
Ulterior, am analizat expresia ICOS și PD-1 pe subseturile de
limfocite T CD4+ și CD8+ în funcție de expresia liganzilor B7 pe
mieloblaștii tumorali din LAM. Am constatat niveluri mai ridicate
de expresie la pacienții B7 pozitivi, fără ca aceste diferențe să fie
însă semnificative statistic.
Toate aceste diferențe în expresia PD-1 și ICOS între limfocitele T
helper și citotoxice sugerează indirect, susceptibilitatea mai ridicată
a limfocitelor CD8+ pentru apoptoza PD-1 mediată și a celulelor
CD4+ pentru activare, dar și pentru moartea celulară indusă de
activare.
În cele din urmă, ne-am propus, în contextul datelor obținute, să
definim un model imunopatogenic al LAM care să se suprapună pe
teoria micromediilor inflamatorii și non-inflamatorii (9). Astfel, în
studiul nostru, cazurile de LAM NPM1 pozitiv, precum și cele cu
risc ELN intermediar sau advers, care au fost frecvent B7 pozitive
(78.2%), au fost cele care au prezentat elemente atribuite în
literatura de specialitate micromediilor inflamatorii, incluzând
expresia predominantă a liganzilor B7 cu rol inhibitor, procentele
ridicate de limfocite T CD4+ efector, proporția scăzută de limfocite
T CD4+ și CD8+ naive și nivelurile mai ridicate de expresie ale
21
ICOS și PD-1. LAM cu mutația NPM1 a prezentat suplimentar
diferențiere efector a limfocitelor T CD8+ PD1+, o dovadă indirectă
a epuizării funcționale a acestor celule. Polaritatea inflamatorie a
micromediului medular din LAM NPM1+ este susținută de cerectări
care au evidențiat faptul că mutația NPM1 generează pepetide
imunogene (16), un răspuns imun T mediat mediat de IFNγ (17) și
asocierea acestui tip de LAM cu expresia B7-HE și PD-L1 (18,19).
Aceste informații prezintă o importantă relevanță practică deoarece
cercetări recente au arătat faptul că polaritatea inflamatorie a
micromediului prezice răspunsul terapeutic la blocada punctelor de
control imun sau la un abord sinergic ICB/DART (7,8).
Cazurile de LAM B7 negativ au fost caracterizate de procente mai
ridicate de limfocite T CD4+ și CD8+ naive, expresie mai scăzută a
ICOS și PD-1. Acestea au fost identificate la pacienții cu LAM cu
t(8;21)(q22;q22), dar și t(9;11)(p21;q23), o entitate patologică
descrisă în literatură ca posedând imunogenicitate redusă (20,21).
Astfel, aceste tipuri de LAM B7- prezintă o imunogenicitate mai
redusă și nu sunt capabile a monta un răspuns imun anti-leucemic.
Din acest motiv, ele impun o abordare diferită din punctul de vedere
al imunoterapiei, ce presupune conversia micromediului din non-
inflamator în inflamator (de exemplu, cu ajutorul agenților
hipometilanți), vaccinuri anti-leucemice sau terapii celulare adoptive
(7,22).
Rezultatele studiului nostru susțin ideea conform căreia această
boala extrem de heterogenă are modalități distincte și versatile de
evadare imună, influențate de multipli factori, dincolo de trăsăturile
genetice ale celulelor leucemice. Acest concept este important în
contextul în care noi terapii pentru LAM sunt în continua dezvoltare
și noi biomarkeri, precum profilurie imune, aduc un aport
semnificativ în ghidarea acestor terapii.
22
23
9 CAPITOLUL 9. Concluzii finale
LAM reprezintă o patologie a cărei terapie este, în prezent,
redefinită datorită emergența de numeroase noi abordări, printre care
și imunoterapia. Determinarea profilurilor de expresie genică prin
GEP se dovedește un biomarker util de ghidare a imunoterapiei, însă
cu multiple neajunsuri legate de cost și disponibilitatea redusă.
Biomarkerii care ar putea prezice răspunsurile la imunoterapie în
LAM sunt un domeniu în care cercetările se află încă la început și
sunt subiectul multor controverse.
În acest context, cercetarea doctorală ‚‚IMUNOEDITARE ȘI
IMUNOSUPRAVEGHERE ÎN LEUCEMIA ACUTĂ
MIELOBLASTICĂ’’ aduce importante elemente inovatoare: 1)
tranziția de la investigarea relevanței prognostice de markeri izolați
la un plan de investigație complex și multiparametric; 2)
implementarea unui plan de investigare prin citometrie de flux ca și
alternativă la GEP; 3) elaborarea a două modele imunopatogenice de
evadare imună în LAM, concordante cu datele recent publicate în
literatură.
În acest studiu, am investigat, succesiv, cinci niveluri de
complexitate ale răspunsului imun antileucemic: 1) caracteristicile
genetice ale celulelor tumorale, determinante ale imunogenicității;
2) calitatea de APC a mieloblaștilor; 3) capacitatea co-stimulatorie a
celulelor leucemice; 4) polarizarea maturativă și funcțională a
limfocitelor T medulare și 5) expresia receptorilor punctelor de
control imun la nivelul acestora. Originalitatea și caracterul inovator
al studiului se regăsesc în complexitatea evaluării imunității
antitumorale, care urmărește logica, derivată din imunologia
fundamentală, a pașilor de activare a limfocitelor T și care se
suprapune pe etapele conceptului modern al ciclului cancer-
imunitate.
Am demonstrat faptul că evaluarea polarității imunologice a
măduvei osoase în LAM prin citometrie de flux reprezintă o metodă
rapidă, mai puțin costisitoare decât GEP, dar care este capabilă sa
genereze date relevante.
În studiul nostru, în peste jumătate din cazuri, mieloblaștii maligni
au exprimat semnături moleculare B7 sau molecule B7 izolate, ce au
prezentat în mod constant în componența lor molecule cu rol co-
inhibitor.
24
Aceste LAM B7 pozitive au prezentat caracteristici atribuite în
literatură profilurilor imune inflamatorii, precum predominanța
celulelor T CD4+ efector la nivelul măduvei osoase, cu niveluri de
expresie ridicate ale ICOS și PD-1 și prezența unui procent discret
crescut de limfocite Treg. LAM B7 pozitive au făcut parte din
categoria pacienților cu LAM-NOS, cu risc ELN intermediar sau
advers, și care au prezentat boala refractară la tratament.
Pacienții B7 negativi au prezentat o predominanță semnificativă
statistic a limfocitelor T CD4+ și CD8+ naive, precum și niveluri
mai reduse ale expresiei ICOS și PD-1, trăsături caracteristice
profilurilor imune non-inflamatorii. De remarcat, aceşti pacienţi au
făcut parte mai frecvent din categoria LAM cu anomalii genetice
recurente.
Astfel, studiul nostru avansează ipoteza conform căreia profilul
imun B7 al blaștilor leucemici și al limfocitelor T ar putea
reprezenta un biomarker util pentru a discrimina rapid între
leucemiile acute mieloblastice cu micromediu inflamator și non-
inflamator, distincție importantă deorece profilurile imune diferite
dictează strategii distincte de imunoterapie pentru fiecare caz.
25
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. Kondo A, Yamashita T, Tamura H et al. Interferon-gamma
and tumor necrosis factor-alpha induce an immunoinhibitory
molecule, B7-H1, via nuclear factor-kappaB activation in
blasts in myelodysplastic syndromes. Blood 2010; 116(7):
1124–31.
2. Berthon C, Driss V, Liu J et al. In acute myeloid leukemia,
B7-H1 (PD-L1) protection of blasts from cytotoxic T cells is
induced by TLR ligands and interferon-gamma and can be
reversed using MEK inhibitors. Cancer Immunol
Immunother 2010; 59(12): 1839–49.
3. Krönig H, Kremmler L, Haller B et al. Interferon-induced
programmed death-ligand 1 (PD-L1/B7-H1) expression
increases on human acute myeloid leukemia blast cells
during treatment. Eur J Haematol 2014; 92(3): 195–203.
4. Greaves P, Gribben JG. The role of B7 family molecules in
hematologic malignancy. Blood 2013; 121(5): 734-744.
5. Vadakekolathu J, Patel T, Reeder S et al. Immune Gene
Expression Profiling in Children and Adults with Acute
Myeloid Leukemia Identifies Distinct Phenotypic Patterns.
Blood 2017; 130(Suppl 1): 3942–3942.
6. Uy GL, Godwin J, Rettig MP et al. Preliminary Results of a
Phase 1 Study of Flotetuzumab, a CD123 x CD3 Bispecific
Dart® Protein, in Patients with Relapsed/Refractory Acute
Myeloid Leukemia and Myelodysplastic Syndrome. Blood.
2017; 130(Suppl 1).
7. Davidson-Moncada J, Viboch E et al. Dissecting the
Immune Landscape of Acute Myeloid Leukemia.
Biomedicines 2018; 6(4): 110.
8. Rutella S, Church SE, Vadakekolathu J et al. Adaptive
Immune Gene Signatures Correlate with Response to
Flotetuzumab, a CD123 × CD3 Bispecific Dart® Molecule,
in Patients with Relapsed/Refractory Acute Myeloid
Leukemia. Blood 2018; 132(Suppl 1): 444.
9. Guo Y, Wang AY. Novel Immune Check-Point Regulators
in Tolerance Maintenance. Front Immunol 2015; 6:421.
10. Whiteway A, Corbett T, Anderson R et al. Expression of co-
stimulatory molecules on acute myeloid leukaemia blasts
26
may effect duration of first remission. Br J Haematol 2003;
120(3): 442–51.
11. Maeda A, Yamamoto K, Yamashita K et al. The expression
of co-stimulatory molecules and their relationship to the
prognosis of human acute myeloid leukaemia: poor
prognosis of B7-2-positive leukaemia. Br J Haematol 1998;
102(5): 1257–62.
12. Han Y, Dong Y, Yang Q et al. Acute Myeloid Leukemia
Cells Express ICOS Ligand to Promote the Expansion of
Regulatory T Cells. Front Immunol 2018; 9: 2227.
13. Knaus HA, Berglund S, Hackl H et al. Signatures of CD8+
T cell dysfunction in AML patients and their reversibility
with response to chemotherapy. JCI insight 2018; 3(21).
14. Ozkazanc D, Yoyen-Ermis D, Tavukcuoglu E et al.
Functional exhaustion of CD4 + T cells induced by co-
stimulatory signals from myeloid leukaemia cells.
Immunology 2016; 149(4): 460–71.
15. Ostroumov D, Fekete-Drimusz N, Saborowski M et al. CD4
and CD8 T lymphocyte interplay in controlling tumor
growth. Cell Mol Life Sci 2018; 75(4): 689–713.
16. Greiner J, Ono Y, Hofmann S et al. Mutated regions of
nucleophosmin 1 elicit both CD4+ and CD8+ T-cell
responses in patients with acute myeloid leukemia. Blood
2012; 120(6): 1282–9.
17. Forghieri F, Riva G, Lagreca I et al. Characterization and
dynamics of specific T cells against nucleophosmin-1
(NPM1)-mutated peptides in patients with NPM1-mutated
acute myeloid leukemia. Oncotarget 2019; 10(8): 869–82.
18. Hu Y, Lv X, Wu Y, Xu J et al. Expression of costimulatory
molecule B7-H3 and its prognostic implications in human
acute leukemia. Hematology 2015; 20(4): 187–95.
19. Greiner J, Hofmann S, Schmitt M et al. Acute myeloid
leukemia with mutated nucleophosmin 1: an immunogenic
acute myeloid leukemia subtype and potential candidate for
immune checkpoint inhibition. Haematologica 2017;
102(12): e499–501.
20. Andersson AK, Ma J, Wang J et al. The landscape of
somatic mutations in infant MLL-rearranged acute
lymphoblastic leukemias. Nat Genet 2015; 47(4): 330–7.
27
21. Winters AC, Bernt KM. MLL-Rearranged Leukemias-An
Update on Science and Clinical Approaches. Front Pediatr
2017; 5:4.
22. Curran EK, Godfrey J, Kline J. Mechanisms of Immune
Tolerance in Leukemia and Lymphoma. Trends Immunol
2017; 38(7): 513–25.
I
Anexa I. Pattern-uri de expresie ale liganzilor B7, ale receptorilor punctelor de control imun și a populațiilor
de limfocite T helper și citotoxice în funcție de tipurile OMS de LAM și de riscul citogenetic ELN. Tip OMS
LAM
Caracteristici LAM Liganzi B7
% de expresie pe celulele din LAM
Subset T
CD4+
% ICR
CD4+
Subset T
CD8+
% ICR
CD8+
V LAM Cariotip Risc ELN
B7.1 B7.2 ICOSL PD-L1
PD-L2
B7-H3
B7-H4
N CM Late EM
ICOS PD-1
N CM Late EM
ICOS PD-1
LAM Cu
anomalii genetice recurente
83 NPM1 NK Fav 13.2 27.4 62.4 50.1 29.9 1.9 16.7
70 NPM1 NK Fav 26.3 20.5 16.7 68.3 43.4 13.0 37.3
34 NPM1 CK Fav 62.3 13.2 40.2 35.8
60 t(8;21) t(8;21) Fav 28.0 13.6 9.0 25.2
66 t(8;21) t(8;21) Fav 43.4 11.6 22.1 37.4
48 t(8;21) t(8;21) Fav 34.1 19.5 5.6 33.3
44 t(8;21) t(8;21) Fav 32.8 12.2 16.4 25.5
27 t(9;11) t(9;11) Int 25.8 5.3 8.5 12.7
LAM-NOS
51 NOS 5 NK Int 20 15.2 23.5 10 69.8 21.3 11.2 24.6
43 NOS 5 NK Int 34.7 25 12 61.8 17.0 21.5 31.2
36 NOS 5 NK,FLT3 Int 22 63.6 15.4 40.7 27.3
66 NOS 5 NK Int 43.6 54.1 23.8 32.0 45.3
74 NOS 5 NK Int 17 43.4 27.0 6.6 14.5
71 NOS 4 NK Int 20.9 52.3 52.9 48.6 91.7 11.6 58.0 6.7
66 NOS 4 NK Int 26.1 22.9 21.1 75.8 27.1 42.3 26.3
41 NOS 4 NK Int 37.2 31.4 12.6 10.9 21.4
42 NOS 4 NK Int 54.9 19.1 17.3 22.8
48 NOS 1 NK Int 14.1 21.2 24.3 69.1 37.3 42.1 35.1
67 NOS 1 NK Int 16 64.3 9.6 8.6 8.7
56 NOS 1 NK Int 83.9 12.3 71.7 35.6
59 NOS 0 NK Int 13.1 34.4 79.1 40.5 49.8 58.0
71 NOS 0 NK Int 59.3 24.0 18.1 37.4
64 NOS 5 t(1;11) Adv 10.9 57.0 14.1 27.6 29.8
45 NOS 4 CK Adv 43.5 9.4 13.7 7.0
53 NOS 4 CK Adv 80.5 14.9 67.6 57.1 28.9 27.1 42.2
51 NOS 4 CK,FLT3 Adv 48.4 45.1 17.0 9.6 22.1
69 NOS 2 CK Adv 23.1 19 19.6 80.8 11.9 40.0 43.1
65 NOS 1 CK Adv 65.3 22.0 29.0 16.0
59 NOS 1 CK Adv 16.3 62.4 12.1 9.4 7.6
67 NOS7 Del 7 Adv 50.4 29.9 12.3 45.8
HD1 13.9 29.9 18.5 21.3 26.7
HD2 13.1 71.5 21.3 27.3 34.3
HD3 64.0 2.1 15.2 24.1
HD4 64.8 21.4 20.6 23.9
II
Expresia unui ligand B7 cu rol co-stimulator
Expresia unui ligand B7 cu rol co -inhibitor
Fără expresie B7 sau absența predominanței uneui anumit subset maturativ de limfocite T
Predominanța unei subpopulații de limfocite T
Expresia ICOS sau PD-1> 10%, expresia ICOS depășind pe cea a PD-1 sau vice versa.
Expresia ICOS sau PD-1> 10%, fără ca expresia ICOS să o depășească pe cea a PD-1 sau vice versa.
Expresia ICOS sau PD-1< 10%,
Adv= advers, CD= cluster of differentiation, CK= cariotip complex, del= deleție, Fav= favorabil, FLT3= prezența mutației FLT3-ITD,
HD= subiect sănătos, ICOS= inducible T cell co-stimulator, co-stimulatorul inductibil al limfocitelor T, ICR= immune checkpoint
receptor, Int= intermediar, NPM1= prezența mutației NPM1, NK= cariotip normal, receptor al punctelor de control imun- PD-1 sau
ICOS, NOS= not otherwise specified, LAM nespecificată, OMS= Organizația Mondială a Sănătății, PD-1= programmed death 1,
receptorul de moarte celulară programată 1, V= vârsta.
