614.542

Ind

PPEDOMAN OPERASIONAL BAKU

UJI DIAGNOSTIK MOLEKULARLOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION

(LAMP ) UNTUK DETEKSI CEPAT TB PARU DIINDONESIA

KEMENTRIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

2012

Kotalog Dalam Terbitan. Kementerian Kesehatan RI

614.542IndP

In onesia. Kementerian Kesehatan RI. BadanPenelitian dan Pengembangan Kesehatan

Pedoman operasional baku uji diagnosticolekuler : loop mediated isothermal

amplification (lamp) untuk deteksi cepat TB paru

1i Indonesia .-- Jakarta : Kementerian Kesehatan RI.012

ISBN 978-602-235-172-6

1. Judul I. TUBERCULOSIS - DIAGNOSIS

KONSULTAN:

Dr.dr. Trihono, MSc.

Prof.dr. Pratiwi Pujilestari Sudarmono, Sp.MK(K), PhD.

Drs. Ondri Dwi Sampurno, MSi, Apt.

TIM PENYUSUN:

Vivi Lisdawati

Tjahjani Mirawati Sudiro

Nelly Puspandari

Triyani Sukarso

Ni Wayan Ariani

Aulia Rizki

Holy Arif Wibowo

ii

KATA PENGANTAR

Assalamu'alaikum wr.wb.

Puji syukur kepada Allah SWT kami panjatkan karena hanya

berkat rahmat dan karunia serta taufik dan hidayahNya maka tim

penyusun berhasil menyelesaikan tugas mempersiapkan buku

"Pedoman Operasional Baku Uji Diagnostik Molekular Loop-

mediated Isothermal Amplification (LAMP) untuk Deteksi Cepat

TB Paru di Indonesia" ini.

Telah diketahui bahwa beban penyakit TB merupakan ancaman

terbesar bagi perekonomian negara dan saat ini Indonesia masih

menduduki posisi no. 4 di dunia dalam kelompok negara dengan

masalah Tuberkulosis Paru besar (high burden countries). Oleh

karena itu penatalaksanaan TB di laboratorium juga merupakan

fokus utama Pemerintah sesuai dengan prioritas Millenium

Development Goals (MDGs) untuk tata laksana penyakit infeksi

menular.

iii

Salah satu langkah alternatif dalam menemukan metode

terobosan untuk diagnosis TB di laboratorium adalah

pengembangan sistem deteksi cepat secara molekuler. Metode

yang diunggulkan untuk diaplikasikan pada daerah dengan

sumber daya terbatas seperti halnya Indonesia adalah

pengembangan sistem deteksi molekuler secara isothermal (suhu

tetap), yaitu metode LAMP. Penerapan metode LAMP akan

mampu mereduksi penggunaan alat PCR konvensional yang

mahal untuk amplifikasi bakteri. Pelaksanaan metode LAMP

belum banyak dilakukan di Indonesia sehingga penyusunan buku

pedoman untuk melaksanakan teknik ini di laboratorium

merupakan langkah awal agar pengembangan metode dapat

dilakukan secara lebih luas. Buku pedoman juga dapat menuntun

pekerja laboratorium untuk mengembangkan teknik secara terus

menerus dan melakukan berbagai penyesuaian sesuai

kemampuan laboratorium yang tersedia.

Terimakasih kami ucapkan kepada Tim Penyusun yang telah

bekerja bersama-sama untuk dapat menghasilkan buku pedoman

ini yang diperuntukkan sebagai sumbangsih berharga kepada

masyarakat Indonesia.

iv

Harapan kami semoga buku pedoman ini dapat bermanfaat dan

berperan serta pada penatalaksanaan TB Paru di Indonesia.

Billahit taufiq walhidayah wassalamu'alaikum wr.wb.

Kepala Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan

Kementerian Kesehatan RI

Dr. dr. Trihono, MSc.

V

UCAPAN TERIMA KASIH

Seluruh penelitian yang melatar belakangi penyusunan bukupedomanan ini dibiayai oleh dana DIPA 2008-2009 dan DIPA2009-2010 Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan

(Balitbangkes) dan dana DIPA 2010-2011 Pusat Biomedis danTeknologi Dasar Kesehatan, Balitbangkes.

Ucapan terimakasih kami sampaikan kepada Dr. Endang R.Sedyaningsih, MPH, Dr. PH., selaku pencetus ide pengembangandiagnostik TB di Indonesia dan bertindak selaku KoordinatorPenelitian Identifikasi dan Karakterisasi Bakteri Mtb di

Puslitbang BMF tahun 2008; serta dr. Triono Soendoro, Ph.D.selaku pencetus ide pemetaan bakteri Mtb yang ada di Indonesiasekaligus bertindak selaku konsultan dalam penelitian.

Secara khusus, kami juga mengucapkan terimakasih yang sangatbesar kepada Dr. Tomohiro Oshibe dan Mr. Hidetaka Tsuji dariHyogo Perfectural Institute of Public Health and ConsumerScience, Public Health Science Research, Kobe - Japan yang telahmemberikan bimbingan dan membegikan ilmunya kepada kami

selama pembelajaran yang kami lakukan di laboratorium mereka.

Kami juga mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya

kepada Drs. Syahrial Harun, MSc. dan seluruh anggota TimPenelitian TB 2008-2010, para peneliti dan para pembantupeneliti beserta staf administrasi penelitian. Terimakasih jugakami sampaikan kepada seluruh pihak yang telah

menyumbangkan segala bantuan moril dan materil untuktersusunnya buku pedoman ini.

vi

RINGKASAN

Data Badan Kesehatan Dunia (WHO) tahun 2009 masih

menempatkan Indonesia pada urutan ketiga sebagai negara

dengan pengindap Tuberkulosis Paru (TB) terbanyak sesudah

India dan Cina. Salah satu intervensi pengendalian TB yang

direkomendasikan oleh WHO adalah penelitian untuk

pengembangan diagnostik molekular yang dapat menjadi metode

alternatif diagnostik konvensional. Oleh karena itu, Badan

Penelitian dan Pengembangan Kesehatan melakukan optimasi

metode LAMP dari tahun 2008-2010 untuk diagnostik TB

molekuler cara langsung berdasarkan uji asam nukleat bakteri.

Metode Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) adalah

salah satu teknik diagnostik molekuler yang telah dikembangkan

dari tahun 1999 di Jepang. Teknik LAMP menggunakan

amplifikasi DNA pada suhu tetap, sehingga penggunaan alat

thermocycler yang mahal tidak diperlukan. Amplifikasi pada

suhu tetap dapat terjadi dengan menggunakan jumlah primer

yang lebih banyak berdasarkan prinsip nested dan reverse

transcriptase PCR (Polymerase Chain Reaction). Proses

amplifikasi pada metode LAMP menggunakan enzim yang dapat

menjadi substrat selama proses reaksi amplifikasi berlangsung.

vii

.,1

Analisis basil metode ini sangat sederhana karena dapat

dideteksi secara visual dengan melihat endapan (pada proses

reaksi ditambahkan reagen pengendap) atau dapat berupa

perubahan pendar warn/ fluoresensi (pada proses reaksi

ditambahkan reagen fluoresensi) dengan menggunakan bantuan

sinar UV.

viii

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL i

DAFTAR KONSULTAN DAN TIM PENYUSUN ii

KATA PENGANTAR iii

UCAPAN TERIMA KASIH vi

RINGKASAN vii

DAFTAR ISI ix

DAFTAR GAMBAR xi

DAFTAR LAMPIRAN xii

BAB I . PENDAHULUAN 11.1. Latar Belakang 11.2. Tujuan Penulisan 6

1.3. Luaran 6

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA 7

2.1. Mycobacterium tuberculosis 7

2.1.1 Taksonomi 72.1.2 Struktur Dinding Set dan Pewamaan Set 82.1.3 Perkembangbiakan Set 10

2.2. Genome Mycobacterium tuberculosis 10

2.3. Uji Diagnostik Tuberkulosis Paru 13

2.4. Uji Diagnostik Cara Langsung (Direct Methode) 14

2.5. Uji Diagnostik Loop-mediated isothermalamplification (LAMP) 15

2.5.1. Metode amplifikasi asam nukleat 15

2.5.2. Prinsip kerja LAMP 16

ix

BAB III. METODE UJI DIAGNOSTIK LAMP TB

3.1. Preparasi Sampel Dahak 22

3.2. Preparasi dan Ekstraksi DNA dari SampelDahak 24

3.3. Uji LAMP TB 28

BAB IV. DAFTAR RUJUKAN 34

LAMPIRAN 39

x

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 A.

B.

Struktur dinding sel Mycobacteriumtuberculosis.Karakteristik dinding sel bakteri

9

Gambar 2.2Peta sirkular kromosom Mycobacterium

tuberculosis H37Rv11

Gambar 2.3 Filogenetik Mtb complex 12

Gambar 2.4Skema pembagian metode uji

diagnostik kasus TB14

Gambar 2.5 Mekanisme amplifikasi LAMP 18

Gambar 3.1 Proses preparasi sampel dahak 23

Gambar 3.2Proses ekstraksi DNA dari sampel

dahak25

Gambar 3.3Proses mixture reagen amplification

LAMP-TB30

Gambar 3.4 Proses Amplifikasi LAMP-TB 30

xi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Lembar Kerja dan Evaluasi Metode LAMP 39

Lampiran 2. Prosedur Operasional Baku (POB) LAMP 40

Lampiran 3. Tahap Kerja Uji Diagnostik LAMP-TB 42

xii

BABI

PENDAHULUAN

1.1. Latar belakang

Salah satu kendala dalam meningkatkan penemuan kasus

Tuberkulosis Paru (TB) adalah akibat keterbatasan dari metode

diagnostik konvensional yang saat ini digunakan (WHO, 2000).

Metode diagnostik yang ada pada umumnya bertujuan untuk

mendeteksi bakteri Mycobacterium tuberculosis (Mtb) yang

menjadi penyebab dari infeksi. Uji konvensional mikroskopik

BTA (Bakteri Tahan Asam) terhadap apusan dahak suspek TB

yang terintegrasi dalam program Directly Observed Short Course

Treatment (DOTS) merupakan baku emas untuk deteksi awal TB

selain uji biakan kultur bakteri pada media sediaan yang sesuai

(Murray, et.al., 2005).

Kelemahan uji mikroskopik BTA terletak pada keragaman

teknik pembuatan sediaan dan kemampuan interpretasi hasil yang

sangat bervariasi dari para pekerja laboratorium. Jumlah bakteri

yang dibutuhkan cukup besar, yaitu minimal 10° per ml dahak

untuk dapat teridentifikasi positif sehingga umumnya hanya

efektif terhadap pasien yang sudah memiliki manifestasi klinis

(Boehme, et.al., 2007). Sementara diketahui bahwa manisfestasi

klinis TB perlu waktu hampir satu bulan atau bahkan lebih

sebelum dapat menimbulkan respon imunitas selular dan jumlah1

bakteri dapat di mukan dalam jumlah cukup banyak di dalam

dahak (Nester,

menyebabkan k

et.al., 2007; Gantz, et.al., 2006). Hal ini

terbatasan uji mikroskopis BTA di daerah

endemik sering enghambat terapi dini penangan kasus (Forbes,

et.al., 2007). Se sitivitas uji berkisar antara 67%-87% meskipun

spesifisitas dapa mencapai 99%-100% (Mathew, et.al., 2002).

Prevalensi koin ksi TB-HIV yang meningkat pada dekade

terakhir juga me ambah kesulitan pembacaan mikroskopik BTA.

Hasil negatif alsu sering muncul akibat menurunnya

kemampuan ma rofag menangkap bakteri sehingga jumlah

bakteri yang ke dian dapat berkembangbiak serta ditemukan di

dalam dahak me 'adi sangat sedikit (Achkar, et.al., 2010).

Uji konve sional baku emas lain adalah dengan cara

mengkultur bakt ri pada media biakan yang sesuai, terutama

untuk deteksi asus resistensi. Meskipun sensitivitas dapat

meningkat hingg 87-90%, terutama dengan menggunakan kultur

media cair MGI Bactec, tetapi spesifisitas hanya mencapai 90%

serta lambatnya ertumbuhan koloni (2-4 minggu) menyebabkan

deteksi cepat to hadap pasien tidak dapat dilakukan. Pasien

dengan resistensi TB positif terhambat memperoleh pengobatan

yang tepat sebe um hasil pertumbuhan koloni dapat diamati

secara jelas (J Q Palomino, et.al., 2005).

2

Metode diagnostik menggunakan prinsip molekuler

merupakan salah satu metode diagnosis TB yang diharapkan

dapat menjadi alternatif mengatasi keterbatasan diagnostik

konvensional (WHO, 2007). Identifikasi yang ditujukan terhadap

asam nukleat atau DNA (deoxy nucleic acid) bakteri dapat

meminimalisasi kebutuhan jumlah bakteri dalam spesimen klinis

dan oleh karenanya juga dapat mengurangi kendala deteksi dini

akibat keterlambatan manifestasi klinis penyakit (Pai, et.al.,

2006). Kendala diagnostik molekuler pada umumnya adalah

teknik ini memerlukan beberapa suhu reaksi agar proses

amplifikasi dapat terjadi. Instrumen yang umum digunakan

adalah thermocycler yang harganya sangat mahal, terutama bagi

negara dengan sumber daya terbatas . Kendala lain adalah sering

terjadi kegagalan amplifikasi DNA pada saat proses reaksi

berlangsung . Hasil amplifikasi juga memerlukan sistem deteksi

yang rumit dengan penggunaan metode elektroforesis untuk

mendeteksi jumlah amplicon (produk DNA) yang teramplifikasi.

Metode Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)

adalah salah satu teknik diagnostik molekuler yang telah

dikembangkan dari tahun 1999 di Jepang sebagai alternatif untuk

mengatasi beberapa kendala penerapan uji diagnostik molekuler

sebagaimana tersebut di atas. Teknik LAMP menggunakan

amplifikasi DNA pads suhu tetap, sehingga penggunaan alat

3

thermocycler y ng mahal tidak diperlukan. Amplifikasi pada

suhu tetap dap at teijadi dengan menggunakan jumlah primer

yang lebih ba yak berdasarkan prinsip nested dan reverse

transcriptase P R (Polymerase Chain Reaction). Sedangkan

kegagalan prose amplifikasi pada metode LAMP diatasi dengan

menambahkan enzim yang dapat menjadi substrat selama proses

reaksi amplifik si berlangsung. Sistem deteksi pada teknik ini

juga sederhana 1 arena amplicon yang akan dideteksi dapat berupa

endapan (pada proses reaksi ditambahkan reagen pengendap) atau

dapat berupa p bahan pendar warna/ fluoresensi (pada proses

reaksi ditambah an reagen fluoresensi). Oleh karena itu, deteksi

hasil akhir dap at langsung dilakukan secara visual (Notomi,

2t.al., 2000). D gan prinsip amplifikasi DNA bakteri pada suhu

tetap serta hasil yang terdeteksi berupa presipitasi ataupun pendar

fluoresensi yang dapat diamati secara mudah maka WHO telah

merekomendasi an metode LAMP sebagai uji diagnosis rutin TB

pada laboratoriu rujukan di sejumlah negara (WHO, 2007).

Amplifi si DNA pada suhu tetap menyebabkan metode

LAMP dapat m manfaatkan instrumen sederhana seperti: water

bath (penanga air) atau heating block (pelat pemanas).

Interpretasi has 1 juga dapat dilakukan secara sederhana yaitu

dengan menggu akan mata telanjang atau sinar UV sederhana.

Berdasarkan re rensi ini maka teknik LAMP merupakan suatu

4

I

metode yang sangat menjanjikan untuk dikembangkan lebih

lanjut di negara-negara dengan sumber daya terbatas, seperti

halnya di Indonesia.

Optimasi metode LAMP untuk diagnostik TB telah

dilaksanakan di Badan Litbangkes dari tahun 2008-2010.

Sejumlah hasil optimasi yang diperoleh adalah:

a. Protokol kerja metode LAMP yang sudah teroptimasi

menggunakan sarana dan prasarana laboratorium di

Indonesia (Laboratorium Bakteriologi, Pusat Biomedis dan

Teknologi Dasar Kesehatan - Balitbangkes);

b. Primer LAMP-TB hasil karakterisasi sekuens highly

conserved bakteri Mtb yang bersirkulasi di wilayah Indonesia

(analisis sampel bakteri Mtb dari 16 ibukota provinsi di

Indonesia);

Berdasarkan hasil tersebut dan untuk memudahkan berbagai

pihak melaksanakan uji LAMP-TB di Indonesia, maka kemudian

disusun buku PEDOMAN OPERASIONAL BAKU UJI

DIAGNOSTIK MOLEKULER LOOP MEDIATED

ISOTHERMAL AMPLIFICATION (LAMP) UNTUK

DETEKSI CEPAT TB PARU di INDONESIA.

5

1.2. Tujuan Penulisan

Umum:

Menyediak n tenaga laboratorium yang memiliki

kemampua melaksanakan uji diagnostik molekuler

LAMP-TB di fasilitas kesehatan masyarakat di seluruh

Indonesia

Khusus:

ne ngan menggunakan standard baku yang sesuai.

Memperol tenaga laboratorium yang memahami prinsip

kerja LAMP -TB pada saat melaksanakan uji diagnostik TB

secara mol kuler;

1.3. Luaran

Pencapai Tujuan Penulisan:

Dengan lah disusurmya buku pedoman, maka akan

diperoleh tenaga laboratorium yang akan mampu

memaha i seluruh prinsip kerja metode LAMP untuk

deteksi ce at TB di Indonesia.

6

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Mycobacterium tuberkulosis (Mtb)

2.1.1. Taksonomi

Penentuan taksonomi pada organisma dimulai dari taksa

terbesar sampai taksa terkecil, yaitu: domain-kingdom-phylum-

order-class-family-genus-species (Alberts, et.al., 2002;

Mandell, et.al., 2005). Mycobacterium tuberculosis (Mtb)

berdasarkan aturan taksonomi memiliki urutan taksa sebagai

berikut, yaitu Domain: Bacteria, Phylum: Actinobacteria, Kelas:

Actinobacteridae, Ordo: Actinomycetales, Famili:

Mycobacteriaceae, Genus: Mycobacterium, Species:

Mycobacterium tuberculosis complex dan Subspesies:

Mycobacterium tuberculosis (Driscoll, et.al., 2002; Nester, et.al.,

2007).

Merujuk pada taksonomi bakteria dari NCBI (National

Center for Biotechnology Information), yang menggunakan

phylogenetic tree berdasarkan 16S ribosomal RNA, maka Mtb

dikelompokkan kedalam Actinobacteria karena berkaitan

langsung dengan kandungan (G + C)nya yang tinggi , berada

dalam kelompok yang sama dengan Bacillus/ Clostridium pada

taksa Firmicutes, dan termasuk bakteri Gram-positive.

7

Beberap penelitian terakhir kemudian menunjukkan

bahwa Mtb seb tulnya lebih memiliki sifat bakteri Gram-negatif

dibandingkan ram-positif (Conville, et.al., 2007). Observasi

klinis yang dil kukan menggambarkan suseptibilitas Mtb lebih

tinggi terhada antibiotik Gram-negatif seperti streptomicin,

siprofloksasin n amikasin dibandingkan antibiotik Gram-positif

spesifik seperti beta-laktam. Hal ini menyebabkan kelompok

Actinomycetes ang merupakan ordo Mtb diusulkan ditempatkan

tersendiri ant a bakteri Gram-positif dan Gram-negatif

(Lefe'vre, et.al. 2004). Kekhususan sifat Mtb ini terkait dengan

karakteristik da struktur dan dinding sel bakteri.

2.1.2. Struktur linding sel dan pewarnaan sel

Bakteri tb berbentuk batang ramping dengan struktur

dinding sel yang kaya akan lipid dan protein, terdiri dari

peptidoglikan d an sejumlah besar glikolipid seperti asam mikolat,

phosphatidyinos tol mannosides (PIM), kompleks

arabinogalactan dan lipoarabinomannan (Murray, et.al., 2005).

Dinding sel t' ak dilapisi eksotoksin maupun endotoksin.

Struktur dasar inding sel meski tipikal untuk bakteri gram

positif, yaitu b gian dalam membran plasma memiliki lapisan

peptidoglikan s rta tidak memiliki membran luar, strukturnya

jauh lebih komp eks dibanding bakteri gram positif lainnya. Oleh

8

karena itu Mtb sering dikatakan bersifat gram positif lemah

(Nester, et.al., 2007; Park, et.al., 2008). Kekhususan struktur

serta karakteristik dari dinding sel bakteri Mtb dapat dilihat pada

gambar 2.1. berikut:

A

GRAM, I GRAM -)

Gambar 2.1. A. Struktur dinding sel Mycobacterium tuberculosis.B.Karakteristik dinding sel bakteri (htpp//Doc

Kaiser's Microbiology Hoare Page, 2010).

Struktur unik dari dinding sel menyebabkan bakteri dapat

menyerap pewarnaan merah (karbol fukhsin) dengan kuat dan

tidak luntur meski dicuci oleh asam alkohol dan diwarnai dengan

biru metilen. Hanya sedikit bakteri yang memiliki karakteristik

tahan asam seperti ini, misalnya: Nocardia, sementara bakteri

lain akan menjadi biru. Sifat ini dimanfaatkan untuk

membedakan Mycobacterium dari bakteri lain dengan pewarnaan

B

9

yang disebut p warnaan Bakteri Tahan Asam (BTA), misalnya

dengan pewa aan Ziehl Neelsen (ZN) atau auramin (Nester,

et.al., 2007; A ab, et. al., 2009).

2.1.3. Perkem angbiakan Sel

Hal lain yang menjadi kekhususan bakteri Mtb adalah

perkembangbi an sel yang lambat, dimana memerlukan waktu

24-32 jam un k dapat berlipat dua (Watson, et.al., 2004).

Pembelahan yang lambat terkait dengan lapisan lemak pada

dinding sel yang tebal sehingga menghambat nutrisi masuk ke

dalam sel (M ndel, et.al., 2005; Nester, et.al., 2007). Meski

membutuhkan kondisi aerob untuk berkembang biak, tetapi

bakteri memili ' potensi genetik dan kemampuan biokimiawi

untuk membe tuk enzim yang berperan dalam metabolisme

anaerob. Hal i menyebabkan bakteri mudah beradaptasi dengan

lingkungan dan mampu bertahan hidup dalam jangka waktu yang

sangat lama intuk menunggu kondisi optimum tercapai.

Perkembangbia an sel bakteri Mtb menghasilkan koloni dengan

reaksi biokimia khas (Hett; et.al., 2008).

2.2. Genome ycobacterium tuberculosis

Dalam i tilah molekuler, definisi gen menjadi penting

karena karakte istik struktur molekuler spesies ditentukan oleh

10

gen. Secara umum, gen adalah sekuens asam nukleat yang

berperan untuk mengkode satu atau lebih produk protein. Terkait

dengan daerah coding yang biasa disebut ekson, definisi gen juga

termasuk daerah kontrol dan intron. Spesies bakteri (prokariot)

umumnya tidak memiliki daerah intron, dimana ekson tersusun

rapat sepanjang DNA genome sebagai daerah coding (Lodish,

etal., 2005; Watson, etal., 2002).

Studi genomik menyeluruh telah berhasil memetakan

secara komplit genome Mtb H37Rv yang terdiri dari 4.411.529

bp (NCBI Reference Sequence: NC_000962.2) dengan tipe

kromosom berbentuk sirkular yang dapat dilihat pada gambar 2.2.

DR

Gambar 2.2.Peta sirkular kromosom Mycobacterium tuberculosisH37Rv dimana terlihat daerah conserved pada gentipe RNA (tRNA berwarna biru dan merah muda)dan di daerah Direct Repeat (kubus merah muda)(Cole, et.al., 1998).

Penyusunan peta sirkular mampu menjelaskan keragaman

dari berbagai tipe Mtb yang ada. Istilah complex kemudian

11

muncul merujuk pada sejumlah galur dari genus Mycobacterium

yang memiliki arakteristik specimen klinis yang sulit untuk

dibedakan den an galur Mtb. Seluruh galur kemudian

dimasukkan dal m satu kelompok spesies yang disebut Mtb

complex (March tti, et.al., 1997).

Mtb comp ex pada awalnya terdiri dari sub spesies: M.

tuberculosis, M bovis, M bovis Bacille Calmette-Guerin (BCG),

M. africanum, M.microti dan Mtuberculosis subsp.caprae

subsp.nov. seper i terlihat pada gambar 2.3 (Costello, et.al., 1999;

van Der Zanden, 2002)."Ancestor'

R09

M. tuberculosis ( n = 10), M. africanum (n = 4)Principal genetic group 1, 2, 3

M. africanum (n = 1)Principal

_^^RD7, RD8 genetic group I

,RD10

RD5, RD6RDI2, RD13

N-RD25

R D4

M. microti (n=7), seal bacillus (n=10), U. africanum(n=S)Principal genetic group 1

1-* M. caprae (n = 10)Principal genetic group 1

M. bovis (n= 16)Principal genetic group t

Gambar 2.3. F' ogenetik Mtb complex yang diusulkan pertamakalidi ana setiap anggota spesies berasal dari nenekm yang (ancestor) yang sama, dengan daerah dise elah kiri menunjukkan wilayah delesi berulangp a genome yang menjadi penanda untukm mbedakan setiap subspesies. http://bioweb.u lax.edu/ bio203/s2007/millard ashl/ classification.ht

12

Perkembangan penelitian kemudian menunjukkan adanya

subspesies barn yang memiliki sekuens gen yang berasal dari gen

nenek moyang (common ancestor) yang sama dengan Mtb

complex, yaitu M canettii, dan M pinnipedii (Somoskovi, et.al.,

2007) serta yang terbaru M smegmatis (Coros, et.al., 2008; Jain,

et. al; 2002). Pengenalan terhadap gen yang conserved terhadap

spesies Mtb complex yang akan diidentifikasi menjadi penting

dalam langkah pengembangan suatu metode diagnostik

molekuler untuk deteksi TB.

2.3. Uji Diagnostik Tuberkulosis Paru

Secara garis besar, WHO sudah menetapkan uji diagnostik

untuk kasus TB menggunakan pendekatan dua metode, yaitu

metode cara tidak langsung dan cara langsung (WHO, 2007).

Uji diagnostik cara tidak langsung (Indirect Method)

ditujukan untuk mendeteksi reaksi antibodi serta reaksi biokimia

dari hospes terhadap infeksi bakteri Mtb (Pratt, et.al., 2007;

Kobashi, et.al., 2009). Sedangkan uji diagnostik cara langsung

merupakan uji diagnostik yang ditujukan untuk mengidentifikasi

bakteri Mtb berikut komponen penyusunnya yang terdapat di

dalam tubuh hospes (Pai, et.al., 2006). Skema pada gambar 2.4.

13

dapat menggam rkan prinsip yang digunakan dalam penetapan

uji diagnostik ka is TB.

Metode Lan sung

Deteksi bak eri dankomponenn a

DiagnostikMolekuler TB

Metode tidak Langsung

Deteksi antibodi hospes

Konfirmasi PCR

Gambar 2 .4. Ske a pembagian metode uji diagnostik molekulerTB Modifikasi :WH ,2007;http//new_diagnostik_modalities.TB.II415 224.pdf.)

2.4. Uji Diagno ik Cara Langsung (Direct Method)

Beberapa c ntoh uji diagnostik cara langsung yang umum

digunakan untuk mendeteksi kasus TB adalah uji mikroskopis

BTA menggunak pewamaan spesifik, uji pertumbuhan bakteri

pads media kul r, uji phage dan uji identifikasi asam nukleat

oakteri.

14

2.5. Uji diagnostik molekuler Loop-mediated isothermal

amplification (LAMP)

2.5.1. Metode amplifikasi asam nukleat

Metode Loop-mediated Isothermal Amplification

(LAMP) merupakan metode uji diagnostik molekuler cara

langsung berdasarkan uji identifikasi asam nukleat bakteri yang

mulai dikembangkan pada tahun 1999 oleh Notomi, et.al.

Pengembangan metode mengacu pada beberapa metode

amplifikasi asam nukleat sebelumnya yang efisien dan memiliki

kemudahan teknologi, yaitu dari metode: nucleic acid sequence-

based amplification (NASBA), self-sustained sequence

replication (3SR), dan strand displacement amplification (SDA).

Metode NASBA dan 3SR menerapkan amplikasi asam nukleat

pada suhu tetap dengan teknik pemanfaatan set primer

transcription dan reverse transcription sementara metode SDA

juga meniadakan siklus denaturasi dengan memanfaatkan

penyediaan enzim restriksi dan substrat DNA. Ketiga metode

memungkinkan proses amplifikasi berlangsung tanpa perlu

menunggu suhu denaturasi serta dapat meniadakan instrument

thermocycler dalam pelaksanaan reaksi. Gabungan dari ketiga

mekanisme kerja ini kemudian menjadi prinsip kerja dari metode

LAMP.

15

2.5.2 Prinsip Ke 'a LAMP

Metode AMP merupakan metode modifikasi amplifikasi

PCR pada suhu etap dengan menggunakan empat sampai enam

pasang primer ari gen dengan sekuens highly conserved pada

spesies target. 1 rimer yang digunakan terdiri dari inner primer

(FIP = F1, F2), backward primer (BIP = B 1, B2), outer primer

(F3 dan B3) da untuk mempercepat reaksi dapat pula dengan

cara menamba an sekuens loop primer (loop F & B) (Notomi,

et.al., 2000; Na amine, et.al., Iwamoto, et.al., 2003; Poon, et.al.,

2005).

Primer AMP mencakup Forward Inner Primer (FIP),

yang terdiri dari aerah F2 (di bagian 3' ujung) yang merupakan

komplementer erah F2c serta daerah Flc di bagian 5' ujung

dari sekuens ya g sama, disebut primer FIP dan merupakan

gabungan dari p 'mer F2 dan F1. Forward Outer Primer, terdiri

dari daerah F3 yang merupakan komplementer daerah F3c,

dikenal juga de gan primer F3. Backward Inner Primer (BIP),

terdiri dari dae ah B2 (di bagian 3' ujung) yang merupakan

komplementer d erah B2c serta daerah B 1 c di bagian 5' ujung

dari sekuens yar g sama, disebut primer BIP. Backward Outer

Primer, terdiri ari daerah B3 yang merupakan komplementer

16

daerah B3c, disebut primer B3. Untuk mempercepat reaksi dapat

ditambahkan untai komplementari dari BIP-linked dan FIP-linked

untuk membentuk struktur stem-loops (Loop-B dan Loop-F).

Struktur primer ini akan menjadi struktur awal pembentukan

siklus amplifikasi pada metode LAMP (Hase, et.al., 2007;

EIKEN, 2007; Liang, et.al., 2009).

Teknik LAMP mengidentifikasi sekuens bakteri dengan

mekanisme rolling circle amplification (RCA) yang merupakan

metode gabungan dari multiplex PCR dan nested PCR, dimana

menggunakan minimal 2 set primer (multi primer) serta outer

primer (standard primer) dan inner primer (nested primer) serta

reagen amplifikasi yang sesuai (Kuboki, et.al., 2003; Rovira,

et.al., 2009; Thekisoe, et.al., 2009).

Prinsip untuk mendesain primer LAMP adalah memastikan

jarak daerah primer dari Ujung 5' di F2 ke daerah B2 sekitar 120-

180bp, dan jarak antara F2 dan F3 sebagaimana B2 dan B3

adalah 0-20bp. Jarak untuk daerah pembentuk loop (Ujung 5' di

F2 ke Ujung 3' di F1, dan Ujung 5' di B2 ke Ujung 3' di B1)

sebesar 40-60bp (EIKEN, 2007). Tahap-tahap pada prinsip kerja

LAMP dapat dilihat pada gambar 2.5.

17

F F, N, 1 1, n I u: I I

15 F1 II q I, a:, 11I'

F!r l1c l'Ic III 112 11!

.I^ I U `1 P/1^^enx** •vlw....,.nwm

F!c I2, Flr

F) F2 FI

III 8'_ 11!

.ter - iIII. B2r B!r

I!, IN IIc BI B: B!IA ^ ^^ .ter. .^

,VirV. FI BI3N}<Bk

III B2 B!iiipo 1-5,

I! I: I! BI,B2,Bk

151 w^ r. 11r F2 FI HIr x2.111

-.

FIc F2 FI N11 R2c Ric

11!

FI BIr B2,&kF2(^- .^. -1•

7B! VM1wr

BZ Bk!'RII

1̂'Ic IIIis) F2r t J112

FI Ill.

1 L l 1°'t p

Gambar 2.5. M kanisme amplifikasi LAMP: 1. Untai gandadal keadaaan dynamic equilibrium; suhu sekitar65° ; annealing sekuens komplemen oleh FIP;dila jutkan inisiasi sintesis DNA oleh DNApol erase membentuk untai tunggal DNA baru; 2.DNA polymerase menginisiasi sintesis DNAko lemen dari template DNA; dimulai dari ujung3' F pada FIP; 3. Primer F3 mengannealing daerahF3c diluar FIP dan target DNA, lalu menginisisasisint sis untai DNA baru dan melepas untai barn dari

18

FIP; 4 . Untai ganda terbentuk sebagai hasil sintesaF3 Primer terhadap template DNA; 5. Untaikomplementer dari FIP dilepas dalam bentuktunggal karena akan bergabung dengan untai DNAyang disintesis oleh primer F3. Kemudian, bentuk

untai tunggal membentuk formasi struktur stem-loopdi ujung 5' karena adanya komplementer dari daerahF 1 c dan Fl; 6. Untai DNA tunggal di (5) bersifatsebagai template yang dengan DNA BIP- initiated,juga akan membentuk untai subsekuen dari sintesisB3-primer DNA. Annealing oleh BIP bertujuanmembentuk untai DNA di tahap (5). Dari ujung 3'

BIP sintesis komplementer DNA dimulai . Setelahproses ini, DNA kembali dari struktur loop kebentuk struktur linear . Saat annealing B3 Primerkeluar dari BIP, kemudian inisiasi dimulai di ujung3' dengan adanya DNA polymerase. Sintesis DNAdiganti BIP dan dilepas dalam bentuk untai tunggalsebelum sintesis DNA oleh Primer B3; 7. Untaiganda DNA terbentuk seperti gambar (6); 8. Untaikomplementari dari BIP-linked tejadi di tahap (6)dan membentuk struktur stem-loops di setiap ujung,yang menyerupai struktur halter. Struktur inimenjadi struktur awal pembentukan siklusamplifikasi pada metode LAMP; 9-11. Amplfikasiberulang pada suhu tetap(file:///C:/Documents%2Oand%2OSettings/FAST/My%20Documents/data/LAMP/ principle-LAMP%20EIKEN.htm)

Aplikasi metode LAMP untuk deteksi TB telah diuji

menggunakan primer set dari beberapa gen penyandi , yaitu gen

19

protein gyrB (Iwamoto, et.al., 2003), molekul 16S rRNA

(Yamaguchi, A al., 2006; Pandey, et.al., 2008) dan rimM (Zhu,

et.al., 2009).

Optimasi yang dilakukan di Badan Litbangkes dari tahun

2009-2010 ter adap metode LAMP menggunakan primer gyr B

(Iwamoto, et.a ., 2003) diujikan terhadap 122 sampel spesimen

dahak pasien TB Indonesia. Uji dilakukan menggunakan

peralatan lab atorium sederhana; yaitu untuk instrumen

amplifikasi ad ah penangas air dan sistem deteksi menggunakan

lampu uv fluo esensi, memberikan sensitifitas hasil (positivity

rate) sebesar 4,2% (114/121), yang sekaligus membuktikan

diagnostik LAMP dapat diaplikasi pada pasien TB di Indonesia.

Pengemb ngan desain primer LAMP berdasarkan

karakteristik akteri Mtb di Indonesia (sequence highly

conserved) ke iudian dilakukan dan diperoleh primer LAMP

spesifik Indon sia. Uji optimasi primer gyrB LAMP Indonesia

pada serial laru an DNA Mtb H37Rv menunjukkan bahwa primer

set dapat meng mplifikasi sampai dengan [100 fg/pl] DNA Mtb

H37Rv. Uji o timasi primer gyrB LAMP Indonesia kemudian

dilakukan ter dap 85 sampel spesimen dahak pasien TB

Indonesia, yang merupakan bagian dari sampel uji validasi

LAMP, memb rikan hasil sensitifitas atau positivity rate lebih

kurang 97,6% (82/84), dimana basil ini membuktikan bahwa

20

primer set LAMP Indonesia mampu mengenali seluruh tipe dan

sub-tipe Mtb di Indonesia dan lebih sensitif dibanding primer

gyrB LAMP (Iwamoto , et.al.) yang terhadap sampel yang sama

memberikan nilai sensitifitas atau positivity rate lebih kurang

95,2% (80/84).

21

BAB 3

METODE UJI DIAGNOSTIK LAMP-TB

3.1. Prepara i Sampel Dahak

Sampel dahak yang diterima langsung didekontaminasi

untuk mengh langkan berbagai bakteri lain yang dapat

menyebabkan ampel rusak . Dekontaminasi dilakukan dengan

metode bake O, 2000). Pekerjaan dilaksanakan di dalam

Biosafety Cabi et (BSC) Tipe IIA menggunakan Alat Pelindung

Diri (APD) s suai standard Good Microbiological Practice

(GMP).

Alat: BSC Type IIA; pot dahak standard; tabung falcon bertutup

ukuran 0 mL; Vortex mixer; Sentrifuse; Incubator; paper

work SC; tang penjepit; Mikropipet; pipet pasteur;

wadah 1 erisi disinfektan; APD: Jas Lab, Masker N95 atau

Double asker Operasi; sarung tangan.

Bahan: Larut n N-acetylsystein (NALC) / NaOH dan Buffer

fosfat teril pH 6,8; Cairan disinfektan (Lysol/Alkohol

70%).

22

Gambar 3.1 Sampel dahak yang sudah mengalami prosesdekontaminasi

Prosedur Kerja:

1. Sejumlah sampel dahak volume 5-10 mL dipindahkan ke

dalam tabung falcon bertutup ukuran 50 mL, kemudian

ditambahkan campuran N-acetylsystein (NALC)/ NaOH segar

dalam jumlah sama.

2. Tabung kemudian ditutup rapat , lalu sampel dihomogenkan

dengan vortex mixer selama 5-20 detik.

3. Tabung kemudian dibalik , tunggu ± 15-20 menit, lalu

ditambahkan buffer fosfat steril pH 6,8 hingga volume 45 ml,

kemudian tabung dikocok manual.

4. Ditunggu sampai aerosol hilang.

5. Sampel lalu disentrifuge dengan kecepatan 3000 g selama 15

menit , lalu sentrifuse didiamkan selama ± 5-10 menit sebelum

tutup dibuka.

23

6. Supernatan dalam tabung lalu dibuang dan endapan di-

resuspensi engan buffer fosfat memakai pipet pasteur steril

untuk mem eroleh volume 1-3 mL.

7. Tabung dis pan di dalam inkubator pada suhu 37°C selama

15 menit d n siap untuk digunakan kemudian.

Catatan: Tab g dan tutupnya selalu didekontaminasi dengan

disinf ktan tuberkulosidal (Lysol/Alkohol 70%)

sebelum keluar dari BSC.

3.2. Preparasi an Ekstraksi DNA dari Sampel Dahak

Sampel ahak yang sudah didekontaminasi kemudian

disiapkan untu proses ekstraksi DNA. Metode yang digunakan

adalah modifik si dari metode baku ekstraksi DNA menggunakan

reagen kit. P kerjaan dilakukan di dalam BSC Tipe IIA

menggunakan PD sesuai standard GMP.

Alat: BSC T e IIA; Tabung eppendorf; Tabung spin column ;

Mikro ipet ; Vortex mixer; spin down; Sentrifuge;

Incub tor; Wadah (sampah / limbah/ disinfektan).

Bahan: Qiamr DNA Mini Kit ekstraksi

24

(a) (b) (c)

r

(h) (i)

G)Gambar 3.2 Proses Ekstraksi DNA dari Sampel Dahak. (a)

Persiapan reagen dan preparasai sampel dahak, (b)penambahan lysis buffer dan proteinase K kedalam sampel (c) homogenisasi dengan vortexmixer (d) inkubasi dengan heating block (e)

25

emindahan sampel ke spin coulom (f)enambahan larutan AW 1 (g) penambahan larutan

W2 (h) penambahan buffer AE untuk melarutkanNA yang diperoleh dari proses ekstraksi (i)ntrifuse 8000 rpm selama 1 menit (j) DNA

t rlarut dalam buffer.

Prosedur kerja:1. Tabung e pendorf 1 , 5 mL disiapkan sesuai jumlah sampel

sputum y ng akan diekstraksi.

2. Pada tab g dipindahkan sejumlah 200 µL sampel dahak

yang to h didekontaminasi dengan N-acetylsystein

(NALC)/ NaOH) dan sejumlah 400 µL PBS.

3. Larutan icampur menggunakan vortex mixer , lalu spin

down un k mengendapkan aerosol, dilanjutkan dengan

inkubasi da suhu 37 °C selama 1 jam.

4. Kemudia pada tabung eppendorf 1,5 mL yang barn,

ditambah an 200 µL buffer AL, 200 µL campuran

sputum-PBS yang telah diinkubasi dan sejumlah 20 µL

proteinas K.

5. Larutan ihomogenkan dengan vortex mixer beberapa

detik, ke udian dilakukan spin down untuk mengendapkan

aerosol.

26

6. Tabung kemudian diinkubasi kembali selama 30 menit pada

suhu 56 °C, dan 15 menit pada suhu 95 °C.

7. Kedalam tabung kemudian ditambahkan 200 gL alkohol

absolut, dihomogenkan kembali dengan vortex mixer lalu

spin down beberapa saat untuk mengendapkan aerosol.

8. Larutan dalam tabung eppendorf kemudian dipindahkan ke

dalarn spin column DNA. Tabung spin column disentrifuse

selama 1 menit pada 8000 rpm, lalu ganti tabung

penampung bagian bawah (collection tube).

9. Pada tabung spin column barn ditambahkan larutan buffer

AWl sejumlah 500 µL, kemudian disentrifuge 8000 rpm

selama 1 menit, lalu ganti kembali tabung penampung

bagian bawah (collection tube).

10. Pada tabung spin column barn ditambahkan larutan buffer

AW2 sejumlah 500 µL, sentrifuge kembali 14.000 rpm

selama 3 menit.

11. Tabung penampung bawah kemudian diganti dengan tabung

eppendorf 1.500 µL.

12. Kedalam tabung ditambahkan 150 µL Buffer AE, lalu

diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit.

13. Sentrifuge 8000 rpm selama 1 menit, lalu tabung spin

dibuang dan larutan supernatan yang terkumpul adalah

DNA dari sampel.

27

14. Hasil eks aksi DNA kemudian disimpan pada suhu -80°C

sebelum gunakan lebih lanjut.

15. Uji kemu ian hasil dapat dilakukan menggunakan kontrol

DNA Mt H37Rv pada gel agarose I%.

Catatan: Tabu g dan tutupnya selalu didekontaminasi dengan

disin ektan tuberkulosidal (Lysol/Alkohol 70%)

sebel m keluar dari BSC.

3.3. Uji LA P-TB

Sampel NA yang sudah diekstraksi kemudian disiapkan

untuk proses dentifikasi bakteri Mycobacterium tubeculosis

menggunakan etode modifikasi Loop-mediated Isothermal

Amplification ( AMP) (Iwamoto , 2003 ). Pekerjaan dilaksanakan

di dalam BSC Tipe IIA menggunakan APD sesuai standard

GMP.

Alat: Biosafety Cabinet (BSC) Type IIA; tabung tube nuclease

free for P R; mikropipet ; vortex mixer ; spin down; wadah

sampah/li bah ; penangas air; lampu UV; APD (jas

laboratori m; masker ; sarung tangan).

28

Bahan:

1. Sampel lysat DNA Pasien TB masing-masing 2,0 µl.

2. LoopAmp DNA amplification kit (Eiken Chemical Co Ltd.)

terdiri dari : 12,5-µ12x reaction mix [40 mM Tris-HCI pH8.8;

20 mM KCI; 16 mM MgSO4 ; 20 mM (NH4)2SO4; 0,2%

Tween20; 1,6 M Betaine; 2,8 mM dNTPs]; Bst DNA

polymerise ; Larutan Fluoresence Detection Reaction (Eiken

Chemical Co Ltd.)

3. Distille Water secukupnya.

4. Primer set LAMP-TB (Balitbangkes, 2010) yang terdiri dari 6

pasang primer:

F3; B3; FIP; BIP ; dan Loop F serta Loop B.

5. Primer set LAMP-TB komersial (Iwamoto, 2003 ), dengan

gen target gyrB dari genome Mycobacterium tuberculosis,

sebagai kontrol primer:

Primer F3 : GCGATATCTGGTGGTCTG;

Primer B3 : CCGTGGTTTCGAAAACAGC;

Primer FIP: AGACCACTCGTACCCGTCGCCGGTGGTT

AACGCGCTAT;

Primer BIP: ATGAGAAGTCGGAACCCCTGGGACCGTT

GACCCCGTCTTC;

Primer Loop F: AACTAGAGCTGAAGCTCGG;

Primer Loop B: CCTCAAGCAAGGGGCG

29

1`

i h

Gambar 3.3. Proses mixture reagen dan amplifikasi LAMP-TBdengan meng nakan waterbath/heatblock a. Preparasi reagenmix, b.proses ix reagen FIP, BIP, F3, B3, Loop F, Loop Bdihomogenkan. c. spin down. d. inkubasi pada suhu 95°C 3,5menit. e. pen bahan RM (reaction mix), FD (fluorescencedetection), Bs DNA polymerase, DW (distilled water), f.campuran reag dan sampel.

Berpendar : LAMP positif

Tidak berpendar : LAMP negatif

(a) (b)

Gambar 3.4. 1 roses Amplifikasi LAMP-TB (a) Inkubasi suhu2°C 60 menit (proses amplifikasi) dan suhu°C selama 2 menit (inaktivasi) (b) deteksi hasil

ibawah lampu UV

30

Prosedur kerja:

1. Tabung berisi DNA hasil ekstraksi disiapkan. Apabila

menggunakan sampel DNA yang sudah disimpan

sebelumnya, maka sampel DNA harus dikeluarkan terlebih

dahulu dari lemari pembeku (-80°C) dan dipindahkan ke

dalam lemari pendingin dengan suhu (2-8°C) sebelum dapat

digunakan lebih lanjut.

2. Siapkan tabung PCR ukuran 0,2 mL.

3. Kemudian ke dalam tabung ditambahkan larutan inner primer

FIP dan BIP masing-masing 40 pmol;

4. Tambahkan outers primer F3 dan B3 masing-masing 5 pmol,

5. Tambahkan loop primers yaitu loop F and loop B masing-

masing 20 pmol;

6. Homogenkan larutan dengan vortex mixer lalu spin down

beberapa saat.

7. Kemudian dilakukan heating shock pada suhu 95°C selama

3,5 menit.

8. Kemudian ditambahkan larutan 2xReaksi Mix (RM) dari

Loopamp DNA kit sejumlah 12,5 ul.

9. Larutan di atas kemudian ditambahkan Fluorescence

Detection (FD) sebanyak 0,8 µ1 dan Bst DNA polymerase

sebanyak 1,0 µ1

31

10. Terakhir la tan ditambahkan Distilled Water sehingga total

volume me ' adi 23 µl.

11. Larutan dih mogenkan kembali dengan vortex mixer lalu spin

down beber pa saat.

12. Kedalam la tan kemudian ditambahkan 2,0 pl DNA sampel

(sampel lys t DNA pasien TB di Indonesia).

13. Disiapkan juga tabung berisi kontrol positif dengan

menambah an 2,0 .tl DNA sampel dari lysat DNA Mtb

H37Rv yan disertakan dalam setiap tahap reaksi.

14. Disiapkan j ga tabung berisi kontrol negatif adalah larutan

2xRM+Bst DNA polymerase+DW+FD yang disertakan

dalam setia tahap reaksi.

15. Setelah la tan sampel , kontrol positif dan kontrol negatif

siap maka roses dilanjutkan dengan reaksi amplifikasi pada

suhu 62°C elama 60 menit menggunakan alat penangas air.

16. Kemudian ilanjutkan dengan reaksi inaktivasi pada suhu 80

°C selama menit menggunakan heating block.

Pengamatan ha il:

Identifikasi ha it dilakukan menggunakan lampu sinar UV

dengan panjan gelombang 256/ 360 nm, dimana hasil positif

ditunjukkan de gan adanya warnahuoresensi pada sampel dalam

tabung yang po itif mengandung bakteri Mth.

32

Prinsip penga ►natan hasil:

Kontrol positif merupakan baku pembanding untuk validitas

amplifikasi reagen, sehingga intensitas pendar tidak menjadi

acuan untuk hasil positif, tetapi hanya untuk validasi reaksi

amplifikasi.

Kontrol negatif merupakan baku pembanding untuk pendar

(fluoresensi) dari hasil reaksi positif. Bila terjadi pendar, meski

intensitas lemah tetapi di atas intensitas kontrol negatif, maka uji

LAMP harus dilakukan pengulangan (duplo) dan bila pendar

tetap terjadi maka hasil reaksi dinyatakan positif.

Persyaratan Kerj a:

Pekerjaan dilaksanakan di laboratorium diagnostik yang memiliki

peralatan BSC tipe IIA untuk melakukan proses dekontaminasi

dan ekstraksi DNA dari sampel dahak pasien TB. Pelaksanaan

kerja dilakukan di laboratorium dengan menggunakan prinsip

GMP sesuai standard pemeriksaan TB (WHO, 2007)

33

BAB 4

DAFTAR RUJUKAN

Achkar, J.M., J ny-Avital, E., Yu, X., Burger, S., Leibert, E.,Bilder, P.W., Almo, S.C., Casadevall, A. and Laal, S. 2010.Antibodies against Immunodominant Antigens ofMycobacteri m tuberculosis in Subjects with SuspectedTuberculosis in the United States Compared by HIV Status.Clinical And Vaccine Immunology. 17 (3): 384-392.

Aftab, R., Amj d, F. and Khurshid, R. 2009. Detection OfMycobacterium Tuberculosis In Clinical Samples By SmearAnd Culture. Pak J Physiol. 5(2). 27-30.

Alberts, B., Jo son, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K andWalter, P. 2(02. Molecular Biology of The Cell. Fourth ed.htti)://www.C eocities.com/ zrnet76/(8 of 8)17/10/200507:37:18.

Boehme, C.C., t.al. 2007. Operational Feasibility of UsingLoop-Mediated Isothermal Amplificatin for Diagnosis ofPulmonary Tuberculosis in Microscopy Centers ofDeveloping Countries. J. Clin. Microbiology. 45: 1936 -1940.

Conville, P.S. and Witebsky, F.G. 2007. Analysis of MultipleDiffering Copies of the 16S rRNA Gene in Five ClinicalIsolates and Three Type Strains of Nocardia Species andImplications or Species Assignment J. Clin. Microbiology.45: 1146-115'..

Coros, A., DeCo no, E. and Derbyshirel, K.M. 2008. IS6110, aMycobacterium tuberculosis Complex-Specific InsertionSequence, is lso present in the Genome of Mycobacteriumsmegmatis, uggestive of Lateral Gene Transfer among

34

Mycobacterial Species. Journal Of Bacteriology. 190(9):3408-3410.

Costello, E., O'grady, D., Flynn, 0., O'brien, R., Rogers, M.,Quigley, F., Egan, J. and Griffin, J. 1999. Study of RestrictionFragment Length Polymorphism Analysis and Spoligotypingfor Epidemiological Investigation of Mycobacterium bovisInfection. Journal of Clinical Microbiology. 37(10): 3217-

3222.

Driscoll, JR., Bifani, PJ., Mathema, B., McGarry, MA., Zickas,GM., Kreiswirth, BN., and Taber, HW. 2002. Spoligologos:A Bioinformatic Approach to Displaying and Analyzing

Mycobacterium tuberculosis Data. Emerging Infectious

Diseases. 8:1306-1309.

Forbes, B., Sahm, D.F., and Weissfeld, A.S. 2007. Bailey &Scott's: Diagnostic Microbiology. twelfth edition. MOSBYElsevier. Philadelphia. p: 509-478.

Gantz, N.M., Brown, R.B., Berk, S.L., and Myers, J.W. 2006.Manual of Clinical Problems in Infectious Disease: Role ofTuberculin Test. 5t' ed. Philadelphia: Lippincott Williams &Wilkins. 407-411.

Hase, T. 2007. Rapid detection of Mycobacterium tuberculosiscomplex from sputum samples using novel Loop-MediatedIsothermal Amplification. EIKEN Chemical Co., LTD.

Hett, E.C., and Rubin, E.J. 2008. Bacterial Growth and CellDivision: a Mycobacterial Perspective. Microbiology andMolecular Biology Reviews. 72(1): 126-15.

J.C. Palomino. 2005. Nonconventional and new methods in thediagnosis of tuberculosis: feasibility and applicability in thefield. European Respiratory Journal. 26:339-350.

Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K. 2003. Loop-MediatedIsothermal Amplification for Direct Detection of

35

Mycobacteri m tuberculosis Complex, M avium, and Mintracellular in Sputum Samples. J. Clin. Microbiology.41(6): 2616-2622.

Jain, P. and agaraja, V. 2002. An orphan gyrB in theMycobacteri m smegmatis genome uncovered bycomparative enomics. Journal of Genetics. 81(3): 105-110.

Kuboki, N., In ue, N., Sakurai, T., Di Cello, F., Grab, D.J.,Suzuki, H., Sugimoto, C. And Igarashi, I. 2003. Loop-Mediated Is thermal Amplification for Detection AfricanTrypanosom s. J. Clin. Microbiology. 41: 5517-5524.

Lefe'vre, P., et al. 2004. Antimycobacterial activity of syntheticpamamycins Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 54:824-827.

Liang, S., etal. 2009. Development of Loop-Mediated IsothermalAmplificatio Assay for Detection of Entamoeba histolytica.Journal of C in. Microbiology. 47(6): 1892-1895.

Lodish, B., Kais r, M., Scott, K. and Darnell, Z. 2005. MolecularCell Biolo y: Molecular Structure of Genes andChromosomes. 10.3. Mobile DNA. 415-460. e-book Journal.

Mandell, G.L., Bennett, J.E. and Dolin, R. 2005. Principal andPractice of Infectious Diseases. 6`h ed. Philadelphia: ElsevierChurchill Livingstone. (1)42-50; 182- 192; 226-228; 2867-2915.

Marchetti G, Go i A, Catozzi L, Rossi MC, Moroni M, FranzettiF. 1997. C mparison of spoligotyping vs RFLP DNAfingerprinting analysis in M tuberculosis epidemiologicaltyping. Prog am Abstr 4th Conf Retrovir Oppor Infect ConfRetrovir Op or Infect 4th 1997 Wash D C. Jan 22-26; 4th:184 (abstract no. 645).

Mathew, P., Ku o, Y., Vazirani, B., Eng, R.H.K. and Weinstein,M.P. 2002. re Three Sputum Acid-Fast Bacillus Smears

36

Necessary for Discontinuing Tuberculosis Isolation? Journalof Clinical Microbiology. 40 (9): 3482-3484.

Murray, P.R., Rosenthal, K.S., Pfaller, M.A. 2005. MedicalMicrobiology: Mycobacterium. 5th ed. Philadelphia: Elsevier

MOSBY. 297-301

Nester, E.W., Anderson, D.G., Roberts, Jr., C.E. 2007.Microbiology: A Human Perspective. 5th ed. New York: McGraw Hill. 245-263.

Notomi, T., Okyama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T.,Watanabe, K., Amino, N. and Hase, T. 2000. Loop-mediatedIsothermal Amplification of DNA Nucleic Acids Research.28:e63(i-vii).

Pai, M., Kalantri, S. and Dheda, K. 2006. New tools andemerging technologies for the diagnosis of tuberculosis: PartII. Active tuberculosis and drug resistance. Expert review ofmolecular diagnostics. Posted at the eScholarship Repository,

University of California. 6 (3): 423-432.

Pandey, B.D., et.al. 2008. Development of an in-house loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay fordetection of Mycobacterium tuberculosis and evaluation insputum samples of Nepalese patients. Journal of MedicalMicrobiology. 57: 439-443.

Park, J.T. and Uehara, T. 2008. How Bacteria Consume TheirOwn Exoskeletons (Turnover and Recycling of Cell WallPeptidoglycan). American Society for Microbiology:Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72(2): 211-227.

Rovira, A., Abrahante, J., Murtaugh, M. and Munf oz-Zanzi, C.2009. Reverse transcription loop-mediated isothermalamplification for the detection of Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus. J Vet Diagn Invest. 21:350-354.

37

Somoskovi , A., t.al. 2007 . Sequencing of the pncA Gene inMembers of the Mycobacterium tuberculosis Complex HasImportant Diagnostic Applications: Identification of aSpecies-Spec fic pncA Mutation in "Mycobacterium canettii"and the Re l iable and Rapid Predictor of PyrazinamideResistance . J ournal of Clinical Microbiology . 45(2): 595-599.

Thekisoe, O.M. 1 ., Baziel , R.S.B., Coronel-Servian, A.M.,Sugimoto , C. Kawazu , S. and Inoue, N. 2009 . Stability ofLoop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Reagentsand its Amplification Efficiency on Crude TrypanosomeDNA Templates . J. Vet. Med. Sci . 71(4): 471-475.

Van der Zanden, A. 2002 . Spoligotyping , a tool in epidemiology,diagnosis a control of tuberculosis. Thesis . MedicalMicrobiology and Infecious Disease , location Lukas, GelreHospitals , A ldoorn , Bilthoven, The Netherlands.

Watson , J.D., B er , T.A., Bell , S.P., Gann , A., Levine, M. andLosick , R. 2 04 . Molecular Biology of the Gene . fifth ed.Pearson Educ ation , Inc. San Fransisco.

World Health rganization. 2000. Acid -Fast Direct SmearMicroscopy: Laboratory Training Program.

World Health rganization . 2007. New Technologies forTuberculosis Control : A framework for their adoption,introduction d implementation . WHO Library Cataloguing-in-Publicatio Data . France.

Yamaguchi, et. al. hLtp://www.i-tokyo.com/2006/Cl2N/JP2006-061134.shtml

Zhu, Ru-Yi, et.al 2009. Use of Visual Loop-mediated IsothermalAmplification of rimM sequence for Rapid Detection ofMycobacteri tuberculosis and Mycobacterium bovis.Journal of Mi robiological Method. 78: 339-343.

38

Lampiran

LEMBAR KERJA DAN EVALUASI PEMERIKSAANMETODE LAMP

1. Persiapan master mix:Jumlah E spl Jumlah Total

a. Primer FIP (30 pmol) (uL) x = (uL)BIP (30 pmol) (uL) x = (uL)LoopF (15 pmol) (uL) x = (uL)LoopB (15pmol) (uL) x = (uL)F3 (5 pmol) (uL) x = (uL)B3 (5 pmol) (uL) x = (uL)

Tambahkan:b. 2x Reaction Mix (RM)c. Bst DNA polymerased. Fluorescent Detection(FD)e. Distilled Water (DW)

Total

II. Persiapan Kontrol Negatif:

a. 2x RM

(uL) x = (uL)(uL) x = (uL)(uL) x = (uL)(uL) x = (uL)

(uL) x = (uL)

= 12,5 uLb. Bst DNA polymerase = 1,0 uLc. FD = 0,8 uLd. DW = 8,7 uLTotal = 23 uL

III. Template DNATambahkan 2,0 uL sampel isolat ke dalam master mix

IV. Kondisi Reaksi:Reaksi amplifikasi : 62°C; 60 mntReaksi inaktivasi : 80°C; 20 mnt

V. DETEKSI : UV 256/360 nm

39

PROS. DUR KERJA BAKU (SOP) LAMP

1. Persiapan ^'laster Mix (untuk satu reaksi)

1. Campu semua primer

a. Pri er FIP (30 pmol) : 0,3 µl

b. Pri er BIP (30 pmol) : 0,3 µl

c. Pri er Loop F (15 pmol) :0,15 gl

d. Pri er Loop B (15 pmol) :0,15 p le. Pri er F3 (5 pmol) : 0,05 gl

f. Pri er B3 (5 pmol) : 0,05 µl

2. Prime mix dimasukkan ke dalam tabung PCR 0,2m1,

setela primer tercampur dalam satu tabung

kemu ian spin down dan dilanjutkan heating shock

95°C lama 3,5 menit (210 detik)

3. Prime mix kemudian ditambahkan reagen 2x

reacti mix (RM) sebanyak 12,5 pl

4. Maste mix ditambahkan enzim Bst DNA Polymerase

seban ak 1 µl

5. Maste mix ditambahkan Furescent Detection (FD)

seban ak 0,8µl

6. Maste mix ditambahkan Distilled Water (DW)seban ak 7,7 µl

40

II. Persiapan Mix Kontrol Negatif

a 2 R i. x eact on mix : 12,5 µlb. Bst DNA Polymerase : 1 ,0 Alc. Furescent Detection (FD) : 0,8 µld. Distalled Water (DW) : 8,7µl

Campurkan mix kontrol negatif tersebut dalam tube

PCR 0,2 ml, kemudian dilakukan spin down dandilabel.

III. Template DNA: masing-masing ditambahkan 2 gl ke

dalam tabung mix yang sudah dibuat

IV. Kondisi Reaksi

a. Reaksi Amplifikasi : 62°C selama 60

menit dan

b. Reaksi Inaktivasi : 80°C selama 2menit

V. Deteksi visual dilakukan dengan menggunakan UV

dengan panjang gelombang 256/360 nm

41

KERJA UJI DIAGNOSTIK LAMP-TB

k PREPARATION SPUTUM

PROCESSREACTION

Dete tionis

1. PreparationDNAsamples

2. PreparationLoop-ampDNA mix

3. Add DNAsamples

4. Incubation

RESULT

30'

90

Gambar. Ske a Tahap Kerja LAMP (Modifikasi: EIKEN,Litb ngkes)(filc ///C:/Documents%20and%20Settin s/FAST/M20 cuments/data/LAMP/ principle-LAMP%20

EI N.htm)

42