Industrialización de la producción de células madre

Las células madre tienen el potencial de ser una fuente disponible para diferenciarse en muchos tipos de células. Esta propiedad única se puede aprovechar tanto para facilitar y mejorar una serie de procesos de descubrimiento y desarrollo de drogas para fines terapéuticos. La producción a gran escala, "industrializado" de células madre humanas en condiciones bien controladas deberá entregar la cantidad y calidad de células necesarias para apoyar los ensayos clínicos y las actividades de desarrollo de descubrimiento de drogas (Figura 1). Alcanzar este nivel de producción cumpliendo con las normas reglamentarias y rigurosa calidad dependerá de seguir avanzando en cultivo celular y escalado, caracterización, enriquecimiento, depuración y control del proceso en forma segura y rentable ofrecer un suministro consistente y reproducible de células.

Figura 1. Producción a gran escala de células madres es necesaria para apoyar el desarrollo de aplicaciones terapeúticas y el descubrimiento y desarrollo de drogas.

De Escala de Banco a gran escalaEl cultivo celular puede parecer tanto un arte como una ciencia, a veces piden un enfoque de "lo que funciona". Cada tipo de célula tiene necesidades únicas cuando se cultivan in vitro, y las células madre ciertamente no son una excepción. Estas células pluripotentes han ganado una reputación de ser de difícil crecimiento en el cultivo, y en algunos casos se comporta de forma distinta para los investigadores utilizando los mismos medios y protocolos de control. Se agrega a estos desafíos, el hecho de que las células madre pueden diferenciarse en > 200 tipos de células. Controlar ese proceso — por mantener las células en su estado pluripotentes o conducción diferenciación abajo el linaje deseado — requiere la orquestación cuidadosa de las condiciones de cultivo.En un entorno de investigación básica, células crecen típicamente en frascos de cultivo de tejidos en pequeña escala utilizando medios y suplementos de cultivo (p. ej., factores de crecimiento) que no son totalmente definidos o caracterizados y suelen ser de origen animal.

Con frecuencia se cultivan células madre en capas de alimentador de fibroblastos de ratón, que ayuda a mantener el estado indiferenciado. Aunque factores solubles secretados por tales células de ratón ayudan a proporcionar un ambiente adecuado para la proliferación de células madre, uso de capas de alimentador tiene importantes inconvenientes en el cultivo de células madre para aplicaciones clínicas. Capas de alimentador de ratón pueden variar de lote a lote e introducir las proteínas de ratón en un sistema de cultivo, contribuyendo a una más mala definición de las variables de las condiciones de cultivo. En vez de capas de alimentador, los cultivos de células madre pueden ser crecidos en extractos de la matriz extracelular y complementados con medio condicionado de cultivos de fibroblastos de ratón. Este enfoque elimina la necesidad de que las capas de alimentador, pero el sistema de cultivo todavía contienen contaminantes animales y se define de forma incompleta. Las necesidades de los investigadores científicos han impulsado el desarrollo y uso de medios, protocolos y técnicas que, aunque optimizado para el descubrimiento de escala del blanco, no siempre son directamente traducibles a la producción a gran escala, industrializada. Las condiciones de cultivo de escala de blanco pueden ser relativamente mal definidas. En muchos casos, contienen sustancias de origen animal. Procesos utilizados para la caracterización y enriquecimiento simplemente no son prácticos o factibles a escala industrial.Condiciones in vitro para la investigación con células madre deben evolucionar para permitir la industrialización, para esto necesitan para ser mucho más definida, coherente y reproducible (Figura 2).

En paralelo, las tecnologías de próxima generación deben diseñarse para activar células robusto "fabricación" de la colección y la producción de células madre de industrialización por robert Shaw verde fluorescente protein–expressing ratón células madre embrionarias (verde) teñido de marcador de diferenciación de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) (rojo) y ADN (azul) para su uso en estudios de toxicología. Esta microfotografía por Hideko Sone (Instituto Nacional deestudios ambientales, Japón) recibió mención honorífica en el concurso de imagen de GE en celda

de 2008 (www.gelifesciences.com). 12 BioProcess internacional OctOber2010 aislamiento de células completamente al paciente administración (Figura 3).

La creación de condiciones de cultivo CGMPComo el progreso de la terapéutica basado en células madres hacia pruebas clínicas, la consistencia, calidad, y reproducibilidad de sistemas in vitro a gran escala convertido en imperativo. El uso de métodos estandarizados para el cultivo y cosecha de las células será necesario asegurar poblaciones celulares con fenotipos uniformes y comportamientos predecibles. De hecho, cuando "el proceso es el producto" — como sería el caso con la producción de células madre industrializado — variabilidad es el enemigo, por lo que debe ser reducido y controlado tan completamente como sea posible.A la luz de estos desafíos, las células madre deben cultivarse en condiciones que cumplan con las normas de práctica de fabricación (CGMP). Sistemas de cultivo de células madre CGMP incorporan medios bien definidos, caracterizados y suplementos para apoyar la diferenciación y expansión de células madre. Aunque la FDA no implica una ausencia total de productos de origen animal en cultivos de células madre para los primeros ensayos clínicos, empresas fuertemente desean alejarse de uso de sueros mal definidos que pueden ser incompatible con la necesidad de que las condiciones de cultivo estrictamente controlados.La incorporación de suplementos CGMP contribuye a las condiciones de cultivo de alta calidad, consistente y reproducible. Cuando son fabricados bajo condiciones CGMP, los suplementos que

permiten la proliferación robusta de células madre en el cultivo sin la necesidad de que las capas de alimentador serán plenamente caracterizados y validados para la actividad, potencia y pureza. Además, dichos suplementos generalmente se producen en tamaños mucho más grandes que contribuyen a la reproducibilidad de las condiciones de cultivo.Algunos suplementos del cultivo celular están actualmente disponibles en forma CGMP, pero muchos no lo son (por ejemplo, los factores de crecimiento epidérmico y fibroblastos ampliamente usados). En los laboratorios donde se cultivan células madre para la evaluación en el ámbito clínico, los investigadores a menudo desarrollan sus propios suplementos de CGMP. El proceso puede ser lento y trabajoso, y no permite a través de diferentes laboratorios y organizaciones de normalización de las condiciones de cultivo.

Caracterización y enriquecimientoSe han generado una serie de protocolos para la diferenciación dirigida de células de tejidos específicos de roedores y humanas, células madre embrionarias. Inducir diferenciación controlada de estas células se realiza normalmente mediante cócteles de suplementos de los medios, factores de crecimiento y citoquinas optimizadas para producir un fenotipo deseado. Protocolos para inducir la diferenciación de células madre no producen poblaciones de células homogéneas; culturas contienen no sólo células diferenciadas pero también células indiferenciadas y otros que son algo entre. Los intentos para impulsar tales culturas hacia una población más homogénea pueden conducir a la pérdida de un porcentaje significativo de las células, en algunos casos 30% o más. La caracterización de células dentro de una población heterogénea así se convierte en sumamente importante, especialmente cuando el cultivo de células con fines terapéuticos.Se utilizan métodos como el análisis de flujo, inmunohistoquímica y representación celular para caracterizar las células utilizando marcadores de superficie celular. La evaluación de características funcionales (por ejemplo, la producción de una hormona específica) y morfología (por ejemplo, neurita excrecencia) también se utilizan para distinguir subpoblaciones. Nuevas estrategias están utilizando la expresión génica y microRNA perfiles así como análisis de glycomic más eficazmente y precisamente caracterizar las células.La industrialización de células madre probablemente requerirá el desarrollo personalizado de protocolos de caracterización. Una práctica que se espera se convierta en más común es primero en identificar un conjunto putativo de biomarcadores específicos de células durante el desarrollo del proceso y eventualmente restringir que a los pocos marcadores para su uso durante la caracterización real. Una serie de técnicas de enriquecimiento puede utilizarse para obtener una población celular deseado: partículas magnéticas, métodos basados en la afinidad y matar (de forma seleccionada) a las células no deseadas.Enriquecer un cultivo de gran escala para un tipo deseado mientras selecciona contra otros, sin embargo, puede ser un ejercicio de inutilidad. Los procesos existentes para hacerlo no siempre son escalables, y es poco probable que cualquiera cediera un cultivo que es 100% el tipo celular deseado. Además, los pasos de control de calidad utilizados durante los procesos de enriquecimiento requieren el sacrificio de muchas células, así que agotan sus poblaciones. Introducir o modificar un gen para convertirse en un marcador seleccionable dentro de una población celular deseado es una opción. Este enfoque entonces tendría que respeten las normas de la FDA sobre productos recombinantes. Con un enriquecimiento proceso presentando sus propios retos y no es probable que sea 100% eficaz, cuidadosa caracterización de subpoblaciones dentro de una cultura determinada será fundamental a la industrialización.

Sistemas de "fabricación" de células integradas

Desafíos surgen durante todo el proceso de escalado de células madres para el uso terapéutico. Debido a que las propias células son el producto, su sistema de cultivo debe ayudar a minimizar la variabilidad en la población; controlar eficazmente la diferenciación para permitir la cosecha y formulación sin daño celular; e incorporar procesos que garanticen la viabilidad durante el almacenamiento, transporte y administración a los pacientes. Además de las condiciones de cultivo CGMP, producción a gran escala de las células madre requerirá sistemas completamente integrados y escalables.

Nueva tecnología Microcarrier o alternativa soluciones que permiten partículas libres en cultivo de células madre en un biorreactor: cuando se cultiva en biorreactores, las células madres adherentes deben cultivarse en superficies sólidas como microcarriers. Lamentablemente, las partículas pequeñas o "multas" a menudo se generan durante la fabricación de microcarrier y puede contaminar a un sistema de cultivo. Multas pueden también resultar de perlas de ser aplastados durante la cosecha de la celda. Porque no pueden filtrarse culturas de células madre para eliminar estas partículas, todas las partículas que son lo suficientemente pequeñas se copurified junto con las células. La presencia de materia particulada como microcarrier multas es inaceptable para productos inyectables.

Biorreactores optimizada para el cultivo de células madre: la tecnología de biorreactor existente está diseñada principalmente para apoyar la producción de proteínas expresadas en el sobrenadante de cultivos celulares. Muestras de sobrenadante se extraen fácilmente estos reactores para el análisis. Sin embargo, para los cultivos de células madre, los biorreactores deben permitir el muestreo rápido de pequeños volúmenes que contienen células actuales. Además de supervisar las condiciones típicas de temperatura, pH, oxígeno disuelto (DO) y osmolaridad, investigadores regularmente toman muestra de cultivos de células madre para la caracterización. Cultivos de células madre también necesitan mezclarse bien en un bioreactor antes de muestreo ya que tienden a resolver rápidamente. Tamaños de muestra deben ser pequeños para no desperdiciar producto valioso, y deben procesarse rápidamente mientras que las células son aún viables.

Tecnología de cosecha y embalaje de células vivas: las tecnologías existentes de centrifugación y filtración no están optimizadas para la cosecha y la recuperación de células vivas. Aunque la centrifugación se utiliza a menudo para recoger células para aplicaciones de investigación, no siempre es práctico para recoger grandes cantidades de células madre. Centrifugación no suele ser un sistema cerrado, y las fuerzas de cizalla involucradas pueden dañar las células. Una vez que las células son cosechadas, deben ser rápidamente concentradas (sus medios arrastrados con solución amortiguadora) y envasados en recipientes para congelar o administración a pacientes (la terapia celular equivalente a "fill–finish"). Actualmente no existen sistemas para administrar de manera eficiente este proceso para las células madre

Aplicaciones en desarrollo y descubrimiento de fármacosAdemás de su uso directo en el área de la medicina regenerativa, células madres podrían ofrecerventajas significativas para el descubrimiento de medicamentos y el desarrollo. Las compañías farmacéuticas están explorando el uso de estas células para dilucidar vías y mecanismos de la enfermedad, facilitar la detección del destino nuevo, evaluar la eficacia y mejorar el perfil de seguridad.Entre los más prometedores de las aplicaciones es investigación de toxicidad. Estudios de toxicidad eficiente y predictivo activados por células madres pueden esperarse para reducir los costos de

desarrollo asociados con el fracaso de la última etapa de candidatos de fármacos de moléculas pequeñas. La identificación de tales candidatos con problemas de toxicidad anteriormente en desarrollo mejoraría la seguridad para los pacientes y participantes de ensayos clínicos.Lesión hepática inducida por drogas es la principal razón para la suspensión de los ensayos clínicos y retirar los medicamentos del mercado. De hecho, esta ha sido la causa más frecuente de retiros relacionados con la seguridad de los medicamentos comercializados en los últimos 50 años. Estudios de investigación in vitro de toxicidad hepática normalmente se realizan utilizando hepatocitos humanos primarias o una línea de inmortalizadas celular (genéticamente transformadas) derivado del hígado como HepG2. A pesar de uso rutinario para investigación toxicidad, ambas opciones presentan inconvenientes importantes:

Hepatocitos humanos primarios derivan de tejido del hígado fresco, normalmente procedente de cadáveres o resecciones de cáncer. Suministro de estas células puede ser limitada, y el tejido puede variar ampliamente entre los donantes.

Los hepatocitos primarios no pueden mantenerse por más de unos días en la cultura sin perder la función. Asegurar un suministro constante de células requiere compras repetitivas, lo que contribuye aún más a la variabilidad.

Las líneas celulares de hepatocitos inmortalizadas pueden cultivarse indefinidamente, que aborda las cuestiones de suministro y la variabilidad. Sin embargo, estas células muestran diferencias de las células del hígado normales y no pueden exhibir comportamiento celular normal o respuesta. Por ejemplo, la mayoría enzimas citocromo P450 (responsables de metabolismo de drogas) se expresan sólo débilmente en las células HepG2 comparado con hepatocitos humanos normales.Los desafíos de las pruebas de toxicidad in vitro en hepatocitos han llevado las empresas farmacéuticas dependen de modelos animales para pruebas de toxicidad y metabolismo preclínico. Pero esos modelos tienen sus propias limitaciones. No pueden ser completamente y confiable predictivos de toxicidad humana. Estudios en animales están "bajo rendimiento" y caro, y pueden plantear problemas éticos. Costo y rendimiento de relegan a menudo uso de modelos animales para etapas posteriores de desarrollo preclínico, después de que una empresa ha invertido importantes recursos y tiempo en un compuesto de plomo. Dicha evaluación tardía de toxicidad contribuye a la tasa alta de fracaso de muchos compuestos en fase pruebas preclínicas, que es muy costosoLa evaluación mas temprana, más eficaz de la toxicidad de candidato de drogas podría reducir la tasa de deserción de las drogas en etapas posteriores de desarrollo. Diferenciación y expansión de células madre humanas en hepatocitos para su uso en dichos estudios de toxicidad de investigación podrían superar las deficiencias de hepatocitos primarios y líneas celulares inmortalizadas, así como los modelos animales. Uso de hepatocitos derivado del tallo (y otros tipos celulares utilizados para estudios de toxicidad) ofrece una serie de ventajas importantes para los estudios de toxicidad de investigación:

Disponibilidad de una fuente constante de células que más se asemejen fisiología y fenotipo in vivo

Eliminación de la dependencia en fuentes de donantes disponibles esporádicamente Estandarización de un proceso reproducible para pruebas de toxicidad Reducción en el uso de modelos animales y tejidos animales Mejora de la capacidad predictiva de los primeros estudios de toxicidad para reducir el

desgaste de la etapa tardía de drogas

El camino a seguir

Desde 1998, cuando las células madre primero fueron aisladas de embriones en fase temprana, los investigadores han tratado de ingeniero condiciones óptimas para su crecimiento in vitro. Rutas y eficaces para mantener el robusta crecimiento y control la diferenciación de estas células surgen a un ritmo impresionante. Ahora, en el punto de inflexión entre la escala blanco y producción industrializado a gran escala, surge un conjunto diferente de problemas biológicos y técnicos. Uso de células madre, tanto en el ámbito clínico y apoyar los esfuerzos de desarrollo de drogas exige un nuevo nivel de calidad, consistencia y reproducibilidad. Mientras se desarrollan los avances en la caracterización, las condiciones de cultivo CGMP y sistemas de fabricación integrada, la promesa de las células madre se acerque a la realidad.

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