infiammazione e tumore

Marco Ciró marco.ciro@ieo.it Dip. Oncologia Sperimentale IEO Via Adamello 16, MI

Introduzione Evidenze di legame infiammazione-cancro Perché infiammazione aumenta rischio tumore Via intrinseca/ Via Estrinseca

Oncogeni e infiammazione Relazione infiammazione cancro: il caso di NF-kB

Infiammazione e cancro

Se infiammazione é in grado di stimolare lo sviluppo del cancro, questo deve avvenire attraverso la modulazione di tali meccanismi cellulari

Tra i vari pathway attivati durante infiammazione, NF-kB ha un ruolo centrale sia nel controllo della risposta infiammatoria che nello sviluppo del tumore.

Il cancro é una malattia causata da difetti nei meccanismi cellulari di controllo della stabilitá del genoma e e della proliferazione cellulare

NF-kB NF-kB é un fattore trascrizionale rapidamente attivato in risposta a stress:

Virus- batteri (esempio: LPS) -parassiti shear stress (fluido su superficie) UV-chemoterapia-stress ossidativo danno al DNA citochine infiammatorie (esempio: TNF, IL6)

Regola -attivazione dei linfociti -infiammazione -inibisce apoptosi -stimola crescita cellulare

Le subunitá possiedono il dominio REL di legame al DNA REL (la piú importante: REL-A o p65) p50 p52, derivata da proteolisi di p100 Esiste come Etrodimero di due tipi: REL/p50: pathway canonico REL/p52: pathway non canonico

Regolazione risposta infiammatoria

Organi linfoidi e sviluppo B cell

NF-kB pathway canonico

IkBα lega NF-kB e lo trattiene nel citoplasma

Stimoloè il complesso IkB Chinasi (trimero IKK α,β,γ) inattiva IkBα

NF-kB ha segnali di localizzazione nucleare

NF-kB entra nel nucleo

citoplasma

nucleo NF-kB attivo

NF-kB inattivo

pathway canonico

p65 p50

Nuclear-localization

signals

I-κBα

I-κBkinase

SequesteredNF- κB

p65 p50

E3 ligase

TAK1

1

3

4

5

6

7

2a2b

p65 p50

p65 p50

P Pp65 p50

P P

Ionizingradiation

Poly-ubiquitin

TNF

receptors

IL-1LPS

Cytosol

Nucleus

Free NF- κB

Induces transcriptionof target genes

Unknownmechanism

Proteasomaldegradationof I- κBα

α

βγ

I-κBα

α

Exterior

Come inattivare NF-kB?

I-kB SR: mutante di IkB che non púo essere inattivato da fosforilazione: = Super Repressore costitutivo

Pathway non canonico (organogenesi linfoide - sviluppo B cell)

Nuclear-localization

signals

Nucleus

Induces transcriptionof target genes

NF-kB

p65 p100

p65 p52

p65 p52

P

p65 p100

IKKα

αα

Geni target feedback loop: IkB

proliferazione: MYC, Ciclina D1

anti-apoptosi: BCL2 family (bloccano BAX), cIAP (bloccano caspasi)

Infiammazione:

citochine (e.g., IL-1, IL-6, TNF-a, IFN b, GM-CSF)chemochine (e.g., IL-8, MIP-1 , MCP1, RANTES, and eotaxin),molecole per adesione (e.g., ICAM, VCAM, and E-selectin)effettori, stress ossidativo (e.g., iNOS and COX-2).risposta immunitaria (MHC proteins)proteasi (MMP9 proteins)

NFKB ha un ruolo sia in cellule infiammatorie che in cellule tumorali

NFKB, infiammazione e cancro Indizi: NF-KB é fondamentale per il processo infiammatorio NF-kB é un attivatore di geni anti apoptotici=oncogeni Tumori umani presentano NF-kB costitutivamente attivato validazione del ruolo di NF-kB in modelli murini Epatite e carcinoma del fegato (HCC:hepatocellular carcinoma) Carcinogenesi chimica e HCC

Hepatocellular Carcinoma (HCC)

High mortality rate due to late stage diagnosis -resection and transplantation are mostly ineffective -Commonly used drugs are mostly ineffective -emergence of therapy resistance tumor -associated with chronic Liver injury: HBV infection, HCV infection, alcoholic cirrhosis. NB HBV increase risk by 100 fold

Prevention!

L'epatite virale è un processo infiammatorio (acuto o cronico), che provoca la morte (necrosi) delle cellule del fegato (epatociti) a causa dell'attacco da parte di virus epatotropi (HBV/HCV)

Come risponde l’organo danneggiato?

iperplasia controllata

fegato: capacitá rigenerante

Gli epatociti si dividono raramente. Tuttavia, possiedono la capacità di riprodursi in risposta a: - fattori di crescita - distruzione/asportazione di una parte del fegato stesso Capacitá fondamentale dopo l'asportazione chirurgica o in seguito a lesioni (lesioni virali, tossiche o ischemiche).

iperplasia controllata

la capacità di rigenerazione del fegato viene compromessa da danno eccessivo: - malattie croniche (epatite) - danni ripetuti (alcol: >50g/giorno/piú anni)

Conseguenza: epatociti verranno sostituiti da tessuto cicatriziale (fibrosi) fino a portare alla cirrosi epatica.

Ripopolazione del fegato e cancro

Un ambiente ricco in stimoli proliferativi puó favorire la selezione di una cellula “iniziata” (pre tumorale)

commento

Infiammazione - tumore

Colangite Infiammazione vie biliari

Hepatocellular carcinoma

Topi MDR2-/- Modello murino di epatite

Malattie epatobiliari: Gli epatociti secernono la bile nei canalicoli biliari, che sono spazi tra epatociti adiacenti. La bile é composta da acidi biliari e fosfolipidi. MDR2: glicoproteina di membrana che media la secrezione dei fosfolipidi della bile, famiglia degli ABC transporter. Topi MDR2 -/- : Un difetto nella secrezione della bile: acidi biliari in assenza di fosfolipidi,che sono ritenuti negli epatociti, sono tossici e causano danno delle membrane e epatite → modello di malattia epatobiliare, é considerato un modello di malattia cronico del fegato, precisamente di Colangite, cioé infiammazione delle vie biliari.

All’etá di 4 - 6 mesi i topi mdr2 (-/-) sviluppano foci di HCC.

Topi MDR2-/- Modello murino di epatite

NF-kB e HCC in topi MDR2-/- Sistema: Topi MDR2 -/- sviluppano epatite e poi HCC a 6 mesi Domanda: quale ruolo per NF-kB? Metodo: Inattivazione di NF-kB nel fegato di topi MDR2-/- Come?: Attivazione specifica nel fegato di IkB super-repressor

NF-kB é attivato nei topi MDR2-/-

+/+ -/- HCC from -/-

Immunoistochimica con antiNF-KB (p65)

Cosa succede se inattiviamo NF-kB? (attivando IkBSR con sistema TET-OFF)

IkBSR IkBSR

In presenza di DOX, il gene é spento, NF-kB é attivo In assenza di DOX, il gene é acceso, ikBSR inattiva NF-kB

In presenza di DOX, il gene é spento, NF-kB é attivo

In assenza di DOX, il gene é acceso, ikBSR inattiva NF-kB

IkBSR inibisce NF-kB nel fegato

Staining nucleare di p65 é indice di attivitá di NF-kB: KO = MDR2-/- DM = MDR2-/-, IkBSR

Se inattiviamo NF-kB? (attivando IkBSR)

meno HCC!

MD

R2-

/-

MD

R2-

/- Ik

bSR

acc

eso

MD

R2-

/- Ik

bSR

spe

nto

In che modo NF-kB favorisce lo sviluppo di HCC

Una funzione di NF-kB é inibire apoptosi. Ipotesi: NF-kB favorisce HCC perché inibisce apoptosi Se cosí fosse, IkBSR dovrebbe far diminuire HCC perché aumenta il livello di apoptosi. Quindi: Qual é il livello di apoptosi in topi MDR2-/- rispetto a topi MDR2-/- con NF-kB inattivato (da IkBSR)?

modello

epatite

NF-kB

apoptosi

HCC

IkBSR

MDR2-/-

dox

Inibizione di NF-kB (da parte di IkBSR) aumenta apoptosi e riduce incidenza HCC

Se blocco TNF, blocco NF-KB: tolgo l’inibizione dell’apoptosi, e apoptosi aumenta.

Quali geni target di Nf-kB?

Famiglia IAP:legandosi alle caspasi (anche già attivate) ne inibiscono l’attività enzimatica e ne promuovono ubiquitinazione e degradazione

Quali cellule producono TNF e quali hanno NF-kB attivato?

macrofagi

endotelio

epatociti NFkB

TNF

NFKB funziona sia in cellule

infiammatorie che in cellule tumorali

MODELLO di carcinogenesi chimica di HCC

NF-kB, cellule e citochine infiammatorie

Induzione HCC in topi adulti: -Trattamento singolo DEN

-Trattamento con promotore per 6 mesi -Comparsa HCC intorno ai 6-8 mesi

DNA alkylation

DEN promotore

HCC

mesi

Carcinogeni e HCC: DEN

diethylnitrosamina

DANNO

HCC

DANNO

HCC

Ruolo NF-kB

Produzione di IL6

TLR

DEN

HCC

Attivazione macrofagi

Stimolazione cell tumorali

CELLULE NECROTICHE

Wt NF-kB-/-

Trattamento con DEN induce proliferazione (ripopolamento) nel fegato Proliferazione in vivo é dipendente da NF-kB

Proliferazione misurata nel fegato come % di cellule positive alla BrdU

Il trattamento con DEN induce IL6 Questa induzione dipende da NF-kB

Immunoistochimica per IL6 su sezioni di fegato da topi wt o NF-kB -/-

WT NF-kB-/-

Funzione di IL6 in HCC indotta da DEN: In assenza di IL6 si ha meno danno e meno risposta proliferativa (in vivo)

Proliferazione misurata nel fegato come % di cellule positive alla BrdU

Danno misurato come rilascio di transaminasi (ALT)

Esiste un effetto di genere

Alti livelli Estrogeni inibiscono rilascio di IL6 e proteggono da HCC

Funzione di IL6 in HCC indotta da DEN: IL6 é richiesta per sviluppo del tumore

E quindi aumenta il survival se togliamo IL6

Quali sono le cellule responsabili del rilascio di IL6? Kupffer celI (KC): i macrofagi residenti del fegato!

KC isolate e trattate in piastra con LPS o frammenti necrotici: producono IL6 solo se la via di trasduzione del TLR4 é integra

NB: naturalmente fonte di “tissue damage” é anche epatite

conclusioni Le cellule e i mediatori dell’infiammazione sono una presenza importante dell’ambiente tumorale Lo stato infiammatorio favorisce insorgenza e progressione del tumore - Infiammazione precede e favorisce l’insorgenza del tumore - Attivazione oncogenica induce un’ambiente infiammatorio che favorisce la tumorigenesi

Farmaci antiinfiammatori possono avere sia azione profilattica che terapeutica riducono incidenza o rallentano la crescita tumorale: Inibitori delle ciclo-ossigenasi (aspirina, inbitori di COX2) = riduzione incidenza Colon Cancer, Breast cancer Agire sull’infiammazione pro-tumorale: strategie. ¤Inibizione di dei pathway che mediano la crescita/sopravvivenza delle cellule tumorali in risposta alle citochine infiammatorie (inibizione di NFKB) ¤Sequestro delle citochine /chemochine/recettori che mantengono il microambiente infiammatorio (antiIL6, anti TNF, anti CCR2) ¤modulare la risposta infiammatoria che segue la terapia ¤Eliminare cellule infiammatorie responsabili della progressione tumorale, preservando le cellule responsabili della risposta immunitaria ¤Inibizione selettiva di citochine pro-tumorali.

Terapia anti-infiammatoria come terapia antitumorale

Gli enzimi COX-2 hanno favoriscono di tumorigenesi

COX2 AA

Prostaglandine

Prostaciclina

Blocco apoptosi Migrazione Neoangiogenesi

ALti livelli di COX-2 sono presenti in tumori di diversa origine tissutale: Breast, Prostate, Pancreas, SKin, LUng, Bladder, Heqad and NEck.

Inibitori di COX-2 sono stati studiati come trattamento anti-tumorale

MECCANISMO: -COX-2 crea ambiente infiammatorio pro-tumorale NSAID inibiendo COX-2 bloccano rilascio di metaboliti attivi di Acido Arachidonico. Controindicazioni: vedi slide precedenti

Evidenze epidemiologiche che NSAID riducono rischio tumore 1983 prima osservazione: regressione di polipi al retto in pazienti che assumono NSAID 2012: una serie di tre studi su ampia coorte di pazienti suggerisce uso di Apsirina nel trattamento del tumore e prevenzione di metastasi. utilizzo giornaliero di ASpirina: - riduce il rischio di Colon Cancer -riduce rischio di metastasi. - riduce mortalitá 2015: rischio di effetti collaterali aumentano con etá dei pazienti Trattamento e prevenzione dei tumori Add-ASpirin Trial, 2015 - ongoing " It will recruit 11,000 participants to help find out whether regular aspirin use after treatment for an early stage cancer can prevent the cancer from coming back and preventing death

Le principali opzioni terapeutiche è inducono infiammazione sistemica o locale Causa: danno tissutale o morte di cellule tumorali Chirurgia -> danno tissutale /infezioni Chemioterapia / Radioterapia -> induzione di necrosi

“therapy induced inflammation” Ulteriore livello di complessitá