SANDRA SAYURI ORI

Influncia das auxinas no desenvolvimento e

no teor de carboidratos solveis, amido e

protena total solvel em Phalaenopsis

amabilis (Lineu) Blume (Orchidaceae)

cultivada in vitro Dissertao apresentada ao Instituto de Botnica da Secretaria do Meio Ambiente, como parte dos requisitos necessrios para a obteno do ttulo de MESTRE em BIODIVERSIDADE VEGETAL E MEIO AMBIENTE, na rea de concentrao de Plantas Vasculares em Anlises Ambientais.

SO PAULO

2006

SANDRA SAYURI ORI

Influncia das auxinas no desenvolvimento e

no teor de carboidratos solveis, amido e

protena total solvel em Phalaenopsis

amabilis (Lineu) Blume (Orchidaceae)

cultivada in vitro Dissertao apresentada ao Instituto de Botnica da Secretaria do Meio Ambiente, como parte dos requisitos necessrios para a obteno do ttulo de MESTRE em BIODIVERSIDADE VEGETAL E MEIO AMBIENTE, na rea de concentrao de Plantas Vasculares em Anlises Ambientais.

ORIENTADOR: PROF. DR. EDISON PAULO CHU

Ficha Catalogrfica elaborada pela Seo de Biblioteca do Instituto de Botnica Ori, Sandra Sayuri O69i Influncia das auxinas no desenvolvimento e no teor de carboidratos solveis,

amido e protena total solvel em Phalaenopsis amabilis (Lineu )Blume (Orchidaceae) cultivada in vitro / Sandra Sayuri Ori -- So Paulo, 2006.

133 p. il. Dissertao (mestrado)Instituto de Botnica da Secretaria de Estado do Meio

Ambiente, 2006 Bibliografia. 1. Orchidaceae. 2. Phalaenopsis amabilis. 3. Auxinas. I. Ttulo CDU 582.594.2

Deus pela existncia, pela famlia, pelos amigos, pelos caminhos que percorri e que vou percorrer.

Aos meus queridos pais, Kenji e Mifue, aos meus irmos Marcia e Ricardo que me apoiaram e estimularam neste rduo caminho.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais Kenji e Olga e aos meus irmos Mrcia e Ricardo, por estarem presentes em todos os momentos de conquistas e desespero, por terem dado base slida para vencer os obstculos e principalmente por me amarem;

Ao pesquisador Prof. Dr. Edison Paulo Chu, pela orientao, pelo voto de confiana, por acreditar no trabalho, pelo incentivo, pelos ensinamentos, pela pacincia, pela dedicao;

Ao pesquisador Dr. Armando Reis Tavares, pela orientao, pelas repetitivas correes, pelos ensinamentos e principalmente pela amizade;

Ao pesquisador Prof. Dr. Fbio de Barros pelas incessantes correes do projeto e principalmente pela pacincia;

Ao pesquisador Dr. Shoey Kanashiro pelas sugestes, pelo incentivo e principalmente pela ajuda;

Aos pesquisadores da seo de Ornamentais, Francismar Francisco Alves de Aguiar, Dra. Vvian Tamaki, Dra. Catarina Carvalho Nievola, Doutoranda Vanessa Rebouas Dr. Clovis Jos Fernando de Oliveira Jnior pelo apoio, ateno e incentivo;

Aos funcionrios da seo de Ornamentais Luzia Rodrigues Scarpeta, Cleonice Righetti de Campos, Ivomar Aparecido Medina e Maria da Conceio Maciel Oliveira pelo apoio, carinho, ateno, incentivo e pela amizade;

Secretaria da Agricultura nas Pessoas Clarice, Carmem, Jos Carlos por possibilitarem a utilizao do nibus;

Dra. Mrcia Regina Braga, Dra. Vvian Tamaki, Dra. Nair Sumie Yokoya e ao Dr. Giulio Cesare Stancato pelas sugestes ao projeto;

Ao pesquisador Dr. Rogrio Suzuki pela ateno e principalmente pela pacincia;

Aos amigos e colegas Sandra, Adriana, Llian, Carlos e Rodrigo do curso de ps-graduao em Biodiversidade Vegetal e Meio Ambiente do Instituto de Botnica;

Aos funcionrios da seo de Fisiologia Vegetal em especial Sirley e Helena;

seo do Orquidrio em especial Valdir, Elena e Rosana;

Aos amigos e funcionrios Joo Batista, Adriana, Ivonete e Carlinhos, do Orquidrio Ori, pelo trabalho, pela ajuda e principalmente pela amizade;

Aos estagirios da Seo de Ornamentais Maria Aparecida Gobatto Alves, Monaly Sado, Renata Fester Giacometti, Jennifer Almeida Guariento, Gabriela Fiani Veiga, Jorge Luiz Marx Young e Patrcia Giampaoli pela ajuda e pelo auto-astral;

Ao Programa de Ps-Graduao em Biodiversidade Vegetal e Meio Ambiente nas pessoas da Dra. Snia M. Campos Dietrich e Dra. Solange C. Mazzoni-Viveiros, principalmente a cota de 6 meses de bolsa. A todos os docentes e alunos, em especial a secretria Mrcia Regina ngelo;

Ao Crculo das Associaes de Orquidfilos do Brasil, ao Crculo Paulista de Orquidfilos, aos orquidfilos de Po, Sociedade Orquidfila de Sorocaba e Sociedade Bandeirantes de Orquidfilos pelo estmulo e amizade;

A todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuiram para a realizao desta dissertao.

i

Smbolos e abreviaturas utilizadas

ABA cido abscsico AIA cido indolilactico AIB cido indol-3-butrico ANA cido naftalenoactico C3 Ciclo de Calvin Benson CAM Metabolismo cido das crassulceas CO2 Dixido de carbono cv cultivar D.M.S. Diferena mnima significativa DNA cido desoxirribonuclico F Valor do resultado da anlise de varincia g Gravidade g Gramas KC Knudson, meio L-1 Por litro M Molaridade mg Miligramas mm Milmetros ms massa seca N Normalidade NaOH Hidrxido de Sdio nm Nanmetros ns No significativo ( > 5 %) PAR Taxa de assimilao fotossinttica R2 Coeficiente de determinao RNA Radiao fotossinteticamente ativa sp. espcie TDZ Thidiazuron (1-Fenil-3-(1,2,3-tiadiazol-5-yl)-urea) VW Vacin Went, meio 6-BA 6-Benziladenina 2,4-D cido 2,4 Diclorofenoxiactico oC graus Celsius *P 95% Probabilidade de 95% **P 99% Probabilidade de 99% ***P 99,9% Probabilidade de 99,9% Alfa + Material no detectado M Micromolaridade mol m-2s-1 Micromol por metro quadrado por segundo

ii

ndice

1. Introduo

1.1. Famlia Orchidaceae................................................................................... 01

1.2. Gnero Phalaenopsis.................................................................................. 01

1.3. Mercado mundial de flores e plantas ornamentais...................................... 04

1.4. Cultura de tecidos........................................................................................ 05

1.4.1. Meios de cultura....................................................................................... 06

1.5. Trocas gasosas em cultivo in vitro.............................................................. 07

1.6. Fonte e dreno............................................................................................... 07

1.7. Carboidratos................................................................................................ 08

1.8. Amido.......................................................................................................... 09

1.9. Protena....................................................................................................... 10

1.10. Enraizamento............................................................................................ 11

1.10.1. Enraizamento em Orchidaceae............................................................... 13

1.11. Reguladores vegetais no enraizamento..................................................... 14

1.11.1. Auxinas de efeito herbicida.................................................................... 16

1.12. Luminosidade............................................................................................ 19

1.13. Aclimatizao............................................................................................ 19

2. Objetivos.......................................................................................................... 21

3. Material e Mtodos.......................................................................................... 22

3.1. Obteno das plantas de Phalaenopsis amabilis......................................... 22

3.2. Inoculao in vitro e condies de cultivo.................................................. 23

3.3. Coleta do material para as anlises biomtricas e bioqumicas.................. 24

3.3.1. Anlises biomtricas e preparo das amostras..................................... 24

3.3.2. Extrao e determinao dos teores de carboidratos solveis totais.. 25

3.3.3. Extrao e determinao dos teores de protena total solvel............ 26

3.3.4. Extrao e determinao dos teores de amido................................... 26

3.4. Anlises estatsticas..................................................................................... 27

4. Resultados........................................................................................................ 28

4.1. Anlises biomtricas................................................................................... 28

4.1.1. Efeito do AIB no nmero de folhas e razes ..................................... 28

iii

4.1.2. Efeito do AIB na massa seca de folhas e razes................................. 32

4.1.3. Efeito do AIB na massa seca de folhas e razes................................. 36

4.1.4. Efeito do ANA no nmero de folhas, razes e brotos........................ 40

4.1.5. Efeito do ANA na massa fresca de folhas, razes e dos brotos.......... 45

4.1.6. Efeito do ANA na massa seca de folhas, razes e brotos................... 51

4.1.7. Efeito do 2,4-D no nmero de folhas, razes e brotos........................ 56

4.1.8. Efeito do 2,4-D massa fresca de folhas, razes e brotos..................... 62

4.1.9. Efeito do 2,4-D na massa seca de folhas, razes e brotos................... 68

4.2. Anlises bioqumicas.................................................................................. 74

4.2.1. Efeito do AIB nos teores de carboidratos solveis de folhas e nas

razes............................................................................................................ 74

4.2.2. Efeito do ANA nos teores de carboidratos solveis de folhas, razes

e brotos......................................................................................................... 76

4.2.3. Efeito do 2,4-D nos teores de carboidratos solveis nas folhas,

razes e brotos............................................................................................... 79

4.2.4. Efeito do AIB nos teores de amido de folhas e razes........................ 82

4.2.5. Efeito do ANA nos teores de amido de folhas, razes e

brotos............................................................................................................ 84

4.2.6. Efeito do 2,4-D nos teores de amido de folhas, razes e brotos......... 87

4.2.7. Efeito do AIB nos teores de protena total solvel de folhas e

razes............................................................................................................ 90

4.2.8. Efeito do ANA nos teores de protena total solvel de folhas, razes

e brotos......................................................................................................... 92

4.2.9. Efeito do 2,4-D nos teores de protena total solvel de folhas,

razes e brotos.............................................................................................. 95

5. Discusso......................................................................................................... 98

5.1. Efeito do AIB no nmero, massa fresca e seca de razes e folhas.............. 99

5.2. Efeito do ANA no nmero, massa fresca e seca de razes, folhas e

brotos................................................................................................................. 101

5.3. Efeito do 2,4-D no nmero, massa fresca e seca de razes, folhas e

brotos.................................................................................................................. 103

5.4. Teores de carboidratos solveis.................................................................. 104

5.5. Teores de amido.......................................................................................... 105

iv

5.6. Teores de protena total solvel.................................................................. 106

6. Concluses....................................................................................................... 107

7. Resumo............................................................................................................. 114

8. Abstract............................................................................................................ 116

9. Literatura citada............................................................................................... 118

10. ndice de figuras.............................................................................................. V

11. Anexos............................................................................................................ xiii

1

1. Introduo

1.1. Famlia Orchidaceae

A famlia Orchidaceae, uma das maiores e diversificadas entre as angiospermas,

taxonomicamente uma das mais evoludas entre as monocotiledneas, sendo representada

por 1.800 gneros (Watanabe 2002), com cerca de 35 mil espcies descritas (Singh 1992),

alm dos hbridos. Segundo Pridgeon (1995), as orqudeas ocupam quase todo tipo de

habitat, exceto tundras e regies desrticas.

O Brasil possui invejvel diversidade e quantidade de espcies da famlia

Orchidaceae (Sachs 2002). A famlia apresenta inmeros hbridos intergenricos, existindo

acima de 100.000 hbridos (Sheehan & Sheehan 1994) como Laelio-Cattleya, Brasso-

Cattleya, Brasso-Laelio-Cattleya, Cattleya-Bultonia, Sophro-Cattleya, Sophro-Laelio-

Cattleya, Dendro-Phal, Miltoniopsis, todos de alto valor comercial.

1.2. Gnero Phalaenopsis

A palavra Phalaenopsis origina-se do grego phalaina que significa mariposa e

opsis aparncia (Pridgeon 1995) e tem procedncia no norte da Austrlia, sudeste da sia,

montanhas do Himalaia, Indonsia e Filipinas (Sheehan & Sheehan 1994). O hbito de

crescimento epiftico com 60 espcies descritas (Harper 2004). O gnero Phalaenopsis

tem alto potencial ornamental e comercial, no s no mercado nacional como tambm

internacional, pois uma das poucas plantas da famlia Orchidaceae que floresce a cada 6

meses e apresenta grande durabilidade da inflorescncia. Segundo Paul & Starosta (1998),

a maioria dos hbridos de Phalaenopsis provm de cruzamentos entre P. amabilis (Lineu)

Blume (Figura 1) e Phalaenopsis stuartiana (Rchb. f) (Figura 2). Seu crescimento

monopodial onde as folhas se dispem de forma alternada sobre as gemas axilares.

2

Figura 1. Flores de Phalaenopsis amabilis, barra = 5 mm (Ori 1999).

Figura 2. Flores de Phalaenopsis stuartiana (Pridgeon 1995).

As plantas do gnero Phalaenopsis podem ser propagadas de forma sexuada e

assexuada. Na propagao sexuada, aps a polinizao, formam-se frutos do tipo cpsula

com sementes que se tornam maduras entre 6 a 8 meses (Figura 3) e, em geral, produzem

poucas sementes, quando comparadas s cpsulas do gnero Cattleya. Uma cpsula de

Phalaenopsis produz aproximadamente 4 mil mudas em condies in vitro, desde de que

sejam feitas 4 repicagens (Figura 4), com aproximadamente 1 ano de cultivo in vitro. No

havendo repicagens, os protocormides no se desenvolvem plenamente (Figura 5).

3

Segundo Kikuchi (2006), as plntulas do gnero Phalaenopsis necessitam de 30 dias entre

as repicagens totalizando 6 passagens, sendo este um dos fatores importantes na produo

comercial, pois as plantas comeam a competir por nutrientes, gua, espao e

luminosidade.

A propagao assexuada pode ser in vivo e ex vitro. A tcnica in vitro realizada

atravs da inoculao de fragmentos de folhas, razes, ponta da raiz, lminas e ns da haste

floral em meio de cultura assptica, com a adio de reguladores de crescimento. Na

propagao assexuada ex vitro podem ser utilizados o n da haste floral, o broto lateral

(gemas axilares originam brotos inteiros em detrimento da haste floral) e fragmentos de

raiz como o caso de Phalaenopsis lueddemanniana (Rchb. f) (Arditti & Ernst 1993).

Figura 3. Cpsulas de P. amabilis com aproximadamente 6 meses aps a polinizao, barra = 2 cm (Ori 2001).

Figura 4. Mudas de P. amabilis cultivadas in vitro com aproximadamente 360 dias de cultivo (quarta repicagem), barra = 1,5 cm (Ori 2003).

4

Figura 5. Protocormides de P. amabilis com aproximadamente 360 dias de cultivo que no foram repicados, barra = 0,5 cm (Ori 2003).

As gemas axilares do gnero P. amabilis podem dar origem a mais de uma haste

floral ou a mudas laterais (Arditti & Ernst 1993). A primeira florao de P. amabilis ocorre

no perodo de 3 a 4 anos aps a aclimatizao, apresentando 6 flores, podendo exibir at

18 flores por haste floral (Harper 2004). As flores tm durabilidade aproximada de 45 dias,

sendo que aps o corte da haste floral, outra inflorescncia cresce aps 6 meses de cultivo

em condies de estufa (Holttum 1996).

1.3. Mercado mundial de flores e plantas ornamentais

O mercado de plantas e flores ornamentais foi denominado como indstria de

flores por movimentar bilhes de dlares. Esta conotao apropriada por envolver todos

os segmentos da cadeia produtiva, dos insumos aos agentes da intermediao e varejo, at

o consumidor final. Pases como Noruega, Sua, Sucia, Dinamarca e Itlia so os

maiores consumidores com mais de US$ 100,00 per capita por ano, o que mostra uma

importante perspectiva comercial da indstria de flores no mundo (Matsunaga 1997).

5

As tcnicas de cultura in vitro, no setor de floricultura, vm sendo amplamente

utilizadas para a propagao de grande nmero de espcies, apresentando rpida

multiplicao em relao aos mtodos convencionais, possibilitando o fornecimento de

mudas em maior quantidade, qualidade fitossanitria, de alto valor ornamental, produo

em curto espao de tempo e em pequena rea cultivada (Bosa et al. 2003). A produo in

vitro a partir de sementes de orqudeas no Brasil mostrou-se vivel por obter uma receita

lquida de 52 % em uma produo de 3 mil mudas (Stancato et al. 2001).

1.4. Cultura de tecidos

A cultura de tecidos em condies asspticas um mtodo utilizado em programas

de melhoramento, conservao e aumento da variabilidade das espcies para fins de

seleo em plantas ornamentais (Ferreira et al. 1998). Segundo Bosa et al. (2003) a tcnica

de propagao in vitro vem sendo utilizada com amplo sucesso para produo de mudas

em escala comercial.

Os tecidos cultivados in vitro so mantidos pelos nutrientes orgnicos e minerais do

meio de crescimento, enquanto a expresso morfolgica das clulas ou de rgos vegetais

pode ser controlada por fatores como variaes nas concentraes nutricionais ou

reguladores de crescimento nos meios de cultura, que definem respostas especficas para

cada espcie (Caldas et al. 1998).

O mtodo consiste em 5 etapas: a) fase zero, com a seleo da planta matriz e

preparao do explante (cuidados fitossanitrios), b) fase 1, assepsia do material e

estabelecimento em cultura assptica, c) fase 2, multiplicao dos explantes, d) fase 3a,

induo da parte area e fase 3b, induo radicular e pr-aclimatizao, e e) fase 4,

6

aclimatizao em casa de vegetao (Carvalho 1978, Debergh & Maene 1981, Guimares

1994).

1.4.1. Meios de cultura

Na cultura de tecidos em plantas de Phalaenopsis so utilizados vrios tipos de

meios nutritivos, tanto para propagao vegetativa como atravs de sementes (Arditti &

Ernst 1993). Park et al. (2002), avaliaram a taxa de sobrevivncia de plantas do gnero

Phalaenopsis, utilizando diferentes meios de cultura, sendo um deles o adubo comercial

Hyponex de frmula 20-20-20 (N:P:K). Os autores observaram que o meio de cultura de

Murashige & Skoog (1962) foi um dos melhores meios de cultura proporcionando 62 % de

sobrevivncia dos portocormides. Chen et al. (2000) utilizando a metade da concentrao

de macronutrientes e micronutrientes do meio de cultura MS obtiveram resultados

excelentes no estabelecimento e na regenerao de calos de plantas do gnero

Phalaenopsis.

O meio MS utilizado em cultura in vitro em vrios gneros da famlia Orchidaceae

podendo citar o trabalho de Martin (2003) com Ipsea malabarica, Lu et al. (2002) com

Phalaenopsis sp., Chen et al. (2002) com Paphiopedilum sp., Sobhana & Rajeevan (2002a)

com Dendrobium sp., Yang et al. (2002) com Cymbidium sp. e Torres & Mogollon (2002)

com Cattleya mossie, entre outros.

No cultivo in vitro de orqudeas, compostos orgnicos como gua de coco e extrato

de frutas so comumente utilizados para estimular o crescimento de protocormides e

mudas in vitro (Arditti & Ernst 1993). Estes extratos vegetais podem afetar o

desenvolvimento da planta devido presena de vrias substncias como hormnios

vegetais, aminocidos, peptonas e vitaminas que se apresentam de forma indefinida,

podendo alterar a composio qumica do meio de cultura e que so variveis conforme o

7

lote e perodo de preparo. Segundo Giatti (2005), o uso de componentes orgnicos como

gua de coco benfico nas culturas de tecidos de hbridos de Cattleya, mas deve ser dada

maior ateno maneira como se emprega essas substncias, pois possuem uma qumica

indefinida onde podem gerar alteraes no meio de cultura, como oscilaes no pH e

acrscimo de mais reguladores de crescimento em quantidades no mensurveis. Sobhana

& Rajeevan (2002b) verificaram que no meio de cultura MS, a adio de polpa de banana,

gua de coco, NAA e IBA foram favorveis germinao e desenvolvimento de sementes

de hbrido de Dendrobium, mostrando melhores resultados, quando comparado aos meios

Vacin & Went (1949) e Knudson (1946).

1.5. Trocas gasosas em cultivo in vitro

Grout & Aston (1977), trabalhando com rosas cultivadas in vitro, observaram uma

alta taxa de sobrevivncia (84 %) na aclimatizao quando se utiliza algodo na vedao

dos frascos, reduzindo a umidade e possivelmente estimulando a sntese de cera

epicuticular, permitindo maior atividade fotossinttica in vitro pela disponibilidade de CO2

da atmosfera interna e reduzindo a concentrao de gs etileno. Por outro lado, plantas

cultivadas in vitro fechadas hermeticamente tiveram reduo no nvel de clorofila, aumento

de CO2 onde no favorecero o desenvolvimento dos explantes (De Proft et al. 1985).

1.6. Fonte e dreno

A fonte de carbono metabolizado nas angiospermas provm do tecido

fotossinteticamente ativo (folhas, caules, frutos e razes verdes) e a produo de

carboidratos oriunda das folhas maduras utilizada como fonte de energia para tecidos em

crescimento e desenvolvimento (dreno) como novas razes e folhas, flores, bulbos,

tubrculos e frutos (Roitsch & Ehneb 2000).

8

Os carboidratos so uma importante fonte de energia para o crescimento e

desenvolvimento de razes atuando como fonte de energia e de esqueletos de carbono para

os tecidos jovens e tambm na manuteno do potencial osmtico do meio celular (Itai &

Birnbaum 1996).

1.7. Carboidratos

Os acares solveis so essenciais ao metabolismo, no desenvolvimento e em

muitos processos fisiolgicos (Gibson 2000) e metablicos tais como a fotossntese e na

sntese e degradao de amido em plantas superiores (Koch 1996, Krapp et al. 1993). Chu

& Figueiredo-Ribeiro (2002) observaram que a utilizao de sacarose nas concentraes de

1,5 a 8 % em plantas do gnero Dioscorea cultivadas in vitro, retardou o desenvolvimento

das folhas em relao s plantas que foram cultivadas em ambiente natural, porm

estimularam a formao de bulbilhos nos caules.

Segundo Kraus et al. (2004), os carboidratos esto envolvidos no processo que

antecedem a diviso celular, possivelmente servindo como fonte de energia, pois quando

cultivaram pices radiculares isolados de Catasetum frimbiatum in vitro, durante 24 a 48

horas, observaram a presena de amiloplastos na regio subapical e adjacncias, sendo que

aps 72 horas estas organelas no estavam mais presentes. Lon & Sheen (2003)

mostraram que houve uma interao complexa entre acares e reguladores vegetais

(etileno e cido abscsico), quando mutantes de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. foram

cultivados in vitro em diferentes concentraes de acares exgenos, onde as razes

apresentaram um desenvolvimento diferenciado e que podem ter sido estimulados por um

mesmo sinal em diferentes concentraes de carboidratos.

9

A sacarose um componente importante no meio de cultura in vitro, servindo como

fonte de esqueleto de carbono e energia. Faria et al. (2004) cultivando Dendrobium nobile

Lindl. (Orchidaceae) em diferentes concentraes de sacarose em meio de cultura MS

observaram que houve crescimento da parte area in vitro sem a adio de reguladores de

crescimento, porm no estimularam o crescimento de novas razes adventcias.

White (1934), em seus estudos pioneiros com razes de tomate, mostrou que a

sacarose foi superior a outros tipos de carboidratos no estmulo do crescimento deste

rgo. Altos valores na relao de carbono/nitrognio favorecem o enraizamento, atravs

do balano das concentraes de carboidratos solveis como sacarose, frutose e glicose,

que conseqentemente iro atuar na parte area (Read 1990). Segundo Vant Hof (1968),

os carboidratos possuem papel fundamental no processo de diviso celular no pice

radicular e em seu experimento com Pisum sativum L., as clulas de razes excisadas no

se dividiram at ser adicionada sacarose ao meio de cultura. Arditti (1984) detectou

diferentes carboidratos em P. amabilis, sendo que os principais foram a xilose, glicose,

sacarose, manitol e sorbitol.

Tokuhara & Mii (2001) estabeleceram protocolos para a micropropagao de

plantas do gnero Phalaenopsis, a partir de gemas das hastes florais, utilizando diferentes

fontes de carboidratos como maltose, sorbitol, sacarose, frutose e glicose, estimulando a

formao de protocormides e calos em cultura de clulas em suspenso.

1.8. Amido

Grande parte do desenvolvimento das clulas vegetais envolve a degradao do

amido, tendo como fonte os carboidratos presentes nas razes, tubrculos, cotildones e

folhas (Smith et al. 2005).

10

O amido o composto de reserva em plantas superiores, servindo como fonte de

energia para o desenvolvimento inicial da planta e tem como produto de sua hidrlise, a

maltose (dissacardeo) e a glicose (monossacardeo) que esto presentes tanto nas fraes

de amilose (solvel em gua) como nas fraes de amilopectina (insolvel em gua)

(Badenhuizen, 1965).

1.9. Protena

As protenas correspondem a aproximadamente 30 % da massa seca total de uma

planta tpica (Taiz & Zeiger 1998), englobando as estruturas citoesquelticas (microtbulos

e microfilamentos), as protenas de reservas principalmente de sementes (globulinas e

prolaminas), as enzimas como catalisador biolgico e em menor quantidade os peptdeos e

os aminocidos.

A sntese de protenas ocorre no retculo endoplasmtico rugoso (75 % do total),

onde o RNA mensageiro permite a correta seqncia de ligaes peptdicas de

aminocidos (Spremulli 2000). Os aminocidos so compostos de esqueleto de carbono

(derivado da gliclise, fotossntese, via pentose ou ciclo do cido ctrico) e esto

associados ao nitrognio inorgnico (H3N+) sendo o glutamato, a glutamina, o aspartato e a

asparagina os principais compostos fornecedores do nitrognio para os demais

aminocidos translocados pelo floema (Coruzzi & Last 2000).

Segundo Peres & Kerbauy (2004), pelo menos 2 protenas (invertase e

transportadora de hexoses) tm participao direta nos drenos, as quais so necessrias

para o descarregamento do floema, sendo que a enzima invertase favorece o fornecimento

contnuo de carboidratos e, ao mesmo tempo, a hexose necessria para que os acares

entrem nas clulas do tecido dreno.

11

Altos nveis de protena podem estar relacionados grande taxa de diviso mittica,

pois a sntese de novas protenas acarreta mudanas morfolgicas e bioqumicas durante as

fases de crescimento e desenvolvimento (Gutmann et al. 1996, Silveira et al. 2004).

1.10. Enraizamento

A rizognese ocorre no perodo de uma a trs semanas e pode ser dividida em trs

etapas: induo, iniciao e alongamento de razes (Grattapaglia & Machado 1998).

Algumas espcies podem enraizar de forma rpida, outras so lentas ou, tambm,

podem no enraizar in vivo (Ford et al. 2002), mostrando a importncia do estudo

bioqumico e fisiolgico, quando se trata de induo de razes adventcias. Em condies

de cultura in vitro, a fase de enraizamento e posterior desenvolvimento um dos maiores

obstculos na propagao, podendo-se classificar os explantes em: (a) de fcil

enraizamento que ocorre atravs do tratamento com auxinas, observando-se a

desdiferenciao de clulas e acmulo de amido em at 24 horas, a induo e a formao

de razes seguindo-se a degradao de amido em 24 a 96 horas e diferenciao, com a

visualizao de primrdios radiculares aps 96 horas; a utilizao de reguladores pode ser

suspensa na ltima etapa; e (b) de difcil enraizamento, em que a induo e

desenvolvimento ocorrem em um perodo muito mais extenso (De Klerk 2002).

Novos estudos de induo e desenvolvimento de razes esto sendo conduzidos,

tendo como interesse o acmulo de compostos secundrios nestes rgos, exsudados que

afetam a rizosfera, a fitoremediao de metais txicos, micorrizas, interaes com outros

fungos (Bais et al. 2001) e as novas abordagens genticas no desenvolvimento do sistema

radicular em relao aos stios ativos de auxinas, tendo como base o seqenciamento do

DNA de Arabidopsis thaliana (Terasaka et al. 2005, Wang et al. 2005), bem como os

12

aspectos globais, correlacionando a dinmica das razes, como aumento de gs carbnico,

deposio de nitrognio e acidificao do solo (Norby & Jackson 2000) e ainda o ciclo de

carbono, nas quais as razes podem ser consideradas reservatrios (Gill & Jackson 2000).

De acordo com Itai & Birnbaum (1996), as razes produzem hormnios que so

translocados para as partes superiores da planta, influenciando a taxa e a natureza do

desenvolvimento do sistema caulinar. O aprimoramento da tcnica de cultura in vitro

possibilitou o acesso direto ao tecido radicular e tambm o controle mais rigoroso das

condies de cultivo, abrindo novas perspectivas para o estudo deste rgo. Segundo

Torrey (1976), as razes passaram a despertar interesse dos pesquisadores, no s do ponto

de vista morfolgico e anatmico, como tambm fisiolgico e ecolgico destacando-se: a)

as razes tm uma organizao meristemtica menos complexa que a do pice caulinar; b)

as razes produzem hormnios (citocininas, auxinas e cido abscsico) que so

transportados para outras partes da planta e, conseqentemente, iro influenciar no

desenvolvimento destas; c) o pice radicular possui todos os estgios de diferenciao

celular, tornando-se interessante para o estudo no desenvolvimento e crescimento; d) as

razes so rgos importantes no que se refere absoro de gua e de ons inorgnicos, e

na manuteno destes no substrato bem como a interao com fungos; e e) as razes podem

formar gemas como mecanismo de reproduo vegetativa para garantir a sobrevivncia da

espcie, alm de contribuir como reserva de compostos orgnicos e gua na famlia

Orchidaceae (Arditti & Ernst 1993, Bais et al. 2001).

A induo de sistemas radiculares funcionais in vitro difcil, devido ausncia de

plos absorventes nesta fase de desenvolvimento ocasionando a morte da planta logo aps

a transferncia ex vitro; dessa forma, necessrio que as razes que sero transplantadas

13

sirvam como fonte de energia para produzir novas razes funcionais na fase de

aclimatizao (Debergh & Maene 1981).

1.10.1. Enraizamento em Orchidaceae

As razes das plantas da famlia Orchidaceae so fasciculadas e no possuem plos

absorventes, sendo composta por cmbio vascular, crtex e velame (Arditti 1992). A

principal caracterstica das razes de orqudeas epfitas a presena do velame que em

condies in vivo e ambiente seco, possuem colorao branca. Em ambiente mido a

colorao se torna esverdeada devido presena de clorofila, sendo um rgo altamente

eficiente na fotossntese, podendo fixar aproximadamente 73 % de carbono na ausncia de

estresse hdrico (Winter & Holtum 2002). Kerbauy (1998) destaca que as razes de

orqudeas representam um nico stio ativo de fixao de dixido de carbono e estes rgos

podem desempenhar outras atividades como propagao vegetativa.

Em plantas do gnero Phalaenopsis, o velame composto por 2 a 3 camadas de

clulas lignificadas. Essas clulas podem ser tanto longas como curtas, sendo que as

primeiras so geralmente clulas mortas quando atingem a maturidade e as clulas curtas

so vivas. O velame pode servir como rgo de reserva (gua e nutrientes) e proteo,

principalmente para razes de orqudeas epfitas, pois estes no possuem a proteo fsica

do solo como as espcies terrestres (Arditti & Ernst 1993).

Segundo Paul & Starosta (1998), as razes de orqudeas possuem 3 funes: captar

gua e sas minerais, fixar solidamente a planta ao substrato e fotossntese pelas razes,

sendo a quantidade de carbono fixado pelas razes do gnero Phalaenopsis maior do que

nas folhas (Avadhani et al. 1990). Com relao fixao de carbono pelas razes, segundo

Tanaka et al. (1999) a concentrao de CO2 no interferiu no crescimento de explantes de

14

hbrido de Cymbidium cultivados in vitro. Em condies in vivo, Li et al. (2002)

mostraram que as razes do hbrido de Oncidium, aps 2 meses de crescimento em

ambiente com alta concentrao de CO2, tiveram maior crescimento das razes em relao

s plantas com baixos ndices de CO2. Pindel & Miczynski (1996) trabalhando com

fragmentos de folhas e razes de hbridos de Cymbidium cultivados em meio MS aps a

fase de multiplicao, induziram a formao de razes nos protocormides com a utilizao

de 18 mg L-1ABA.

Segundo Slump (2004), o crescimento das razes essencial para o

desenvolvimento das orqudeas pois tambm aumentam a capacidade de absoro de gua,

nutrientes e associaes com fungos.

1.11. Reguladores vegetais no enraizamento

Os hormnios ou reguladores vegetais atuam no s atravs da alterao de suas

concentraes, como tambm atravs de mudanas na sensibilidade das clulas receptoras

a estes compostos (Trewavas & Cleland 1983).

Segundo Mercier (2004), a ao das auxinas no alongamento celular depende da

afinidade da ligao entre a auxina e a protena receptora na membrana da clula. A

protena ABP1 (auxin binding protein1) caracterizada como uma protena receptora que

tem alta afinidade com a auxina porm, na membrana plasmtica, ela se encontra em

menor quantidade. Segundo Napier (2001), a protena ABP1 est associada induo de

razes adventcias alm do alongamento celular.

Uma outra protena chamada de RX, ainda no identificada, tem menor afinidade

com a auxina e encontra-se em menor quantidade. Neste caso, quando a auxina se encontra

15

em maior quantidade, h uma ligao entre a protena receptora RX e auxina que controla a

diviso celular (Mercier 2004).

Recentemente, Woodward & Bartel (2005a) trabalhando com Arabidopsis thaliana

(L.) Heynh, encontraram um stio proteico promotor no prprio DNA. Esta protena

receptora denominada T1R1 (Transport inhibitor response 1) esta ligada a fita de DNA

que impede o RNA polimerase de se ligar ao stio de transcrio. Quando a auxina se liga a

esta protena receptora, forma-se um complexo protena-auxina que se desliga da fita de

DNA, possibilitando que a enzima RNA polimerase se ligue ao stio promotor e

desencadeia o processo de formao do RNA mensageiro, seguindo-se a traduo de

enzimas e protenas.

Nos vegetais superiores, os stios de sntese hormonal no so to definidos e

localizados estruturalmente como nos animais (Trewavas 1981). As auxinas so os nicos

reguladores de crescimento que aumentam a formao de primrdios radiculares (Taiz &

Zeiger 1998), sendo predominantemente obtidas em tecidos jovens (Davies 1995) e de

forma inversa, as citocininas so produzidas principalmente nas razes (Itai & Birnbaum

1996), estimulando a iniciao de gemas caulinares (Pillary & Railton 1993).

Segundo Zaidan (1975), o crescimento da raiz, conseqncia do funcionamento do

meristema apical, sempre despertou interesse, tanto sob o ponto de vista fisiolgico quanto

anatmico. Quanto formao de razes, conhecido a observao de que estacas dotadas

de folhas e gemas em desenvolvimento formam razes mais facilmente do que estacas

desprovidas de folhas e gemas. A auxina produzida na parte area o principal fator de

estmulo formao de razes (Vannest et al. 2005).

16

Os reguladores de crescimento na cultura in vitro so adicionados para suprir as

deficincias dos teores endgenos do prprio explante, estimulando respostas de interesse

para diferenciao, crescimento, alongamento e multiplicao celular (Grattapaglia &

Machado 1990).

As auxinas so os nicos reguladores de crescimento que aumentam

consistentemente a formao de primrdios radiculares, pelo menos em tecidos que

naturalmente apresentam certa predisposio ao enraizamento (Haissig 1972), contudo as

respostas s auxinas no so universais (Hartmann & Kester 1983), ou seja, algumas

espcies enrazam com dificuldade ou no enrazam, mesmo com a utilizao deste tipo de

regulador.

Segundo Bridges et al. (1973), as auxinas presentes nas razes so de origem

caulinar. Outros autores, entretanto, consideram que esta pode ser sintetizada no pice

radicular (Moore 1979). Dore & Williams (1956) verificaram que a alta concentrao de

auxinas em pices radiculares de Armoracea rusticana inibiu a formao de gemas,

todavia, concentraes relativamente baixas deste hormnio foram estimulatrias.

Wardell & Skoog (1969a, 1969b, 1973) verificaram que a utilizao exgena de

auxinas em altas concentraes in vitro, aumentou a formao de gemas em Nicotiana

tabacum cv. Wisconsin-38. Por outro lado, em baixas concentraes induziu a

neoformao de gemas florais.

Uma das auxinas mais utilizadas na induo do enraizamento o AIB (cido indol-

butrico) (Bachelard & Stowe 1963, Grattapaglia & Machado 1998, Radmann et al. 2002),

que em associao com outras auxinas podem promover maior nmero de razes do que

isoladamente (Hartmann & Kester 1983).

17

Tanaka et al. (1976) trabalhando com P. amabilis obtiveram poucos

protocormides a partir de fragmentos de razes de mudas provenientes de semente, sem a

adio de reguladores de crescimento. Kerbauy (1984a, b) trabalhando com Oncidium

varicosum conseguiu regenerar um grande nmero de plantas a partir de pices radiculares.

O mesmo resultado foi observado em Catasetum fimbriatum (Kerbauy 1984b) e Vanilla

planifolia (Philip & Nainar 1986). Diferentes tipos e concentraes de auxinas em outras

espcies de orqudeas promoveram diferentes respostas (Arditti & Ernst 1993).

Radmann et al. (2002) observaram que a adio de reguladores de crescimento em

porta-enxertos de macieira cultivada in vitro apresentou formao de razes adventcias e

maior porcentagem de sobrevivncia na fase de aclimatizao, indicando que razes

induzidas na fase de cultivo in vitro so importantes para o desenvolvimento da planta.

Para regenerao de protocormides derivados de propagao via semente de P.

amabilis, Chen & Chang (2004) utilizaram 50 % da concentrao de macronutrientes e

micronutrientes de MS onde obtiveram 100 % de protocormides regenerados com a

adio de 1,0 mg L-1 de TDZ (Thidiazuron). No entanto, a utilizao do mesmo meio com

ANA inibiu a formao de protocormides. A utilizao de altas concentraes de AIA

(5,0 mg L-1) in vitro, inibiu o crescimento e desenvolvimento de Phalaenopsis sp. (Arditti

1992).

A utilizao de 1,0 mg L-1 ANA e 20 mg L-1 BA formam protocormides em

Phalaenopsis sp. (Park et al. 2002). Em condies in vivo a utilizao de ANA na

concentrao de 0,02 mg L-1 induz a formao de mudas em gemas da haste floral (Arditti

& Ernst 1993).

18

Segundo Arditti & Ernst (1993), diversas respostas foram observadas em plantas de

Phalaenopsis com aplicao in vivo de altas concentraes de AIB (1,0 a 5,0 mg L-1),

sendo que Arditti (1992) constatou: a) inibio da haste floral, b) desenvolvimento do

vulo, pois plantas deste gnero produzem poucas sementes, c) quebra da dominncia do

monopdio, e d) induo de mudas laterais. Em condies in vitro pode ocorrer a quebra

da dominncia do monopdio e induo na formao de mudas laterais.

1.11.1. Auxinas e efeitos herbicidas

As auxinas como cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) e o picloram tem efeito

herbicida com respostas similares s altas concentraes de AIA no crescimento da planta.

O 2,4-D usualmente empregado no controle de plantas invasoras de folhas largas e o

picloram no controle de ps-colheita devido a sua alta atividade e persistncia no solo.

Ambos causam epinastia das folhas, expanso radial e alongamento da parte area,

podendo induzir a formao de calos em cultura in vitro (Gianfagna 1988).

O 2,4-D um herbicida seletivo, induz a morte de dicotiledneas e de algumas

gramneas descontrolando o seu crescimento, no sendo considerado persistente pois

degrada em 10 anos em condies naturais. Em baixas concentraes, estimula a sntese de

RNA, de DNA e de protenas. Com a aplicao contnua leva ao descontrole da diviso

celular, do crescimento e ocorre a destruio do tecido vascular com a morte das plantas

entre 3 a 5 meses (Tu et al. 2001).

O 2,4-D exibe grande atividade auxnica, apresentando menor atividade sobre as

gramneas pois apresentam diferenas nos stios de ligao do regulador e tambm

induzem a sntese de etileno (Usui 2001).

19

Segundo Grattapaglia & Machado (1998), o 2,4-D induz, in vitro, a formao de

calos mesmo em baixas concentraes. A utilizao de 2,4-D in vitro em ao conjunta

com TDZ induz a formao de calos (Chen et al. 2000). Em condies in vivo a utilizao

de 10 mg L-1 2,4-D aumenta o comprimento de mudas de Phalaenopsis sp., porm inibe o

seu desenvolvimento (Arditti & Ernst 1993).

1.12. Luminosidade

As orqudeas podem comportar-se tanto como plantas CAM (em condies de

estresse hdrico) ou C3 (sem estresse hdrico). A mesma luminosidade pode influenciar

negativamente na induo das razes, ocasionando a reduo dos teores de AIA endgenos,

assim como o acmulo de fenis e seus subprodutos que podem inibir o enraizamento

(Assis & Teixeira 1998). Segundo Winter & Holtum (2002), 73,3 % da fixao de carbono

ocorre durante a fase escura e comum confundir plantas CAM com plantas C3. No

entanto, elas podem se diferenciar pela quantidade de carbono fixado durante a fase escura,

sendo que as plantas CAM fixam 71 a 77 % durante a noite, enquanto que as plantas C3

fixam apenas 1/3.

As razes do gnero Phalaenopsis so fotossintetizantes e a fixao de carbono

maior do que nas folhas (Avadhani et al. 1990). Para o melhor desenvolvimento e a sua

propagao, o sistema radicular deve ser o mais amplo possvel, com exposio radiao

solar e que nos novos procedimentos de tratos culturais, os vasos so transparentes.

1.13. Aclimatizao

A aclimatizao um processo de adaptao de plantas cultivadas in vitro para o

ambiente ex vitro (Bosa et al. 2003). Segundo Naves (2001), este processo tem sido uma

das fases mais crticas e so poucos os trabalhos que relatam as dificuldades nesta etapa.

20

Grattapaglia & Machado (1998) consideram que existem vrios fatores que interferem no

processo de aclimatizao sendo os principais abiticos: luminosidade, nutrientes e

umidade relativa.

Cozai & Kitaya (1995) observaram que as condies in vitro como umidade

relativa, temperatura do ar, alta concentrao de CO2, ons e reguladores de crescimento

so alterados quando essas plantas so submetidas a condies de aclimatizao,

dificultando o seu crescimento, ocorrendo reduo na absoro de gua e ons pelo sistema

radicular.

Os explantes vegetais mantidos in vitro absorvem carboidratos e compostos

nitrogenados inorgnicos do meio de cultura em que se desenvolve, atravs da prpria raiz

ou por difuso nas clulas em contato com o meio, permitindo obter energia, esqueletos de

carbono, nitrognio e outros ons para o seu desenvolvimento. Na aclimatizao, o

explante retirado das condies asspticas e conta somente com os compostos orgnicos

acumulados nas partes area e radicular, sendo necessrio desenvolver novas folhas com o

processo fotossinttico e estmatos funcionais, novas razes para fixao e absoro

(Hazarica 2003). Segundo Debergii (1991), as plantas em fase de aclimatizao utilizam as

reservas acumuladas durante o perodo de cultivo in vitro para garantir a sua sobrevivncia,

durante as alteraes morfolgicas e fisiolgicas em respostas s condies do ambiente de

propagao e crescimento.

21

2. Objetivos

O aumento do nmero de razes nas plantas propagadas in vitro, de grande

importncia econmica e horticultural pois possibilita a sustentao da planta na fase de

aclimatizao evitando com que as folhas da muda entrem em contato com o substrato.

Durante o manejo em casa de vegetao, podem ocorrer perdas por pragas e doenas por

tombamento devido a irrigaes e pulverizaes.

Os tratamentos que possibilitam melhor enraizamento e maior acmulo de

nutrientes (compostos de molculas de carbono na forma de amido e carboidratos solveis

e molculas nitrogenadas na forma de protenas solveis e peptdeos) permitem maior

probabilidade de sobrevivncia dos explantes na fase ex vitro.

A remobilizao dos nutrientes das folhas e das razes acumuladas na fase in vitro

possibilitariam a formao ex vitro de novas folhas com o processo fotossinttico

funcional, mecanismos contra perda de gua ativos (estmatos, cutcula e tricomas) bem

como novas razes para fixao e sustentao no substrato, e velame fotossinttico,

tornando um explante autotrfico em um curto perodo, proporcionando seu melhor

desenvolvimento na fase de aclimatizao.

O trabalho teve como objetivo estudar o efeito de diferentes concentraes das

auxinas AIB, ANA e 2,4-D na induo, no desenvolvimento e no crescimento de plantas

de P. amabilis cultivados in vitro, avaliando-se os parmetros biomtricos, nmero, massa

fresca e seca de folhas, razes e brotos e as anlises bioqumicas de carboidratos solveis

totais, amido e protena total solvel de folhas, razes e brotos.

22

3. Material e mtodos

O estudo foi desenvolvido no Instituto de Botnica, sendo as anlises bioqumicas

realizadas no Laboratrio da Seo de Fisiologia e Bioqumica de Plantas, o cultivo in

vitro e as anlises biomtricas no Laboratrio de Cultura de Tecido da Seo de

Ornamentais.

3.1. Obteno das plantas de Phalaenopsis amabilis

As plantas de Phalaenopsis amabilis (Lineu) Blume utilizadas no estudo, com

aproximadamente 360 dias de cultivo in vitro (Figura 6), foram obtidas atravs da

semeadura in vitro com sementes aptas inoculao provenientes de cpsulas de plantas

matrizes selecionadas e mantidas na coleo do Orquidrio Ori de So Paulo (Figura 7). As

plantas matrizes foram adquiridas da coleo do Orquidrio Habu, onde foram

selecionadas atravs de cruzamentos da espcie P. amabilis (Figura 8).

Figura 6. Mudas de P. amabilis com aproximadamente 360 dias de cultivo in vitro, barra = 3 cm (Ori 2004).

23

Figura 7. Planta adulta de P. amabilis selecionada do Orquidrio Ori, barra = 5 cm (Ori 2003).

Figura 8. Planta adulta de P. amabilis selecionada no Orquidrio Habu, barra = 5cm (Ori 1999).

3.2. Inoculao in vitro e condies de cultivo

As plantas com aproximadamente 5,0 cm de altura, 2,0 cm de largura e 2 folhas

tiveram as razes excisadas para uniformizao e sua induo com os tratamentos de

auxina.

As plantas foram inoculados em meio de cultura MS (Anexo 1) modificado, com 10

% da concentrao de macronutrientes, concentraes normais de micronutrientes e

24

vitaminas, 3 % de sacarose, e 5,0 g L-1 de gar, pH ajustado para 5,8 e acrescido de

diferentes concentraes de auxinas.

Com a finalidade de estabelecer o melhor tratamento para o estmulo e emisso de

novas razes das plantas de P. amabilis, foram adicionados ao meio MS as auxinas ANA,

AIB nas concentraes de 0,2; 1,0 e 5,0 mg L-1 e 2,4-D nas concentraes de 0,032; 0,160

e 0,800 mg L-1 e os respectivos controles (tratamentos sem adio de reguladores de

crescimento).

Foram adicionados 60 mL dos meios de cultura em frascos de vidro transparente,

com capacidade de 500 mL, fechados com tampa de polipropileno adaptada com tubete

tambm de polipropileno preenchida de algodo hidrfobo e autoclavados por 20 minutos,

a 121 oC e 1,2 atm. Foram inoculadas 5 plantas por frasco em condies asspticas e

posteriormente, colocados em sala de crescimento com 25,0 mol m-2 s-1 de radiao

fotossinteticamente ativa (PAR), temperatura mdia de 25 oC, fotoperodo de 12 horas,

sendo o intervalo de iluminao das 6h s 18h e incubadas durante 120 dias. As trocas dos

meios foram realizadas a cada 30 dias at completar 120 dias de cultivo.

3.3. Coleta do material para as anlises biomtricas e bioqumicas

3.3.1. Anlises biomtricas e preparo das amostras

As coletas foram realizadas aos 30, 60, 90 e 120 dias de cultivo, onde foram

retiradas aleatoriamente 2 frascos, totalizando 10 plantas analisadas por tratamento.

As variveis biomtricas analisadas foram o nmero, massa fresca e massa seca de

razes, folhas e brotos. Foram considerados como brotos, as massas celulares compactas de

colorao esverdeada que surgiram na fase de induo no incio do experimento, com

25

estruturas semelhantes gemas. As plantas foram pesadas em balana analtica para

determinao da massa fresca de cada rgo considerado. Em seguida, cada material foi

congelado a uma temperatura de -18 oC e liofilizado, obtendo-se as respectivas massas

secas, expressas em gramas.

O material seco de cada planta foi reunido nos respectivos tratamentos, triturado em

micromoinho com peneira de malha 0,2 mm e dividido em 3 amostras de 100 mg para

realizao das extraes e anlises bioqumicas.

3.3.2. Extrao e determinao dos teores de carboidratos solveis totais

As extraes para as anlises bioqumicas dos perodos de 30 e 120 dias foram

realizados nos mesmos indivduos utilizados nas anlises biomtricas.

A partir de cada amostra liofilizada e triturada (100 mg de massa), foi realizada 3

extraes com 5 ml de soluo de etanol (80 %), homogeneizados durante 10 minutos em

cada extrao. A seguir foram centrifugados a 1000 g durante 10 minutos em temperatura

ambiente, obtendo-se o extrato sobrenadante e o resduo da extrao, sendo estes

acrescidos aos respectivos sobrenadantes e o seu volume medido.

Os carboidratos solveis totais foram determinados, em triplicata, utilizando o

mtodo do cido fenol-sulfrico (Dubois et al. 1956) e a leitura realizada em

espectrofotmetro no comprimento de onda de 490 nm, os valores foram expressos em

teores de carboidratos solveis (mg carboidrato por grama de massa seca), tendo como

padro D-glucose (curva padro: y = 0,0185x - 0,0273; R2 = 0,9968).

26

3.3.3. Extrao e determinao de protena solvel total

Ao resduo resultante da extrao etanlica foi adicionado 5 mL de tampo fosfato

0,2 M e pH 6,7, homogeneizado por 10 minutos e centrifugado a 1000 g a temperatura

ambiente, com 3 repeties da extrao, obtendo-se os sobrenadantes e o resduo. Os

sobrenadantes foram reunidos e o volume final mensurado.

A determinao dos teores de protena solvel total foi realizada de acordo com o

mtodo de Bradford (1976) utilizando o corante Coomassie Blue R e tendo como padro

albumina bovina. A leitura foi realizada em espectrofotmetro no comprimento de onda de

595 nm e o teor de protena solvel total foi expresso em mg de protena por grama de

massa seca (curva padro: y = 0,0095x + 0,0191; R2 = 0,9802).

3.3.4. Extrao e determinao do teor de amido

O resduo resultante das extraes foi utilizado para extrao de amido, adicionado-

se 5,0 mL de cido perclrico 52 %, homogeneizado a 4 oC por 15 minutos com agitao

peridica e centrifugado a 1000 g, na temperatura ambiente durante 10 minutos,

totalizando duas extraes.

Os sobrenadantes foram reunidos e mensurados, obtendo-se o extrato de amido e o

resduo descartado. Para a anlise de amido foi utilizado como padro D-glucose

(McCready et al. 1950) multiplicado pelo fator de correo 0,9 (estimativa padro para

amido vegetal). O teor de amido foi expresso em (mg de amido g-1 de massa seca),

utilizando-se a curva padro de D-glucose.

27

3.4. Anlises estatsticas

O espao amostral do experimento foi de 720 plantas de P. amabilis com

aproximadamente 360 dias de cultivo in vitro, divididos em 3 tratamentos de auxinas (AIB,

ANA e 2,4-D) nas diferentes concentraes descritas anteriormente.

As comparaes das mdias biomtricas obtidas nos tratamentos de AIB, ANA e

2,4-D nos perodos de 30, 60, 90 e 120 dias foram analisadas por ANOVA atravs do

programa estatstico SANEST (Zonta & Machado 1991). Foram realizadas as anlises de

varincia de regresses polinomiais de primeiro e segundo grau, sendo que as

significncias esto dispostas nas figuras de cada tratamento e teste TUKEY com nvel de

significncia de 5 %.

As comparaes das mdias bioqumicas quantitativas de carboidratos solveis,

amido e protena solvel total das folhas, razes e brotos foram realizadas aos 30 e 120

dias. As mdias foram comparadas ao nvel de significncia 5 % utilizando o teste

TUKEY.

28

4. Resultados

4.1. Anlises biomtricas

As anlises biomtricas foram realizadas utilizando-se como parmetros nmero,

massa fresca e seca de folhas, razes e brotos nas diferentes concentraes de auxinas aos

30, 60, 90 e 120 dias. As figuras dos anexos 2, 3 e 4 mostram aspectos gerais das plantas

nos diferentes perodos de cada tratamento.

4.1.1. Efeito do AIB no nmero de folhas e razes

A figura 9 mostra a resposta dos explantes de P. amabilis, quando submetidos aos

tratamentos com 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1 de AIB e analisadas aos 30, 60, 90 e 120 dias,

tendo como varivel o nmero de folhas.

O teste TUKEY 5 % (Anexo 5) mostra que as mdias do nmero de folhas no foram

significativas para o fator tratamento, porm foram significativas para o fator tempo (P 99,9

%) e apresentou interao entre os fatores tempo e tratamento (P 99,9 %). Aos 30 dias e 60

dias todos os tratamentos foram estatisticamente iguais ao controle. Aos 90 dias os maiores

valores ocorreram no controle e na concentrao de 1,0 mg L-1 de AIB, valor intermedirio

com 0,2 mg L-1 de AIB e menor valor para 5,0 mg L-1 de AIB. Aos 120 dias o maior valor

para o nmero de folhas ocorreu na maior concentrao (5,0 mg L-1 de AIB), valores

intermedirios foram obtidos no controle e em 0,2 mg L-1 de AIB e menor valor para o

tratamento com 1,0 mg L-1 de AIB.

A anlise de regresso (figura 9 A - texto) mostrou que todos os tratamentos foram

significativos, variando segundo uma regresso linear, com decrscimo do nmero de

folhas com o aumento do perodo de cultivo, com exceo do tratamento com 5,0 mg L-1 de

AIB que variou segundo a equao do 2o grau e observou-se que houve perda de folhas

entre 30 e 60 dias e aumento de folhas entre 90 e 120 dias.

29

Figura 9. Nmero de folhas de P. amabilis nos tratamentos com 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1 AIB nos perodos de 30, 60, 90 e 120 dias; (A) regresses: controle 0,0 mg L-1 y = -0,016x + 5,05 e R2 = 0,59*; AIB 0,2 mg L-1 y = -0,024x + 5,15 e R2 = 0,89**; AIB 1,0 mg L-1 y = -0,025x + 5,10 e R2 = 0,71***; AIB 5,0 mg L-1 y = 0,0013x2 - 0,20x + 9,92 e R2 = 0,92***; (B) anlise estatstica pelo teste TUKEY 5 % mostra as diferenas significativas entre os tratamentos representados pelas diferentes letras maisculas e as diferentes letras minsculas representam as diferenas significativas entre os tempos; ns = no significativo, * = significativo a 95 %, ** = significativo a 99 % e *** = significativo a 99,9 %. Nmero de repeties em cada tempo e tratamento = 10 plantas.

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

30 60 90 120

Tempo (dias)

Nm

ero

de fo

lhas

+

AaAa

AaAa

AaAab

Aab

Aa

ABb

Aa

ABbABa

Aab

Bb

Abc

Bc

B

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0 30 60 90 120 150

Tempo (dias)

Nm

ero

de fo

lhas

A

5,0

1,0 0,2

Controle

Tratamento de AIB (mg L-1)

30

A figura 10 mostra a resposta dos explantes de P. amabilis nos tratamentos com 0,0,

0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1 de AIB, nos perodos de 30, 60, 90 e 120 dias, tendo como varivel o

nmero de razes. O teste TUKEY 5 % (ANEXO 5) mostra que as mdias para o nmero de

razes foram significativas para o fator tempo (P 99,9 %), o fator tratamento (P 99,0 %) e

mostrou interao entre os dois fatores (P 99,9 %). O nmero de razes foi estatisticamente

igual entre os tratamentos dentro dos perodos de 30 dias, 60 e 90 dias e apresentaram

diferena significativa aos 120 dias com maior nmero de razes no controle e na

concentrao de 0,2 mg L-1 de AIB e menores valores significativos para 1,0 e 5,0 mg L-1

de AIB (figura 10 B).

A anlise de regresso mostra que as mdias dos pontos se ajustam s retas no

controle e no tratamento com 0,2 mg L-1 de AIB e tambm se ajustam curva do

tratamento com 5,0 mg L-1 de AIB, no entanto, no foram significativos para o tratamento

com 1,0 mg L-1 de AIB (figura 10 A - texto). Observa-se um aumento no nmero de razes

com o tempo para o controle e 0,2 mg L-1. Para o tratamento com 5,0 mg L-1, um aumento

de at 60 dias e posterior reduo de 60 at 120 dias.

31

Figura 10. Nmero de razes de P. amabilis nos tratamentos com 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1 AIB nos perodos

de 30, 60, 90 e 120 dias; (A) regresses: controle 0,0 mg L-1 y = 0,05x - 0,05 e R2 = 0,80***; AIB 0,2 mg L

-1 y = 0,04x + 0,75 e R2 = 0,83***; AIB 1,0 mg L- 1y = -0,0003x2 + 0,05x + 1,52 e R2 = 0,99ns; AIB 5,0 mg L-1 y = -0,0008x2 + 0,107x + 0,6 e R2 = 0,981*; (B) anlise estatstica pelo teste TUKEY 5 % mostra as diferenas significativas entre os tratamentos representados pelas diferentes letras maisculas e as diferentes letras minsculas representam as diferenas significativas entre os tempos; ns = no significativo, * = significativo a 95 %, * = significativo a 95 % e *** = significativo a 99,9 %. Nmero de repeties em cada tempo e tratamento = 10 plantas.

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

0 30 60 90 120 150

Tempo (dias)

Nm

ero

de r

aze

s

A

5,0

1,0 0,2

Controle

Tratamento de AIB (mg L-1)

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

30 60 90 120

Tempo (dias)

Nm

ero

de r

aze

s

Ab

Ab

Aa Aab Ab

Aa

Aa AbAa Aa

Aa

Aa

Ba

Bb

Aa

Aab

B

32

4.1.2. Efeito do AIB na massa fresca de folhas e razes

A figura 11 mostra a mdia dos valores de massa fresca das folhas no perodo de 30

aos 120 dias dos tratamentos com 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1 de AIB, cujas mdias foram

comparadas pelo teste TUKEY 5% e de anlise de varincia da regresso das mdias ao

longo do tempo.

A comparao das mdias pelo teste TUKEY 5% (Anexo 5) mostra que houve

diferena significativa no fator tempo (P 95%) e no fator tratamento (P 95%). Mostrou

tambm interao entre o tempo e tratamento (P 99%).

A figura 11 B mostra que as mdias da massa fresca das folhas no controle foram

estatisticamente iguais dos 30 aos 120 dias. O mesmo comportamento foi observado no

tratamento com 0,2 mg L-1 de AIB. O tratamento com 1,0 mg L-1 de AIB obteve maior

valor aos 30 dias, valores intermedirios aos 60 e 90 dias e menores valores de massa fresca

das folhas aos 120 dias. O tratamento com 5,0 mg L-1 de AIB mostrou o maior valor para a

massa fresca das folhas aos 30 dias e menores valores nos perodos seguintes. As mdias

foram estatisticamente iguais entre os tratamentos aos 30 dias e aos 60 dias, exceto para 5,0

mg L-1. Aos 90 dias o maior valor ocorreu no controle, valores intermedirios na

concentrao de 0,2 e 1,0 mg L-1 de AIB e menor valor para o tratamento com 5,0 mg L-1

de AIB.

A anlise de regresso (figura 11 A - texto) mostrou-se significativo para as

concentraes de 1,0 e 5,0 mg L-1 de AIB sendo que o tratamento com 1,0 mg L-1 de AIB

reduziu a massa fresca das folhas dos 30 aos 120 dias. A concentrao de 5,0 mg L-1 de

AIB teve efeito inibitrio dos 30 aos 90 dias com aumento da massa fresca das folhas aps

este perodo.

33

Figura 11. Massa fresca das folhas de P. amabilis nos tratamentos com 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1 AIB nos

perodos de 30, 60, 90 e 120 dias; (A) regresses: controle 0,0 mg L-1 y = 1,61x + 539,69 e R2 = 0,63ns; AIB 0,2 mg L-1 y = 1,36x + 447,06 e R2 = 0,60ns; AIB 1,0 mg L-1 y = -3,54x + 745,7 e R2 = 0,58*; AIB 5,0 mg L-1 y = 0,22x2 - 39,00x + 1830 e R2 = 0,98***; (B) anlise estatstica pelo teste TUKEY 5 % mostra as diferenas significativas entre os tratamentos representados pelas diferentes letras maisculas e as diferentes letras minsculas representam as diferenas significativas entre os tempos; ns = no significativo, * = significativo a 95 % e *** = significativo a 99,9 %. Nmero de repeties em cada tempo e tratamento = 10 plantas.

5,0

1,0 0,2

Controle

Tratamento de AIB (mg L-1)

0,00

300,00

600,00

900,00

1200,00

0 30 60 90 120 150

Tempo (dias)

Mas

sa fr

esca

(mg)

A

0

300

600

900

1200

1500

30 60 90 120Tempo (dias)

Mas

sa fr

esca

(mg)

AaAa

Aa

Aa

Aa

Aa

Aab

Bb

Aa

ABa ABab

AaAa

Bb

Bb

Ab

B

34

A figura 12 mostra os valores de massa fresca das razes no perodo de 30 aos 120

dias dos tratamentos com 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1de AIB. As mdias foram comparadas

atravs do teste TUKEY 5% (figura 12 - legenda) mostrou que a mdia para a massa fresca

das razes no foi significativa para o fator tratamento, porm foi significativo para o fator

tempo (P 99,9 %) e no mostrou interao entre os dois fatores.

A maior mdia para a massa fresca das razes ocorreu aos 120 dias, valores

intermedirios aos 60 e 90 dias e valores menores aos 30 dias (figura 12 B).

A anlise de regresso mostrou que todas as mdias no foram significativas ao

longo do tempo (figura 12 A - texto).

35

Figura 12. Massa fresca das razes de P. amabilis nos tratamentos com 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1 AIB nos

perodos de 30, 60, 90 e 120 dias; (A) regresses: controle 0,0 mg L-1 y = 7,50x + 63,26 e R2 = 0,98ns; AIB 0,2 mg L-1 y = 9,72x + 48,20 e R2 = 0,96ns; AIB 1,0 mg L-1 y = 4,18x + 238,39 e R2 = 0,90ns; AIB 5,0 mg L

-1 y = 5,97x + 289,43 e R2 = 0,89ns; (B) anlise estatstica pelo teste TUKEY 5 % mostra as mdias seguidas de letras maisculas que comparam as diferenas significativas entre o fator tratamento e mdias seguidas de letras minsculas comparam as diferenas significativas entre o fator tempo; ns = no significativo e nmero de repeties em cada tempo e tratamento = 10 plantas.

737,58 a 5,0

552,23 a 1,0 777,45 a0,2

625,85 a Controle

Mdia da massa fresca (mg)

Tratamento de AIB (mg L-1)

0

300

600

900

1200

1500

0 30 60 90 120 150

Tempo (dias)

Mas

sa fr

esca

(mg)

A

0

300

600

900

1200

1500

30 60 90 120

Tempo (dias)

Mas

sa fr

esca

(mg)

366,27 C558,87 BC

796,21 AB

971,76 A

B

36

4.1.3. Efeito do AIB na massa seca de folhas e razes

A figura 13 apresenta o grfico com as regresses lineares dos tratamentos com 0,0,

0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1 de AIB, mostrando os valores da massa seca das folhas aos 30, 60, 90

e 120 dias.

O teste TUKEY 5 % (figura 13 B - legenda) mostra que a massa seca das folhas no

foi significativa para os fatores tempo e tratamento. No houve interao entre o fator

tempo e tratamento.

A anlise de regresso mostrou que todas as mdias dos pontos dos tratamentos no

foram significativos ao longo do tempo (figura 13 A - texto).

37

Figura 13. Massa seca das folhas de P. amabilis nos tratamentos com 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1 AIB nos perodos de 30, 60, 90 e 120 dias; (A) regresses: controle 0,0 mg L-1 y = 0,08x + 70,41 e R2 = 0,02ns; AIB 0,2 mg L-1 y = -0,01x + 64,96 e R2 = 0,02ns; AIB 1,0 mg L-1 y = -0,57x + 97,32 e R2 = 0,74ns; AIB 5,0 mg L

-1 y = -0,58x + 95,56 e R2 = 0,47ns; (B) anlise estatstica pelo teste TUKEY 5 % mostra as mdias seguidas de letras maisculas que comparam as diferenas significativas entre o fator tratamento e mdias seguidas de letras minsculas comparam as diferenas significativas entre o fator tempo; ns = no significativo e nmero de repeties em cada tempo e tratamento = 10 plantas.

51,60 a 5,0

54,49 a 1,0 63,68 a0,2

76,80 a Controle

Mdia da massa seca (mg)

Tratamento de AIB (mg L-1)

0

20

40

60

80

100

120

140

30 60 90 120

Tempo (dias)

Mas

sa se

ca (m

g)

77,64 A61,16 A

55,46 A 52,31 A

B

0

20

40

60

80

100

120

0 30 60 90 120 150

Tempo (dias)

Mas

sa se

ca (m

g)A

38

A figura 14 mostra a resposta dos explantes de P. amabilis nos tratamentos com 0,0,

0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1 de AIB, nos perodos de 30, 60, 90 e 120 dias, tendo como parmetro

a massa seca das razes.

O teste TUKEY 5 % (Anexo 5) mostra que as mdias para a massa seca das razes

no foram significativas para o fator tratamento, no entanto, foram significativas para o

fator tempo (P 99 %) e no mostrou interao entre os dois fatores. Os resultados mostram

que as razes desenvolveram mais aos 120 dias, sendo que os valores intermedirios foram

obtidos aos 60 e 90 dias e os valores menores aos 30 dias (figura 14 B).

A anlise de regresso mostrou que todas as mdias dos pontos dos tratamentos no

foram significativos ao longo do tempo (figura 14 A - texto).

39

Figura 14. Massa seca das razes de P. amabilis nos tratamentos com 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1 AIB nos

perodos de 30, 60, 90 e 120 dias; (A) regresses: controle 0,0 mg L-1 y = 0,83x - 3,51 e R2 = 0,83ns; AIB 0,2 mg L-1 y = 1,14x - 10,18 e R2 = 0,94ns; AIB 1,0 mg L-1 y = 0,57x + 19,45 e R2 = 0,99ns; AIB 5,0 mg L

-1 y = 0,647x + 21,03 e R2 = 0,77ns; (B) ) anlise estatstica pelo teste TUKEY 5 % mostra as mdias seguidas de letras maisculas que comparam as diferenas significativas entre o fator tratamento e mdias seguidas de letras minsculas comparam as diferenas significativas entre o fator tempo; ns = no significativo e nmero de repeties em cada tempo e tratamento = 10 plantas.

69,56 a 5,0

62,36 a 1,0 75,36 a0,2

59,00 a Controle

Mdia da massa seca (mg)

Tratamento de AIB (mg L-1)

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

140,00

0 30 60 90 120 150

Tempo (dias)

Mas

sa se

ca (m

g)

A

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

140,00

30 60 90 120

Tempo (dias)

Mas

sa se

ca (m

g)

31,32 C

60,51 B64,67 B

109,77 A

+

B

40

4.1.4. Efeito do ANA no nmero de folhas, razes e brotos

A figura 15 mostra os valores da varivel nmero de folhas no perodo

compreendido entre 30 a 120 dias, cujos tratamentos variaram nas concentraes 0,0, 0,2,

1,0 e 5 mg L-1 de ANA. A comparao das mdias, atravs do teste TUKEY 5 % (Anexo 6),

mostra que para o fator tempo e para o fator tratamento os valores mdios do nmero de

folhas foram significativos (P 99,9 %) e houve interao significativa entre o fator tempo e

tratamento (P 99,0 %). As mdias do controle e das concentraes de 0,2 e 1,0 mg L-1 de

ANA foram estatisticamente iguais e superiores comparados ao tratamento com 5,0 mg L-1

de ANA, que apresentou perda de folhas dos 60 aos 90 dias e que aos 120 dias observou-se

a formao de novas folhas (figura 15 B). As menores mdias para o nmero de folhas

ocorreram no perodo de 60 e 90 dias, valores intermedirios aos 30 dias e maiores valores

aos 120 dias (figura 15 B).

A anlise de regresso (figura 15 A - texto) mostrou os mesmos resultados

observados pela anlise do teste TUKEY 5 % onde todos os tratamentos foram significativos

e alcanaram o maior nmero de folhas ao 120 dias, exceto o tratamento com a

concentrao 5,0 mg L-1 de ANA que apresentou uma inibio na formao de folhas entre

30 e 90 dias.

41

Figura 15. Nmero de folhas de P. amabilis nos tratamentos com 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1 ANA nos perodos

de 30, 60, 90 e 120 dias; (A) regresses: controle 0,0 mg L-1 y = 0,0013x2 - 0,18x + 8,72 e R2 = 0,97***; ANA 0,2 mg L-1 y = 0,0015x2 - 0,19x + 8,05 e R2 = 0,92***; ANA 1,0 mg L-1 y = 0,002x2 - 0,27x + 10,38 e R2 = 1***; ANA 5,0 mg L-1 y = 0,0004x2 - 0,0432x + 1,12 e R2 = 0,94ns; (B) anlise estatstica pelo teste TUKEY 5 % mostra as diferenas significativas entre os tratamentos representados pelas diferentes letras maisculas e as diferentes letras minsculas representam as diferenas significativas entre os tempos; ns = no significativo, * = significativo a 95 %, ** = significativo a 99 % e *** = significativo a 99,9 %. Nmero de repeties em cada tempo e tratamento = 10 plantas e (+) = material no detectado.

5,0

1,0 0,2

Controle

Tratamento de ANA (mg L-1)

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

30 60 90 120

Tempo (dias)

Nm

ero

de fo

lhas

+

Aab

Ab

Ab

Bb

Abc Ab

ABc

+Bc

+Bc

Ac AbAc

Aa

Aa

Aa

Ba

B

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

0 30 60 90 120 150

Tempo (dias)

Nm

ero

de fo

lhas

A

42

A figura 16 mostra os valores da varivel nmero de razes dos 30 aos 120 dias dos

explantes tratados nas concentraes 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1 de ANA. O teste TUKEY 5 %

(Anexo 6) mostra que as mdias foram significativas para o fator tempo (P 99,9 %), o fator

tratamento (P 99,9 %) porm no houve interao significativa entre o fator tempo e o fator

tratamento. Observando apenas o fator tempo (figura 16 B), as mdias foram maiores e

estatisticamente iguais aos 60 e 90 dias sendo que aos 30 e 120 dias foram menores e

estatisticamente iguais. As mdias entre o controle e os tratamentos nas concentraes de

0,2 e 1,0 mg L-1 de ANA foram maiores e estatisticamente iguais quando comparado com o

tratamento de 5,0 mg L-1 de ANA (figura 16 - legenda).

A anlise de regresso indicou que as mdias dos pontos no foram significativos no

ajuste de curvas em todos os tratamentos de ANA para o nmero de razes (figura 16 A -

texto).

43

Figura 16. Nmero de razes de P. amabilis nos tratamentos com 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1 ANA nos perodos

de 30, 60, 90 e 120 dias; (A) regresses: controle 0,0 mg L-1 y = -0,0017x2 + 0,25x - 3,85 e R2 = 0,99ns; ANA 0,2 mg L-1 y = -0,0013x2 + 0,18x 1 e R2 = 0,95ns; ANA 1,0 mg L-1 y = -0,0003x2 + 0,03x + 2,80 e R2 = 1,00ns; ANA 5,0 mg L-1 y = -0,0013x2 + 0,19x - 5,10 e R2 = 0,65ns; (B) anlise estatstica pelo teste TUKEY 5 % mostra as mdias seguidas de letras maisculas que comparam as diferenas significativas entre o fator tratamento e mdias seguidas de letras minsculas comparam as diferenas significativas entre o fator tempo; ns = no significativo e nmero de repeties em cada tempo e tratamento = 10 plantas.

0,001,002,003,004,005,006,007,008,00

0 30 60 90 120 150Tempo (dias)

Nm

ero

de r

aze

s

A

1,28 b 5,0

3,05 a 1,0 3,95 a0,2

3,65 a Controle

Nmero de razes Tratamento de ANA (mg L-1)

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

30 60 90 120

Tempo (dias)

Nm

ero

de r

aze

s

2,25 B

3,70 A 4,28 A

1,70 B

+

B

44

A figura 17 mostra o nmero de brotos que se formou apenas na concentrao de

5,0 mg L-1 de ANA aos 60 e aos 90 dias, sendo que aps este perodo houve reduo no

nmero de brotos. A anlise estatstica pelo teste TUKEY 5 % (Anexo 6) apresentou

resultados significativos para o fator tempo (P 99,9 %), fator tratamento (P 99,9 %) e mostrou

interao entre os fatores (P 99,9 %). A anlise de regresso mostra que os pontos das mdias

do nmero de brotos so significativos e que se ajustam na curva (figura 17 A - texto).

Figura 17. Nmero de brotos de P. amabilis no tratamento com 5,0 mg L-1 ANA no perodo de 30, 60, 90 e 120 dias; (A) regresso: ANA 5,0 mg L-1 y = -0,0051x2 + 0,46x + 15,72 e R2 = 0,74***; (B) anlise estatstica pelo teste TUKEY 5 % mostra as diferenas significativas entre as mdias dos tratamentos e as diferentes letras minsculas representam as diferenas significativas entre os diferentes tempos,*** = Significativo a 99,9 %. Nmero de repeties em cada tempo e tratamento = 10 plantas e (+) = material no detectado.

0,00

1,00

2,00

3,00

0 30 60 90 120 150Tempo (dias)

Nm

ero

de b

roto

s

A

5,0

Tratamento de ANA (mg L-1)

5,0

Tratamento de ANA (mg L-1)

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

30 60 90 120

Tempo (dias)

Nm

ero

de b

roto

s

Aa

Ab

+Ba

+Ba

+Ba

+Ba

+Ba

+Ba

+Aa

+Aa

+Aa

+Ab

+Aa

+Aa

+Aa

+Ab

B

45

4.1.5. Efeito do ANA na massa fresca de folhas, razes e dos brotos

A figura 18 mostra os valores da massa fresca das folhas no intervalo compreendido

entre 30 a 120 dias dos tratamentos variando entre 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1de ANA. O

teste TUKEY 5 % (Anexo 6) mostra que o fator tempo no foi significativo e no houve

interao entre o fator tempo e o fator tratamento. Apenas o fator tratamento foi

significativo (P 99,9 %). A comparao dos tratamentos atravs do teste de TUKEY 5 %

permitiu inferir que a maior mdia da massa fresca de folhas foi encontrada no controle e

na concentrao de 0,2 mg L-1 de ANA, seguindo-se do tratamento de 1,0 mg L-1 e

significativamente menor no tratamento com 5,0 mg L-1 de ANA (figura 18 - legenda).

A anlise de regresso mostrou que todas as regresses foram significativas, exceto

no tratamento com 0,2 mg L-1 de ANA, que no mostrou tendncia significativa (figura 18 -

texto). Pela anlise de regresso do controle e do tratamento com 1,0 mg L-1 de ANA pode-

se observar que houve reduo da massa fresca das folhas dos 30 aos 60 dias sendo que

aps este perodo, entre 90 e 120 dias, a massa fresca das folhas cresceu nos dois

tratamentos (figura 18 A - texto). O tratamento com 5,0 mg L-1 apresentou uma reduo da

massa fresca das folhas aos 30 dias, perda total entre 60 e 90 dias e pequeno acrscimo aos

120 dias de tratamento (figura 18 A - texto).

46

Figura 18. Massa fresca das folhas de P. amabilis nos tratamentos 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1de ANA nos perodos de 30, 60, 90 e 120 dias; (A) regresses: controle 0,0 mg L-1 y = 0,06x2 - 9,70x + 855,57 e R2 = 0,51*; ANA 0,2 mg L-1 y = 0,75x + 521,40 e R2 = 0,11ns; ANA 1,0 mg L-1 y = 0,13x2 - 20,57x + 960,70 e R2 = 0,99*; ANA 5,0 mg L-1 y = 0,01x2 - 2,05x + 78,50 e R2 = 0,98**; (B) as anlises estatsticas pelo teste TUKEY 5% mostra as mdias seguidas de letras maisculas que comparam as diferenas significativas entre o fator tratamento e mdias seguidas de letras minsculas comparam as diferenas significativas entre o fator tempo; ns = no significativo, * = significativo a 95 %, ** = significativo a 99 %. Nmero de repeties em cada tempo e tratamento = 10 plantas e (+) = material no detectado.

0

200

400

600

800

0 30 60 90 120 150

Tempo (dias)

Mas

sa fr

esca

(mg)

A

0

300

600

900

1200

1500

30 60 90 120

Tempo (dias)

Mas

sa fr

esca

(mg)

419,50 A 321,71 A 328,05 A439,22 A

+ +

B

11,56 c5,0

341,44 b 1,0 577,80 a0,2

577,80 a Controle

Mdia da massa fresca (mg)

Tratamento de ANA (mg L-1)

47

A figura 19 mostra os valores referentes massa fresca das razes no perodo entre

30 e 120 dias dos tratamentos com ANA nas concentraes de 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1. A

comparao entre as mdias, atravs do teste de TUKEY 5 % (Anexo 6) mostra que a massa

fresca das razes foi significativa para o fato tempo (P 99,9 %) e o fator tratamento (P 99,9 %),

no entanto, no houve interao significativa entre os dois fatores. Considerando apenas as

mdias de cada tempo, os menores valores mdios significativos foram alcanados aos 30

dias, valores intermedirios aos 60 dias e superiores aos 90 e 120 dias da massa fresca das

razes (figura 19 B). Comparando as mdias entre os perodos de anlise, o maior valor

significativo para a massa fresca de razes foi observado na concentrao de 0,2 mg L-1 de

ANA, valores intermedirios no controle e na concentrao de 1,0 mg L-1 de ANA e o

menor valor para o tratamento com 5,0 mg L-1 de ANA (figura 19 - legenda).

As anlises de regresso mostraram que a massa fresca das razes cresceu

significativamente no controle e na concentrao de 1,0 mg L-1 de ANA e os tratamentos

nas concentraes 0,2 e 5,0 mg L-1 variaram com o tempo, alcanando os maiores valores

entre 60 e 90 dias (figura 19 B texto).

48

Figura 19. Massa fresca das razes de P. amabilis nos tratamentos 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1 de ANA nos perodos de 30, 60, 90 e 120 dias; (A) regresses: controle 0,0 mg L-1 y = 6,43x + 276,92 e R2 = 0,83*; ANA 0,2 mg L-1 y = -0,16x2 + 28,23x - 22,85 e R2 = 0,98*; ANA 1,0 mg L-1 y = 9,20x + 69,08 e R2 = 0,68** e ANA 5,0 mg L-1 y = -0,22x2 + 38,91x - 1033,10 e R2 = 0,63*; (B) anlise estatstica pelo teste TUKEY 5 % mostra as mdias seguidas de letras maisculas que comparam as diferenas significativas entre o fator tratamento e mdias seguidas de letras minsculas comparam as diferenas significativas entre o fator tempo; * = significativo a 95 %, ** = significativo a 99 %, ns = no significativo e nmero de repeties em cada tempo e tratamento = 10 plantas.

382,00 c5,0

759,34 b 1,0 1.012,42 a0,2

760,00 b Controle

Mdia da massa fresca (mg)

Tratamento de ANA (mg L-1)

0

300

600

900

1200

1500

30 60 90 120

Tempo (dias)

Mas

sa fr

esca

(mg)

372,00 B

695,10 AB

913,77 A

932,00 AB

0

300

600

900

1200

1500

0 30 60 90 120 150Tempo (dias)

Mas

sa fr

esca

(mg)

A

49

A figura 20 mostra o efeito de diferentes concentraes de ANA na varivel massa

fresca de brotos em plantas de P. amabilis. A formao de brotos ocorreu apenas no

tratamento com 5,0 mg L-1 de ANA.

O teste de TUKEY 5% (Anexo 6) mostra que as mdias para a massa fresca de brotos

foram significativas com relao ao fator tempo (P 99,9 %) e ao fator tratamento (P 99,9 %) e

mostrou interao entre os dois fatores (P 99,9 %). A massa fresca dos brotos dos 60 aos 90

dias foi maior em relao aos 30 e 120 dias sendo que aos 120 dias o efeito foi deletrio

(figura 20 B). No tratamento com 5,0 mg L-1 de ANA a maior mdia da massa fresca dos

brotos ocorreu aos 60 dias sendo que a partir dos 90 dias, reduziu (figura 20 B).

A anlise de varincia da regresso (figura 20 - texto) mostrou as mdias da massa

fresca dos brotos foram significativos e que os pontos das mdias da massa fresca dos

brotos de cada tempo se ajustam na curva de regresso (figura 20 A).

50

Figura 20. Massa fresca dos brotos de P. amabilis no tratamento com 5,0 mg L-1de ANA nos perodos de 30, 60, 90 e 120 dias; (A) regresses: ANA 5,0 mg L-1 y = -0,11x2 + 16,45x - 361,30 e R2 = 0,72***; (B) anlise estatstica pelo teste TUKEY 5 % mostra as diferenas significativas entre as mdias dos tratamentos e as diferentes letras minsculas representam as diferenas significativas entre os diferentes tempos; *** = significativo a 99,9 %. Nmero de repeties em cada tempo e tratamento = 10 plantas e (+) = material no detectado.

0

10

20

30

40

0 30 60 90 120 150Tempo (dias)

Mas

sa fr

esca

(mg)

A

5,0

Tratamento de ANA (mg L-1)

5,0

Tratamento de ANA (mg L-1)

0

300

600

900

1200

1500

30 60 90 120

Tempo (dias)

Mas

sa fr

esca

(mg)

Aa

Ab+Ba

+Ba

+Ba

+Ba

+Ba

+Ba

+Aa

+Aa

+Aa

+Ac

+Aa

+Aa

+Aa

+Ac

B

51

4.1.6. Efeito do ANA na massa seca de folhas, razes e brotos

A figura 21 mostra os valores mdios da massa seca das folhas de P. amabilis nos

tratamentos com 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1 de ANA. As anlises estatsticas pelo teste

TUKEY 5% (Anexo 6) foram significativas para o fator tempo (P 99%), o fator tratamento (P

99,9%) porm a interao entre o fator tempo e o fator tratamento no foi significativa. A

anlise somente do fator tempo apresentou o maior valor aos 30 dias, valores intermedirios

aos 60 e 120 dias e menor valor aos 90 dias (figura 21 B). O fator tratamento apresentou o

controle e a concentrao de 0,2 mg L-1 de ANA com maior massa seca sendo que os

tratamentos com 1,0 e 5,0 mg L-1 foram menores (figura 21 B - legenda). O tratamento com

5,0 mg L-1 de ANA foi inibitrio para as folhas dos 30 aos 90 dias com ganho de massa

seca das folhas aos 120 dias.

A anlise de regresso no foi significativa para todos os tratamentos (figura 21 A -

texto).

52

Figura 21. Massa seca das folhas de P. amabilis nos tratamentos com 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1de ANA nos

perodos de 30, 60, 90 e 120 dias; (A) regresses: controle 0,0 mg L-1 y = -0,33x + 86,73 e R2 = 0,57ns; ANA 0,2 mg L-1 y = -0,07x + 67,99 e R2 = 0,0844ns; ANA 1,0 mg L-1 y = 0,016x2 - 2,62x + 128,84 e R2 = 0,97ns; ANA 5,0 mg L-1 y = 0,01x - 0,78 R2 = 0,6ns. (B) anlise estatstica pelo teste TUKEY 5 % mostra as mdias seguidas de letras maisculas que comparam as diferenas significativas entre o fator tratamento e mdias seguidas de letras minsculas comparam as diferenas significativas entre o fator tempo; ns = no significativo, nmero de repeties em cada tempo e tratamento = 10 plantas e (+) = material no detectado.

0,38 c 5,0

40,94 b 1,0 62,67 a0,2

61,78 a Controle

Mdia da massa seca (mg)

Tratamento de ANA (mg L-1)

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

140,00

30 60 90 120

Tempo (dias)

Mas

sa se

ca (m

g)

53,64 A

39,15 AB

31,51 B41,41 AB

+ + +

B

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

0 50 100 150Tempo (dias)

Mas

sa se

ca (m

g)

A

53

A figura 22 mostra os valores referentes s mdias da massa seca das razes dos 30

aos 120 dias no tratamento com ANA nas concentraes de 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1. A

anlise estatstica pelo teste TUKEY 5 % (Anexo 6) mostra que houve diferena significativa

no fator tempo (P 99,9%) e no fator tratamento (P 99,9%), no entanto, a interao entre os dois

fatores no foi significativa. O teste TUKEY 5 % apresentou o tratamento com 0,2 mg L-1 de

ANA significativamente maior do que o de 5,0 mg L-1, com os tratamentos de 1,0 mg L-1 e

controle com mdias intermedirias significativas (figura 22 - legenda).

A anlise de regresso mostra que as equaes das retas so significativas para o

ganho de massa seca que ocorreu em todos os tratamentos (figura 22 A - texto) tambm

observado no fator tempo (figura 22 - B).

54

Figura 22. Massa seca das razes de P. amabilis nos tratamentos com 0,0, 0,2, 1,0 e 5,0 mg L-1de ANA nos

perodos de 30, 60, 90