PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

ESPECIALIZACION EN BIOQUIMICA CLINICA

INSTRUMENTAL QUIMICO AVANZADO

PROFESOR: JAIME CASAS

PRESENTADO POR: HERNAN MAURICIO RIVERA ESCOBAR

INFORME Nº 1. CICLO 3

DETERMINACION FLUOROMETRICA DE FLUORESCEÍNA EN H2O

OBJETIVOS:

1. Conocer el funcionamiento de un fluorómetro de filtro. 2. Ilustrar el proceso de estandarización de un método fluorométrico

de análisis. 3. Diseñar el espectro de emisión de la fluoresceína. 4. Diseñar la curva de calibración para el sistema en estudio:

fluoresceína en H2O 5. Determinar el porcentaje m/v de fluoresceína de la muestra

problema. 1. Muchos compuestos orgánicos y algunos inorgánicos tienen la capacidad de absorber energía radiante de una longitud de onda determinada y luego emitir la energía como radiación a una longitud de onda mayor. Éste fenómeno se conoce como fluorescencia y determina las bases para un instrumento analítico muy sensible. La fluorescencia se puede medir con un instrumento simple llamado fluorómetro, que emplea filtros para seleccionar la longitud de onda.

A continuación presento dos esquemas sencillos que representan el funcionamiento de un espectrofluorómetro:

Diagrama 1. Esquema de un espectrofluorómetro.

Diagrama 2. Un fluorómetro típico. (Cortesía de Farrand Optical Co., Inc.)

Mediante determinación fluorimétrica es posible determinar concentraciones de especies orgánicas (tales como: compuestos orgánicos, enzimas, agentes medicinales, productos naturales, esteroides y vitaminas), gracias a la alta sensibilidad del método. Como lo mencione anteriormente, los métodos espectrométricos de emisión tienen sensibilidades dos o tres órdenes de magnitud superiores a los métodos de absorción, ya que la sensibilidad de un método espectrométrico de emisión se puede aumentar aumentando P0 mientras que en espectrofotometría de absorción un aumento en P0 también aumenta P y no afecta A.

Ahora bien, el funcionamiento de un fluorómetro difiere en esencia mas no del total de los componentes de un espectrofotómetro, es por esto que con frecuencia se hace uso de un sistema espectrofotométrico múltiple y se adecua según lo que se requiera trabajar. En un sistema como este trabajamos en el laboratorio.

En los siguientes diagramas presento algunas generalidades en cuanto al funcionamiento de un fluorómetro de filtro:

Fotografía 1

En esta fotografía presento el fluorómetro con el cual se llevo a cabo la práctica de laboratorio, aquí se relacionan de izquierda a derecha:

• El obturador encargado de dejar pasar la señal al fotomultiplicador. • En la cabina central: el “Zero Adj” que se utiliza para ajustar el blanco

(en este caso agua) al 0% de porcentaje de fluorescencia, el slit (en grado 3) y el selector: encargados de hacer el ajuste tanto de radio de abertura de la rejilla como de la relación matemática del porcentaje de emisión que se relaciona en la escala del registrador y el monocromador cuya función es determinar la longitud de onda sobre la cual se toman las medidas en el equipo.

• La cabina donde se colocan las muestras en celdas de cuarzo con una perilla que permite ubicar tanto el blanco como la muestra a medir. Detrás de la cabina se encuentra la fuente.

En las fotografías 2 y 3 se reflejan mucho mejor la cabina donde se colocan las muestras (hasta 4) y el filtro que posee la fuente que le permite dejar pasar tan solo las líneas del espectro del mercurio de la zona ultravioleta.

Fotografía 2

Fotografía 3

En el siguiente esquema se muestra el espectro del mercurio.

Fotografía 4.

En esta fotografía se muestra el obturador, en la parte superior se ve la perilla que se cierra o se abre dando paso de la señal al fotomultiplicador. Ver fotografía 5.

Fotografía 5

En cuanto al fotomultiplicador, está conectado al obturador y tiene 2 perillas: El grueso y el fino. El primero fundamental a la hora de proteger el equipo, se hace recomendable antes de empezar el análisis colocar el grueso al máximo. Y el fino que junto con el slit y el selector regulan el porcentaje de emisión.

Fotografía 6. El equipo en pleno

Fotografía 7. El equipo casi en pleno

2. Para ilustrar el proceso de estandarización de un método fluorométrico de análisis creo conveniente establecer momentos puntuales lo que relaciono a continuación: Si se desconoce la longitud de onda, se debe elaborar el espectro de emisión de la sustancia fluorescente con la finalidad de establecer la longitud de onda de máxima emisión. Para tal fin, se dispone de una sustancia fluorescente promedio que está dentro de una serie de patrones de concentración conocida. Con esta sustancia se establece un rango amplio de emisión a diferentes longitudes de onda (lambda) y se describe el comportamiento en un espectro de emisión (lambda vs % de fluorescencia). Ya establecido el lambda máximo a partir del espectro de emisión se procede a ajustar nuevamente el blanco (dependiente del solvente sobre los que se hicieron las diluciones) se colocan uno a uno los patrones de acuerdo a su concentración (de la menos diluida hasta la más concentrada). Se diseña la curva de calibración para el sistema en estudio y se determina la concentración de la muestra problema por extrapolación. Con respecto a la curva de calibración, existe la probabilidad de que los patrones no entren en la linealidad de la zona 1 de la curva. Si los valores a extrapolar reflejan dos puntos de concentración diferente, para establecer el punto verdadero se debe hacer dilución ½ de la muestra y volver a medir el %

de fluorescencia, este valor resultante debe ser la mitad del inicial puesto que la relación entre el % de fluorescencia y la concentración es directamente proporcional. En dado caso que este valor no sea la mitad de la muestra concentrada se deben establecer diluciones tantas cuantas sean necesarias hasta que se relacionan de manera directamente proporcional la concentración y el % de fluorescencia. Establecida la curva de calibración con los patrones de concentración conocida es posible hacer la extrapolación de la muestra problema, dicha concentración debe ser cotejada con la arrojada por la ecuación de la recta y adecuada con los inversos del factor de dilución (si los hay). 3. Espectro de emisión de la fluoresceína

Lambda % Fluorescencia Valor relativo de % de Fluorescencia

400 0 0

410 0 0

420 1 0,952380952

430 1 0,952380952

440 1 0,952380952

450 1 0,952380952

460 1 0,952380952

470 2 1,904761905

480 7 6,666666667

490 35 33,33333333

495 62 59,04761905

500 89 84,76190476

501 93 88,57142857

502 96 91,42857143

503 99 94,28571429

504 101 96,19047619

505 102 97,14285714

506 103 98,0952381

507 103 98,0952381

508 105 100

509 104 99,04761905

510 103 98,0952381

512 98 93,33333333

515 91 86,66666667

520 77 73,33333333

530 54 51,42857143

550 32 30,47619048

570 14 13,33333333

Espectro de Emisión de la Fluoresceína

Se estableció Máxima longitud de onda: 508 nm pero es importante anotar que este espectro está relacionado con el % de fluorescencia relativo mas no absoluto de la fluoresceína. 4. Curva de calibración para el sistema: fluoresceína en H2O Cálculos en la siguiente hoja:

Muestra

% de

Fluorescencia

Concentración

ppm

Valor relativo de % de

Fluorescencia

1 16 0,928 15,23809524

2 39 2,552 37,14285714

3 63 4,176 60

4 80,5 5,8 76,66666667

5 100 7,424 95,23809524

Problem

a 49 X 46,66666667

C UR VA D E C AL IB R AC ION S IS T E MA F L UOR E S C E ÍNA E N H 2O

y = 12,286x + 5,551

R2 = 0,9962

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8

C once ntra c ión (ppm)

Va

lor

Re

lati

vo

% F

luo

res

ce

ína

V alor relativo de % de

F luores cenc ia

L ineal (V alor relativo

de % de

F luores cenc ia)

5. Previa a la determinación el porcentaje m/v de fluoresceína de la muestra problema se hace la extrapolación: Para un % de fluorescencia relativo de 46.67 el valor de concentración es:

• Si y = 12.286x + 5.551 entonces x = y – 5.551 12.286 x = 46.67 – 5.551 12.286 x = 3.347 ppm 3.347 ppm (3.347 mg / 1000 ml) * 100 % m/v = 0.3347 El porcentaje m/v de la muestra problema es 0.3347 mg % (m/v)