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Informe de expresion del gen ADXR2
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Ticchi, Ana Julia Biología Molecular II, 2014
Análisis de mutantes de inserción de ADXR
Introducción
El ciclo de vida de las plantas alterna entre una etapa haploide y otra diploide. Las
células diploides del cuerpo de la planta (esporofito) sufren meiosis dando así células
que luego sufren varias divisiones mitóticas formando estructuras especializadas
haploides (gametofito), del cual se producen las gametas sexuales. En angiospermas, el
esporofito es la generación prominente (Pagnusat, 2005). La generación de las
gametas femeninas o masculinas ocurre por medio de un proceso que se conoce como
gametogénesis y que involucra en una primera instancia meiosis y posteriormente
mitosis y diferenciación celular.
En Arabidopsis thaliana, el gametofito femenino o saco embrionario es una estructura
altamente polarizada compuesta de siete células, juega un rol fundamental en todas
las etapas del proceso reproductivo. Con el fin de conocer los genes requeridos y las
rutas involucradas en el desarrollo de este gametofito en angiospermas se han
realizado muchos estudios de mutantes gametofitos. El screening de líneas con
inserciones de T-DNA para determinar genes funcionalmente importantes para el
desarrollo del gametofito ha llevado a la identificación de varios mutantes gametofitica
en Arabidopsis. (Pagnusat 2005)
Las mutaciones gametofitica afectan aspectos del desarrollo del gametofito que
ocurren después de la meiosis, incluyendo megagametogénesis y el funcionamiento de
del gametofito maduro. Los mutantes gametofíticos son típicamente identificados
usando dos criterios: 1) Reducción del set de semillas, 2) Distorsión de la segregación
(Yadegari, 2014).
Una de las mutantes gametofitica identificadas presenta una inserción en un gen
codificante para una proteína tipo Adrenodoxina reductasa (ADXR), la cual presenta
gametofitos femeninos que arrestan su desarrollo en diferentes estadios.
En base a lo anterior el objetivo del presente trabajo se centró en caracterizar la
mutante gametofitica ADXR a partir del análisis de plantas ADXR/adxr las mismas
presentan un 38.4% de abortos y dificultades de transmisión a través del lado
materno, sugiriendo un defecto en la gametogénesis o en la función del gametofito
femenino.
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Materiales y Métodos
Material Vegetal: A partir de semillas sembradas en placas con medio ATS de
Arabidopsis thaliana wild type ecotipo Columbia (Col-0) o mutantes de inserción T-DNA
se seleccionaron cinco plantas aleatoriamente.
Preparación de ADN genómico y Genotipificación: Se realizó una extracción de ADN
genómico a partir de hojas de Arabidopsis thaliana wt y mutantes de inserción de T-
DNA utilizando el protocolo de extracción de DNA genómico (Guía TP, 2014). Se realizó
un dosaje (Abs260/280) y se determinó el genotipo de las cinco plantas (P1-P5)
mediante reacciones de PCR a partir del protocolo (Guía TP, 2014), debido a que se
utilizó la polimerasa que se utilizo fue la Taq Pegasus y no la indicada en el protocolo
se realizaron cambios en las concentraciones de los reactivos para así ajustarlo a esta
polimerasa. Se utilizó, para las PCR, extracto de DNAg como templado o Tejido tratado
(Tissue-PCR) con las siguientes combinaciones de primers:
Primers específicos del gen AT4g05450, ADXR (Fw + Rv)
Primer específico de ADXR (Rv) + primer especifico de inserto (LBB1)
Primer adxrLB, 5´ GCTTGCATATGGTGCTGAAA
Primer adxrRV, 5´ CCCGTCTTCCGATGAGATAC
Primer LBb1.3, 5’ TTTTGCCGATTTCGGAAC
Se realizó en paralelo una Tissue-PCR según indicado en la guía de trabajos Prácticos.
Extracción de RNA, se extrajo RNA total a partir de pistilos de plantas mutantes y wild
type siguiendo el método de extracción fenólica con Trizol (Guía TP, 2014).
Cuantificación del RNA, se leyó la absorbancia de las extracciones a 260nm y 280nm y
se realizó una electroforesis en gel de agarosa.
RT-PCR, se realizó la síntesis de primer hebra, cDNA, a partir del RNA extraído
utilizando dos transcriptasas reversas distintas (M-MLV e IP2) y un mix que contiene
buffer, oligodT, mezcla de dNTPs y DTT (Guía TP, 2014). Se utilizaron 3ul de la muestra
de cDNA para las reacciones de PCR cuantitativa ajustada para los ciclos 26, 30 y 34. Se
utilizándose los mismos primers específicos del gen ADXR que en el genotipado así
como primers específicos de Actina2 como control de expresión.
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Resultados y Discusión
Analisis del DNA genómico.
Con el fin de determinar el genotipado de las 5 plantas de Arabidopsis thaliana
se realizó una extracción de DNA genómico a partir de 2-3 hojas a cada una de las
plantas. Se midió luego la absorbancia del precipitado para determinar la
concentración cualitativa de la muestra de DNA extraída de cada planta y se realizó
también una corrida electroforética en un gel de agarosa con el fin de corroborar la
integridad del DNA (Fig. S1).
En la tabla 1 se puede observar las plantas 1, 2 y 3 tuvieron una concentración
de ADN y Absorbancias similares sin embargo a relación 260/280 para la planta 1 y 3 es
muy alta, esto indicaría que podría presentar contaminación con RNA o fenol, por otro
lado la Planta 2 presenta una buena relación de absorbancias por lo que podría
decirse que casi su totalidad corresponde a DNAg. Con respecto a la planta 4 se
mantiene la relación entre absorbancia y concentración presente en las plantas antes
mencionados pero con valores de aproximadamente la mitad de estas, sin embargo,
estos valores caen dentro del rango de error del espectrofotómetro por lo cual no
podrían tomarse como valores estimativos. Por último la planta 5 presenta una alta
absorbancia pero concentración muy baja de DNA, esto significa que en esta muestra
hay una gran cantidad de contaminante, probablemente debido a un error con la
última dilución en donde se resuspendió con un volumen mayor del indicado.
Genotipificacion de A. thaliana
Luego se procedió a verificar
la presencia del inserto de T-DNA
utilizando dos métodos diferentes análisis, PCR y Tissue-PCR. Las muestras, DNAg o
tejido tratado, se amplificaron utilizando primers específicos del gen de ADXR y del
inserto T-DNA, los productos de PCR se corrieron luego por electroforesis en gel de
agarosa para así poder determinar el genotipo de cada pl anta.
El gel correspondiente a la corrida electroforética de las reacciones de PCR y Tissue-
PCR se observa en la figura 1. El tamaño esperado para el gen de interés sin inserto
Tabla 1. Cuantificación de DNA. Se midió la Abs260 y 280 de 5ul del extracto de DNAg de cada planta. Concentración Abs260 =1 para 50 µg/ml.
Planta [DNAg](µg/µl) 260/280 OD
1 0,621 1,89 0,161
2 0,645 1,703 0,155
3 0,684 1,925 0,156
4 0,365 1,75 0,094
5 0,041 1,835 0,827
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amplificado con los primers de ADXR, LB y RB, es de aproximadamente 672 bp lo cual
demostraría un genotipo Wild Type, en cambio para la combinación primer de ADXR + primer
de T-DNA (Rv+LBB1) se esperaría un tamaño de aproximadamente 950 bp lo cual indicaría un
genotipo mutante. A partir de estos datos se pudieron determinar los genotipos de las
distintas plantas:
Planta 1 en las calles G1 y T1 se observa una banda de aproximadamente 700pb la
cual correspondería al gen sin inserción y en la calle G2 otra de 900pb
correspondiente a la inserción. Por lo tanto se podría decir que la Planta 1 es una
mutante heterocigota.
Planta 2 Se observa solo resultados en las reacciones de Tissue-PCR los cuales son
los mismos que los de la planta 1 por lo que podría decirse que esta también presenta
un genotipo mutante.
Planta 3 Debido a que no se encontraron bandas específicas en ninguna calle no se
pudo determinar el genotipo de esta planta.
Planta 4 A partir de las calles correspondientes a las reacciones de PCR se puede
determinar que esta planta presenta un genotipo wild type homocigota debido a la
presencia de una sola banda de aproximadamente 700pb en la calle G1.
Planta 5 Se determina que esta planta presenta un genotipo mutante debido a las
bandas que se observan en las calles G1 y G2 (difusa) de aproximadamente 700pb y
900pb respectivamente.
La ausencia de bandas en las respectivas
calles puede deberse a varios factores: los
Figura 1. Genotipificación por PCR con DNA de hojas o
tejido tratado. Los productos se corrieron por
electroforesis en gel de agarosa. P: Planta de A. thaliana,
G1/T1: primers de ADXR (LB + RB) G2/T2: primers de
ADXR Rv + primer de T-DNA LBB1. G PCR; T Tissue-
PCR. Pm: marcador de peso molecular. C: Control sin DNA
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primers no hibridaron correctamente en las reacciones de PCR, presencia de muestra
excedente, ya sea de hoja tratada o extracto de ADN, mal sembrado en el gel, etc.
Expresión de ADXR
Extracción y análisis de RNA
Luego, con el fin de determinar el nivel de expresión de las distintas plantas, se
procedió a realizar una RT-PCR a partir de RNA. Se realizó entonces una extracción de
RNA total con Trizol a partir de pistilos de cada una de las plantas según el protocolo
indicado (Guía de TP, 2014). Se continuó con una cuantificación de RNA de cada
extracción a una ABS. 260/280 con el fin de determinar la cantidad necesaria para la
síntesis de primer hebra y a su vez se realizó una corrida electroforética para evaluar la
integridad de la muestra, verificar que el RNA extraído no se encuentre degrado, y
para corroborar su dosaje.
En la tabla 2 se muestran los valores obtenidos de la cuantificación de RNA, en
base a estos se puede determinar que las extracciones de las plantas 4 y 5 presenta
una buena pureza debido a que la relación 260/280 es cercana a 2, sin embargo la
concentración presente en la muestra de la planta 4 es muy baja. En el caso de las
plantas 1 2 y 3 la relación Abs. 260/280 obtenida fue baja lo cual indicaría que podría
haber contaminación con proteínas o DNA, las plantas 1 y 2 presentan a su vez una
Tabla 2. Cuantificación de RNA. Se midió la Abs260 y 280 de 6ul de la solución de extracción de RNA de cada planta. Concentración Abs260 =1 para 40ug/ml.
Figura 2. Análisis de RNA. Se corrieron por electroforesis 2ug del extracto RNA de cada planta en gel de agarosa. P: Planta de A. thaliana
Grupo [RNA](µg/µl) 260/280 OD
1 0,36 1,65 0,094
2 0,62 1,56 0,173
3 1,061 1,49 0,28
4 0,17 1,9 0,25
5 1,004 1,86 0,284
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baja concentración de RNA lo cual concuerda con la relación Abs260/280, pero en la
planta 3 se ve una buena concentración de muestra de RNA.
En la corrida electroforética de la extracción de RNA total de las distintas
plantas (figura 2), se pueden observar dos bandas marcadas correspondientes a RNAr
28 y 18S, en las plantas 1, 2 y 5, lo cual me indicaría que no hay degradación del RNA.
En las plantas 3 y 4 las bandas son muy difusas, esto podría deberse a degradación de
RNA o contaminación alta con DNAg. A su vez se cabe destacar las bandas presentes
en la parte de arriba de las calles lo cual podría corresponder también a contaminación
por DNAg.
Análisis de expresión por RT-PCR
Se continuó a partir de las muestras de RNA con una dilución de 1:2 y luego con
la síntesis de primer hebra según lo indicado en el protocolo (Guía TP, 2014),
obteniéndose el cDNA el cual se utilizó luego en reacciones de PCR semicuantitativa.
Para esta reacción se utilizaron los primers específicos del gen ADXR así como también
primers de ACTINA2 para control de expresión, en reacciones separadas. Se analizaron
las reacciones procedentes a los ciclos 20, 30 y 34 en un gel de agarosa para poder
estar dentro la fase exponencial de la amplificación para el análisis de expresión. La
banda esperadas para los amplicones de ACTINA2 es de aproximadamente 690pb y
para los amplicones de ADXR alrededor de 300pb.
En la figura 3 se observan las reacciones de RT-PCR para las 5 plantas distintas.
En la planta 1 se observan bandas de aproximadamente 800-900 bp ya sea en la calle
de actina o de ADXR correspondientes a los ciclos 30 y 34 y se ve que estas aumenta en
por cada ciclo. Dado que el peso esperado para la actina es de 690pb y para el gen de
300pb, se determina que estos productos son inespecíficos y no brindan la información
deseada. En las plantas 2, 3 y 4 no se ven bandas claras que puedan determinar alguna
expresión. Por último con respecto a la planta 5 solo se observan bandas en los ciclos
30 y 34 de el gen ADXR, de nuevo la banda es de aproximadamente 800-900pb lo cual
no corresponde al gen en estudio.
Por ende se podría decir que el análisis de expresión realizado por RT-PCR presentó
resultados inespecíficos.
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Debido a estos resultados inconclusos se repitió la RT-PCR siguiendo el mismo
protocolo anterior con una modificación, el templado se diluyó 1:5 para disminuir la
posible contaminación con DNA genómico (figura S2). Para las plantas 1, 2 3 y 4 no se
observó banda y en el gel correspondiente a la planta 5 se obtuvo un resultado similar
al anterior. Una de las hipótesis por lo cual se cree que fallaron las primeras dos RT-
PCR es que la enzima transcriptasa reversa (MLMV) no estaba funcionando
óptimamente, por lo tanto se realizaron dos nuevas reacciones de RT-PCR, en la cada
síntesis de primer hebra se utilizaron dos transcriptasas reversas distintas (MLMV e
IP2). Luego se tomaron 2µl de los productos cDNA y se procedió con las reacciones de
PCR semicuantitativa.
Figura 3. Análisis de expresión por RT-PCR del gen ADXR. Se corrieron los productos de RT-PCR de los ciclos 26, 30 y 34 de ADXR (X) y de Actina (A). Pm: peso molecular, C: control sin cDNA; A: Control de expresión Actina2; X: expresión de ADXR, P, Planta de A. thaliana; Nº de Ciclos 26, 30,34
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En la figura 4, correspondiente al gel de la tercera RT-PCR, se ve que en las
reacciones con las distintas enzimas hay presencia de bandas en ambos casos, lo cual
indicaría que la transcriptasa reversa no falló. En las calles correspondiente a la
amplificación con los primers de ADXR se pueden observar bandas de
aproximadamente 300pb las cuales corresponderían a los amplicones del gen
especifico, demostrando así que las mutantes heterocigotas presentan expresión de
ADXR. Con respecto a los controles con actina solo se observa la banda
correspondiente a aproximadamente 690pb en la última calle de la planta 5
correspondiente a la enzima IP2, que los amplicones de actina no estén presente en las
calles correspondientes podría deberse a que los primers correspondientes a ACTINA2
no hibridaron correctamente con el gen de actina.
Conclusión
El análisis de genotipificación de las plantas ADXR/adxr determinó que las plantas
1, 2 y 5 eran mutantes, la 4 wild type pero la planta 3 no se pudo determinar su
genotipo. Si bien no se obtuvieron resultados en todas las reacciones de PCR o Tissue,
estos fueron suficientes para determinar el genotipo de cada planta pero no para
comparar la efectividad de los distintos procedimientos.
Los primeros dos análisis de expresión realizados mediante RT-PCR presentaron
resultados dudosos los cuales podrían deberse a diversos factores:
RNA degradado u oxidado
Que el RNA no haya sido limpiado totalmente de Trizol por ende quedan
fenoles que interfieren en la reacción
Figura 4. Análisis de expresión por RT-PCR de ADXR. Se corrieron los productos de RT-PCR del ciclo 35 de ADXR (X) y de Actina (A). Pm: peso molecular, A: Control de expresión Actina2; X: expresión de ADXR, P1-5, Planta de A. thaliana; MLV, IP2, transcriptasas reversa.
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Contaminación con DNA genómico.
No se haya mantenido el templado de RNA en frío, formándose así estructuras
secundarias.
A partir de la tercer RT-PCR se pueden ver los amplicones correspondientes al gen
(300pb), lo cual indicaría que no hubo falla en la enzima transcriptasa reversa, sin
embargo no se observó expresión del gen Housekeeping, actina, lo cual podría indicar
algún tipo de falla con los primers de actina. A partir de estas PCRs se puede
determinar que el gen es expresado en plantas mutantes ADXR/adxr, pero como las
dos últimas reacciones de PCR se hicieron a partir de dos plantas mutantes no se pudo
hacer una valoración comparativa entre mutante y Wild Type. A su vez como no se
obtuvo expresión de Actina tampoco se pudo realizar un análisis sobre la expresión
relativa de ADXR con respecto a la actina.
Teniendo en cuenta la cantidad de resultados inespecíficos se recomienda,
entonces, repetir los procedimientos evitando errores en los pasos claves de la RT-PCR,
así como utilizar DNasa para eliminar la contaminación con DNA genómico en las
muestras de RNA extraído.
Bibliografía
1) Drews G. N., Koltunow A. M. G. (2011). The Female Gametophyte. The
Arabidopsis book.
2) Guía de Trabajos Prácticos, Biología Molecular II, 2014.
3) Pagnussat G. C., Yu H., Ngo Q. A., Rajani S., Mayalagu S., Johnson C. S., Capron
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genes required for female gametophyte development and function in
Arabidopsis. Development 132: 603-614.
4) Takubo K., Morikawa T., Nonaka Y., Mizutani M., Takenaka S., Takabe K.,
Takahashi M., Ohta D. (2003). Identification and molecular characterization of
mitocondrial ferredoxins and ferredoxin reductase from Arabidopsis.Plant
Molecular Biology 52: 817:830.
5) Yadegari R., Drews G. N. (2004). Female Gametophyte Development. The Plant
Cell, Vol. 16, S133-S141.
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Figuras Suplementarias
RT-PCR
Fig. S2. Análisis de expresión por RT-PCR, Se corrieron los productos de RT-PCR de los ciclos 26, 30 y 34 de ADXR (X) y de Actina (A). Pm: peso molecular, C: control sin cDNA; A: Control de expresión Actina2; X: expresión de ADXR P1-5: Planta de A. thaliana; Nº de Ciclos 26, 30,34
Fig. S1. Análisis de DNA. Corrida electroforética de 2µl de extracto de DNAg en gel de agarosa, 20µ para P5. P1-5: Planta de A. thaliana