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cromatografia de intercambio ionico, definicion, metodo y aplicaciones
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2 INDICE
OBJETIVOS 02
INTRODUCCIÓN 03
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO 04
PROPIEDADES DE LOS INTERCAMBIADORES IÓNICOS 04
PROCEDIMIENTO 05
FACTORES QUE AFECTAN LA RETENCIÓN 06
RESULTADOS 08
APLICACIONES 09
MEDICIÓN DE LA HEMOGLOBINA GLICOSILADA 09
DETERMINACIÓN DE PBG Y ALA EN ORINA 11
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 12
OTRAS APLICACIONES 12
CONCLUSIÓN 13
BIBLIOGRAFÍA 13
OBJETIVOS
Desarrollar el concepto de las técnicas
cromatográficas a nivel general.
Comprender los principios de la cromatografía de
intercambio iónico.
Analizar paso a paso el método de la técnica y
los distintos tipos de intercambiadores iónicos
que permiten su función.
Determinar los factores que afectan, interfieren o
alteran el procedimiento y su correcta ejecución
para lograr el objetivo deseado.
Reconocer las distintas aplicaciones
preferentemente en el ámbito médico y la
importancia de esta técnica cromatográfica.
3 INTRODUCCIÓN
Para el estudio de las sustancias se deben ocupar
diversas técnicas, que han ido evolucionando con el
paso de los años. Una de las técnicas más básicas es
la cromatografía, en sus múltiples variantes. Esta
técnica se da desde siempre en la naturaleza, como
en lo que efectúan las piedras, que permiten purificar
el agua.
La cromatografía como tal adquiere importancia
cuando en 1850 el químico F.F.Runge, que trabajaba
con tintas, descubrió que los cationes orgánicos se
separaban por migración cuando se depositaba una
disolución que los contenía sobre un material poroso,
como papel. El botánico ruso Mijaíl Tswett empleó por
primera vez en 1906 el término "cromatografía" (que
proviene del griego χρομα y γραφω que significan
respectivamente chroma "color" y graphos "escribir").
Según la definición dada por Keulemans la
cromatografía es un método de separación en el que
los componentes a desglosar se distribuyen entre dos
fases, una de las cuales constituye un lecho
estacionario de amplio desarrollo superficial y la otra
es un fluido que pasa a través o a lo largo del lecho
estacionario. Recientemente la I.U.P.A.C define la
cromatografía de forma más amplia como(1)
: Método
usado principalmente para la separación de los
componentes de una muestra, en el cual los
componentes son distribuidos entre dos fases, una de
las cuales es estacionaria, mientras que la otra es
móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un
líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La
fase estacionaria puede ser empaquetada en una
columna, extendida en una capa, distribuida como
una película, etc.
Se basa en el principio de retención selectiva, cuyo
objetivo es separar los distintos componentes de una
mezcla, permitiendo identificar y determinar las
cantidades de dichos componentes. Las retenciones
mencionadas pueden tener su origen en dos
fenómenos de interacción que se dan entre las dos
fases y que pueden ser:
1. La adsorción, que es la retención de una
especie química por parte de los puntos activos
de la superficie de un sólido quedando delimitado
el fenómeno a la superficie que separa las fases
o superficie interfacial.
2. La absorción, que es la retención de una
especie química por parte de una masa, y debido
a la tendencia que esta tiene a formar mezcla
con la primera, absorción pura, o a reaccionar
químicamente con la misma, absorción con
reacción química, considerando ambas como un
fenómeno másico y no superficial.
A comienzos del año 1903, Mijail Tsvet usó columnas
de adsorción de líquidos para separar pigmentos
vegetales (por ejemplo, clorofilas). Las disoluciones
se hacían pasar a través de una columna de vidrio
rellena de carbonato de calcio, que finamente dividido
de un material poroso que interacciona de forma
diferente con los componentes de la mezcla, de forma
que éstos se separaban en distintas bandas
coloreadas a lo largo de la columna.
Imagen 1. Separación de
clorofilas mediante cromatografía
en papel.
La cromatografía puede cumplir dos funciones
básicas, como son el de separar los componentes de
la mezcla, para así purificarlos, o para medir las
proporciones de los componentes.
Existen múltiples tipos de cromatografía, que se
pueden separar en dos grandes grupos:
a) Cromatografía plana. La fase estacionaria se
sitúa sobre una placa plana o sobre un papel.
Las principales técnicas son: Cromatografía en
papel, Cromatografía en capa fina.
b) Cromatografía en columna. La fase
estacionaria se sitúa dentro de una columna.
4
Según el fluido empleado como fase móvil se
distinguen: Cromatografía de líquidos,
Cromatografía de gases, Cromatografía de
fluidos supercríticos.
Dentro de la cromatografía en columna de líquidos,
están un grupo de técnicas, dentro de las que
queremos destacar la cromatografía de intercambio
iónico, que ocupa en su fase móvil un liquido polar, y
estacionaria un sólido. Esta cromatografía es un
proceso que permite la separación de iones y
moléculas polares basadas en las propiedades de
carga de moléculas.
Esta técnica apareció durante la II Guerra Mundial y
en principio tenía la finalidad de separar las tierras
raras y los elementos de transición. En 1938 Taylor y
Urey utilizan este método para separar isótopos de
Litio y Potasio utilizando resinas de zeolita. En 1939
Samuel logra sintetizar resinas de intercambio iónico.
Puede ser usada en casi cualquier tipo de molécula
cargada incluyendo grandes proteínas, pequeños
nucleótidos y aminoácidos. La solución que debe
inyectarse es usualmente llamada “muestra” y los
componentes separados individualmente son
llamados “analitos”. Es usada a menudo en
purificación de proteínas, análisis de agua o control
de calidad(2)
.
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
La cromatografía de intercambio iónico es un método
de separación que permite la separación de
moléculas basada en sus propiedades de carga
eléctrica. Se compone de dos fases, la fase
estacionaria o intercambiador iónico y la fase móvil.
La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie
cargas electrostáticas fijas, que retienen contraiones
móviles que pueden intercambiarse por iones de la
fase móvil La fase móvil en cromatografía de
intercambio iónico suele ser una disolución acuosa
con cantidades moderadas de metanol u otro
disolvente orgánico miscible con agua que contiene
especies iónicas en forma, generalmente de buffer.
Los iones de la fase móvil compiten con los analitos
por los sitios activos de la fase estacionaria.
El principio básico de la cromatografía de intercambio
iónico(3)
es que las moléculas cargadas se adhieren a
los intercambiadores de forma reversible de modo
que dichas moléculas pueden ser unidas o desunidas
cambiando el ambiente iónico. La separación
mediante intercambiadores iónicos se realiza por lo
general, en dos fases: en la primera las sustancias a
separar se unen al intercambiador utilizando
condiciones que originan una unión fuerte y estable; a
continuación, se eluye de la columna con tampones
de diferentes pH o diferente fuerza iónica,
compitiendo los componentes del tampón con el
material, por los sitios de unión.
Imagen 2. (A) Con una fase
estacionaria cargada
negativamente son retenidas las
sustancias cargadas
positivamente. (B) Deben competir
con los contraiones (del
amortiguador). (C) Las sustancias
cargadas negativamente pasan a
través de la face estacionaria sin
enlazarse.
PROPIEDADES DE LOS
INTERCAMBIADORES IÓNICOS
Un intercambiador iónico es, por lo general, un
polímero que tiene grupos cargados unidos. Si un
grupo está cargado negativamente, podrá
intercambiar iones positivos y será un intercambiador
de cationes o catiónico. Un grupo típico que se utiliza
en los intercambiadores de cationes es el grupo
sulfónico, SO3-. Si se une un H+ al grupo, se dice que
el intercambiador se encuentra en forma ácida, y
puede por ejemplo intercambiar un H+ por un Na+ o
dos H+ por un Ca2+
. El grupo ácido sulfónico es un
intercambiador de cationes fuertemente acido. Otros
grupos de utilización corriente son el carbonilo e
hidroxilo fenólico, dos intercambiadores catiónicos
A
B
C
5 débilmente ácidos. Si el grupo cargado es positivo
(por ejemplo un grupo amino cuaternario), es un
intercambiador de aniones o aniónico fuertemente
básico. Los intercambiadores aniónicos débilmente
básicos más corrientes son grupos aminos alifáticos o
aromáticos.
Imagen 3. Estructuras de
Resinas Intercambiadoras de
Cationes. (A) Resina de
poliestireno, ácido fuerte
(Dowex-50). (B) Resina de
carboximetil celulosa, ácido
débil (CM Cellulose). (C)
Resina de poliestireno, ácido
débil y quelante (Chelex-100).
La matriz puede estar hecha de diferentes materiales.
Los de uso más corriente son el dextrano, la celulosa
y copolímeros del estireno y divinilbenceno, en los
que el divinilbenceno contie los grupos cargados y se
entrecruza con las cadenas de poliestireno.
La elección entre intercambiadores fuertes o débiles
está basada en el efecto del pH sobre la carga y la
estabilidad. Por ejemplo, si se va a cromatografiar
una sustancia débilmente ácida que necesita pH muy
altos o muy bajos para su ionizacion, se requiere un
intercambiador fuerte debido que este funciona a pH
extremos. No obstante, si la sustancia es lábil, es
preferible la utilizacion de intercambiadores débiles.
Los intercambiadores débiles son tambien excelentes
para la separacion de moléculas con una carga
elevada de aquellas con poca carga, debido a que los
iones debilmente cargados no se unen, por lo
general, al intercambiador. Los intercambiadores
débiles permiten, asimismo, una mayor resolucion de
las sustancias si las diferencias de carga son muy
pequeñas.
Imagen 4. Estructuras de
Resinas Intercambiadoras de
Aniones. (A) Resina de
poliestireno, base fuerte (Dowex-
1). (B) Resina de dietilaminoetil
celulosa, ácido débil (DEAE).
Para una correcta elección de la porosidad y del
tamaño de la malla es necesario tener en cuenta que
las moléculas pequeñas se separan mejor sobre
matrices con tamaño de poro pequeño (o sea, un
elevado grado de entrecruzamientos) debido a que la
capacidad disponible es grande, mientras que las
macromoléculas necesitan un tamaño de poro mayor.
Los intercambiadores de celulosa han probado ser los
mejores para la purificación de moléculas grandes
como proteínas y polinucleótidos. Ello es debido a
que la matriz es fibrosa, por lo que todos los grupos
funcionales se encuentran en la superficie y
disponibles, incluso, para las moléculas mayores.
PROCEDIMIENTO
Para realizar una cromatografía de intercambio iónico
son necesarios los siguientes materiales: (1) Columna
de vidrio, (2) Matriz de intercambio iónico (Resina),
(3) Eluyente, (4) Muestra a fraccionar y (5)
Colectores(4)
.
La mayoría de los experimentos basados en esta
técnica están basados en 4 etapas(5)
.
1. Equilibrio: El primer paso es el equilibrio de la
fase estacionaria con las condiciones iniciales
deseadas. Cuando el equilibrio se ha logrado, toda
la fase estacionaria se encuentra asociada a iones
complementarios (que pueden ser cloro o sodio).
Por ejemplo, un intercambiador catiónico
sulfonado asociado a Na+ producto de la
disociación de NaOH.
2. Aplicación y Lavado: El paso siguiente es aplicar
la muestra la cual queremos filtrar a través de la
columna mediante un lavado específico. Para ello
es necesario aplicar un buffer con el mismo pH y
fuerza iónica que el buffer inicial para que todas
las proteínas cargadas se unan al intercambiador.
Por ejemplo: A la forma sódica de la resina lavada
se le añade una solución ácida (pH=3) de la
mezcla de aminoácidos; a dicho pH los
aminoácidos se encuentran en forma de cationes
con carga neta positiva. Los aminoácidos
catiónicos tienden a desplazar algunos de los
iones ligados a las partículas de resina. A pH 3 los
aminoácidos más básicos se unirán a la resina de
forma más estrecha y los más ácidos o menos
básicos, se unirán menos.
A
B
C
A
B
6
Imagen 5. Fases del procedimiento de cromatografía de
intercambio iónico. (A) Fase de Equilibrio en la parte
inferior. (A) y (B) Aplicación. (C) Elusión. (D)
Regeneración.
3. Elusión: Las moléculas captadas por el
intercambiador son eluídas debido a cambios en la
composición del buffer. Una manera común es
incrementando la fuerza iónica con cloruro de
sodio u otra sal común. Los aminoácidos serán
eluídos dependiendo de la carga neta que estos
posean. A medida que se aumenta gradualmente
el pH y la concentración de NaCl del medio
eluyente acuoso, los aminoácidos descienden en
la columna a velocidades diferentes y pueden
recogerse en muchas pequeñas fracciones. La
disminución del pH protonará a los grupos de los
aminoácidos por lo que su carga neta tenderá a
ser positiva, al revés si se aumenta el pH. Si se
aumenta la concentración de sal, sus iones
competirán mucho más por la resina y se
intercambiarán por los grupos de aminoácidos.
Las diversas fracciones pueden analizarse
cuantitativamente mediante la reacción con
ninhidrina. Los aminoácidos aniónicos aparecen
primero y los más catiónicos aparecen
posteriormente (con un intercambiador catiónico).
4. Regeneración: Por último, remover las partículas
que aún están asociadas al intercambiador. Para
ello se debe generar un cambio más drástico en el
pH y la concentración salina. Ahora la fase
estacionaria puede volver a ser utilizada.
Imagen 6. (A) Resina de intercambio catiónico antes de
añadir la muestra. (B) Se añade la muestra, una mezcla
de Asp, Ser y Lys. (C) Se añade Na+ (NaCl), el Asp, el
aminoácido con menos carga positiva eluye el primero.
(D) Se aumenta el Na+, a continuación eluye la Ser. (E)
Se aumenta el Na+, la Lys, el que posee más carga
positiva eluye el último.
FACTORES QUE AFECTAN LA RETENCIÓN
Tiempo de retención (Tr): se describe como el
tiempo que transcurre después de la inyección de
la muestra hasta que la mayor concentración del
analito alcanza el detector (cuando se ha
separado todo el analito), es decir, el tiempo que
un compuesto tarda en salir de la columna. En la
cromatografía de intercambio iónico la retención
está basada en la atracción entre iones del soluto
y la carga complementaria de la fase estacionaria.
Los intercambiadores iónicos favorecen la unión
de iones de mayor carga y radio inferior. Cuando
la retención de los compuestos se ve afectada, se
favorece la elusión de ellos para ser recolectados
en una serie de fracciones.
pH: Los intercambiadores iónicos se clasifican en
ácidos o básicos, fuertes o débiles. Las resinas
ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en
disoluciones muy ácidas, en cambio las resinas
ácidas débiles se protonan a un pH próximo a 4 y
pierden su capacidad de intercambio catiónico,
reduciéndose así, el tiempo de retención. Los
grupos muy básicos de amonio cuaternario siguen
siendo catiónicos a cualquier valor de pH. Los
básicos débiles de amonio terciario se
desprotonan en disoluciones moderadamente
básicas y pierden entonces su capacidad,
reduciéndose también el tiempo de retención.
Cargas: La fuerza de enlace de la muestra
depende de la magnitud de la carga. La fuerza de
retención es mayor y, por consiguiente la de
elusión es menor, mientras más cargado se
encuentre el compuesto, ya sea negativa
(aniones) o positivamente (cationes). Los iones
A B C D
A B
C D E
7
polivalentes se unen con mayor fuerza a la fase
estacionaria que los monovalentes.
Imagen 7. Muestra el intercambio catiónico a la
izquierda desde los menos absorbidos a los más
absorbidos. A la derecha se muestra la fuerza eluyente
en el intercambio aniónico.
Gradiente: Aumentando la concentración de la
fase móvil, los iones compiten cada vez más
favorablemente con la muestra por los sitios
activos cargados de la fase estacionaria.
Imagen 8. Esquema del gradiente del Buffer con
contraiones cargados negativamente. Se presenta un
gráfico con el poder de elusión (fuerza iónica) y el
porcentaje de proteína eluída, que muestra una gradiente
directamente proporcional.
Porosidad: El tamaño del poro de la resina al que
se une el compuesto móvil por intercambio iónico
influye directamente en la capacidad de unión. En
membranas cuyo tamaño de poro es pequeño
(menor de 600Å) no hay espacio suficiente para
unir el ión dentro de dichos poros por lo que la
cantidad de intercambiador por unidad de
superficie es menor. Sin embargo, en membranas
con tamaño de poro mayor (mayor de 600Å) se
puede unir el compuesto móvil dentro de dichos
poros, con lo que se incrementa la cantidad de
intercambiador por unidad de superficie. La
porosidad busca una mayor superficie de
intercambio.
Imagen 9. Donde existe mayor porosidad (derecha), se
puede unir el compuesto móvil dentro de estos poros
incrementando la cantidad de intercambiador
de superficie.
Supresor es de iones: La
cromatografía iónica tardó en
desarrollarse debido a la falta de un
buen sistema de detección. La
elección evidente es un detector
conductimétrico. El problema es
debido a la elevada concentración
iónica necesaria para eluir a la
mayoría de los iones en un tiempo
razonable. Ello hace que la
conductibilidad de la propia fase móvil
sea muy elevada haciendo muy difícil
la detección de pequeñas
concentraciones de analito. Este
problema se resolvió mediante un
sistema supresor de conductibilidad
colocado a la salida de la columna
cromatográfica. Los primeros
supresores fueron columna de intercambio iónico
que convierten los iones del disolvente en
especies moleculares poco ionizadas y por lo tanto
poco conductoras. Así, por ejemplo, cuando se
separan cationes es frecuente emplear una
8
disolución de HCl como eluyente. La columna
supresora es anionica y contiene iones OH-. Al
paso de la fase móvil por la columna supresora
los Cl- son intercambiados por iones OH
-. De este
modo se ha sustituido el HCl muy conductor por
H2O poco conductora. En la separación de iones
es frecuente usar HCO3Na y CO3Na2 en la fase
móvil. La columna supresora es en este caso
catiónica. De este modo el Na+ es sustituido por H
+
formándose un electrolito débil como H2CO3.
Imagen 10. (A) Esquema del mecanismo de supresión
de iones. (B) Reacciones de supresión de iones.
RESULTADOS
El cromatograma es el resultado gráfico de la
cromatografía. En el caso de separación óptima, los
diferentes picos o manchas del cromatograma se
corresponden a los componentes de la mezcla
separada.
Imagen 11. Cromatograma. (A) Aniones. (B) Cationes.
La cromatografía iónica es una variante de la
cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Es un
método eficaz para la separación y determinación de
iones, basado en el uso de resinas de intercambio
iónico. Cuando una muestra iónica atraviesa estas
columnas, los iones presentes sufren una separación
debido a las diferentes retenciones que sufren al
interactuar con la fase fija de las columnas analíticas.
Una vez separada, la muestra pasa a través de un
detector (conductimétrico, amperométrico, UV, etc.)
donde se registra la señal obtenida respecto al tiempo
de retención. El resultado son los cromatogramas
donde la posición de los máximos nos indica el ión
presente (carácter Cualitativo) y su área nos indica la
cantidad existente de dicho ión (carácter
Cuantitativo)(6)
.
Imagen 12. El Servicio de
Análisis del ICB dispone
de un cromatógrafo iónico
Metrohm con columna
Metrosep A Supp 5 y
detector conductimétrico,
que se emplea en la
determinación de
fluoruros, cloruros, nitritos,
nitratos, bromuros fosfatos
y sulfatos.
A
B
A B
9 APLICACIONES
MEDICIÓN DE LA HEMOGLOBINA GLICOSILADA
La diabetes mellitus(7)
es una condición metabólica de
incidencia creciente, caracterizada por disfunción en
la homeostasis de la glucosa, con hiperglicemia
crónica por inmunodeficiencia absoluta o relativa. La
enfermedad es progresiva y asociada con alto riesgo
de desarrollar compromiso vascular.
La determinación de los niveles de glucosa en sangre
y orina y de los cuerpos cetónicos en la orina
suministran una información muy útil para el
tratamiento diario de la diabetes. Sin embargo,
ninguno de estos tests facilita al paciente y al equipo
de cuidados médicos un valor representativo y
cuantitativo de la glicemia a lo largo del tiempo.
La determinación de las proteínas glicosiladas, sobre
todo de la hemoglobina y de las proteínas séricas, ha
añadido una nueva dimensión a la evaluación de la
glicemia. Mediante una simple medida, estos tests
permiten cuantificar los valores de la glicemia media
durante semanas e incluso meses, complementando
los análisis que el paciente lleva a cabo día a día.
La hemoglobina(8)
es una proteína que se encuentra
en los glóbulos rojos de la sangre (hematíes) y sirve
para aprovisionar de oxígeno al resto de nuestras
células y tejidos. Esta proteína se une a la glucosa
circulante por el torrente sanguíneo. El porcentaje de
proteína unida a la glucosa es lo que se denomina
hemoglobina glicosilada (HbA1). Esto sucede también
en las personas sin diabetes. Cuanto mayor es la
cantidad de glucosa en la sangre, más se une a las
proteínas y su porcentaje de unión indica cual ha sido
la cantidad media de glucosa circulante durante el
tiempo de vida de la hemoglobina.
La HbA1 describe una serie de componentes estables
minoritarios de la hemoglobina que se forman
lentamente y sin intervención enzimática, a partir de
la hemoglobina y la glucosa. La velocidad de
formación de HbA1 es directamente proporcional al
nivel de glucosa en la sangre y al ciclo de vida de las
proteínas glicosiladas.
La hemoglobina es una de las proteínas de la sangre
que pueden glicosilarse en proporción a la
concentración de glucosa en plasma, dependiendo
solamente de la concentración de glucosa y del
tiempo de exposición celular a la misma. Como los
eritrocitos son fácilmente permeables a la glucosa, el
nivel de la HbA1 en una muestra de sangre facilita la
historia glicémica de los 120 días anteriores, que
corresponde a la vida media de estas células. En la
mujer en gestación, el estado de la glicemia se
relaciona con las últimas 4 semanas precedentes
debido al acelerado recambio de los eritrocitos.
La American Diabetes Association recomienda que el
objetivo de todo tratamiento debe ser un valor de la
HbA1 menor a 7% y que los médicos deben de
reevaluar cualquier régimen de tratamiento en el que
los valores sean consistentemente mayores de 8%.
Estos valores específicos de la HbA1 se refieren sólo
a los que han sido obtenidos por medios validados
frente al método de referencia(9)
.
HbA1c (%) Promedio de Glicemias (mg/dl)
Calificación
5-6 80-120 Excelente 6-7 120-150 Muy Bueno 7-8 150-180 Bueno 8-9 180-210 Regular
9-10 210-240 Problemático 10-11 240-270 Malo 11-12 270-300 Muy Malo
Tabla 1. La hemoglobina glicosilada (HbA1c) refleja la
concentración de la glucosa en los últimos 120 días. El
porcentaje de HbA1c se aumenta en proporción a las
cifras de glicemia que han precedido en las últimas 6-8
semanas. En general por cada 1% de aumento en la
HbA1c, evidencia un incremento en los promedios de
glicemia de aproximadamente 30mg/dl. Una HbA1c de
6% refleja un promedio de glicemia de 120mg/dl. Es
deseable que las personas con diabetes mantengan un
promedio de HbA1c inferior a 7%.
Existen varios métodos para la determinación de la
hemoglobina glicosilada, a manera informativa se
encuentran las pruebas inmunoquímicas, la
electroforesis, la cromatografía de afinidad al borato,
la cromatografía líquida de alta presión y la
cromatografía de intercambio iónico.
El método de cromatografía de intercambio iónico(10)
se basa en la elusión diferencial de la hemoglobina
glicosilada por el cambio de carga que se produce en
la molécula debido a la glicación del grupo amino
terminal de la cadena. Para realizar el procedimiento
se utiliza carboximetil celulosa cargada (-).
10
Imagen 13. Esquema de las variantes de hemoglobina
encontradas en el torrente sanguíneo; incluye el
porcentaje de HbA1 en estados “normales” en la sangre
para el control de la glicemia.
La hemoglobina adulta humana usualmente consiste
de HbA (97% del total), HbA2 (2,5%) y HbF (0,5%). El
análisis cromatográfico de la HbA identifica distintas
hemoglobinas menores llamadas HbA1a, HbA1b,
HbA1c, que colectivamente se denominan HbA1,
glicohemoglobinas o hemoglobinas glicadas.
La hemoglobina glicosilada A1c es el componente
mayoritario (80%) de la hemoglobina A1. La HbA1c
es el resultado de la condensación de la glucosa con
la valina N-terminal de la cadena β de la
hemoglobina. La incorporación de glucosa es un
proceso no enzimático e irreversible.
Imagen 14. La glucosa se una de las cadenas β de la
hemoglobina en el extremo Val terminal, transformando
la HbAo en HbA1c.
El valor de la HbA1c ha
mostrado su utilidad para
predecir el riesgo del desarrollo
de muchas de las
complicaciones crónicas de la
diabetes. La determinación de
la HbA1c debe ser realizada
rutinariamente en todos los
pacientes con diabetes, en
primer lugar para documentar el
grado de control glicémico al
inicio del tratamiento, y luego
como parte del mismo.
Para cada paciente individual,
la frecuencia de la
determinación de HbA1c
dependerá del régimen de
tratamiento utilizado y del
criterio del médico. En ausencia
de estudios bien controlados que sugieran un
protocolo definido, la opinión de los expertos es que
se deben practicar al menos dos determinaciones de
la hemoglobina glicosilada en los pacientes bien
controlados que se mantienen estables y al menos
cada tres meses en sujetos que no han alcanzado un
nivel de glicemia óptimo o en los que se ha
modificado el tratamiento.
Como cualquier otro parámetro, la hemoglobina
glicosilada puede resultar modificada por alteraciones
que varíen el natural recambio de los glóbulos rojos,
tales como por hemorragias, anemia hemolítica,
transfusiones, embarazos, etc., situaciones que
producirían falsos descensos. También se puede ver
alterada por la ingestión de dosis elevadas de ácido
acetil salicílico, vitamina C, alcohol, altas cifras de
lípidos en sangre, etc., que conducirían a falsos
aumentos.
La HbA1c puede valorar además el éxito del
tratamiento antidiabético; permite comparar y
comprobar la eficacia de nuevos tratamientos; nos
posibilita determinar la duración de la hiperglicemia y
a su vez individualizar los regímenes del control
antidiabético.
La hemoglobina glicosilada es muy importante, sin
embargo no puede sustituir al monitoreo de glicemias,
ya que ésta no puede medir su control diario y por lo
tanto no le permite ajustar sus dosis de
11 medicamentos orales, de insulina, de actividad física
o de ingesta de alimentos en el día a día.
DETERMINACIÓN DE PBG Y ALA EN ORINA
Las porfirias son un grupo de enfermedades de origen
genético o adquirido que tienen como característica
común una alteración en la actividad de una o varias
enzimas de la vía metabólica del grupo HEM, lo que
ocasiona niveles anormalmente elevados de
porfirinas o sus precursores (p. ej., ácido delta-
aminolevulínico [ALA] y porfobilinógeno [PBG]). Estos
se acumulan en los tejidos y se excretan en la orina y
las heces. Las manifestaciones patológicas son
producidas casi en su totalidad por los efectos sobre
el sistema nervioso y la piel(11)
.
Imagen 15. Estructuras químicas del Aminolevulinato y
del porfobilinógeno.
Las variedades de porfiria que presentan
sobreproducción de los precursores de las porfirinas -
ácido delta aminolevulínico (ALA) y porfobilinógeno
(PBG)- suelen presentar crisis agudas, las que
pueden ser muy graves y causa de muerte. Estas
crisis se caracterizan por síntomas digestivos (dolor
cólico, vómitos, estreñimiento), neuropsíquicos
(paresias, parestesias, parálisis, confusión, depresión,
alucinaciones y psicosis), cardiovasculares
(taquicardia e hipertensión) y otros (secreción
inadecuada de la hormona antidiurética, intolerancia a
la glucosa, alteración de los niveles de la hormona del
crecimiento e hipercolesterolemia). Su patogenia ha
sido explicada en parte por un efecto neurotóxico del
ALA y PBG, y por un déficit del grupo HEM(12)
.
Los pacientes con variedades de porfirias que
presentan producción aumentada de porfirinas
manifiestan fotosensibilidad debido a la activación de
estos compuestos por acción de la luz UV. Las
alteraciones cutáneas se caracterizan por eritema y
ampollas, que al mejorar dejan cicatrices hiper o
hipopigmentadas.
La Porfiria Intermitente Aguda (PAI) es una de las
más comunes y severas de las porfirias heredadas.
Es un desorden autosómico dominante, que causa
deficiencia parcial de la actividad de la
porfobilinógeno desaminasa (PBGD), tercera enzima
de la ruta de síntesis del grupo HEM.
Imagen 16. Signos de una crisis aguda de porfiria.
Cambio de Porfobilinógeno de coloración normal a
Uroporfiria I en la orina reposa.
Cuando los pacientes con PAI presentan una crisis
aguda, disminuye la actividad de la PBGD y, como
consecuencia los niveles de Porfobilinógeno (BPG)
y/o Ácido 5- Aminolevulónico (ALA) en la orina se
incrementan significativamente. Por lo cual es
necesario contar con un método que cuantifique estos
precursores metabólicos para una pronta
confirmación del diagnóstico e inicio del tratamiento.
Durante la crisis aguda, el PBG urinario aumenta de
20 a 200 mg/día, cuyos valores de referencia son de
0-4 mg/día, y la excreción de ALA se eleva
aproximadamente a la mitad, 10-100 mg/día, cuando
sus valores de referencia son 0-7mg/día. El método
de Mauzerall-Granick y otros parecidos son los más
usados para la cuantificación de estos dos
precursores(13)
. Este método se basa en la técnica de
cromatografía de intercambio iónico, en la cual se
utilizan columnas con resinas aniónicas y catiónicas.
El PBG se queda retenido en la aniónica y el ALA en
la catiónica. En la columna con PBG, se utiliza ácido
12 acético 1M para que éste eluya y pueda ser
cuantificado. En la columna con ALA, se le agrega
acetato de sodio 1M para que éste eluya y sea
cuantificado. Luego, el eluido de cada columna
reacciona con Reactivo de Ehrlich, formando un
producto rojo intenso. Este reactivo está conformado
por 4-dimetilbenceno diluido en ácido acético y ácido
perclórico. El producto es medido
espectrofotométricamente a 553 nm, y a partir de esta
medición se puede calcular la concentración de estos
intermediarios.
En casos de intoxicación por plomo pueden
detectarse concentraciones de ALA elevadas en orina
también, ya que el plomo puede bloquear la vía
metabólica en la que interviene el ALA. Por lo tanto, la
determinación conjunta de ALA y PBG permite
diferenciar las porfirias de la intoxicación por
plomo(14)
.
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
La cromatografía de intercambio iónico es el método
más utilizado para la separación de ácidos nucleicos.
Un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se
unirá a un intercambiador iónico con grupos cargados
positivamente, pero eluirá de la columna al cambiar el
pH del tampón (tampón de elusión) ya que los iones
del tampón de elusión interaccionan con los grupos
cargados del ácido nucleico o del intercambiador
iónico. Primero fluirán de la columna las moléculas
cargadas positivamente que no se unen a la fase
estacionaria y posteriormente, al añadir el tampón de
elusión, eluiran las moléculas con poca carga
negativa neta y luego las de mayor carga negativa
neta(15)
.
Actualmente se utilizan dos tipos de intercambiadores
aniónicos(16)
: el metilaminoetanol (MAE) o el
dietilaminoetil (DEAE). La unión del ADN (cargado
negativamente) depende principalmente del
componente estérico de los grupos funcionales y de
la afinidad del intercambiador aniónico por el
respectivo ácido nucleico; puesto que el grupo MAE
es menos voluminoso y más hidrofílico que el DEAE,
la unión de los ácidos nucleicos a los primeros es
más efectiva que a los segundos.
Una modificación de este método es la extracción en
fase sólida, en la que se utiliza una matriz
intercambiadora de aniones empaquetada en
columnas de polipropileno. La unión se produce bajo
condiciones de baja salinidad y durante los pasos de
lavado y elusión se va incrementando la
concentración de sales en los tampones
correspondientes. Las impurezas se eliminan debido
a su diferente capacidad de unión y se obtiene una
rápida y eficiente purificación de los ácidos nucleicos
(ADN y/o ARN). Al final los ácidos nucleicos se eluyen
con un tampón de máxima salinidad. Por último, se
precipita con isopropanol para lavar y eliminar todos
los restos de impurezas, finalmente, se reconstituye el
ADN de elevada pureza en un tampón de baja
salinidad para su posterior utilización o
almacenamiento.
Debido a la elevada pureza del ADN obtenido con
esta tecnología, la principal aplicación de esta
cromatografía es la purificación de ADN plasmídico
para transfección (introducción de material genético
externo en células eucariotas mediante plásmidos).
Esta técnica incluye un pretratamiento de la muestra
que consiste en una lisis bacteriana en condiciones
alcalinas que ocasiona una desnaturalización del
ADN cromosómico y plasmídico. Antes de la
introducción de la muestra en la columna se trata con
acetato potásico, lo que ocasiona que el ADN
cromosómico precipite junto con el resto de
componentes de la muestra, mientras que el ADN
plasmídico se renaturaliza y permanece en disolución.
OTRAS APLICACIONES
Purificación de agua
Purificación del fibrinógeno de la leche
Determinación de anticonvulsantes en el suero
después de la extracción de la fase sólida.
Análisis de antibióticos de poliéter
Determinación de pesticidas.
Identificación de ácidos orgánicos en la fruta y en el jugo.
Detección de derivación-fluorescencia post-columna para análisis para varios tipos de pesticidas agrícolas .
Determinación de metabolitos de Triptofan en el suero umbilical.
13 CONCLUSIÓN
La cromatografía de intercambio iónico, también
llamada cromatografía iónica o cromatografía del ión,
es una técnica que permite la separación de iones y
moléculas polares basada en las propiedades de
carga de las moléculas. Puede ser usada en casi
cualquier tipo de molécula con carga. La solución que
debe inyectarse es llamada "muestra" y los
componentes separados individualmente; “analitos”.
El intercambio iónico es el intercambio reversible y
estequiométrico de iones entre una fase sólida y una
fase líquida. Si nos interesa separar analitos
catiónicos se utiliza una fase estacionaria que
contenga sitios activos negativos, los cuales deberán
encontrarse unidos a algún catión que mantenga la
electroneutralidad. Este catión deberá ser desplazado
por el analito para establecer el equilibrio y unirse al
sitio aniónico de la fase estacionaria. De manera
análoga, para separar aniones se utilizan fases
estacionarias con cargas fijas positivas que se
encontrarán unidas a algún anión encargado de
mantener la electroneutralidad, y que será
desplazado por el analito para el establecimiento del
equilibrio.
Diversos factores como el pH, cargas, gradiente y
porosidad afectan el tiempo que un compuesto
demora en eluir de la columna (tiempo de retención).
Los resultados se muestran en un cromatograma, que
es una representación gráfica de los resultados
obtenidos; en el caso de separación óptima, los
diferentes picos o manchas del cromatograma se
corresponden a los componentes de la mezcla
separada.
Este tipo de cromatografía presenta diversas
aplicaciones, en este informe se mecionaron la
determinación de la hemoglobina glicosilada,
determinación de PBG y ALA en orina y separación
de ácidos nucleicos, pero su uso no termina allí, ya
que hay numerosos usos más, como por ejemplo,
análisis de proteínas en la industria alimenticia con
valor nutricional, y en la purificación del agua; así
como también a lo largo de la historia cobró
relevancia en el Proyecto Manhattan durante la
segunda guerra mundial para la fabricación de la
bomba atómica.
BIBLIOGRAFÍA
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grafia
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**** Voet, Donald; Voet, Judith. “Bioquímica” 3a
Edición 2006
**** Texto base guía para todo el desarrollo y
entendimiento de la investigación sobre cromatografía
de intercambio iónico.