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7/26/2019 Informe de Practicas Pre Profesionales Israel Salazar
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UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE BIOLOGA-MICROBIOLOGA
INFORME DE PRCTICAS PRE PROFESIONALES
ANLISIS MICROBIOLGICO DE MUESTRAS DE AGUAS,
ALIMENTOS Y SUPERFICIES VIVAS E INERTES
Institucin: Direccin Ejecutiva de Salud Ambiental
Presentado por: Israel Jos Salazar Quispe
15 de Febrero15 de Mayo
TacnaPer
2012
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INDICE GENERAL
I. GENERALIDADES.Pg.03
Razn social de la empresa o institucindescripcin .Pg.03
Ubicacin.. . Pg.04
Organizacin de la empresa o institucin.. ...Pg.05
Objetivos de la prctica....Pg.22
II. FUNDAMENTO TEORICOPg.25
Agua....Pg 25
Vigilancia de la calidad de agua de consumo humano.............. ....Pg.26
Requisitos de calidad del agua para consumo humano...............Pg.28
Aspectos generales de microbiologa de aguas............................Pg.31
Alimentos.......................................................................................Pg.35
Normativa sanitaria de alimentos...................................................Pg.38
Aspectos microbiolgicos...............................................................Pg.38
Superficies vivas e inertes relacionadas a alimentos.....................Pg.41
III. MATERIAL Y METODO....................................................Pg.48
Preparacin y esterilizacin de medios de cultivos y diluyentesPg.48
Instructivo de preparacin y dilucin de muestras. ..Pg.53
Procedimiento de recuento de bacterias heterotrficas.. Pg.57
Procedimiento de Monitoreo Ambiental Pg.65
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Procedimiento de anlisis para la deteccin de Salmonel la sppPg.66
Procedimiento de anlisis para la numeracin de Staphy lococcusureus... ....Pg.80
Procedimiento de anlisis de coliformes fecales
por filtro de membrana Pg.94
Procedimiento de anlisis de coliformes totales, fecales y E.col i..Pg.103
Procedimiento para anlisis de superficies .Pag.114
IV. RESULTADOS..Pg.121
Muestras de Agua Potable (Cuadro 1) ..Pg.121
Muestras de Agua Natural (Cuadro 2) ..Pg.133
Muestras de Agua de Mar (Cuadro 3) .Pg.139
Muestras de Alimento (Cuadro 4) ..Pg.144
Muestras de Anlisis de superficies (Cuadro 5) ..Pg 147
V. CONCLUSIONES YSUGERENCIAS.Pg.153
5.1 Conclusiones..Pg.153
5.2 Sugerencias.......Pg.154.
VI. BIBLIOGRAFA.. Pg 157
VII. ANEXOS.Pg.159
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I. GENERALIDADES
1.1. Razn social de la empresa o institucindescripcin:
La Direccin Ejecutiva de Salud Ambiental de la Direccin Regional de
Salud Tacna, es una institucin que despliega una serie de acciones de
control y asesoramiento tcnico a las diferentes empresas que desarrollan
sus trabajos en los sectores de pesquera, industria manufacturera,
agroindustria y transportes a fin de que la ejecucin de estas actividades
econmico - productivas, no ocasionen impactos negativos en el medio
ambiente y la salud humana. Para ello cuenta con el personal profesional y
Tcnico capacitado en sus diferentes divisiones.
La cul tiene como funcin bsica la direccin y coordinacin de
actividades tcnico-administrativas de alto nivel de responsabilidad en
programas de lnea asignados al rea de competencia del Ministerio de
Salud y Gobierno Regional de Tacna. La funcin bsica es lograr que se
cumpla la poltica, visin, misin, objetivos y normas nacionales y regionales
de salud.
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Relaciones internas:
Se encuentra bajo la Direccin del MINSA, y de la Gerencia
Regional de Desarrollo Social del Gobierno Regional de Tacna,
ante quienes da cuenta de su gestin.
Dirige y supervisa a las Unidades Orgnicas de la Direccin
Regional de Salud-Tacna y sus rganos desconcentrados del
Hospital Hiplito Unnue de Tacna y Direccin de Red de Salud-
Tacna.
Relaciones externas:
Entidades y organizaciones pblicas y privadas del sector y Sistema
Nacional, Macro-regional y Regional de Salud.
1.2. Ubicacin:
El laboratorio de salud ambiental se localiza en la direccin ejecutiva
de salud ambiental, ubicado en la prolongacin dos de mayo s/n segundo
piso.
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Provincia Tacna
Departamento Tacna
Distrito Tacna
1.3. Organizacin de la empresa o institucin:
La Direccin Ejecutiva de Salud Ambiental de la Direccin Regional de
Salud Tacna, como Autoridad Sanitaria tiene por funcin la Proteccin del
Medio ambiente, el Saneamiento Bsico, la Higiene Alimentaria y el Control
de Zoonosis para lo cual est dividido en cuatro grupos de trabajo los cuales
son los siguientes:
Equipo de trabajo de saneamiento bsico, higiene alimentaria y
zoonosis.
Equipo de trabajo de ecologa, proteccin ambiental y salud
ocupacional.
Equipo de trabajo de sanidad area, martima y de fronteras.
Laboratorio.
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Para ello cuenta con el personal profesional y Tcnico capacitado en
sus diferentes Direcciones.
ORGANIGRAMA ESTRUCTURAL DE LA DIRECCIN EJECUTIVA DE
SALUD AMBIENTAL
DIRECCI N EJECUTIVA DESALUD AMBIENTAL
Laboratorio
EQUIPO DE TRABAJODE SANEAMIENTOBASICO, HIGIENEALIMENTARIA Y
EQUIPO DE TRABAJODE ECOLOGA,PROTECCIN
AMBIENTAL Y SALUDOCUPACIONAL
EQUIPO DE TRABAJODE SANIDAD EREA,
MARTIMA Y DEFRONTERAS
DIRECCION REGIONAL DESALUD TACNA
Secretaria
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1.3.1. Organigrama estructural de la direccin de saneamiento bsico
higiene alimentaria y control de zoonosis:
DIRECTOR DE SANEAMIENTO B SICO HIGIENEALIMENTARIA Y CONTROL DE ZOONOSIS
AREA DECONTROL DE
ZOONOSIS
AREA DECONTROL DEVECTORES
AREA DE
SERVICIOS
BSICOS
AREA DE
RESIDUOS
DOMICILIARIOS
DIVISI N DE SERVICIOSBSICOS
DIVISIN DE CONTROL DE
ZOONOSIS Y VECTORES
DE LA DIVISI N DE
VIGILANCIA Y CONTROL DE
ALIMENTOS Y SERVICIOS
AREADE INSPECCIN A
CENTROSRECREACIONALES
AREA DE INSP. AESTABLECIMIENTOS DEELABORACIN DE
ALIMENTOS Y BEBIDAS
AREA DE INSPECCI N A
ESTABLECIMIENTOS DE
SERVICIOS
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1.3.2. Organigrama estructural de la direccin de ecologa, proteccin
del ambiente y salud ocupacional:
DIRECCION DE ECOLOG A, PROTECCI N DELAMBIENTE Y SALUD OCUPACIONAL
VIGILANCIA DERECURSOSHIDRICOS
VIGILANCIA DE
VERTIMIENTOS
VIGILANCIA DEZONAS
COSTERAS
VIGILANCIA YCONTROL DE LA
CALIDAD DEL AIRE
CONTROL YCONTAMINACION
ATMOSFERICA
CONTAMINACION PORRUIDO
VIGILANCIA DEEMFERMEDADESCAUSADAS POR
CONTAMINACIONATMOSFERICA
VIGILANCIA YCONTROL DE
RESIDUOS
PELIGROSOS
VIGILANCIA YCONTROL DE
CEMENTERIOS
VIGILANCIA YDESARROLLO
SOSTENIBLE DE LABIODIVERSIDAD
VIGILANCIA YCONTROL DE LASEXPORTACIONES /IMPORTACIONES
TRANSFRONTERISOS
VIGILANCIA YCONTROL DESUSTANCIASPELIGROSAS
PROGRAMA DEVIGILANCIA YCONTROL EN
SALUD, HIGIENE
PROGRAMA DEVIGILANCIA EN
PREVENCIN DEENFERMEDADES
Y ACCIONOCUPACIONAL
AREA DE PROTECCIONDE RECURSOS
HDRICOS Y DE AGUASCOSTERA
AREA DE PREVENCI N YCONTROL DE LACONTAMINACION
AREA DE PROTECCI NDE PREVENCIN. DE
RECURSOS.NATURALES, FLORA Y
FAUNA
AREA
SALUD OCUPACIONAL
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1.3.3. Organigrama estructural de la direccin de sanidad area
martima y fronteras
DIRECCCI N DE SANIDAD A REAMARTIMA Y FRONTERAS
AREA DETERRESTRE
AREA DEPUERTOS
AREA DE AEROPUERTOS
PUERTO ARICA
PUERTO GRAU
SANTA ROSA
ZOFRA - TACNA
PALCA
TOMASIRI
ESTIQUE
FERROCARRIL
ADMINISTRACIN
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1.3.4. Laboratorio de salud ambiental:
El laboratorio de salud Ambiental brinda soporte analtico a los
equipos de trabajo del DESA , en la ejecucin de las acciones de vigilancia y
control en salud ambiental, mediante el diagnstico de la calidad sanitaria del
agua ( mar , piscinas , potable, residuales, cuencas ) , alimentos , superficiesen contacto con los alimentos ( superficies vivas e inertes ) identificando y
cuantificando los contaminantes biolgicos contribuyendo de este modo a la
adecuada y oportuna toma de decisiones, especialmente en casos de
contingencia y alertas sanitarias. Es en este contexto el laboratorio viene
consolidando la implementacin de un sistema de gestin de la calidad de
acuerdo a la Norma NTP ISO/IEC 17025:2006 con el fin de buscar el
reconocimiento de su competencia. La direccin ejecutiva de salud ambiental
pertenece a la direccin de salud Tacna.
A. Objetivo:
Brindar resultados analticos confiables y eficaces en apoyo alos diferentes programas sanitarios ambientales de la direccin
ejecutiva de salud ambiental.
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B. Funciones:
Brindar soporte analtico cualitativo y cuantitativo mediante
ensayos biolgicos de contaminantes relacionados a las
actividades de identificacin, vigilancia y control de riesgos
ambientales para la salud.
Implementar el sistema de gestin de la calidad
Brindar soporte analtico a solicitud de parte en los ensayos de
su competencia.
Planificar, organizar y monitorear las actividades para
implementar y mejorar el sistema de gestin de la calidad del
laboratorio de salud ambiental.
Implementar el sistema de gestin de la calidad del laboratorio
en base a la poltica y objetivos del laboratorio.
Mantener actualizada la documentacin del sistema de gestin
de la calidad.
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Mantener interaccin permanente con los usuarios del
laboratorio con relacin a los mtodos caractersticos
resultados de los ensayos.
Realizar los ensayos microbiolgicos en muestras de aguas,
alimentos y superficies en contacto con alimentos aplicando
los criterios de calidad para garantizar la confiabilidad de los
resultados de los ensayos que constituyen el soporte tcnico
de las acciones de control y vigilancia en aspectos higiene.
Implementar mtodos de anlisis de acuerdo a las
necesidades de la DESA y en cumplimiento con la normativo
vigente actualmente se viene fortaleciendo el anlisis de
microorganismos patgenos como Salmonel la, E col i y S.
ureus.
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El laboratorio est dividido en 5 reas:
1.3.5. rea de recepcin de muestras:
rea destinada a recepcionar las muestras que ingresan de las
diferentes localidades de Tacna; para su respectivo anlisis microbiolgico,
abarcando muestras derivadas de acciones de vigilancia, control,
fiscalizacin sanitaria, denuncias entre otros.
LABORATORIO DE SALUDAMBIENTAL
rea de recepcin demuestras
rea deesterilizacin y
lavado
rea de preparacin demedios de cultivo
rea de anlisis Microbiolgico
rea de almacn
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Esta rea cuenta con su respectivo procedimiento aprobado
recepcin de muestras para anlisis microbiolgicos, el cual establece las
condiciones y requisitos de recepcin, que aseguran la representatividad y
caractersticas necesarias que deben reunir las muestras para ser
analizadas, y nos menciona lo siguiente:
Finalidad:
Contribuir a asegurar la confiabilidad y reproductibilidad de los
resultados de los anlisis de agua que se efectuaran en el laboratorio de
Salud ambiental de la direccin ejecutiva de salud ambientalDESA.
Procedimiento de Aplicacin:
Las principales caractersticas para recepcionar las muestras de agua
y alimentos son:
Frascos de vidrio estriles, conteniendo un mnimo de 250 o 500
ml de muestra de agua segn sea el caso. Para muestras dealimentos las bolsas de plstico, estriles deben tener una
capacidad adecuada para que la cantidad de muestra a recolectar
pueda sellarse firmemente tras su llenado.
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Para el caso de superficies vivas los frascos deben contener 100
ml solucin diluyente.
Para el caso de superficies inertes los tubos de ensayo deben
contener 10 ml de agua peptonada tamponada al 0,1 %, con sus
respectivos hisopos estriles.
Deben estar claramente rotulados (cdigo de campo).
El transporte de las muestras debe realizarse en recipientes
refrigerados (coolers) para que el material recolectado se conserve
por debajo de los 10 C.
El tiempo transcurrido desde la toma de muestra hasta la llegada
al laboratorio; para el caso de muestras de agua tratada,
superficies vivas e inertes, no debe pasar ms de 24 horas
mientras que para muestras de alimentos, agua de mar, aguas
residuales, aguas naturales, no debe exceder de ms 6 horas.
Deben presentar la respectiva cadena de custodia (previamente
llenada).
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La cadena de custodia refleja en los documentos en donde se
registra toda la informacin relevante para asegurar la integridad
de la muestra desde la recoleccin hasta el reporte de resultados
por parte del laboratorio. La importancia de contar con este
documento radica en prevenir la falsificacin y/o alteracin de los
datos de campo, as como para definir la cantidad y tipos de
anlisis requeridos, el tipo de pre tratamiento al que ha sido
sometido, la fecha y hora de muestreo, el numero de frascos
remitidos por punto de muestreo, la fecha y hora de remisin, la
identificacin del responsable del muestreo y todo lo relacionado
con la recepcin por parte del laboratorio; para luego asignarle acada una de las muestras un cdigo de laboratorio y
posteriormente ser procesadas en el rea de anlisis
microbiolgico.
Toda la informacin es recopilada a travs de las cadenas de
custodia las cuales son transferidas a la base de datos que seencuentra en el rea de recepcin de muestras para fines
institucionales.
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1.3.6. rea de almacn:
Debido a la demanda que tiene el laboratorio de salud ambiental, es
necesario que tengan un almacn el cual debe abastecer las necesidades
que esta requiera, para su normal funcionamiento y por ende brindar los
anlisis respectivos.
Es un rea destinada a guardar stock de los materiales e insumos
necesarios para el funcionamiento del laboratorio.
Esta rea tambin cuenta con una base informativa que controla el
ingreso y salida de los diferentes materiales de uso comn en un laboratorio.
1.3.7. rea de lavado, control y esterilizacin de materiales:
rea destinada al lavado, preparacin y esterilizacin del material
necesario para el anlisis microbiolgico; para lo cual se requiere uso de
material de vidrio, equipos de esterilizacin a calor hmedo y seco, etc.
Esta rea cuenta con su respectivo procedimiento aprobado lavado
de material de cristalera y esterilizacin el cual proporciona las siguientes
instrucciones:
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Finalidad:
Reunir todas las condiciones necesarias y de seguridad para poder
realizar actividades de preparacin y esterilizacin de materiales.
Procedimiento de aplicacin:
Descontaminar todo material de vidrio proveniente de incubacin,
antes de someter al proceso de lavado en autoclave por 30
minutos a 121C y a 15 libras de presin.
Sumergir en solucin de Tegol al 0,5 % o solucin desinfectante
de hipoclorito de sodio, todo material utilizado durante ensayos
microbiolgicos antes del lavado.
Utilizar una solucin de detergente neutro (alconox) y dejar
inmerso el material durante 1 hora a temperatura ambiente.
Para esterilizacin a calor seco, colocar el material de vidrio e
instrumentos envueltos en papel kraff en el horno durante 3 horas
a 170 C.
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Control del proceso de esterilizacin:
Para el control del proceso de esterilizacin en el horno se coloca una
cinta indicadora de esterilizacin de calor seco por cada lote de material a
esterilizar, el cambio de color en la cinta indicar que el material ha sido
expuesto a temperatura de esterilizacin, de igual manera se utiliza otra cintapara esterilizacin a calor hmedo.
Control de calidad de material de vidrio:
Para comprobar que se ha realizado un buen lavado de material de
vidrio se aade unas gotas de azul de bromotimol al 0.04 % (ABT) y observar
en cambio en el color. En el caso que el ABT virara al color azul indicar
presencia de lcali; al color amarillo indicar presencia de cido y el color
verde corresponder el neutro. Si la reaccin es neutra, el material se
liberara para su uso, caso contrario se repetir el lavado.
Para comprobar que no existen residuos de grasa en el material de
lavado, tomar de manera aleatoria cualquier pieza y dejar escurrir el agua
observando si la pelcula es contina.
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1.3.8. rea de preparacin de medios de cultivo:
rea destinada a la preparacin y al control de todos los medios de
cultivo para los anlisis microbiolgicos.
En esta rea cuenta con su respectivo procedimiento aprobado
preparacin de medios de cultivo y diluyentes el cual nos proporciona las
siguientes instrucciones:
Finalidad:
Llevar a cabo la preparacin, esterilizacin y controles de esterilidad
de los medios de cultivo y diluyentes.
Procedimiento de aplicacin:
Para la preparacin de medios de cultivo utilizar recipientes que
tengan el doble del volumen que se va a preparar siguiendo las
instrucciones del fabricante para pesar la cantidad exacta del
medio y proceder a disolverla en agua destilada.
Calentar hasta disolver el medio, con cuidado de no sobrecalentar
e inmediatamente distribuirlo en frascos de vidrio o tubos de
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ensayo y esterilizarlo como mximo dentro de las dos horas
siguientes.
Verificar el pH del medio antes y despus de la esterilizacin
utilizando una cinta indicadora y reajustar con soluciones de NaCl
y HCl si es necesario.
Examinar los medios recin preparados para comprobar el color el
oscurecimiento o posible precipitacin. Si los tubos contienen
campanas Durham, manipular cuidosamente para no formar
burbujas de aire.
1.3.9. rea de anlisis microbiolgico:
En esta rea se evala y analiza los parmetros microbiolgicos de
todas las muestras que ingresen al laboratorio de Salud Ambiental.
Funcin:
Realiza ensayos microbiolgicos en muestras de aguas alimentos y
superficies vivas e inertes en contacto con alimentos, aplicando los criterios
de esterilidad para garantizar la confiabilidad de los resultados de los
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ensayos que constituyen el soporte tcnico de las acciones de control y
vigilancia en aspectos de higiene alimentaria y calidad de agua de consumo
humano.
Implementa mtodos de anlisis de acuerdo a las necesidades de la DESA, y
en cumplimiento con la normativa vigente. Actualmente se vienefortaleciendo el anlisis de microorganismos patgenos como Salmonel la,
Escher ichia Col i, Staph ylo co ccu s ureus.
Procedimiento de aplicacin:
Cada procedimiento cuenta con un protocolo dependiendo de la
muestra que se va a analizar.
1.4. Objetivos de la prctica:
Objetivo general:
1. Adquirir conocimientos prcticos y tericos en los anlisis
microbiolgicos de muestras de aguas, alimentos, superficies
inertes y vivas ingresadas al laboratorio de la Direccin Ejecutiva
de Salud Ambiental.
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Objetivos especficos:
1. Aplicar los mtodos y/o tcnicas microbiolgicas apropiadas para
el anlisis de aguas, establecidas por la DIGESA NTP ISO / IEC
17025: 2006.
2. Determinar la calidad microbiolgica de las muestras de agua
potable (agua de consumo humano), agua natural, aguas de
piscinas y agua de mar mediante la aplicacin de los
procedimientos tcnicos especficos basados en normas
internacionales y establecidas por la DIGESA-DS N 031-2010-
SA.
3. Determinar la calidad microbiolgica de las muestras de alimentos,
superficies vivas e inertes, segn la aplicacin de la norma
sanitaria, Resolucin Ministerial N 461-2007 / MINSA.
4. Aplicar el procedimiento normalizado para el monitoreo ambiental
(calidad microbiolgica del aire y superficies) del rea de anlisis
microbiolgicos basado en la norma ISO / IEC 17025-1999. tem
5.3
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5. Conocer como recepcionar las muestras que lleguen al
laboratorio de la direccin ejecutiva de salud ambiental segn
procedimiento.
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II. FUNDAMENTO TERICO
2.1. Agua:
El agua es uno de los bienes ms importantes y escasos que tienen
las personas alrededor del mundo, nuestro pas no es una excepcin;
muchas de nuestras poblaciones se ven obligados a beber de fuentes cuya
calidad deja mucho que desear y produce un sin fin de enfermedades a nios
y adultos.
El acceso al agua potable es una necesidad primaria y por lo tanto un
derecho humano fundamental, en este contexto con la finalidad de garantizar
su inocuidad, prevenir los factores de riesgos sanitarios, as como proteger y
promover la salud y bienestar de la poblacin el estado elabor el
Reglamento de los requisitos Oficiales Fsicos, Qumicos y Bacteriolgicos
que deben reunir las aguas de bebida para ser consideradas potables en
(1946), luego en el ao 2000, la Direccin General de Salud Ambiental,
asume la tarea de elaborar el Reglamento de la Calidad del Agua para
Consumo Humano, tarea que el 26 de setiembre del 2010, a travs del D.S.
N 031-2010-SA, se vi felizmente culminada.(MINSA,2010)
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2.2. Vigilancia de la calidad de agua de consumo humano:
La vigilancia sanitaria del agua para consumo humano es una
atribucin de la Autoridad de Salud, que se define y rige como:
1. La sistematizacin de un conjunto de actividades realizadas por la
Autoridad de Salud, para identificar y evaluar factores de riesgo
que se presentan en los sistemas de abastecimiento de agua para
consumo humano, desde la captacin hasta la entrega del
producto al consumidor, con la finalidad de proteger la salud de los
consumidores en cumplimiento de los requisitos normados en este
Reglamento.
2. Un sistema conducido por la Autoridad de Salud, el cual est
conformado por consumidores, proveedores, instituciones de
salud y de supervisin de mbito local, regional y nacional
3. El establecimiento de prioridades y de estrategias para la
prevencin o eliminacin de los factores de riesgo en el
abastecimiento del agua, que la Autoridad de Salud establezca
para el cumplimiento por el proveedor
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Programa de vigilancia:
La DIGESA y las Direcciones de Salud o las Direcciones Regionales
de Salud o las Gerencias Regionales de Salud en todo el pas, administran el
programa de vigilancia sanitaria del abastecimiento del agua, concordante a
sus competencias y con arreglo al presente Reglamento. Las acciones delprograma de vigilancia se organizan de acuerdo a los siguientes criterios:
1. Registro: Identificacin de los proveedores y caracterizacin de los
sistemas de abastecimiento de agua.
2. mbito: Definicin de las zonas de la actividad bsica del
programa de vigilancia, distinguiendo el mbito de residencia:
urbano, peri urbano y rural, a fin de determinar la zona de trabajo
en reas geogrficas homogneas en cuanto a tipo de suministro,
fuente y administracin del sistema de abastecimiento del agua.
3. Autorizacin sanitaria: Permiso que otorga la autoridad de salud
que verifica los procesos de potabilizacin el agua para consumo
humano, garantizando la remocin de sustancias o elementos
contaminantes para la proteccin de la salud.
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4. Monitoreo: Seguimiento y verificacin de parmetros fsicos,
qumicos, microbiolgicos u otros sealados en el presente
Reglamento, y de factores de riesgo en los sistemas de
abastecimiento del agua.
5. Calidad del agua: Determinacin de la calidad del aguasuministrada por el proveedor, de acuerdo a los requisitos fsicos,
qumicos, microbiolgicos y parasitolgicos del agua para
consumo humano establecidos en el presente Reglamento.
6. Desarrollo de indicadores: Procesamiento y anlisis de los
resultados de los monitoreos de la calidad del agua, del sistemade abastecimiento y del impacto en la morbilidad de las
enfermedades de origen o vinculacin al consumo del agua.
2.2.1. Requisitos de calidad del agua para consumo humano:
Parmetros microbiolgicos y otros organismos:
Segn el Artculo 60 de la norma sanitaria del Reglamento de la
Calidad del Agua para Consumo Humano de la DIGESA DS N 031-2010-
SA.
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Toda agua destinada para el consumo humano, como se indica en el
Anexo 1, debe estar exenta de:
1. Bacterias coliformes totales, termotolerantes y Escher ichia col i.
2. Virus.
3. Huevos y larvas de helmintos, quistes y ooquistes de protozoarios
patgenos.
4. Organismos de vida libre, como algas, protozoarios, coppedos,
rotferos y nemtodos en todos sus estadios evolutivos.
5. Para el caso de Bacterias Heterotrficas menos de 500 UFC/ml a
35C.
Parmetros de calidad organolptica: Segn Artculo 61 del
reglamento N 031-2010-SA.
El noventa por ciento (90%) de las muestras tomadas en la red dedistribucin en cada monitoreo establecido en el plan de control,
correspondientes a los parmetros qumicos que afectan la calidad esttica y
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organolptica del agua para consumo humano, no deben exceder las
concentraciones o valores sealados en el (Anexo 2).
Parmetros inorgnicos y orgnicos: Segn Artculo 62 del
reglamento N 031-2010-SA.
Toda agua destinada para el consumo humano, no deber exceder los
lmites mximos permisibles para los parmetros inorgnicos y orgnicos
sealados en el (Anexo 3).
Parmetros de control obligatorio (PCO): Segn Artculo 63 del
reglamento N 031-2010-SA.
Son parmetros de control obligatorio para todos los proveedores de
agua, los siguientes:
Coliformes totales
Coliformes termotolerantes
Color
Turbiedad
Residual de desinfectante
pH
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En caso de resultar positiva la prueba de coliformes termotolerantes, el
proveedor debe realizar el anlisis de bacterias Escher ichia col i, como
prueba confirmativa de la contaminacin fecal.
2.2.2. Aspectos generales de microbiologa de aguas:
Los microorganismos presentes en los diferentes tipos de aguas,
constituyen una gran variedad de gneros y especies que juegan roles
importantes, por ejemplo, en los ciclos biogeoquimicos, transformando los
diferentes componentes orgnicos e inorgnicos, contribuyendo de esta
forma a la transferencia de energa, en presencia de oxigeno; siendo estos
los iniciadores de la cadena trfica en los cuerpos de aguas naturales.(Lazcano, 2000)
As mismo, la accin metablica de los microorganismos, es aplicada
en los sistemas de bioestabilizacin para la transformacin de la materia
orgnica (DBO) presente en aguas de desechos, contribuyendo de esta
forma a descontaminar las fuentes receptoras de aguas y suelos. (Lazcano,2000)
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Cuando las descargas de desages, principalmente domsticos, son
arrojadas a los cuerpos de agua, los microorganismos all presentes
representan un riesgo potencial para la salud de la poblacin usara,
especialmente cuando estas constituyen fuentes de abastecimiento de agua
de bebida, siendo frecuentes las enfermedades hdricas por consumo de
aguas sin tratamiento, o con tratamientos deficientes, especialmente en la
desinfeccin. (Lazcano, 2000)
El grupo coliforme y principalmente la bacteria Escher ichia col i, es el
indicador de mayor importancia en la calidad sanitaria del agua, y los
mtodos de diagnstico para la deteccin cualitativa o cuantitativa de los
indicadores, debe ser realizada por personal entrenado, a fin de obtener
resultados confiables, que permitan tomar decisiones en caso fuera
necesario, a fin de evitar o minimizar los riesgos epidmicos y/o focos
infecciosos puntuales. (ICMFS, 2000)
Los mtodos usados comnmente en el diagnostico microbiolgico de
aguas se basan principalmente en el tipo de aguas que se trate , as las
aguas con turbiedades excesivas (mayores de 20 NTU) o con presencia de
detritos , materia orgnica u otros elementos, deben analizarse por mtodos
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cualitativos, semi-cuantitativos o por el mtodo de tubos mltiples , para
estos exmenes existen medios de cultivo apropiados para diversos
parmetros analticos y los reportes finales se dan en NMP ( numero ms
probable) por 100 ml de muestra.(Lazcano,2000)
Cuando las muestras de agua corresponden a bajas turbiedades , loms recomendable es usar la tcnica de filtracin por membrana , la que
retiene de acuerdo al tamao de poro ( generalmente se usa el de 0,45 m) a
todos los microorganismos presentes y que colocada en la superficie de un
medio de cultivo lquido o slido selectivo para el tipo de microorganismo a
usar , e incubando a una temperatura y tiempo de incubacin adecuado , se
obtienen colonias las que se pueden contar a simple vista o con la ayuda de
un microscopio estereoscpico .Los resultados se reportan siempre como
UFC (unidades formadoras de colonias) por unidad de
volumen.(Lazcano,2000)
Organismos patgenos:
Representados por virus como los de la hepatitis, poliomelitis, etc
bacterias como el Vibr io cho lerae, Salmonella, Shigel la, Escher ichia col i
enterotoxignico y enteropatognico, Yersinia enterocol i t ica, etc los que
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son eliminados fcilmente con la adicin de cloro quistes de protozoarios
como Giardia intestinal is y Cryptospor id ium parvum los que son
altamente resistentes a la accin de cloro, por lo que su eliminacin debe
realizarse en los procesos de coagulacin y filtracin.
Indicadores de contaminacin fecal:
El concepto del indicador, se ha usado hace mucho tiempo para definir
a un microorganismo o procedimiento que seale el grado de contaminacin
fecal de una fuente y su riesgo potencial en la salud pblica.
Un indicador debe cumplir con los siguientes requisitos:
Debe ser aplicable a todos los tipos de aguas.
Si es un microorganismo, debe estar presente en mayor nmero
que el o los patgenos.
No debe incrementar significativamente en ausencia del patgeno.
La metodologa para el anlisis debe ser rpida y poco costosa.
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Principales indicadores de contaminacin fecal e indicadores
alternativos:
Coliformes totales
Coliformes termotolerantes
Escher ichia col i
Enterococcu s faecalis
Bacterias hetertrofas
Clostr idium perfr ingens
Klebsiel la pneumon iae
Aeromonas sp.
Pseudom onas aeruginosa
2.3. Alimentos:
Alimento es cualquier sustancia natural o sinttica que contenga uno o
varios de los principios que la qumica a catalogado como hidratos de
carbono, grasas, protenas, vitaminas y sales orgnicas. Se define como
alimento a cualquier sustancia que introducida en la sangre, nutre, repara el
desgaste y da energa y calor al organismo, sin perjudicarlo ni provocarle
prdida de su actividad funcional.
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Los alimentos son ecosistemas complejos, los ecosistemas estn
constituidos por el medio ambiente y por los organismos que viven all. El
ambiente de un alimento est compuesto por factores intrnsecos inherentes
al alimento y factores extrnsecos que son externos a l .Se pueden
manipular todos estos factores intrnsecos y extrnsecos para conservar el
alimento, y de este modo puede considerarse la conservacin de alimentos
como la ecologa de crecimiento cero. (Michael P. Doyle, 1997)
Las interacciones mutuas entre los microorganismos por una parte y
las plantas y los animales por otra, son naturales y constantes .Como quiera
que los alimentos que consume el hombre procedan bsicamente de las
plantas y de los animales o de productos derivados de los mismos, resulta
comprensible que dichos alimentos puedan contener microorganismos que
interaccionen con ellos.
En la mayora de casos los microorganismos utilizan nuestros
alimentos como fuente de nutrientes para su propio crecimiento, hecho que,
naturalmente, puede ocasionar su alteracin. Los microorganismos pueden
echar a perder un alimento porque se multiplican en l, porque utilizan
nutrientes, porque producen modificaciones enzimticas y porque le
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comunican sabores desagradables mediante el desdoblamiento de
determinadas sustancias o mediante la sntesis de nuevos compuestos.
(Doyle, 2003)
Adems de la microbiota normal, los alimentos son susceptibles de
contaminacin durante su manejo, ya sea por operadores, equipo, faunanociva, o por contaminacin cruzada; algunos de los microorganismos
contaminantes pueden ser patgenos y en tal caso, su desarrollo e incluso
su mera sobrevivencia, pueden ocasionar desde el incumplimiento de
normas de higiene y seguridad, hasta la aparicin de enfermedades
transmitidas por alimentos (ETAs).(Tcnicas para el Anlisis Microbiolgico
de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico)
En el Per, las enfermedades transmitidas por Alimentos (ETAs)
representan un gran problema en la salud pblica, en especial los grupos
vulnerables (nios y adultos). Desde el ao 1998 se reportaron una serie de
brotes de ETAs en diferentes zonas del Pas, aislndose Salmon ella sp, por
el consumo de mayonesa casera y salsa de rocotos preparados
artesanalmente, en restaurantes tursticos y puestos de venta ambulatoria.
(MINSA)
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2.3.1. Normativa sanitaria de alimentos:
La LEY DE INOCUIDAD DE LOSALIMENTOS Decreto Legislativo N
1062 El Peruano, 28 de junio de 2008 (Ley) 03 de julio de 2008 (Fe de
erratas)
Se cre con la finalidad de establecer el rgimen jurdico aplicable
para garantizar la inocuidad de los alimentos destinados al consumo humano
con el propsito de:
Proteger la vida y la salud de las personas
Reconocer y asegurar los derechos de los consumidores
Promover la competitividad de los agentes econmicos
2.3.2. Aspectos microbiolgicos:
La presencia de microorganismos en los alimentos no significa
necesariamente un peligro para el consumidor o una calidad inferior de estos
productos. En realidad, si se excepta el reducido nmero de productos
esterilizados, cada bocado de alimento contiene levaduras inocuas, mohos,
bacterias y otros microorganismos. La mayor parte de los alimentos se
convierten para el consumidor solo despus de que han sido violados los
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principios de higiene, limpieza y desinfeccin. Si los alimentos han estado
sometidos a condiciones que pudieran haber permitido la llegada a los
mismos y/o la multiplicacin de agentes infecciosos toxignicos, pueden
constituirse en vehculo de transmisin de enfermedades tales como la
salmonelosis o la intoxicacin estafiloccica. (ICMFS, 2000)
El examen microbiolgico rutinario de los alimentos para detectar en ellos
toda una serie numerosa de microorganismos patgenos y de sus toxinas no
es practicable en la mayora de laboratorios .Sin embargo, es imperativo
realizar los anlisis microbiolgicos de rutina correspondientes siempre que
la informacin epidemiolgica o de otro tipo de que se disponga sugiera o
haga pensar en la presencia de un agente patgeno especifico en un
determinado alimento.
Para ellos se utilizan un grupo de microorganismos cuya enumeracin
o recuento se realiza con mayor facilidad y cuya presencia en los alimentos
indica que estos productos estuvieron expuestos a condiciones que pudieran
haber introducido organismos peligrosos y/o permitido la multiplicacin de
especies infecciosas o toxignicas. Los grupos o especies utilizadas con
estos fines se denominan microorganismos indicadores y sirven para evaluar
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tanto la seguridad que ofrecen los alimentos en cuanto a microorganismos y
sus toxinas, como su calidad microbiolgica.(ICMSF,2Edicion)
Los exmenes microbiolgicos realizados a los microorganismos
indicadores son:
Recuento en placa de bacterias
Bacterias entricas indicadoras
Salmonellas
Shigelas
Escher ichia col i
Vibr io parahemol i t icus
Vibr io cholerae
Staphylococ cus aureus
Clost rid ium botu l inumy Clostr idium perfr ingens
Baci l lus cereus
Estreptococos
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2.3.3. Superficies vivas e inertes relacionadas a alimentos:
El anlisis de superficies vivas e inertes se realizaran en el
establecimiento donde se procesan, elaboran, almacenan, fraccionan o
expenden alimentos y bebidas, sea fbrica, almacn, servicios de alimentos,
quiosco, puesto, comedor, u otro.
Comprende las siguientes operaciones consecutivas, realizadas por
personal capacitado en la materia:
1. Procedimiento para la seleccin de la muestra.
2. Seleccin del mtodo de muestreo.
3. Procedimiento para la toma de muestra.
Procedimiento para la seleccin de la muestra:
El procedimiento para seleccionar las muestras, debe estar en
funcin de los riesgos sanitarios relacionados a las diferentes
etapas de la cadena alimentaria, sea de la fabricacin, de laelaboracin y/o expendio.
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En fbricas de alimentos y bebidas:
Superficies inertes: Se seleccionarn aquellas que estn o
tendrn contacto directo con los alimentos que no sern sometidos
a un proceso trmico posterior u otro que disminuya la carga
microbiana.
Superficies vivas: Se seleccionarn a los manipuladores de
alimentos, con o sin guantes, que estn en contacto directo con
los alimentos que no sern sometidos a un proceso trmico
posterior u otro tratamiento que disminuya la carga microbiana.
En establecimientos de elaboracin y expendio:
Superficies inertes: Se seleccionarn aquellas superficies que
estn en contacto con los alimentos destinados al consumo
directo, como utensilios, vajilla, superficies de corte, menaje,
equipos, entre otros.
Superficies vivas: Se seleccionarn las manos de los
manipuladores, con o sin guantes, que estn en contacto con los
alimentos destinados al consumo directo.
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Seleccin del mtodo de muestreo:
La seleccin del mtodo de muestreo debe estar en funcin de las
caractersticas de la superficie a muestrear.
METODO DE
MUESTREO
SUPERFICIES A MUESTREAR
Mtodo del hisopo
Se utiliza para superficies inertes regulares e
irregulares, tales como tabla de picar, bandejas,
mesas de trabajo, utensilios, cuchillas de equipos,
cortadora de embutidos, cortadora de pan de molde,
fajas transportadoras, tolvas, mezcladoras, pisos,
paredes y otros.
Mtodo de laesponja
El mtodo de la esponja se utiliza preferentementepara muestrear superficies de mayor rea.
Mtodo del
enjuague
Se utiliza para superficies vivas (manos) y para
objetos pequeos o para el muestreo de superficies
interiores de envases, botellas, bolsas de plstico, etc.
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Procedimiento para la toma de muestra:
Mtodo del hisopo:
Consiste en frotar con un hisopo estril previamente humedecido
en una solucin diluyente, el rea determinada en el muestreo.
Conservacin y Transporte de la muestra: Las muestras se
colocarn en un contenedor isotrmico con gel refrigerante, el cual
se distribuir uniformemente en la base y en los laterales, de tal
manera de asegurar que la temperatura del contenedor no sea
mayor de 10C, a fin de asegurar la vida til de la muestra hasta
su llegada al laboratorio. El tiempo de transporte entre la toma de
muestra y la recepcin en el laboratorio estar en funcin estricta
de dicha temperatura, no debiendo exceder las 24 horas y
excepcionalmente las 36 horas.
Se debe registrar la temperatura del contenedor al colocar las
muestras y a la llegada al laboratorio a fin de asegurar que las
mismas hayan sido transportadas a la temperatura indicada.
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Temperaturas superiores a 10C invalidan la muestra para su
anlisis.
Mtodo de la esponja:
Consiste en frotar con una esponja estril, previamente
humedecida en una solucin diluyente, el rea determinada en el
muestreo.
Conservacin y Transporte de la muestra: Las muestras se
colocarn en un contenedor isotrmico con gel refrigerante, el cual
se distribuir uniformemente en la base y en los laterales, de tal
manera de asegurar que la temperatura del contenedor no sea
mayor de 10C, a fin de asegurar la vida til de la muestra hasta
su llegada al laboratorio. El tiempo de transporte entre la toma de
muestra y la recepcin en el laboratorio estar en funcin estricta
de dicha temperatura, no debiendo exceder las 24 horas y
excepcionalmente las 36 horas.
Se deber registrar la temperatura del contenedor al colocar las
muestras y a la llegada al laboratorio a fin de asegurar que las
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mismas hayan sido transportadas a la temperatura indicada.
Temperaturas superiores a 10C invalidan la muestra para su
anlisis.
Mtodo del enjuague:
Dependiendo de la muestra, el mtodo consiste en realizar un
enjuague (botellas, frascos, similares) o inmersin (manos, objetos
pequeos) en una solucin diluyente.
Para recipientes (frascos, jarras, otros): Para esto:
a. Vaciar en el recipiente a muestrear una parte de la solucinestril (frasco con 100 mL) y agitar vigorosamente.
b. Regresar la solucin a su frasco original.
c. Cerrar hermticamente el frasco para su traslado.
Para objetos pequeos (piezas de equipos, otros): Se
introduce individualmente cada objeto en el frasco o bolsa con lasolucin estril y agitar vigorosamente.
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1. Con una pinza estril, retirar el objeto pequeo del frasco o
bolsa.
2. Si se muestrea ms de un objeto pequeo de igual naturaleza,
se debe considerar esto en el clculo de resultados.
Conservacin y Transporte de la muestra: Las muestras secolocarn en un contenedor isotrmico con gel refrigerante, el cual
se distribuir uniformemente en la base y en los laterales, de tal
manera de asegurar que la temperatura del contenedor no sea
mayor de 10C, a fin de asegurar la vida til de la muestra hasta
su llegada al laboratorio. El tiempo de transporte entre la toma de
muestra y la recepcin en el laboratorio estar en funcin estricta
de dicha temperatura, no debiendo exceder las 24 horas y
excepcionalmente las 36 horas.
Se deber registrar la temperatura del contenedor al colocar las
muestras y a la llegada al laboratorio a fin de asegurar que las
mismas hayan sido transportadas a la temperatura indicada.
Temperaturas superiores a 10C invalidan la muestra para su
anlisis.
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III. MATERIAL Y MTODO
El laboratorio de Salud ambiental de la Direccin Ejecutiva de Salud
Ambiental consta de 4 reas en las cuales en cada una de ellas se emplear
un material y mtodos distintos para lograr los fines especficos de dichas
reas.
3.1. Preparacin y esterilizacin de medios de cultivos y diluyentes:
Objetivo:
Indicar la metodologa llevada a cabo para la preparacin
esterilizacin y controles de esterilidad de los medios de cultivos ydiluyentes.
Materiales:
Probetas.
Material de vidrio, tubos de ensayo, frascos de vidrio de
Borosilicato.
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Otros materiales, balones, matraces, vasos de precipitacin,
esptulas.
Equipos:
Balanza, con capacidad de 2Kg exactitud 0,01 g
Autoclave
pH metro , con exactitud de 0,1 unidades de pH
Refrigeradora de laboratorio
Agitador
Horno
Bao Mara
Pesado:
1. Para la preparacin de los medios de cultivo y diluyentes se utiliz
nicamente agua destilada o desmineralizada con una calidad
microbiolgica adecuada, se midi los volmenes de agua a
utilizar con probetas graduadas.
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2. Se prepar los medios de cultivo en recipientes que tenan al
menos el doble de volumen del medio que se iba a preparar, para
esto se utiliz materiales de vidrio bien lavados y enjuagados.
3. Se prepar los medios de cultivo y reactivos siguiendo las
instrucciones del medio.
4. Posteriormente se procedi a pesar la cantidad necesaria del
medio deshidratado, luego se cerr el frasco del medio de cultivo.
5. El pesado de medios de cultivo que no se sometieron a
esterilizacin como el Agar XDL se realiz en condiciones de
esterilidad (haciendo uso de agua destilada y frascos previamente
esterilizados).
Disolucin y medicin de pH:
1. Se disolvi la porcin pesada de acuerdo a lo requerido, para esto
se tuvo cuidado de no sobrecalentar, para lo cual se utiliz una lacocina elctrica.
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2. Tras rehidratar el medio, se distribuy en los frascos y se esteriliz
como mximo dentro de las dos horas siguientes.
3. Se verific el pH de cada medio (segn el instructivo de medicin
de pH).
4. El personal responsable de la preparacin de medios de cultivo
registro en el formato de Preparacin de medios de cultivo y
diluyentes (F01-AM-IT-05)
5. Se esteriliz los medios de cultivo y diluyentes al tiempo y la
temperatura indicada.
6. Luego se retir los medios esterilizados de la autoclave tan pronto
cuando la presin de la cmara lleg a cero.
Verificacin de la esterilizacin de medios de cultivo preparados:
1. Se examinaron los medios de cultivo recin preparados para
comprobar el color, el oscurecimiento o posible precipitacin.
2. Se examinaron los tubos recin preparados para determinar la
existencia o no de burbujas de gas.
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3. Posteriormente se realiz la verificacin de calidad de cada lote de
medio de cultivo o diluyente preparado incubando a la temperatura
y tiempo correspondiente a las condiciones usadas durante el
ensayo.
4. El personal responsable registr los datos necesarios en el
formato de preparacin de medios de cultivo y diluyentes.
Mantenimiento de los medios de cultivo preparados:
1. Se mantuvo los medios de cultivo a temperaturas de refrigeracin
de 4 a 8 C y en tiempos indicados en anexo 4 .Se tom las
precauciones de preparar cantidades de medio de cultivo que se
vayan a utilizar dentro de los lmites de tiempo indicados.
2. Los tubos o frascos con medios de cultivo se guardaron a una
temperatura alrededor de 25 C durante no ms de una semana
para que la evaporacin no sea rpida y dar lugar a alteraciones
importantes de la concentracin de los ingredientes.
3. El personal responsable se encargo de colocar una etiqueta en los
medios de cultivo preparados indicando la fecha de preparacin.
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Utilizacin de medios de cultivo:
1. Para esto se fundi los agares solidificados. Se mantuvo fundidos
los agares en bao Mara de 44 a 46 C hasta el momento de
usarlos nunca por un perodo superior a 3 horas.
2. Se temper los tubos y frascos con medio lquido que hayan
estado guardado a bajas temperaturas, mantenindolos a
temperatura ambiente por un lapso de media hora o por un
perodo aproximado de 15 minutos a 44-46C.
3.2. Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de alimentos
aguas y superficies vivas para anlisis microbiolgicos:
Objetivo:
Describir el procedimiento para la preparacin de las muestras y de
las diluciones decimales para el anlisis microbiolgico de muestras
de alimentos de acuerdo a lo indicado en la norma ISO 6887-1: 1999
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Resumen:
Se basa en la preparacin de diluciones primarias, para obtener una
distribucin lo ms uniforme posible de los microorganismos presentes
en la porcin de prueba.
Diluyentes:
Agua de peptona buferada.
Solucin diluyente
Equipos y materiales:
Balanzas, con una sensibilidad de 0,01 g
PH- metro, exactitud 0.1 unidad de pH a 25 C.
Homogenizador tipo Vrtex
Refrigeradora
Frascos de dilucin, capacidad de 100 ml autoclavables.
Pipetas graduadas de capacidad de 1 y 10 ml, graduado en
divisiones de 0,1 y 0,5 ml respectivamente.
Tubos con tapa rosca de 16 x 160 mm de dimetro.
Probetas, matraces, esptulas.
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Material de diverso como alcohol 70%, algodn, plumn indeleble.
Preparacin de las muestras:
Se manipul las muestras de tal manera que se trat de evitar todo
riesgo de contaminacin, para ello se tom las siguientes
precauciones:
1. Como no se trabaj en una cabina de bioseguridad, se hizo
siempre cerca de la flama del mechero.
2. Se limpi la superficie del envase de la muestra que ser abierta
con etanol al 70 %.
3. Todos los instrumentos utilizados para tomar la muestra (plantillas,
frascos, pipetas, tubos de ensayo, etc.) que se proporcionaron a
los muestreadores fueron estriles.
4. Se marc cuidadosamente el cdigo de laboratorio de la muestra,
en el frasco recipiente que sern utilizados para analizar las
muestras.
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Preparacin de la suspensin inicial (primera dilucin):
1. Se pes en un recipiente estril, previamente tarado, 10 g o 10 ml
de la muestra; se adiciono 90 ml del diluyente.
2. Para evitar daar los microorganismos, por un cambio de
temperatura, la temperatura del diluyente durante el anlisis fue
aproximadamente el mismo de la temperatura ambiente.
3. Se homogeniz la muestra, con el homogenizador tipo Vrtex.
Preparacin de las diluciones adicionales:
1. Se transfiri, por medio de una pipeta, 1 ml de la suspensin inicial
(primera dilucin) a un tubo conteniendo 9 ml de diluyente estril a
la temperatura apropiada.
2. Se mezcl cuidadosamente con un homogenizador durante 5 a 10
segundos, para obtener la dilucin 10-2.
3. Se repiti esta operacin tomando 1ml de la dilucin 10-2. Luego
se utiliz una pipeta estril diferente para cada una de las
diluciones 10-2, 10-3, 10-4, etc. Hasta que se obtuvo el nmero
apropiado de microorganismos.
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3.3. Procedimiento de recuento de bacterias heterotrficas:
Objetivo:
Describir el mtodo de ensayo para calcular el nmero de bacterias
vivas hetertrofas en muestras de agua de acuerdo a lo indicado en el
Estndar Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21th
edition 9215 B.
Resumen:
El recuento de bacterias heterotrficas en placa, anteriormente
denominado recuento estndar en placa, consiste en agregar unmililitro de muestra o de la dilucin de la muestra a una placa Petri
estril, por duplicado y verter un volumen adecuado de Agar Plate
Count; el cual debe de estar a una temperatura de 45 C a 46C,
luego se realiza la homogenizacin, se deja solidificar e incubar a 35
C por 48 horas .El conteo de las colonias se expresa como UFC/ml.
Materiales:
Agar PlateCount (Agar para Recuento en Placa)
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Composicin:
Peptona de casena 5.0 g
Extracto de levadura 2,5 g
Glucosa 1,0 g
Agar 15,0 gAgua destilada 1L
Se disolvi el medio deshidratado luego se calent hasta su completa
disolucin en forma frecuente, evitando que hierva. Posteriormente se
reparti en frascos, luego se cerr y esteriliz en autoclave durante 15
minutos a 15 lbs de presin y 121 C, el pH final fue de 7,2 0.2 a25C.
Agua de dilucin (solucin tampn de fosfato):
Para preparar el agua de dilucin de tampn de fosfato, se necesit la
preparacin de soluciones Stock A Y B.
Solucin Stock A:Se disolvi 34g de fosfato mono potsico (fosfato
di hidrogeno de potasio) KH2PO4 en 500ml de agua destilada luego
ajustamos el PH a 7,2 con hidrxido de sodio (NaOH) al 1N y se
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complet al volumen a un litro con agua destilada. Posteriormente
autoclavamos por 15 minutos a 121C.
Solucin stock B:Disolvimos 81,1g de cloruro de magnesio (MgCl2
6H2O) en un litro de agua destilada. Se autoclav por 15 minutos a
121C.
Se agreg 1,25mL de la dilucin Stock A y 5 ml de la solucin Stock B
a un litro de agua destilada .Distribuimos en frascos en cantidades
adecuadas 9 0,2 ml o 90 2ml y se autoclav por 15 minutos a 121
C.
Equipos y Materiales:
Incubadora de aire caliente a 35 C 0,5 C.
Frascos con agua de dilucin, con una capacidad de 100 ml
autoclavables.
Pipetas de 10 ml
Placas Petri de vidrio 100 x 15 mm esterilizable.
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Diluciones de muestra:
1. Las diluciones se realizaron de forma que el nmero de colonias
en una placa sea 30 a 300 colonias .Por ejemplo si se sospecha
que el recuento de hetertrofos en placa alcanzara 3000 se
prepararn placas con diluciones 10-2
.
2. Para realizar diluciones, se utiliz una pipeta estril, la cul se
cambio para cada dilucin que se prepar, en algunos casos que
hubo contaminacin se sustituy por otra esterilizada.
Plaqueo:
1. Se licu el Agar Plate Count con mucho cuidado evitando que
hierva, se mantuvo el medio lquido en un bao de agua entre 44 y
46C hasta que lleg el momento de usarlo.
2. Se Limit el nmero de muestras a ser plaqueadas a una serie,
de manera que no transcurran ms de 20 minutos(preferiblemente 10 minutos) entre la dilucin de la primera
muestra y adicin del medio a ltima placa de la serie.
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3. Se verti de 15 a 20 ml del medio licuado mantenido de 44 a 46 C
en cada placa Petri levantando suavemente la tapa de la placa lo
suficiente para agregar el agar.
4. Se evit el vertido del medio fuera del envase o en el borde de la
placa, cuando se verti el agar de frascos o tubos que han sidomantenidos en agua, se sec con un papel toalla y se flameo el
cuello del frasco antes de verter el agar. Una vez aadido el medio
a todas las placas, se mezcl cuidadosamente el medio lquido
con la porcin de muestra previamente colocada en la placa con
cuidado de no proyectar la mezcla contra el borde, girando
primero la placa y en una direccin y despus en direccin
opuesta, o haciendo girar la placa en forma de ocho varias veces.
Se dej solidificar la placa durante 10 minutos e invirtindose y se
coloc en la incubadora.
5. Con los controles, se comprob la esterilidad del medio y de los
blancos de agua de dilucin preparando con ellos placas fluidas
en cada serie de muestras .Se prepararon controles adicionales
para determinar la contaminacin de las placas y del ambiente.
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Incubacin:
Se incub a 35 C x 48 horas.
Recuento de colonias:
1. Inmediatamente despus de la incubacin, se procedi a contartodas las colonias de las placas seleccionadas.
2. Consideramos solo las placas que tuvieron entre 30 y 300
colonias, aunque hubo casos en que el exceso de
microorganismos sobrepasaban estos valores y se tuvieron que
adecuar para el clculo del recuento bacteriano por mililitro,multiplicando el nmero promedio de colonias de las dos placas
seleccionadas perteneciente a la misma dilucin por el inverso de
la dilucin utilizada reportar UFC/ ml.
3. En casos en que ninguna de las placas de una muestra se obtuvo
colonias, se report como un recuento inferior.
4. Cuando aparecieron colonias expansivas en la placa, se tom por
criterio como una colonia cuando hubo: cadenas de colonias que
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3.4. Procedimiento de Monitoreo Ambiental:
Tiempo y temperatura de incubacin:
Las placas conteniendo el PCA fueron expuestas durante 15 min
luego se cerraron e incubaron a 35C por 48 horas, para
mesfilos.
Para el caso de mohos y levaduras utilizamos placas con Agar
Sabourand, exponindolas por un tiempo de 15 min, de igual
forma se cerraron e incubaron a 22 C por 5 das.
Frecuencia de realizacin de los controles:Semanal.
rea a monitorear para la toma de muestras:
Sala de microbiologa: mesa 1, mesa 2 y mesa 3.
Lmite de tolerancia:
1. Para una exposicin durante 15 minutos de las placas se permitir
hasta 15 colonias.
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2. Los resultados se expresaron como unidades formadoras de
colonias (ufc) por placa.
Acciones correctivas a ejecutar en caso de sobrepasarse el lmite
de tolerancia:
En algunos casos en que se sobrepasaron del lmite se tom medidas
correctivas limpiando y desinfectando dichas reas con el personal
encargado, cerrando las ventanas en algunas ocasiones para evitar
ms contaminacin y una verificacin hasta que el lmite de tolerancia
se cumpla.
3.5. Procedimiento de anlisis para la deteccin de Salmonel la spp:
La deteccin de Salmonella, requiri de 5 etapas sucesivas:
a. Enriquecimiento no selectivo.
b. Enriquecimiento selectivo.
c. Siembra en placa de medios slidos selectivos y diferenciales.d. Estudio de las caractersticas bioqumicas de las colonias
sospechosas, en los medios adecuados.
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Los pasos a) hasta c) se refirieron al aislamiento, y el d) a la
identificacin. El paso a) tiene como fin la revitalizacin de las
Salmonelas daadas por las diferentes condiciones de tratamientos
industriales o de almacenamiento. El paso b) es de enriquecimiento
selectivo y sirvi para favorecer el crecimiento de las salmonellas en
un ambiente que puede contener gran nmero de bacterias diferentes
de ellas mismas. El paso c) permiti la visualizacin de las colonias
sospechosas, por su aspecto caracterstico. El paso d) se refiri a la
identificacin bioqumica.
Medios de Cultivo, reactivos y suero:
Medio de pre-enriquecimiento no-selectivo: agua peptonada
tamponada.
Primer medio de enriquecimiento selectivo: Rappaport-Vassiliadis
con soya (Caldo RVS).
Segundo medio de enriquecimiento selectivo: Caldo Muller-
Kauffmann tetrationato con novobiocina (Caldo MKTTn), en
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nuestro caso no contamos con este caldo pero trabajamos con el
Caldo Selenito Cistina (CSC).
Medio slido selectivo:
Primer medio: Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (Agar XLD).
Segundo medio: Agar Verde Brillante Rojo de Fenol Lactosa
segn Kauffmann
Medios y reactivos para las pruebas bioqumicas:
Agar Nutritivo.
Agar Hierro Tres Azcares azucares (agar TSI).
Agar rea (Christensen).
Medio L-Lysina Descarboxilasa.
Reactivo para Voges Proskauer (Reactivo VP).
Reactivos para la Reaccin de Indol (Reactivo de Kovack).
Agar Nutritivo semi-slido.
Solucin salina
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Pre-enriquecimiento no-selectivo:
Se incub la suspensin inicial a 37 C 1C, por 18 horas.
Enriquecimiento Selectivo:
1. De la suspensin inicial obtenida, se transfiri 0, 1 ml a un tuboque contena 10mL de caldo Rappaport Vassiliadis (RV) y 1 ml a
un tubo conteniendo 10 mL del Caldo Selenito Cistina.
2. Se incub el caldo Rappaport Vassiliadis (RV) a 41.5 C 1C
por 24h 3h y el caldo Selenito Cistina a 37 C 1C por 24h
3h. Se tuvo que tener cuidado de la temperatura mxima deincubacin permitida, no debi exceder de 42,5C.
Plaqueado e identificacin:
1. Del cultivo obtenido del medio RV, luego de la incubacin por 24h,
se inocul por medio de un asa, en la superficie de una placa Petri
conteniendo el primer medio selectivo (agar XLD) de manera que
se pudo obtener las colonias.
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2. Se procedi de la misma manera con el segundo medio selectivo
usando un asa de siembra y placa Petri.
3. Del cultivo obtenido en el caldo Selenito Cistina, se repiti el
procedimiento.
4. Se invirtieron las placas obtenidas y se incubaron a 37C para el
primer medio selectivo. Se siguieron las instrucciones del medio
para el segundo medio selectivo.
5. Despus de la incubacin por 24h se examin las placas y se
observaron la presencia de colonias tpicas de Salmonel la y
colonias atpicas qu podran ser Salmonella .Se marc su
posicin en la base de la placa.
6. Segn la bibliografa del procedimiento nos menciona las colonias
tpicas de Salmonella.
7. Las colonias tpicas de Salmonella en agar XLD tienen un centronegro y una zona ligeramente transparente debido al cambio de
color del indicador.
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cultivo sin inocular. Un segundo control negativo, control
del cultivo, para demostrar la aparicin de flora
competitiva en varios medios o mostrar que esta no
Salmonella no crecer en los medios selectivos usados
para el anlisis. Este control se prepar inoculando el
medio inicial con una cepa no Salmonellay se sigui el
mismo procedimiento que para las muestras de prueba.
3. Las placas de Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) se
prepararon un da anterior al aislamiento ya que las
placas recin preparadas pueden inhibir el crecimiento
de Salmonella. Las placas se almacenaron de 4 a 5C y
se mantuvieron a temperatura ambiente antes de su uso
para evitar la condensacin de humedad en la superficie.
4. Se pic ligeramente el centro de una colonia sospechosa
en la placa de agar selectivo para evitar la transferencia
de: Salmonellano viable que pueden estar situadas bajo
o adyacentes a una colonia sospechosa de Salmonella.
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Preparacin de la muestra, suspensin inicial y diluciones:
Se utiliz el mismo procedimiento de preparacin y dilucin de
muestras de alimentos para anlisis microbiolgico.
Inoculacin:
1. Se transfiri, por medio de una pipeta estril 0,1 mL de la
suspensin inicial (dilucin 10-1), a cada una de las dos placas
con Agar Baird Parker (superficie del agar previamente secada).
2. Se repiti el procedimiento para las siguientes diluciones.
3. Se prepar duplicados usando 2 placas grandes o seis
pequeas.
4. Se extendi el inculo rpida y cuidadosamente sobre la
superficie de la placa con agar, usando una esptula de
Digralsky, se procur no tocar los lados de la placa. Se dej
secar las placas cerca de 15 minutos con las tapas hacia arriba a
temperatura de laboratorio.
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Nota 1.- Las colonias tpicas son negras o grises, brillantes y
convexas (1 mm a 1,5 mm de dimetro despus de la incubacin por
24 horas y 1,5 mm a 2,5 mm de dimetro luego de la incubacin por
48 horas) y rodeada por una zona clara. Despus de incubar por lo
menos 24 horas puede aparecer un anillo opalescente en esta zona
clara, en contacto inmediato con las colonias.
Nota 2.- Las colonias atpicas tienen el mismo tamao como las
colonias tpicas y pueden presentar una de las siguientes
morfologas:
a) Colonias negro brillante con o sin un borde blanco estrecho, lazona clara est ausente o escasamente visible y el anillo
opalescente est ausente o fuertemente visible.
b) Colonias grises sin zonas claras. Las colonias atpicas estn
formadas principalmente por cepas contaminantes de
Staphy lococcus coagulasa-positiva, por ejemplo, productoslcteos, camarones y menudencias de pollo. Estas son menos
frecuentes en otros productos.
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Nota 3.- Otras bacterias no pertenecientes al gnero
Staphy lococcus pueden dar colonias con apariencia similar a
colonias Staphy lococcus. El examen microscpico de una
coloracin Gram, antes de la confirmacin ayudara a la
diferenciacin de otros gneros que nos sean Staphy lococcus.
Confirmacin (Prueba de la Coagulasa):
De la superficie de cada colonia seleccionada, se removi un inculo
con un asa estril y se transfiri a un tubo de infusin de cerebro
corazn.
1. Se incub a 37C por 24 horas.
2. Aspticamente se aadi 0,1 mL de cada cultivo a 0,3 ml de
plasma de conejo en tubos de 13 x 100 mm e incubamos a 37C.
3. Agitando el tubo, examinamos la coagulacin del plasma
despus de 4 a 6 horas de incubacin, y, si la prueba es negativare-examinamos a 24 horas de incubacin.
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4. Se consider la prueba de coagulasa como positiva si el volumen
de cogulo ocupa ms de la mitad del volumen original del
lquido.
5. Como control negativo, para cada lote de plasma, aada 0,1mL
del caldo de infusin de cerebro-corazn a la cantidadrecomendada de plasma de conejo e incubar sin inoculacin.
Para que la prueba sea vlida, el plasma de control no debe
mostrar signos de coagulacin.
Clculos:
Los clculos se efectuaron segn lo indicado en El instructivo de
anlisis para recuento de Staphylococcus aureus, el cual
menciona:
Caso General:
Clculo del nmero "a" de Staphy lococcus coagulasa-positivaidentificados para cada placa seleccionada.
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inocul con un asa el agua de triptona, previamente calentado a
45C. Se incub los tubos inoculados en bao de agua a 45C por
48 horas.
Prueba para la produccin de Indol e interpretacin:
Se aadi 0,5mL del reactivo de Kovacs en tubos que
contenan agua de triptona inoculado, mezclando bien y
examinando despus de un minuto.
Para cada dilucin se cont el nmero de tubos con un color
rojo en la fase alcohlica, indicando la presencia de Indol (tubos
positivos).
Interpretacin final:
Por cada dilucin, se cont el nmero, total de tubos en la cul
se observ la formacin de indol, (tubos positivos).
Reporte:
Los resultados obtenidos, se expresaron en NMP de Escher ichia col i ,
1 gramo o mililitro. Los resultados para cada muestra se transcribieron
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al registro interno de resultados que luego se archiva.
Control de Calidad:
Para el control de calidad utilizamos solo un control negativo, el
control fue preparado colocando un tubo con el medio de cultivo sin
inocular.
3.8. Procedimiento de anlisis de coliformes fecales por filtro
de membrana:
Resumen:
La prueba consiste en hacer filtrar volmenes de agua
adecuados, con ayuda de una bomba de vaco, a travs de una
membrana de nitrocelulosa de 47mm de dimetro, con una
porosidad de 0.45 pm; la cual es colocada en una placa Petri
conteniendo el caldo mFC, se incubara a una temperatura de
44.5 C 0,2C por 24 horas.
Esta tcnica permite examinar volmenes muy variables de
agua y ofrece un resultado directo de la concentracin de
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bacterias Coliformes (por el recuento de colonias), en lugar de
un estimado estadstico, como es el caso de Tubos Mltiples.
Medios de Cultivo:
Caldo M-FC Composicin:
Triptosa 10,0 g
Proteosa, peptona NO3 Polipeptona 5,0 g
Extracto de Levadura 3,0 g
Cloruro sdico, NaCI 5,0 g
Lactosa 12,5 g
Sales biliares N 3 o mezcla Sales biliares 1,5 g
Azul anilina 0,1 g
Agua destilada 1000 mL
Preparacin:
Se disolvi 37 gr del medio deshidratado en un litro de agua
destilada (estril), que contena 10mL de cido roslico al 1%
en solucin 0,2N de NaOH. Se calent evitando la ebullicin y
el sobrecalentamiento. El pH final fue de 7,4 0,2. No se
autoclav el medio. Se guard el medio de lquido a 4C dentro
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en cantidades adecuadas de 90 2mL y autoclavamos por 15
minutos a 121C
Caldo EC Composicin:
Triptosa o tripticasa 20,0g
Lactosa 5,0g
Mezcla de sales biliares N 3 1,5g
Di potasio hidrogeno fosfato K2HPO4 2,75g
Potasio di hidrgeno fosfato, KH2PO4 2,75g
Cloruro de sodio 5,0g
4-rnetylumberiferil-B-D-glucoronido (MUG) 0,05gAgua destilada 1 L
Preparacin:
Se disolvi 37g de medio EC - MUG en un litro de agua
destilada. Se distribuyeron 10mL, en tubos de ensayo provisto
con tubos Durham invertidos. Se esteriliz en autoclave durante
15 minutos a 121 C.
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2. Las muestras se recolectaron en frascos estriles de 250
ml, de boca ancha con tapa rosca.
3. Las placas de caldo M-FC, estuvieron preparadas, antes
de iniciar el proceso de anlisis, as, mismo se marc cada
placa con el cdigo de la muestra.
4. Para preparar las placas de cultivo, se siguieron los
siguientes pasos: Se coloc una almohadilla absorbente en
la placa Petri y se agreg de 1,8 a 2mL de medio M-FC,
hasta saturar la almohadilla. Se elimin cuidadosamente de
la placa de cultivo el posible exceso de lquido.
5. La muestra, se agit vigorosamente varias veces, para
asegurar una buena homogenizacin.
Filtracin de la Muestra:
1. Al comienzo de cada serie de filtraciones, se utilizunidades de filtracin estriles (mediante autoclave), se
evit la interrupcin de una serie de filtracin en para lo cual
tenamos 3 filtros y al momento de cambiar a otra muestra
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y se colocaron en bolsas de plstico impermeables y luego
sumergirlas en un bao de agua, donde se incubaron a
44,5C durante 24 hrs.
6. Las placas se fijaron bajo la superficie del agua para
mantener la temperatura necesaria se situaron los cultivospreparados en el bao de agua antes de transcurrir 30
minutos de la filtracin.
Recuento:
Se contaron todas las colonias de diferentes matices de color
azul. En caso de que no hubo colonias tpicas se contaron las
atpicas las cuales eran de tonos grises a cremosas.
Verificacin de Coliformes Fecales:
Se seleccion 5 colonias azules tpicas, con una asa de
inoculacin, se repic cada colonia en un tubo con medio EC,incubamos a 44,5C 0,2 por 24 hrs 2 hrs.
La incubacin se llev a cabo en un bao de agua caliente,
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En el caso que se utilizaron diluciones, se aplic la siguiente
frmula:
Coliformes fecales/100 mL = Colonias de Coliformes fecales contadas x 100
Vol. de muestra filtrado x Dilucin
3.9. Procedimiento de anlisis de coliformes totales, fecales y E. coli
para alimentos, aguas y agua de mar.
Resumen:
La metodologa de anlisis se basa en 2 etapas:
La prueba presuntiva consisti en colocar volmenes
determinados de muestra de agua en una serie de tubos
conteniendo caldo lauril sulfato que luego fueron incubados a 35
0.5C durante 24 - 48 horas.
La prueba confirmativa para la determinacin de coliformes
totales, consisti en inocular los tubos positivos de la prueba
presuntiva en el caldo verde brillante bilis, incubarlos a 35 0.5
C por 48 horas, en el caso de coliformes fecales y
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Esche r i c h i a co l i , se sembr en caldo EC-MUG para muestras
de alimentos y slo en caldo EC para las dems muestras de
agua, los tubos se incubaron a 44.5 0.2 C por un tiempo de 24
horas.
Para el caso de muestras de agua de mar utilizamos por cada
muestra 5 tubos con medio A1 de doble concentracin y 10 tubos
con medio A1 de simple concentracin, se inocul volmenes de
10ml, 1ml, y 0,1ml respectivamente de cada 5 tubos y se incub en
bao Mara a 44.5C por 24 horas pasado este tiempo se cont los
tubos positivos y negativos y se dej incubar por 24 horas ms para
as poder determinar la densidad de coliformes fecales a travs de la
tabla del NMP.
La formacin de gas en los tubos de Durham as como la
presencia de fermentacin y turbiedad en los tubos, se
consider como reaccin positiva de coliformes. Los
resultados se expresaron en trminos de Nmero Ms Probable
(NMP) de microorganismos.
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Medios de cultivo:
Caldo Lauril Sulfato(CLS)
Caldo Verde Brillante Bilis lactosa (BRILLA)
Caldo EC
Caldo A1
Agua de dilucin
Equipos y Materiales:
Incubadora Bao Mara a 44,5 0,2 C.
Incubadora a 35C.
Frascos de dilucin, capacidad de 100mL, autoclavables.
Pipetas de 10mL.
Tubos de ensayos de 18 x 150mm (para medios de
concentracin simple) y 20 x 150 mm (para concentracin doble).
Tubos (campanas) Durham.
Probetas, matraces, esptulas, vasos de precipitacin.
Asas de siembra.
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Dilucin de la muestra:
1. Recepcionadas las muestras, se procedi a preparar las
diluciones respectivas, el nmero de procedencia de agua
superficial o natural.
2. Se agit vigorosamente varias veces para asegurar una
buena homogenizacin, se transfiri con una pipeta estril un
volumen de 10 ml de la muestra a un frasco con 90mLde
agua de dilucin. De esta manera se obtuvo la primera
dilucin (10-1).
3. Se homogeniz el frasco que contena la dilucin (10-1), con
una nueva pipeta estril, se transfiri 10 ml a un nuevo
frasco de dilucin, teniendo as la segunda dilucin (10 -2).Se
continu con este proces hasta realizar todas las diluciones,
dependiendo del grado de contaminacin de la muestra.
4. Se orden los frascos conteniendo las diluciones, en
secuencia decreciente de concentracin (de mayor a Menor
dilucin).
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Prueba presuntiva:
Para el caso de alimentos y agua natural (AP), agua superficial
(AT):
1. Se prepar una batera con series de cinco tubos conteniendo
10mL de CLS de concentracin doble y series de cinco tubos
con 10mL de CLS de concentracin simple; sta serie
dependi del nmero de diluciones que se hayan realizado de
la muestra. Se coloc los tubos en gradillas y se codific
anotando el nmero asignado a la muestra, y dilucin a
inocular. Para agua de consumo humano se utiliz 10 tubosde 10mL de CLS a doble concentracin.
2. Se agit vigorosamente el frasco con la ltima dilucin
efectuada y con una pipeta transferimos 1mL de la dilucin en
cada uno de los tubos con CLS de concentracin simple
correspondiente a dicha dilucin.
3. Se procedi de la misma forma, transfiriendo 1mL de la
muestra ms diluida a la ms concentrada, utilizando para
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ello la misma pipeta.
4. Transferimos tambin 1mL de la muestra original a cinco
tubos con CLS de concentracin simple y 10 ml. en cinco
tubos con CLS de doble concentracin.
5. Se incub los tubos a 35C. Despus de 24 horas
examinamos y separamos los tubos con CLS positivos,
aquellos que presentaron formacin de gas en el tubo
Durham (fermentacin) y turbiedad. Se anot los resultados.
Todos los tubos positivos pasaron a la siguiente fase, la
prueba confirmativa.
6. Se re-incub los tubos negativos por 24 horas ms. Se realiz
la segunda lectura a las 48 horas. Nuevamente separamos y
anotamos los resultados de los tubos positivos y pasamos a
la prueba confirmativa. Los tubos negativos no se tomaron en
cuenta y se descartan.
Para el caso de muestras de agua de mar (AM):
Se trabaj con 5 tubos de medio A1 de concentracin doble, a los
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cuales agregamos 10 ml de la muestra, luego otros 5 tubos de
medio A1 de simple concentracin a las cuales agregamos 1ml y
por ltimo se agreg 0,1ml a otros 5 tubos de concentracin
simple, luego incubamos en Bao Mara a 44,5C por 24 horas y
pasado este tiempo se realiz la lectura y se separaron los tubos
positivos de los negativos de igual manera y se volvi a incubar
por otras 24 horas ms a los tubos a los tubos negativos,
separamos y anotamos los resultados de los tubos positivos y
pasamos a la prueba confirmativa.
Prueba confirmativa:
Coliformes Totales:
Para el caso de alimentos y agua natural (AP), agua superficial
(AT):
1. Se coloc en gradillas, los tubos conteniendo el medio
BRILLA, atemperamos previamente durante 30 minutos a
temperatura ambiental, codificamos cada tubo con el nmero
asignado a la muestra y con la dilucin inoculada.
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2. Se agitaron los tubos positivos de la prueba presuntiva para una
completa homogenizacin antes de ser inoculados a los tubos
con el caldo BRILLA.
3. Con un asa de siembra estril, se transfiri una o ms asadas
de un cultivo positivo de CLS a un tubo con el medio BRILLA.
4. Se repiti el mismo procedimiento para todos los tubos
presuntivos.
5. Se incub los tubos inoculados a 35 0.5C por 24 3 horas,
6. Se retir los tubos de la incubadora luego del perodo deincubacin, agitamos suavemente para observar la produccin
de gas y procedimos a realizar la lectura, consideramos positiva
toda formacin de gas en los tubos- Durham (Fermentacin) y
turbiedad en los tubos. Se anotaron los resultados. Todos los
tubos positivos pasaron a esterilizacin para ser descartados.
7. Re-incubamos los tubos negativos por otras 24 3 horas.
8. Se realiz la segunda lectura, nuevamente separamos y
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anotamos los resultados de los tubos positivos. Los tubos
negativos no se tomaron en cuenta.
9. Con los resultados obtenidos de las dos lecturas calculamos el
NMP.
Coliformes Termotolerantes (Fecales):
1. Se coloc en gradillas; los tubos c