RESUMEN

Los Extractos Dializables de Leucocitos (DLEs) son pequeñas moléculas mensajeras

inmunológicas de aproximadamente 5 KDa., hidrofílicas y altamente polares, producidas

en pequeñas cantidades por células linfoides de los organismos de nivel más alto.

Presentan un gran efecto terapéutico, sin producir efectos adversos, son libres de

gérmenes, y fueron descubiertos por Sherwood Lawrence en 1954.

En este estudio se busca conocer un poco más acerca de su mecanismo de acción,

al parecer interactúan directamente con algunas células y promueven la producción de

citocinas que actúan de forma directa sobre células fagocíticas para que éstas sean

capaces de controlar la replicación intracelular bacterias.

Como primer paso células de bazo estimuladas con DLE a diferentes tiempos

fueron recolectadas para buscar por RT-PCR la presencia de los mRNA para dos citocinas

importantes como son TNFα e IFNγ y los sobrenadantes de éstos cultivos fueron utilizados

para buscar ambas citocinas por el método de ELISA. Los resultados mostraron solo la

presencia de IFNγ a las 24h de incubación.

Estos mismos sobrenadantes fueron adicionados a cultivos de macrófagos

infectados con Listeria monocytogenes y se observa que hubo una reducción en el número

de bacterias intracelulares por lo que se concluye que el sobrenadante de las células de

bazo estimuladas con DLEs en donde hay presencia de IFNγ puede ayudar, a los

macrófagos infectados a controlar la infección por inducir sus mecanismos microbicidas.

1. INTRODUCCIÓN En 1942 Landstainer y Chase realizaron por primera vez la transferencia de

hipersensiblidad retardada (inmunidad celular) de un animal inmune a otro no

inmune, empleando para ello cobayos sensibilizados con el Bacilo de Calmette y

Guerin (BCG) y Dinitrobenceno (DNCB), los leucocitos obtenidos de estos

animales fueron inoculados en otro animal no inmune, transfiriendo en éste último

la inmunidad celular o hipersensibilidad tardía (DTH) que presentaban los

animales originales (Petersen et al 1979).

Posteriormente Lawrence demostró que si estos leucocitos eran lisados, el lisado

mantenía la capacidad de transferir DTH, cabe mencionar que en aquellos tiempos

se creía que solo una molécula era la responsable de este fenómeno y se le

bautizó con el nombre de “Factor de Transferencia” (FT) (Lawrence et al 1955)

actualmente se le llama apropiadamente extracto dializable de leucocitos (DLE).

En 1963 Lawrence y col. demostraron que el DLE era capaz de pasar por una

membrana con un corte molecular de 10 KDa, sin perder su actividad (Lawrence et

al 1963) y en un principio se pensó que este producto contenían solo una especie

molecular, sin embargo, al analizar con mayor detalle estos extractos, se encontró

que estaban compuestos por mas de 200 especies moleculares entre ellas la

timosina, prostaglandinas, hipoxantina, nicotinamida, quimioatrayentes para

monocitos, y un factor para la inhibición de migración de neutrófilos por mencionar

algunas por mencionar algunas (Fudenberg et al 1993).

En los primeros experimentos de Landstainer y de Lawrence, se observaba una

relación entre la respuesta al antígeno por parte del donador, y la transferencia de

la respuesta al mismo antígeno en el receptor; esto hizo suponer que la

transferencia llevada a cabo por el “Factor de Transferencia” (FT) era antígeno

espécifica.

En los experimentos de Rapaport y Lawrence se obtuvo DLE de un grupo de

donadores positivos a coccidioidina, procedentes de California donde el antígeno

es endémico; y se aplicó a un grupo de Neoyorquinos con respuestas de DTH

negativas a la coccidioidina; observándose que los Neoyorkinos dieron una DTH

positiva hacia la coccidiodina de manera similar al donador. (Rapaport et al 1959)

Años más tarde Borkowsky demuestra que los Factores de Transferencia

contenidos dentro de los extractos eran capaces de unirse específicamente al

antígeno que les daba origen, pero no así a los anticuerpos contra el mismo

antígeno (Borkowsky et al 1981).

Petersen y col. desarrollaron un modelo murino, en el cual estudiaron la respuesta

celular antígeno especifica a través de la determinación de la transferencia de

hipersensibilidad cutánea tardía (DTH), empleando DLE obtenido de esplenocitos

de ratones sensibilizados con PPD, ferritina, peroxidasa de rábano, entre otros,

aplicándolo posteriormente a animales no sensibilizados; 24 horas después los

animales presentaron DTH positiva sólo contra los antígenos con los cuales había

sido inmunizado el donador; además emplearon como control negativo DLE

obtenido de ratones no inmunizados, y al aplicar este último a ratones no

inmunizados estos no presentaron DTH contra ninguno de los antígenos

estudiados (Petersen et al 1979).

Más tarde Kirkpatrick confirmó los trabajos de Borkowsky donde se demostraba

que moléculas dentro del DLE eran capaces de unirse al mismo antígeno

empleado para inmunizar a los animales de donde se obtuvo el DLE, es decir las

moléculas de FT eran antígeno específicas. Kirkpatrick empleó DLE de ratones

sensibilizados con ferritina, los cuales incubó sobre superficies cubiertas con

ferritina, al recuperar el DLE éste perdía su capacidad de transferir la DTH contra

el antígeno; esta actividad podía recuperarse si se eluían de la superficie las

moléculas de FT empleando urea 8M o acetonitrilo (Kirkpatrick et al 1985;

Kirkpatrick et al 1992).

Los DLEs están compuestos por diversas moléculas, muchas de ellas con

actividad biológica, de manera general podemos dividir a los componentes de los

DLEs en moléculas antígeno independientes y antígeno dependientes (Wilson et

al 1979; Fudenberg et al 1993).

Entre los componentes antígeno independientes se encuentran moléculas que

tienen un efecto no específico sobre la inmunidad celular y participan activamente

en el fenómeno inflamatorio como son: prostaglandinas, nicotinamida, ácido

ascórbico, histamina, serotonina, timosina, quimioatrayentes para monocitos entre

otros (Fudenberg et al 1993; Burger et al 1976).

Dentro de los componentes antígenos dependientes se encuentran los

denominados Factores de Transferencia (FT), moléculas de naturaleza peptídica

con un peso molecular comprendido de 3.5 a 5 KDa, y que son capaces de

transferir la respuesta inmune celular de manera antígeno específica, contra los

antígenos hacia los cuales responde el donador de leucocitos de donde se ha

obtenido el extracto.

Con respecto a la estructura del Factor de Transferencia hasta el día de hoy no se

conoce totalmente, sin embargo, diversos grupos de investigación han tratado de

caracterizarlos por ejemplo:

Baram y Mosko fraccionaron el DLE específico para tuberculosis, en columnas de

celulosa, a partir del cual obtuvieron fracciones capaces de transferir sensibilidad a

PPD en individuos no sensibilizados previamente. Empleando filtración en gel

obtuvieron 2 fracciones capaces de transferir sensibilidad a PPD, una de éstas no

era dializable y eluía en la fracción de las gamma globulinas; mientras que la otra

estaba compuesta por un polinucleótido, en el cual se encontraban presentes

adenina, guanina y citosina (Baram et al 1965)

En 1967 Árala, Chávez y Heremans empleando una combinación de filtración en

gel y electroforesis de alto voltaje, describieron proteínas dentro de las fracciones

activas del extracto (Arala-Chavez et al 1967); en 1973 Neidhart y col separaron

así 6 fracciones de DLE específico para tuberculosis de 5 donadores diferentes;

encontrando que la fracción 4 era la que tenía mayor actividad (Neidhart et al

1973). Kronh desarrolló estudios similares de cromatografía; pero el encontró 7

fracciones de las cuales 3 mostraban actividad biológica (Krohn et al 1976) y en

1977 Wilson, Welch y Fundeberg publicaron un análisis en el cual identificaron una

fracción activa de “factor de transferencia dializable humano” lo que hoy

entendemos por DLE, de esta fracción separaron dos subfracciones de las cuales

solo una transfería DTH en cobayos (Wilson et al 1977).

Borvak y Mayer realizan un fraccionamiento bioespecífico en el cual el DLE se

hace pasar por una columna de afinidad con m-aminofenil y ácido borónico, y

posteriormente se mide la absorbancia en luz ultravioleta; con éste

fraccionamiento se concentró material proteíco y además contenía purinas y

pirimidinas, por lo tanto los FT podían ser polipéptidos unidos a fracciones de RNA

21 . Este mismo grupo de trabajo realizó una purificación parcial de dos fracciones

principales por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) demostrando la

presencia de lisina, glicina, serina y ácido glutámico (Borvak et al 1990).

A partir de 1992, Kirkpatrick y col. purificaron factor de transferencia específico

(FTs), a partir de DLE obtenidos de ratones inmunizados con albúmina de huevo y

ferritina de caballo, por diferentes métodos como: afinidad al antígeno,

cromatografía de fase reversa y HPLC; analizando posteriormente por

electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE)

y ensayos in vivo para medir su actividad. Tras estos trabajos la conclusión

principal fué que los FT antígeno especifico eran moléculas de bajo peso

molecular de aproximadamente 5000 Da y que son hidrofílicas y altamente

polares (Kirkpatrick et al 1992). Además Kirkpatrick, logro aislar y secuenciar dos

péptidos diferentes de manera consistente en DLE murino y bovino. La secuencia

que encontraron fue: MxLLYAQDLEDN y MxLLYAQDVEDN, ésta secuencia se

encontraba presente en todos los DLE analizados. Dichos péptidos no eran

capaces de transferir DTH, pero si de inhibirla si se administraban con el FT; lo

anterior hace suponer que dichos péptidos podrían estar compitiendo con el sitio

receptor de los FT en la célula blanco, y probablemente corresponden a una parte

del FT que se une a la célula de manera especifica independientemente del

antígeno (Kirkpatrick et al 2000).

Se han desarrollado diversas hipótesis acerca del mecanismo de acción del DLE,

de acuerdo con los trabajos realizados, tanto “in vitro”, “ex vivo” e “in vivo” desde

su descubrimiento. Pero dentro de las actividades inmunológicas del DLE que se

han demostrado previamente tenemos:

• Proliferación de linfocitos específicos para tuberculina empleando DLE;

realizado “in vitro” en células humanas (Levin et al 1973).

• Aumento de la capacidad de respuesta de linfocitos a mitógenos, realizado

“in vitro” en células humanas (Petersen et al 1979; Burger et al 1976).

• Producción de IFNγ, in vivo ratones sensibilizados con DLEs específicos

(Kirkpatrick et al 1995).

• Producción de células T citotóxicas especificas para células de sarcoma

osteogénico, utilizando DLE obtenido de convivientes (Gottlieb et al 1995).

• Secreción de IFNγ y de IL-12, específicas de antígeno, “in vitro” células de

bazo de ratón (Alvarez et al 1996).

• Incremento en la producción de interefron gamma en pacientes con herpes

zoster tratados con Fcator de transferencia (Estrada Parra S. et al 1998).

• Incremento en el receptor para IL-2 (CD25) en células CD4+, empleando

para la obtención del DLE una membrana de diálisis de 3500Da; realizado

in vitro en células mononucleares periféricas humanas (Pérez-Tapia 1999).

• Modulan la expresión de osteopontina en células mononucleares humanas

(in vitro) (Pérez-Tapia et al 2001).

• Inducción de la expresión de IFN γ en células mononucleares humanas (in

vitro) y en un modelo murino de infección con tuberculosis (in vivo) (Fabre et

al 2004).

• Incremento de células NKT y CD4 + CD25 +, en un ensayo ex vivo a las

24h de haber aplicado el DLE en personas sanas (Rodríguez Flores et al

2004).

• Incremento en la expresión de Beta-defensinas en células de sangre

periférica (Rivera Ordaz A 2005).

• Presencia de ligandos para TLR-2 en los DLEs (Robledo F, 2006).

• Activación y proliferación de linfocitos T CD4+ (De la Fuente M. 2006).

• Incremento de linfocitos T CD4+ y en la expresión de HLA-DR en

monocitos de pacientes con sepsis y tratados con DLE (Pérez-Tapia 2007).

Desde el descubrimiento de los DLE se han utilizado para el tratamiento de

muchas enfermedades que afectan al hombre. En la tabla I se describen los

padecimientos en los cuales los DLE han sido utilizados, los resultados que se han

obtenido son heterogéneos ya que el éxito de su uso depende del padecimiento y

por supuesto del estado clínico del paciente.

Tabla I. Enfermedades en las que se ha dado tratamiento con DLE

I. Defectos de amplio espectro en inmunidad mediada por células (Inmunodeficiencias severas)

II. Cáncer (principalmente cuando tiene etiología viral) o para evitar metástasis específicas.

A. Defectos congénitos

Síndrome de Wiskott-Aldrich

Ataxia telagiectasia

Síndrome de inmunodeficiencia severa combinada

Síndrome parcial de Di George

Disgamaglobulinemia con defectos en inmunidad

celular

B. Defectos de origen desconocido

Sarcoidosis

Enfermedad de Hodking

Osteosarcoma

Cáncer de seno

Hipernefroma

Carcinoma nasofaríngeo

III.- Enfermedades Infecciosas producidas por IV.- Enfermedades autoinmunes

A.- Hongos

Histoplasmosis diseminada

Coccidioidomicosis diseminada

B.- Virus

Citomegalovirus

Herpes zoster

Sarampión

Otros (especialmente aquellos comunes en

inmunodeficiencias)

C. Infecciones provocadas por micobacterias

Tuberculosis

Lepra

3. Mycobacterium fortuitum

D. Infecciones provocadas por protozoarios

Leishmaniasis cutánea

A.- Enfermedades autoinmunes no órgano específico

Lupus eritematoso crónico discoide

Síndrome de Behcet

Tabla tomada de Wilson y Fudenberg (1983).

De los DLEs se ha observado su actividad no es solo como estimulante del

sistema inmune, sino también como supresor de la respuesta, es por esto que se

considera un inmunomodulador. Como sabemos, los inmunomoduladores son

sustancias con la capacidad de mediar los efectos inmunológicos, ya sea

inhibiendo los mecanismos supresores que disminuyen la capacidad de defensa

del huésped o incrementando la capacidad de respuesta del mismo, además los

DLE se han empleado solos o con otros agentes quimioterapeúticos; el número

de dosis empleadas y la frecuencia de estas dependen del padecimiento en

cuestión y no se han encontrado efectos secundarios. (Estrada Parra S. et al

1999)

El efecto del DLE se evalúa en base a la evolución clínica del padecimiento

utilizando pruebas de laboratorio encaminadas a analizar diferentes componentes

del sistema inmune.

El DLE es preparado a partir de donadores de sangre sanos que son sometidos a

pruebas para evitar la transmisión de infecciones por el VIH, la Hepatitis B,

hepatitis C, Brucelosis, VDRL etc, se escogen los donadores que llenen los

requisitos para una donación de una unidad de sangre, es decir que no tengan

antecedentes de hepatitis y que hayan resultado negativos en las pruebas

anteriores. El DLE también se obtienen de tejidos linfoides de donadores sanos.

Los leucocitos se lisan por choque térmico, y posteriormente se dializa, con una

membrana de diálisis de corte molecular de 10 000 Da; todas las moléculas

obtenidas menores a este peso molecular son las que componen el DLE; a los

extractos así obtenidos se les denomina polivalentes, ya que son capaces de

transferir todas las respuestas celulares positivas del donador del cual se

obtuvieron los leucocitos.

Además se pueden preparar DLE antígeno especifico, para esto, se obtiene

sangre periférica del donador reactivo al antígeno; se purifican los leucocitos;

posteriormente se colocan en placas de cultivo en contacto con el antígeno, el FT

especifico para dicho antígeno es liberado al medio; al recuperar el sobrenadante

este mantiene la actividad de transferir la respuesta celular. (Lawrence HS &

Ascher MS 1974).

2. ANTECEDENTES En 1983 Estrada-Parra y cols. demostraron que pacientes con tuberculosis

pulmonar avanzada resistentes al tratamiento antifímico, al ser tratados con factor

de transferencia (1U cada semana por vía oral durante un mes y 1U cada quince

días por vía subcutánea durante un mes), obtenido de donadores sanos PPD

positivos, tuvieron franca mejoría tanto inmunológica como clínica, además de que

estos pacientes se volvieron negativos a la baciloscopía después del tratamiento

con factor de transferencia específico (Estrada-Parra et al, 1983).

En un modelo experimental murino de tuberculosis, Fabre y cols probaron la

eficacia de los DLE al medir la sobrevida de los animales infectados y tratados

con DLE y antifímicos; los resultados demostraron que estos ratones mejoraron

notablemente al utilizar la dosis de 0.1 U, con esta dosis el porcentaje de

sobrevida fue de un 100% siendo todos estos valores estadísticamente

significativos con respecto a los grupos controles (Fabre et al 2004).

Este modelo experimental resulto excelente, pero se tenía la desventaja de ser

extremadamente caro, tanto por el número de ratones que se emplean como por

el tiempo que dura el experimento. Por esta razón se necesitaba desarrollar un

modelo in vitro que nos permitiera evaluar el efecto de estos extractos

directamente sobre la infección del macrófago con M. tuberculosis. Las hipótesis

que se tenían acerca del efecto del factor eran dos:

La primera consistía en proponer que los DLEm específicos de tuberculosis

(DLEmTB) actúan directamente sobre los macrófagos estimulándolos a producir los

mecanismos microbicidas que les permitan controlar la infección con

M. tuberculosis H37Rv. La segunda hipótesis era proponer que los DLEmTB actúan

sobre células del bazo (Macrófagos, células dendríticas, linfocitos T, linfocitos B)

provocando que éstas produzcan citocinas que estimulen a los macrófagos para

activar sus mecanismos microbicidas y de esta manera controlar la infección con

M. tuberculosis H37Rv. En el 2005 Valderrabano Ortiz utilizando este modelo in

vitro concluye que el sobrenadante de cultivos de células de bazo que contiene

DLEmTB tiene un efecto biológico estadísticamente significativo sobre el control de

la infección con M. tuberculosis H37Rv en los macrófagos de la línea celular

J774A.1 y que no hay algún efecto biológico cuando el DLEmTB se agrego

directamente sobre los macrófagos de la linea J774A.1 infectados con M.

tuberculosis H37Rv (Valderrabano Ortiz ; 2004)

Hasta la fecha no se ha estudiado los componentes presentes en los

sobrenadantes de células de bazo estimuladas con DLEm que les permite a los

macrófagos controlar la infección, por lo que en este trabajo se estudiaron los

sobrenadantes de células de bazo estimulados con DLE específico para Listeria

monocytogenes (DLELm). Listeria al igual que M. tuberculosis es una bacteria

intracelular, pero con la gran ventaja de que su crecimiento es muy rápido lo que

nos permitirá en menos tiempo observar los efectos provocados por los DLEs.

3. OBJETIVO Analizar los mecanismos de activación celular involucrados cuando células de

bazo son estimuladas con los EDL

3.1. OBJETIVOS PARTICULARES

Estandarizar la técnica de RT-PCR para las citocinas a determinar.

Analizar la expresión de mRNA para IFNγ, TNFα por RT-PCR en células de

bazo estimuladas con DEL.

Analizar la presencia de IFNγ, TNFα por el método de ELISA en los

sobrenadantes de células de bazo estimuladas con DLE a diferentes

tiempos de incubación.

4. JUSTIFICACIÓN Actualmente se conoce una gran cantidad de beneficios obtenidos al emplear los

DLEs como terapia, sin embargo hasta el momento no se conoce con claridad el

mecanismo de acción de estos extractos por lo que en este trabajo intentaremos

conocer que citocinas se producen en cultivos de células de bazo estimuladas con

DLEs y si estas son suficientes para que macrófagos infectados con

L. monocytogenes puedan controlar la infección.

5. HIPÓTESIS El DLE actúa sobre células del bazo (Macrófagos, células dendríticas, linfocitos T,

linfocitos B) induciéndolos a que se produzcan citocinas como TNFα o IFNγ que

estimulen a los macrófagos para activar sus mecanismos microbicidas que ayuden

a eliminar al microorganismo intracelular.

6. MATERIALES Y METODOS 6.1. Obtención de células de bazo

Los ratones BALB/c sanos se sacrificaron y se les extrajo el bazo, los órganos se

colocaron en la superficie de una tela de organza que cubrió la boca de un frasco

estéril para posteriormente macerarlos usando solución de Hanks.

La suspensión libre de grumos se lavó dos veces con solución de Hanks a

1500rpm durante 5 minutos, y después se resuspendió en 5ml de medio DMEM

con 10% de suero fetal bovino (SFB), así mismo se determinó la viabilidad con

solución de azul de tripano. La suspensión celular se ajustó a 1X106 células

viables/ml.

6.2. Activación celular En una botella de cultivo se colocaron 5 X106 células de bazo viables por pozo y

las células fueron estimuladas con: 2 µg/ml de DLE Lm, o con 0, 40, 80 y

200µg/ml de PMA (phorbol, myristate, ascorbic) como control positivo (de las

citocinas a determinar).

Los cultivos se incubaron a 37°C en atmósfera húmeda de CO2 48h los que

contenían PMA y durante cinco días. Terminado el tiempo de incubación los

cultivos fueron centrifugados a 1500rpm y el sobrenadante fue guardado en

alícuotas de 1ml para la determinación de citocinas mientras que las células

fueron lisadas en Trizol para la extracción de RNA y determinación de citocinas

por RT-PCR.

6.3. Aislamiento de RNA utilizando Trizol (Invitrogen Life technologies)

Se realizó la extracción de RNA total a partir de los cultivos arriba mencionados, a

las células lisadas en 1ml de Trizol se les adicionaron 200 µl de cloroformo, se

mezcló en vortex vigorosamente por 30 segundos obteniéndose así una

suspensión de color rosa lechoso, se incubó a 4ºC por 5 minutos y se centrífugo a

10, 000rpm por 15 minutos. Posteriormente se trasfirió la fase acuosa a un tubo

Eppendorf nuevo y se adicionaron 500µL de isopropanol, se incubaron por 15

minutos a 4ºC y se centrifugó a 10, 000 rpm durante 15 minutos a 4ºC el

precipitado obtenido se lavó con 500 µL de etanol al 80% en agua DEPC y se

centrífugo a 7500 rpm a 4°C por 5 minutos, se removió el sobrenadante y se

elimino el exceso de etanol con ayuda de una micropipeta, el precipitado (RNA

total)se dejo secar durante 5 a 10 minutos en la campana de flujo laminar, y

posteriormente se disolvió el RNA en 13 µL de agua DEPC y se procedió a

cuantificar cada muestra.

6.4. Cuantificación del RNA Para la determinación de las citocinas de interés es importante tener la misma

cantidad de muestra con la que se trabajará, por ello, después de la extracción se

toman 2µl del RNA y se diluyen en 98 µl de agua, es decir se hace una dilución

1:50 y cada una de estas diluciones se colocaron en una celda de cuarzo, para

leerla en un espectrofotómetro, a 260 nm de Luz UV, Todas las muestras se

ajustaron a una concentración de 3µg de RNA total para realizar la transcripción

inversa.

6.5 Trascripción Inversa 3µg de RNA se resuspendierón en 13 µL de agua DEPC se le adicionó 1ug de

Oligo dT y se incubó a 65ºC por 10 minutos en un termociclador, pasado el

tiempo se añadió 15 µL de la mezcla de reacción para cDNA (teniendo un volumen

de reacción final de 30 µL) la cual contiene los siguientes reactivos: 3.8 µL de

agua-DEPC, 6.0 µL de regulador 5X, 1.2 µL de DNTP`S 10mM, 3.0 µL de DTT

100 mM y 1.0 µL de la enzima MMLV.RT 200 U/ µL. La reacción se continuó en el

termociclador con el siguiente programa: 37ºC por 60 minutos, 95ºC por 5 minutos

y finalmente 4ºC. Terminada la reacción se adicionaron 70 µL de agua DEPC para

tener un volumen final de 100 µL

6.6 Determinación de citocinas por el método de RT- PCR (G3DPH, IFN-γ y

TNF-α) A partir 5µL del cDNA de cada muestra y colocados en un tubo Eppendorff se

añadieron 45µL de la mezcla de reacción, la cual contenía 35.3µL agua-DEPC,

5.0µL de regulador 10X, 2.5µL de MgCl2 (50mM), 1.0 µL de DNTP`S 10 mM,

0.5µL de del iniciador 5’ (20 µM), 0.5µL del iniciador 3’ (20 µM) y 0.2 µL de la

enzima Taq polimerasa. La reacción se llevó a cabo en un termociclador con el

siguiente programa: 30 ciclos de 94ºC/45 segundos, 60ºC/45 segundos, 72ºC/90

segundos y un ciclo de 72ºC/7 minutos. La secuencia de los iniciadores se

muestra en la Tabla II

Tabla II. Secuencia de los iniciadores utilizados para la determinación de citocinas por la técnica de PCR.

SECUENCIA DE LOS INICIADORES

Gen Secuencia Producto especifico

TNF α 5`GAGCCCCCAGTCTGTGTCCTTCTA3`

3`CCCCGGCCTTCCAAATCCCTACAT5`

420 pb

IFN γ 5`GAAAGCCTAGAAAGTCTGAATAACT

3`ATCAGCAGCGACTCCTTTTCCGCTT

387 pb

GG33PPDDHH 5`TGCCATCAACGACCCCTTCATT3`

3`ATATACTGTAATAGACATAAACCT5´

235 pb.

6.7 Corrimiento de los productos de PCR (Sambrook y Russell, 2001) en gel de agarosa al 2% Se preparó agarosa al 2% en TBE 1X, posteriormente esta agarosa fue fundida y

colocada en la cámara de electroforesis donde se dejó polimerizar por 30 minutos,

después de esto se llenó la cámara con regulador TBE 1X hasta cubrir la agarosa,

8µL de muestra fueron mezcladas con 2 µL de regulador de corrimiento y los 10µL

totales se colocaron en los pozos del gel de agarosa Las muestras fueron corridas

a 95 voltios durante 40 minutos. Terminado el corrimiento se colocó el gel en una

solución de TBE 1X con bromuro de etidio durante 15 minutos y se enjuagó al

chorro de agua, para finalmente observar el gel en un transluminador de luz

ultravioleta.

6.8 Determinación de citocinas por RT-PCR método semicuantitativo. Para cuantificar los cambios en la expresión de citocinas, a cada una de las

bandas visualizadas en los geles de agarosa se les determinó el valor de

densidad óptica, con ayuda del fotodocumentador.

La semicuantificación se llevó de acuerdo a la relación: D.O. del gen de

interés/D.O. del G3DPH.

6.9 Determinación de IFNγ y TNFα por ELISA.

Los sobrenadantes de células estimuladas con DLEs fueron colectados, y

almacenados a –70°C hasta su uso, posteriormente niveles de IFNγ y TNFα

fueron medidos por ELISA usando un estuche comercial y siguiendo las

instrucciones del fabricante (Amersham, Buckinghamshire, UK). Dos experimentos

independientes fueron realizados.

6.10 Cultivo de células J774. A1 La línea celular J774.A1 son macrófagos de ratón BALB/c provenientes de un

sarcoma, estas células se mantuvieron en cultivo en medio DMEM (Gibco, Grand

Island NY USA) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB)(Hyclone,

Road Logan Utah USA) inactivado con 100U/ml de penicilina y 0.1ng/ml de

estreptomicina (Gibco) a 37°C y 5% de C02)

6.11 Efecto de los sobrenadantes de células de bazo estimuladas con Extractos Dializables de Leucocitos específico (DLE) sobre la infección de macrofagos J774A.1 Se sembraron macrófagos de la línea celular J774A.1 en placas de 24 pozos, las

monocapas confluentes (1 x 106 células/pozo) se lavaron tres veces con solución

de Hanks 1X (Gibco Grand Island NY USA), una vez hecho esto, se adicionó a

cada monocapa 1 ml de medio DMEM (Gibco, Grand Island NY USA) y se infectó

con Listeria monocytogenes a un índice de infección de 20:1 , las placas se

incubaron a 37°C en una atmósfera al 5% de CO2 durante dos horas, transcurrido

el tiempo se lavaron las placas tres veces con Hanks 1X (Gibco Grand Island NY

USA), para eliminar todas las bacterias que hubieran quedado extracelulares.

Posteriormente se adicionó a las células DLE a diferentes diluciones 1:10, 1:5 y

1:2.5 o medio DMEM (Gibco, Grand Island NY USA) y se incubaron durante 24

horas para posteriormente determinar las UFC/ml.

6.12 Cuenta viable. A los tiempos de 2 y 24h se realizó la determinación del crecimiento bacteriano, en

cada tiempo las células infectadas fueron lisadas con 300 µL de agua y se

realizaron diluciones con un factor de 10, 20 µl de cada dilución fueron sembrados

en medio BHI (Becton Dickinson CO., Sparks USA) y se incubaron a 37°C por 24h

para determinar el número de UFC/1 x 106 células.

7. RESULTADOS

7.1. ESTANDARIZACIÓN DE LA RT-PCR Para realizar la determinación de citocinas por RT-PCR el primer paso es la

estandarización de la técnica para conocer que se cuenta con las condiciones y

concentraciones óptimas de todos los reactivos a utilizar. Para la estandarización

de esta técnica primero se hicieron cultivos de células de bazo y fueron

estimuladas con diferentes concentraciones de PMA el cual es un activador

policlonal que induce la expresión y síntesis de citocinas de manera inespecífica.

7.2. Determinación de la expresión de los RNAm para TNFα e IFNγ en las

células de bazo estimuladas con los DLEs a diferentes tiempos

En la figura 1 se muestran los resultados obtenidos en la determinación de TNFα

e IFNγ en las células de bazo estimuladas con los DLEs a diferentes tiempos,

como se observa hay presencia de los mensajeros tanto para ambas citocinas

aún en células sin estimular por lo que fue necesario cuantificar la expresión de los

mensajeros determinando la densidad óptica de cada muestra.

A

Figura 1 Expresión de mRNA de G3DPH, TNFα e IFN γ en células de bazo estimuladas con DLEs y recolectadas a diferentes tiempos. El RNA total de estas células fue extraído y 3µg fueron convertidos a cDNA y este fue amplificado por PCR utilizando los iniciadores respectivos para cada molécula. Figura A y B corresponden al primer y segundo experimento respectivamente. Donde carril 1 corresponde a marcador de peso molecular, carril 2, 3,4 y 5 corresponde a células sin estimular recolectadas a las 24, 48, 72 y 96 horas de incubación respectivamente, carril 6,7,8 y 9 corresponde a células estimuladas con DLE a las 24, 48, 72 y 96 horas de incubación respectivamente, carril 10 corresponde al control negativo de la reacción de PCR.

7.3. Relación de la expresión de TNFα e IFNγ en las células de bazo

estimuladas con los DLEs

Los resultados semicuantitativos de la expresión de los RNAm para TNFα e IFNγ

en las células de bazo estimuladas con los DLEs a diferentes tiempos de

incubación determinando su densidad óptica y se observa que la máxima

expresión de los mensajeros para IFNγ fue a las 24 y 72h de la misma forma se

observa para el TNFα (datos no mostrados). 

 

B

7.4. Determinación de TNFα e IFNγ en las células de bazo estimuladas con

los DLEs por el método de ELISA

Para conocer si teníamos la presencia de las citocinas de estudio en los

sobrenadantes de las células estimuladas con DLEs se procedió a realizar la

búsqueda de estas por ELISA, los resultados mostraron que no hubo presencia

de TNFα en ninguno de los sobrenadantes mientras que para IFNγ se encontró la

proteína solo en los sobrenadantes de las células estimuladas durante 24h de

incubación (figura 2).

Figura 2 Producción de IFNγ en cultivos de células de bazo estimuladas con DLE a diferentes tiempos, terminados los

tiempos de incubación los sobrenadantes de estos cultivos fueron alicuoteados y congelados hasta su uso. La producción

de TNFα fue determinada por el método de ELISA. Los valores son dados como la media ± desviación estándar de

triplicados de un experimento representativo de dos.

Confirmado la producción de una de las citocinas en estudio IFNγ, se procedió a

realizar la infección de macrófagos con L. monocytogenes para conocer si estos

sobrenadantes con la presencia de IFNγ eran capaces de activar a los

macrófagos y que estos fueran capaces de controlar la infección. En la figura 3 se

muestran los resultados en los que se observa que en presencia de los

sobrenadantes de las células estimuladas con DLE los macrófagos si eran

capaces de controlar la infección.

Figura 3. Efecto de los sobrenadantes de células de bazo estimuladas con DLE provenientes de ratones sanos y

adicionados (a diferentes diluciones) posteriormente a cultivos de macrófagos infectados con Listeria monocytogenes. En

los experimentos se utilizó como testigo macrófagos solo con medio DMEM. Los datos que se muestran son el valor

promedio ± desviación estandar de un experimento realizado por triplicado y es representativo de dos experimentos.

 

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

UFC

/1x1

06 cél

ulas

2h24h

0 1:10 1:5 1:2.5 dilución

8. DISCUSIÓN

Los factores de transferencia son moléculas que inducen a los organismos que las

reciben (receptores no inmunes) a que expresen una respuesta inmune celular

específica frente a un antígeno contra el cual el donador ya montó una RIC

previamente (Kirkpatrick et al, 1988).

Los extractos leucocitarios dializables (DLE) que contienen a los factores de

transferencia, han sido utilizados con éxito en innumerables enfermedades

causadas por bacterias, virus y hongos, ya que se ha demostrado que éstos

transfieren la respuesta de linfocitos T, de una manera antígeno específica de un

individuo inmune a otro no inmune (Fudenberg y Pizza, 1993).

Debido a los problemas que se tenían al evaluar el efecto de los extractos

dializables de células de bazo utilizando el modelo murino tanto in vivo como “in-

vitro” en la infección con M. tuberculosis debido a que los experimentos son

costosos y el tiempo de crecimiento de la bacteria que es muy lento, en este

trabajo se realizó la estimulación de células de bazo con DLE a diferentes tiempos

y los sobrenadantes de estos cultivos fueron adicionados a macrófagos infectados

con L. monocytogenes (una bacteria intracelular de rápido crecimiento) con el fin

de que nos pudiera orientar un poco más sobre el mecanismo de acción de estos

extractos dializables, y como actuaban sobre el macrófago para que este sea

capaz de controlar la replicación intracelular de la bacteria.

Los principales mecanismos por los cuales se pudiera activar los macrófagos son:

• Que las células de bazo en presencia de los DLE estimulen la producción

de IFNγ el cual es sintetizado por Lc T, activa a los macrófagos para

convertirlo en una potente célula efectora antimicrobiana, los macrófagos

activados fusionan sus lisosomas mas eficientemente a los fagosomas

exponiendo a los microorganismos ingeridos a una gran variedad de

enzimas lisosomales microbicidas.

• Que las células estimuladas con los DLE sean capaces de producir TNFα

que es una citocina que estimula la producción de óxido nítrico en el

macrófago el cual es tóxico para la bacteria.

De acuerdo a los resultados obtenidos los DLE que se utilizaron en los

experimentos aquí realizados, se encontró que no hubo presencia de la citocina

TNFα en ninguno de los tiempos de incubación aunque si se encontró el

mensajero. Esto pudiera deberse a que hay una modificación postranscripcional

del mRNA para esta citocina que impide la expresión de la proteína. Sin embargo

si encontramos la presencia de IFNγ al tiempo de 24hr posteriores a su

incubación.

Estos resultados nos sugieren que el DLE estimula la producción de IFNγ en las

células de bazo, y al poner estos sobrenadantes, en el cual va dicha citocina en

contacto con los macrófagos infectados los activa, y de esta manera son capaces

de controlar la infección.

El hecho de solo observar IFNγ a las 24hr podría hablarnos que la estimulación

con los DLE es muy rápida lo cual podría explicar el efecto benefico de estos

extractos en un tiempo corto.

Dwyer menciona que las moléculas que componen al factor de transferencia (que

se encuentran dentro de los DLEs) al parecer interactúan con las regiones

variables de las cadenas alfa o beta del receptor de los linfocitos T, para de esta

manera cambiar su avidez y afinidad por el antígeno. (Dwyer et al, 1996).

Nuestros resultados concuerdan con lo encontrado por Alvarez-Thull y Kirkpatrick

en 1996 donde ellos proponen que los linfocitos Th pueden ser los que están

involucrados en la respuesta inmunológica producida por el FT, ya que el perfil de

citocinas que encontraron en los receptores del FT fue la producción de IFNγ y

disminución de IL-4 e IL10 ; por lo que junto con ellos concluimos que uno de los

papeles en la respuesta inmune de los DLE es la activación de linfocitos Th 1

(Alvarez y Kirkpatrick 1996).

9. CONCLUSIONES

• Se estandarizó la técnica de RT-PCR

• La expresión de los mRNA para TNFα e IFNγ en las células de bazo

estimuladas con DLEs fue máxima a las 24 y 72 horas de incubación

• A nivel de proteínas solo se encontró la presencia de IFNγ en los

sobrenadantes de células de bazo estimuladas con los DLEs

• Estos sobrenadantes al ser adicionados a macrófagos infectados con

L. monocytogenes al parecer activaron a los macrófagos a controlar la

infección probablemente por la presencia de IFNγ la cual es una citocina

que activa los mecanismos bactericidas del macrófago.

10. IMPACTO

El trabajo ayuda a comprender como los DLEs modulan la respuesta inmune a

través de la producción de IFN por parte de las células estimuladas con el

DLEs.

Por otra parte los alumnos participantes fueron capacitados en el uso de

diversas técnicas y en el análisis y escritura de sus resultados.

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