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RESUMEN Las enzimas, proteínas con la capacidad de transformar un sustrato en un producto gracias a su potencial catalítico. Realizan la reacción en razón a una velocidad de transformación del sustrato a producto traduciéndose en actividad enzimática. En este informe se da a conocer el comportamiento de la enzima “Biolactasa NTL” de acuerdo a 2 diferentes temperaturas de operación y sustrato. En la primera experiencia se da a conocer los efectos de la actividad y estabilidad de la enzima. Se obtiene que a una mayor temperatura en el medio de reacción esta actividad aumenta, donde a 55°C la actividad medida en leche semi-descremada y lactosa es de 8847 y 9987 [UI/mL] respectivamente. En cuanto a la perdida de estabilidad medida a los 10 minutos, se obtiene que a una temperatura de 45°C es de un 14,4%, mientras que a temperatura de 55°C la perdida es mayor, alcanzando un 17%. La puesta en marcha de un reactor enzimático en comparación con un reactor de cultivo celular, a modalidad por lotes, su operación y control es más simple de acuerdo al manejo de menores variables, ya que en este caso se monitorea factores como pH y temperatura. Como segunda experiencia se evalúa el comportamiento del reactor en forma teórico-práctica en relación al grado de conversión del sustrato lactosa a los monosacáridos, glucosa y galactosa, alcanzando sólo un 52,9%, transcurrida 2,3 horas de operación del reactor. En la última experiencia, correspondiente a la elaboración de manjar, donde la hidrolisis parcial de la lactosa resulta efectiva al momento de concentración de sólidos, pues por medición en refractómetro, la leche tratada con enzima, alcanza la concentración requerida de 60-70°Brix, en menor tiempo de operación. Proporcionando propiedades organolépticas, que la leche 1

Informe Final Biorreactores

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1 RESUMEN Lasenzimas,protenasconlacapacidaddetransformarunsustratoenunproducto graciasasupotencialcataltico.Realizanlareaccinenraznaunavelocidadde transformacindelsustratoaproductotraducindoseenactividadenzimtica.Eneste informe se da a conocer el comportamiento de la enzima Biolactasa NTL de acuerdo a 2 diferentes temperaturas de operacin y sustrato. Enlaprimeraexperienciasedaaconocerlosefectosdelaactividadyestabilidaddela enzima. Se obtiene que a una mayor temperatura en el medio de reaccin esta actividad aumenta,dondea55Claactividadmedidaenlechesemi-descremadaylactosaesde 8847 y 9987 [UI/mL] respectivamente. En cuanto a la perdida de estabilidad medida a los 10minutos, seobtiene queauna temperatura de45Cesdeun14,4%, mientras quea temperatura de 55C la perdida es mayor, alcanzando un 17%. La puesta en marcha de un reactor enzimtico en comparacin con un reactor de cultivo celular, a modalidad por lotes, su operacin y control es ms simple de acuerdo al manejo de menores variables, ya que en este caso se monitorea factores como pH y temperatura. Comosegundaexperienciaseevalaelcomportamientodelreactorenformaterico-prcticaenrelacinalgradodeconversindelsustratolactosaalosmonosacridos,glucosaygalactosa,alcanzandosloun52,9%,transcurrida2,3horasdeoperacindel reactor.Enlaltimaexperiencia,correspondientealaelaboracindemanjar,dondelahidrolisis parcialdelalactosaresultaefectivaalmomentodeconcentracindeslidos,puespor medicinenrefractmetro,lalechetratadaconenzima,alcanzalaconcentracin requeridade60-70Brix,enmenortiempodeoperacin.Proporcionandopropiedades organolpticas, que la leche sin tratamiento enzimtico pierde durante el proceso, como lo es el efecto nocivo de la cristalizacin de lactosa. 2 INDICE GENERAL 1.Introduccin ............................................................................................................ 3 2.Materiales y mtodos ............................................................................................. 4 2.1.Determinacin de azucares reductores por la tcnica de miller (dns) ..................... 4 2.2.Mtodo de glucostat. .............................................................................................. 4 2.3.Metodologa analtica. ............................................................................................ 5 2.3.1.Determinacin del grado de hidrlisis de la leche. .................................................. 5 2.4.Metodologa experimental. ..................................................................................... 6 2.4.1.Determinacin de la actividad de la enzima. ........................................................... 6 2.4.2.Determinacin de la concentracin de glucosa (utilizando lactosa como sustrato) . 6 2.4.3.Determinacin de la concentracin de glucosa (utilizando leche como sustrato) .... 7 2.4.4.Determinacin de la estabilidad de la enzima. ........................................................ 7 2.4.5.Puesta en marcha del reactor. ................................................................................ 7 2.4.6.Hidrlisis enzimtica de lactosa. ............................................................................. 8 2.4.7.Fabricacin del manjar. .......................................................................................... 8 3.Resultados y discusiones ....................................................................................... 9 3.1.Caracterizacin del preparado enzimtico .............................................................. 9 3.1.1.Actividad enzimtica ............................................................................................... 9 3.1.2.Estabilidad enzimtica .......................................................................................... 11 3.2.Hidrlisis enzimtica de la lactosa en un reactor por lotes. ................................... 14 3.3.Hidrlisis enzimtica de lactosa para produccin de manjar ................................. 16 4.Conclusiones ........................................................................................................ 18 5.Bibliografa ........................................................................................................... 19 6.Anexos ................................................................................................................. 20 3 1.INTRODUCCIN Lasenzimassonbiocatalizadoresdenaturalezaproteicaconcapacidadcataltica, altamenteespecficayactivaencondicionesmoderadas,loquehacefavorablesuuso comocatalizadoresenlaindustriadeprocesos.Losprogresosqueestnrealizando actualmente la ingeniera gentica y la biotecnologa permiten augurar un desarrollo cada vezmayordelusodelasenzimas,aldisponerdeunsuministrocontinuodemateriales con la actividad deseada a precios razonables. Enelpresenteinformesemuestraeltrabajorealizadoconelpreparadoenzimtico Biolactasa-NLT,queactadeformasimilaralaLactasaenlaleche,lacualesuna enzimaproducidadeformanaturalenelintestinodelgado,ydeformaartificialcomo preparadoenzimtico,quejuegaunpapelvitaleneldesdoblamientodelalactosa, mediante una reaccin enzimtica de hidrolisis, en sus dos componentes bsicos: glucosa y galactosa. De forma experimental se contemplan tres prcticas de laboratorio, primero se determina laactividadylaestabilidadalpreparadoenzimticocomercialconelcualseest trabajando, midiendo generacin de producto por el mtodo de glucostat utilizando leche semi-descremadaylactosacomosustratos.Luegoestaenzimaseincubadeforma soluble en un reactor por lotes, con leche semi-descremada como medio de reaccin, bajo condicionesambientalescontroladas,dondesedeterminaelgradodehidrlisisdela leche en razndel tiempo (de lactosa a glucosa y galactosa), determinndose tambin la generacindeproductoporelmtododeglucostat,ylaconcentracindelactosaporel mtodo de DNS. Finalmenteutilizandodosreactoresporlotesenlasmismascondicionesmencionadas anteriormente, y cambiando solo que uno contiene la enzimay el otro no, y luego de un determinado tiempo de reaccin y grado de conversin, se lleva a cabo la elaboracin de manjar, hasta llegar a un contenido de slidos de un 65-70%. 4 2.MATERIALES Y MTODOS 2.1.Determinacin de azucares reductores por la tcnica de Miller (DNS) El mtodo DNS es una tcnica colorimtrica que emplea 3,5-cidodinitrosaliclico para la hidrlisisdepolisacridospresentesenunamuestra,seguidodeladeterminacin espectrofotomtrica a 540 nm de los azcares reductores. Estatcnicasirveparacuantificarlosazucaresreductoresproducidosduranteuna fermentacin o para cuantificar los productos de una reaccin enzimtica. Reaccin del mtodoElacido3,5-dinitrosalicilicoenpresenciadeazcaresreductoressereduceaacido3-amino-5-dinitrosalicilico. 2.2.Mtodo de Glucostat.La glucosa oxidasa es una flavoproteina altamente especfica que cataliza la oxidacin de laglucosaa-D-gluconolactona,sinqueningnotroazcarnaturalreaccioneen extensin apreciable. Reaccin del mtodo. Estareaccinenlaqueseconsumeoxgenopodraseguirsemanomtricamente medianteunelectrododeoxgeno.Sinembargo,parapoderseguirelcursodeesta 5 reaccinespectrofotomtricamenteesnecesarioacoplaralamismaunasegunda reaccin enzimtica indicadora adecuada. Para la determinacin colorimtrica de glucosa porelmtododelaoxidasa,seaadealmedioperoxidasaderbanosilvestre(HRP), que elimina el perxido de hidrgeno a medida que se forma, a la vez que se genera un colorante adecuado segn el siguiente esquema de reaccin: Reaccin del mtodo. Sepodranutilizarcomoaceptoresdeoxgenobenzidina,o-toluidina,o-dianisidina.Sin embargo, la naturaleza carcinognica de estos compuestos ha impulsado la bsqueda de aceptores alternativos 2.3.Metodologa analtica 2.3.1.Determinacin del grado de hidrlisis de la leche. -Las muestras de leche (2 ml) se reciben en viales los cuales son colocados en un bao con agua a 80C para detener la reaccin.- Se toman 0,2 ml de la muestras anterior, se le agrega 0,2 ml de una solucin de sulfatodezincy0,2mldehidrxidodebario,secentrifugana5000rpmpor5 minutos y se retira el sobrenadante.- Se toman 0.1 ml del sobrenadante y se le adicionan 1 ml del reactivo enzimtico para determinar glucosa. Si fuese necesario la muestra de sobrenadante se debe diluir con agua destilada antes de realizar la determinacin de glucosa.- Seincubalamezclapor10minutosa37Cysedeterminalaabsorbanciaa 505nm. - Serealizaunblancoutilizandotampnfosfatocomomuestrayunamuestra Standard con una solucin de glucosa de 0.1 g/l6 2.4.Metodologa experimental 2.4.1.Determinacin de la actividad de la enzima. -Seadicionan4mLdeunasolucindeLactosa(100g/Lpreparadaentampn fosfato 0.1 M pH 6), en un tubo de ensayo. -Se incuba aproximadamente por 5 minutos a 45 C o hasta que el sustrato alcance la temperatura de reaccin. -Adiciona 0.1 mL de la muestra enzimtica, previamente diluida con tampn fosfato 0.1 M pH 6. - Agitar suavemente y dejar reaccionar por 5 minutos en un bao a 45 C. -Cumplido el tiempo de reaccin, tomar la solucin y colocarla en un bao con agua hirviendo, para detener la reaccin. -Realizar un blanco de reaccin sin enzima. -Determinar la concentracin de glucosa mediante el metodo de glucostat. Las experiencias se realizan por triplicado. -Se repite la experiencia a 55 C. -Se repite la experiencia tambin utilizando leche semidescremada. 2.4.2.Determinacin de la concentracin de Glucosa (utilizando lactosa como sustrato) -En un tubo de eppendorf colocar 0.1 mL de la muestra de reaccin enzimtica (inactivada).- Adicionar 1 mL del reactivo de determinacin de glucosa.- Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.- Leer la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 505 nm.- Leer contra un blanco que lleva 0.1 mL de tampn fosfato y 1 mL del reactivo, y que tambin es incubado. -Interceptar en la curva de calibrado. 7 2.4.3.Determinacin de la concentracin de glucosa (utilizando leche como sustrato) -En un tubo de eppendorf colocar 0,2 mL de la muestra de reaccin enzimtica (inactivada), adicionar sobre este 0,2 ml de una solucin de sulfato de zinc y 0,2 ml de hidrxido de bario, agitar en un vortex y luego centrifugar a 5000 rpm por 5 minutos. -En un tubo de eppendorf colocar 0.1 mL del sobrenadante anterior y adicionar 1 mL del reactivo de determinacin de glucosa.-Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.-Leer la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 505 nm.-Leer contra un blanco que lleva 0.1 mL de tampn y 1 mL del reactivo, y que tambin es incubado.-Interceptar en la curva de calibrado. 2.4.4.Determinacin de la estabilidad de la enzima. -Preparar 5 mL de una solucin enzimtica en tampn fosfato 0.1 M pH 6.-Tomar 0,5 mL de la muestra anterior y medir la actividad inicial (por triplicado), como se describe previamente. -Incubar a 45C la solucin enzimtica restante (4,5 mL).-Cada 10 minutos tomar muestras de la solucin enzimtica (0,5 mL) y medir su actividad enzimtica residual, como se describe previamente. Las experiencias deben ser realizadas por triplicado.-Repetir la experiencia a 55C 2.4.5.Puesta en marcha del reactor. -Instalar el reactor. - Verificar las conexiones de las mangueras y el estado de los sellos. - Evaluar la potencia de agitacin.8 -Instalar y calibrar el electrodo de pH.-Poner en marcha el sistema de calefaccin. -Adicionar al reactor el medio de reaccin que es la leche a hidrolizar. -Adicionar la cantidad de enzima lactasa, calculada previamente. -Instalar el termmetro para medir temperatura. -Poner en marcha el sistema de agitacin que consiste en un agitador mecnico de hlice. -Mantenerlalechebajoagitacinsuaveyatemperaturaconstanteduranteel tiempo necesario para alcanzar el grado de hidrlisis preestablecido. 2.4.6.Hidrlisis enzimtica de lactosa. -Adicionar la leche descremada seleccionada y medir su pH. - Tomarunamuestraparadeterminarlaconcentracindelactosainicial(tiempo cero). -Poner en marcha el sistema de agitacin y calentamiento (45C o 55C). -Esperar que el sistema de reaccin alcance la temperatura deseada. - Adicionar la enzima de acuerdo a la razn enzima sustrato entregada. -Mantenerlalechebajoagitacinsuaveyatemperaturaconstanteduranteel tiempo necesario para alcanzar el grado de hidrlisis preestablecido. Cada10minutossacarmuestrasde2mlparadeterminarelgradodehidrlisisdela lactosa. 2.4.7.Elaboracin del manjar. Una vez finalizada la etapa de hidrlisis se procede a la fabricacin del manjar Debemos: -Calentarlalechebajoagitacinhasta80C,enalgnrecipienteuolla,midiendo temperatura constantemente. - Adicionarlentamentelacantidaddesacarosadeacuerdoaladosificacin sugerida (200 g/l de leche). - Mantener bajo agitacin hasta llegar a un contenido de slidos de un 65-70%, el que se determina mediante un refractmetro y corresponde a un valor de 70Brix. 9 3.RESULTADOS Y DISCUSIONES 3.1.Caracterizacin del preparado enzimtico 3.1.1.Actividad enzimtica Enestaprcticaseprocedeadeterminarlaactividaddelaenzimaadostemperaturas, 45y 55Celsius, para el preparado enzimtico comercial Biolactasa NTL. Como primera experiencia se procede adeterminar la actividad de la enzima, la cual se realizaadicionando4[ml]deunasolucindeLactosaenuntubodeensayo,elcualse incubapor5minutosa45C,luegoseprocedeaadicionar0,1[ml]delamuestra enzimtica previamente diluida con tampn fosfato, que en este caso la dilucin aplicada esde1:1000,seagitasuavementeysedejareaccionarpor5minutosenunbao termostatizadoa45C.Unavezcumplidoeltiempo,lamuestrasellevaaunbaode agua hirviendo para la detener la reaccin. Finalmente se determina la glucosa existente en la muestra mediante el mtodo de glucostat. Laexperienciaserealizatambinparaunamuestradelechedescremadaalamisma temperatura (45C) adems de repetirla para 55C junto a la de Lactosa. Todaslasmuestrasserealizanportriplicado.ESNECESARIOQUEAPAREZCAACA TAMBIEN?Sedeseaanalizarelcomportamientodelahidrlisisdelalactosa,cuantificandola aparicin de producto final en trminos de concentracin de glucosa. En la tabla siguiente se muestran los datos obtenidos en laboratorio. (Ver Anexo D, Tabla D.5.) Tabla 3.1: Datos obtenidos de actividad enzimtica a dos temperaturas. Actividad [UI/ml] LecheLactosa 45 C9478,17894,6 55C8847,49987,4 De acuerdo a los datos presentados, se evidenciaque el potencial cataltico de la enzima aumenta en cuanto aumenta la temperatura del medio donde esta inserto el sustrato con laenzima.Cabesealarquealsermayorestatemperaturacadavezms,llegaraun puntodondeestaltimatiendeaperdersuconformacintridimensionalporefectos trmicos implicando que la conversin de sustrato a producto, en este caso la hidrlisis de 10 lalactosaaglucosamsgalactosa,decrezcannotoriamente.Segnbibliografaeste punto mximo de capacidad cataltica bordea los 60, punto en que no conviene realizar esta prctica pues su estabilidad tambin se ve afectada en gran medida.Analizandolaactividadencuantoatipodesustrato,enestecasolactosaylechesemi-descremadaaconcentracionesdeterminadade100[g/L]y45[g/L]respectivamente.Se evidencia que la enzima mantuvo una mayor actividad para la leche, aunque lo esperado esquelaenzimaalestarenunmediosaturadodesustratoseamsactiva.Sepodra pensarqueseinhibeporsustrato,peronoeselcasopuesdeacuerdoaloestudiado, estaenzimasecomportadeformadistinta,inhibindoseposteriormentedeforma competitiva. 11 3.1.2.Estabilidad enzimtica Como segunda experiencia se procede a determinar la estabilidad de la enzima, la cual se realizapreparando5[ml]deunasolucinenzimticaentampnfosfato,delacualse toma 0,5 [ml] y se procede a medir la actividad inicial, como se realiz en la experiencia anterior. La solucin enzimtica sobrante se incuba en bao termostatizado a 45C, luego setomanmuestrascada10minutosdeestasolucinysemidesuactividadenzimtica residual. Laexperienciaserepiteparaunatemperaturade55C.Dondetodaslasmuestrasse realizan por triplicado. NECESARIO DENUEVO?Se entiende por actividad enzimtica residual como la actividad a un determinado tiempo de incubacin. Y por actividad inicial la actividad a tiempo cero. Losresultadossernexpresadosenactividadrelativa,lacualseentiendeporactividad residual/actividad inicial. Acontinuacinsemuestranlosresultadosobtenidosparalaestabilidaddelaenzima respecto a la velocidad que se alcanza en la hidrlisis de la lactosa en el tiempo. Tabla 3.2. Actividad enzimtica residual y relativa a 45Celsius. 45C Actividad enzimtica TiempoResidualRelativa [min][UI/L][%] 06,99100 105,9985,6 255,4778,2 405,3176,0 635,2274,6 744,9070,1 884,7167,3 1034,2060,0 12 Tabla 3.2. Actividad enzimtica residual y relativa a 55Celsius. 55C Actividad enzimtica TiempoResidualRelativa [min][UI/ml][%] 06,47100 105,3783,0 255,0878,6 404,8775,4 634,7573,5 744,4468,7 1033,7157,4 Observandolosporcentajesdeactividadrelativaexistentesparacadatemperatura,se puede ver que la enzima pierde estabilidad a los pocos minutos, ejemplo de ello es a los 10minutoslaperdidadeactividadpara45Cesdeun14,4%yparalatemperaturade 55Claperdidadeactividaddeun17%.Estaprdidamayora55Csedebeaquela enzima es termolbil, por lo cual sufre una desnaturalizacin por causa de la temperatura por lo cual decrece su actividad y ocurre en menor tiempo que a 45C. En la siguiente grafica (grafica 3.1) se muestra la comparacin de la actividad a 45y 55Celsius, para poder observar el comportamiento que tiene cada una. De la grfica siguiente se puede decir que la enzima a latemperatura de 45Celsius es ms estable que la de 55C por el comportamiento apreciado. 13 Grafica 3.1. Comparacin actividad relativa a dos temperaturas de reaccin. LasfluctuacionesqueseaprecianenlaGrafica3.1.delaactividadenzimticaa55C puedendebersealcomportamientonormaldelaenzima,yaqueestanopermanece estable dentro del medio. 01020304050607080901000 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Actividad relativa [%] Tiempo [min] 45C55C14 3.2.Hidrlisis enzimtica de la lactosa en un reactor por lotes. Para comenzar esta experiencia de hidrlisis enzimtica se calcula la cantidad de enzima aagregaralreactor.Detalformaquepresenteunaconversindel99%en2horasde operacin en el reactor con leche semi-descremada (ver Anexo F), dando como resultado a agregar 0,677 ml de enzima. Luego de adicionar la enzima y dejar el reactor en las condiciones ptimas para operar, se pone en marcha y se comienza experimentalmente la hidrlisis de la lactosa obteniendo el grado de conversin de los azucares reductores en la hidrlisis enzimtica, siendo los que se muestran en el siguiente grfico: Grfica 3.2. Grado de conversin en el tiempo de operacin del reactor, segn ANEXO F. Para determinar la concentracin de glucosa [g/L] se utiliza el mtodo de glucostat, para poder calcular los moles de glucosa, y para determinar la concentracin de Lactosa [g/L] seutilizaelmtodoDNS,dandocomoresultadounaconcentracindelactosainicialde 33,8[g/L],valorqueseutilizaparadeterminarelgradodeconversin(molesde glucosa/molesdelactosa)enfuncindeltiempo,parapoderllevarunseguimientodel curso de la reaccin. (Clculos en ANEXO F). 01020304050607080901000 0.5 1 1.5 2 2.5[%] de conversin Tiempo [h] 15 Experimentalmente con 1 ml de enzima agregado al reactor, solo se logr un 52,9 % de conversin en 2.3 horas, esperndose un 99% en 2 horas de operacin, esto pudo haber sucedido porque se agreg ms enzima de lo que se deba, ya que al realizar los clculos lacantidaddeenzimaaadicionareraslode0,677ml,ycomolaenzimaposeeuna inhibicin competitiva por producto, al haber ms cantidad de enzima y sta al estar en las condicionesadecuadasparareaccionar,comenzahidrolizarlalactosateniendoas glucosa y galactosa, donde al pasar del tiempo y al haber ms galactosa que lactosa est la inhibi y no se alcanz el porcentaje de conversin en el tiempo esperado. 16 3.3.Hidrlisis enzimtica de lactosa para produccin de manjar staprcticasedesarrollaendosetapas.Primeroserealizaunahidrlisisparcialde lactosa,dondeserecomiendaunadisminucindel35%.Luegoseprocedeala fabricacin de manjar.Conrespectoalgradodehidrolisisdelactosa,seagrega1mldeenzimaalreactorde volumen de reaccin de 2 litros, y temperatura de operacin de 45C, donde transcurrida unahoradereaccinseobtuvoungradodehidrolisisdeun14%.Cabemencionarque paraefectosdeesteclculoseconsideracomoconcentracininicialdelactosaenla leche 45 [g/L]. Luego se procede a la elaboracin del manjar, y mediante un refractmetro sedeterminaelcontenidodeslidos,finalizandoconunvalorde70 Brix aproximadamente.Paracompararentrelechehidrolizadaysinhidrolizar,mantenidasacondicionesde operacin iguales. Se presenta el siguiente grfico: Grfico 3.3. Elaboracin de manjar con leche hidrolizada y sin hidrolizar. Medicin de Grados Brix en el tiempo (Ver anexo E) LalechehidrolizadapresentunamayoralzadegradosBrixenmenortiempoquela lechesinhidrolizar.CabemencionarquelamedicindegradosBrixrepresentala concentracindeazcarpresenteensolucin.Semideconunrefractmetroyla concentracindeazcaresproporcionalasundicederefraccin.Esto debidoaquela 0204060801000 20 40 60 80Grados Brix [Brix] Tiempo [min] Chart Title 17 enzimaBiolactasaNTLhidrolizalalactosa,generandocomoproductomonosacridos tales como glucosa y galactosa. Elmayorproblemaquepresentaelmanjarcomoanomaladeproductoeslasobre-estructuracin de la lactosa y su consecuente cristalizacin como lactosa monohidratada. Es por esto, que la hidrlisis enzimtica constituye uno de los mtodos ms efectivos en laelaboracindemanjar,pueslogradisminuirelefectonocivodelacristalizacin excesiva de la lactosa sobre la estabilidad organolptica del producto. 18 4.CONCLUSIONES 19 5.BIBLIOGRAFA -AcevedoF,GentinaJuanCarlos,IllanesA,2002,FundamentosdeIngeniera Bioqumica,1era edicin, Capitulo 4 Cintica de Fermentaciones pp.94-118,Chile. -SENATI,Elaboracindemanjarblanco,DocumentodeConsulta,10Juniode 2012, www.infolactea.com 20 6.ANEXOS Anexo A Curva calibrado DNS Estndar glucosa: 1,5 [mg/ml] Tabla A.1. Datos medidos de absorbancia a 540 [nm]. Vol. EstndarVol. TampnConc. GlucosaAbsorbancia [540 nm] [ml][ml][mg/ml]12Promedio 0,10,90,150,0850,0550,070 0,20,80,300,1430,1310,137 0,30,70,450,2220,2140,218 0,50,50,750,3890,3650,377 0,70,31,050,5210,5200,521 0,80,21,200,5960,5850,591 1,00,01,500,7600,7390,750 Figura A.1. Curva de calibrado de glucosa por mtodo DNS. y = 0.5038x - 0.0083 R = 0.9996 0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.0 0.5 1.0 1.5 2.0Absorbancia [540 nm] Concentracin glucosa [mg/ml] 21 Anexo B Curva calibradopara lactosa Estndar lactosa: 1,5 [mg/ml] Tabla B.1. Datos medidos de absorbancia a 540 [nm]. Vol. EstndarVol. TampnConc. GlucosaAbsorbancia [540 nm] [ml][ml][mg/ml]12Promedio 0,10,90,150,0440,0560,050 0,20,80,300,1060,1050,106 0,30,70,450,1710,1710,171 0,50,50,750,2660,2910,279 0,70,31,050,4210,4100,416 0,80,21,200,4780,4660,472 101,500,5940,5910,593 Figura B.1. Curva de calibrado para lactosa por mtodo DNS y = 0.4042x - 0.0139 R = 0.9993 0.00.10.20.30.40.50.60.70.0 0.5 1.0 1.5 2.0Absorbancia [540 nm] Concentracin lactosa [mg/ml] 22 Anexo C Curva de calibrado glucostat Estndar glucosa: 0,25 [mg/ml] Tabla C.1. Datos medidos de absorbancia a 505 [nm] Volumen Absorbancia EstndarTampnConc. Glucosa[505 nm] [ml][ml][mg/ml]12Promedio 10900,0250,0800,0760,078 30700,0750,2090,2550,232 50500,1250,3870,4030,395 70300,1750,5530,5440,549 80200,2000,6380,6370,638 10000,2500,7890,7910,790 Figura C.1. Curva de calibrado para glucosa por mtodo glucostat. y = 3.178x - 0.0034 R = 0.9998 0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.90.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30Absorbancia [505 nm] Concentracin de glucosa [mg/ml] 23 Anexo D Determinacin de actividad y estabilidad de la enzima.

Tabla D.1. Datos para estabilidad a 45Celsius Tiempo Absorbancia [nm] Glucosa Actividad enzimtica ActividadMuestra [min] abcPromedio[g/l] [UI]Relativa T00 0,4960,4670,4900,484 0,153 6,991,00 T110 0,3380,4450,4600,414 0,131 5,990,856 T225 0,3560,3900,3880,378 0,120 5,470,782 T340 0,3180,3940,3900,367 0,117 5,310,760 T463 0,3520,3700,3600,361 0,115 5,220,746 T574 0,3600,3400,3150,338 0,108 4,900,701 T688 0,3600,3150,3000,325 0,103 4,710,673 T7103 0,2710,2880,3090,289 0,0921 4,200,600 Tabla D.2. Datos para estabilidad a 55Celsius Tiempo Absorbancia [nm] Glucosa Actividad enzimtica ActividadMuestra [min] abcPromedio[g/l] [UI]Relativa T00 0,4160,4370,4900,448 0,142 6,471,00 T110 0,3620,3630,3880,371 0,118 5,370,830 T225 0,340,3690,3440,351 0,112 5,080,786 T340 0,3340,3010,3750,337 0,107 4,870,754 T463 0,3060,3250,3530,328 0,104 4,750,735 T574 0,2940,3000,3250,306 0,097 4,440,687 T688 0,3880,30,3060,331 0,105 4,800,742 T7103 0,2040,3130,250,256 0,0815 3,710,574 24 Tabla D.3. Actividad de la enzima en leche Absorbancia 45C55C 123Promedio123Promedio muestra - blanco0,2050,2370,2090,2170,2390,1470,2210,202 muestra0,2700,3020,2740,2820,3080,2160,2900,271 blanco0,065--0,0650,0690--0,0690 Tabla D.4. Actividad de la enzima en lactosa. Absorbancia 45C55C 123Promedio123Promedio muestra - blanco0,520,5350,5870,5470,6960,6520,7320,693 muestra0,5420,5570,6090,5690,7430,6990,7790,740 blanco0,0220--0,02200,0470--0,0470 Tabla D.5. Actividad enzimtica enleche y lactosa a 45y 55Celsius TemperaturaPromedioGlucosaFDActividad enzimatica [C]abs[g/L] [UI] Leche 45 0,2820,069430009478,1 Lactosa0,5690,173-7894,8 Leche 55 0,2710,064730008847,4 Lactosa0,7400,219-9985,8 25 Ejemplo calculo actividad enzimtica: Para la leche: [

]

[]

[] []

[ ] [ ]

[ ] [ ]

[] []

[][] [

] [] [

] Agregando el factor de dilucin de 3 [

] Para lactosa: [

]

[]

[] []

[ ] [ ]

[ ] [ ]

[] []

[][] [

] [] [

] 26 Anexo EHidrolisis enzimtica de lactosa para elaboracin de manjar. Tabla E.1. Medicin de absorbancia por mtodoglucostat y clculo del porcentaje de conversin de lactosa GlucosaLactosa Absorbancias [505 nm] Tiempo [min] 123Promconcentracin glucosa [g/L] mol glucosa % de conversinConcentracin lactosa[g/L] mol lactosa 00,0230,0280,0310,0270,0290,0000,12245,0000,132 300,0140,0130,0160,0141,6740,0097,068 600,0300,0340,0310,0323,3100,01813,977 Utilizandocurvadecalibradoparadeterminacindeglucosapormtodoglucotatse obtiene la concentracin de glucosa transcurrido 0, 30, 60 minutos de reaccin.El clculo a tiempo 30 minutos se presenta a continuacin: [

] ()

()

[

] Elclculodeporcentajedeconversinserealizaconlosmolesdeglucosaylactosa,lo que se presenta a continuacin:

[

] [

] [

][

] 27 Tabla E.2. Medicin de grados Brix para leche hidrolizada y sin hidrolizar Grados Brix [Brix] Tiempo [min] LecheSin Hidrolizar LecheHidrolizada026,227 1528,229,2 303237 4042,645 506066 606384 7571,4 28 Anexo F Hidrlisis enzimtica de la lactosa en un reactor por lotes. Para una conversin del 99% en el reactor en 2 horas de operacin, utilizando para esta enzimalosvaloresdeparmetroscinticosdeKm20[g/L]ylavelocidadmximade reaccinsecalculsegnloobtenidoenellaboratorioanterior.Laexpresinquese utiliz es: ( ) X XKSV Kt Vm rxn mm = 1 ln ***0

X: Grado de Conversin, 99%, 0,99 S0: Sustrato inicial, 40 [g/L] t: Tiempo, 120 [min]Vrx: Volumen de reaccin, 2 [L] Km: constante de afinidad, 20 [g/L] Vm: Velocidad mxima.

De esto calculamos Vm = 6418,3 UI. ElVm obtenido,lorelacionamosconlaactividaddelaenzimaenUI/mlenzima (determinada en la experiencia anterior) de la siguiente forma: 9478,1 UI/ml enzima * X = 6418,3 UI X = 0,677 ml de enzima. Por lo que la cantidad de enzima a adicionar es 0,677 ml de enzima. 29 Determinacin de lactosa por mtodo de DNS. Tabla F.1. Absorbancias obtenidas a diferentes intervalos de tiempo a 540 [nm]. TiempoAbsorbancia LactosaTemperatura [h]12Promedio[g/L]fd[g/L] *fdpH [C] 00,1790,1570,1680,4502533,7526,5144 1,00,1650,1850,1750,4233038,0976,5743 2,30,1080,1070,108 0,2306041,4606,5244 MediantelasiguienteecuacinsecalcullaconcentracindeLactosaen[g/L],atravs del tiempo: ( )fdAbsLgLactosa *4042 , 00139 , 0 +=((

30 Determinacin de glucosa por mtodo de glucostat. Tabla F.2: Absorbancias obtenidas a diferentes intervalos de tiempo a 505 [nm]. TiempoAbsorbanciaGlucosa Porcentaje de [h] 12Promedio [g/L]fd[g/L] *fd mol glucosa conversin 00,0990,0900,0950,031-0,0920,0010,520 0,20,1300,1250,1280,041602,4710,01413,9 0,30,3300,3500,3400,108303,2420,01818,2 0,50,4800,4850,4830,153304,5870,02525,8 0,70,5300,5200,5250,166304,9880,02828,1 1,00,4430,4100,4270,135456,0870,03434,3 1,60,5320,5150,5240,166457,4610,04142,0 1,80,2700,2650,2680,0851018,6090,04848,5 2,10,2900,2800,2850,0911019,1660,05151,6 2,30,2850,3000,293 0,0931019,4040,05252,9 Mediante la siguiente ecuacin se calcul la concentracin de glucosa [g/L], a travs del tiempo: ( )fdAbsLga Glu *178 , 30034 , 0cos+=((

Paracalcularelgradodeconversinenfuncindeltiemposeutilizaronlassiguientes ecuaciones: Grado de conversin = (moles de glucosa/moles de lactosa) Por lo que la concentracin de glucosa y lactosa en [g/L], se transformo a [moles/L] de la siguiente forma: 31 Moles de lactosa = Lactosa M PLgLactosa. .((

Ejemplo: Moles de lactosa = ((

((

molgLg3428 , 33 = 0,099 [mol/L] Moles de glucosa = a Glu M PLga Glucos . .cos((

Ejemplo: Moles de Glucosa =| |LmolmolgLg0005 , 0180092 , 0=((

((

Luego se realiza el clculo para el grado de conversin: Grado de conversin = | || |3 .10 * 2 , 5099 , 00005 , 0=LmolLmol

[%] de conversin= (5,2* 10-3)* 100 = 0,516 Todos los clculos de conversin se realizaron con los [mol/L] de la concentracin de Lactosa inicial