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UNIVERSIDAD ESTATAL PENÍNSULA DE SANTA ELENA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS ESCUELA DE AGROPECUARIA CARRERA DE INGENIERÍA AGROPECUARIA TERCER SEMESTRE BIOQUÍMICA PRÁCTICA No. 1 ESTUDIANTES: Génesis Usca Valle Víctor Pozo Ramírez Carlos Castillo Melar PROFESOR: Dra. Nardy Diez. LA LIBERTAD – ECUADOR Julio de 2014

Informe proteinas

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Informe de Laboratorio de Proteinas

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UNIVERSIDAD ESTATAL

PENÍNSULA DE SANTA ELENA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

ESCUELA DE AGROPECUARIA

CARRERA DE INGENIERÍA AGROPECUARIA

TERCER SEMESTRE

BIOQUÍMICA

PRÁCTICA No. 1

ESTUDIANTES: Génesis Usca Valle

Víctor Pozo Ramírez

Carlos Castillo Melar

PROFESOR: Dra. Nardy Diez.

LA LIBERTAD – ECUADOR

Julio de 2014

ÍNDICE GENERAL

1. INTRODUCCIÓN.................................................................................................................................... 1

1.1. ANTECEDENTES. ................................................................................................................................ 1

1.2. JUSTIFICACIÓN. .................................................................................................................................. 1

1.3. OBJETIVOS. ........................................................................................................................................ 2

1.3.1. OBJETIVO GENERAL. ................................................................................................................... 2

1.3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS. ............................................................................................................ 2

2. REVISIÓN DE LITERATURA ................................................................................................................... 3

2.1. PROTEINAS. ....................................................................................................................................... 3

2.1.1. Definición. ................................................................................................................................... 3

2.1.2. Clasificación de las proteinas. ..................................................................................................... 3

2.2.3. Estructura de proteinas .................................................................................................................. 4

2.2.3.1. Estrutura primaria. .................................................................................................................. 4

2.2.3.2. Estrutura secundaria. .............................................................................................................. 4

2.2.3.3. Hélice alfa ................................................................................................................................ 4

2.2.3.4.Hélice de colágeno. .................................................................................................................. 5

2.2.3.5 Estructura terciaria. .............................................................................................................................. 5

2.2.3.6. Estructura cuaternaria ............................................................................................................ 5

2.2.4. Reactivo de Biuret. ..................................................................................................................... 6

2.2.4.1 Definicion . .............................................................................................................................. 6

2.2.4.2 .Identificacion de proteinas de la clasificacion de Biuret ....................................................... 6

3. MATERIALES Y MÉTODOS. ................................................................................................................... 7

3.1. LUGAR DE ENSAYO. ........................................................................................................................... 7

3.2. MATERIALES. ..................................................................................................................................... 7

3.3.MÉTODOS………. .................................................................................................................................. 7

3.3.1. PROTOCOLO DE PROTEINAS ................................................................................................... 7

4. RESULTADOS. ....................................................................................................................................... 8

4.1 Resultados……………………………………………………………………………………………………………………………………..8

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. ..................................................................................................... 9

BIBLIOGRAFÍA. ........................................................................................................................................... 10

ANEXOS ..........................................................................................................................................................

ÍNDICE DE CUADROS

CUADRO 1. Materiales y reactivos utilizados en la práctica………………………………………………7

CUADRO 2. Datos de absorbancia……………………………………………………….…………………………….8

CUADRO 3. Curva patrón…………………………………………………………………………………………………..8

ÍNDICE DE ANEXOS

FIGURA 1 A. SOLUCION DEL REACTIVO DE BIURET MAS EL BUFFER……….………….…………………………..

FIGURA 2 A. COLOCACION DE LA SOLUCION DE LECHE EN CADA UNO DE LOS TUBOS DE ENSAYOS.

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1. INTRODUCCIÓN

1.1 ANTECEDENTES.

Las proteínas son moléculas orgánicas más abundantes en las células, estas constituyen más del

50% en su constitución del peso de la célula, los aminoácidos diferentes están unidos en cualquier

orden para formar los polipéptidos en cientos de aminoácidos, donde cada una de ellas tiene un

extraordinario potencial de producir una gran cantidad de variante en su conformación. La

composición proteica de las células en un determinado momento depende del conjunto de genes

que se estén activando y están relacionado con las señales que recibe la célula.

El proceso que se va a desarrollar en la práctica es calcular la cantidad total de proteína contenida

en una disolución, utilizaremos técnicas ya conocidas para desarrollar la cuantificación de

proteínas. Cabe destacar que en este proceso se añade un agente químico que es un colorante a

una muestra de proteína, provocando un cambio de color en la muestra. La mayor concentración

de proteínas determinara un color más intenso, este cambio la produce el colorímetro, que se

basa en analizar la intensidad de calor, y determina el valor correspondiente de absorbancia, de

acuerdo al resultado se proyectara una recta en un esquema donde especificara la cantidad de

proteínas que hubo en el agente colorante.

1.2 JUSTIFICACIÓN

Entre las reacciones coloreadas específicas de las proteínas, que sirven por tanto para su

identificación, destaca la reacción del Biuret. Esta reacción la producen los péptidos y las

proteínas, pero no los aminoácidos ya que se debe a la presencia del enlace peptídico CO-NH que

se destruye al liberarse los aminoácidos.

El reactivo de Biuret lleva sulfato de Cobre (II) y sosa. El Cu, en un medio fuertemente alcalino, se

une con los enlaces peptídicos formando un complejo de color violeta (Biuret) cuya intensidad de

color depende de la concentración de proteínas.

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1.3 OBJETIVOS.

1.3.1 Objetivo general.

Esta práctica pretende introducir al alumno en dos métodos para la cuantificación de proteínas: su

fundamento, sus ventajas e inconvenientes. Se pretende utilizar (Biuret y cuantificación directa a

280nm), para cada uno de ellos se realizará una curva estándar, se determinará el coeficiente de

extinción, el rango de sensibilidad, y se realizará la cuantificación de al menos dos muestras

problemas.

1.3.2 Objetivos específicos.

Preparar diluciones para curva de calibración y muestra problema.

Entender los principios químicos que permiten la determinación de las proteínas.

Realizar una curva de calibración.

Determinar la concentración de la muestra problema.

Comparar un método de determinación por absorción y uno por ensayo químico

interpretar la diferencia.

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2 REVISIÓN DE LITERATURA.

2.1 PROTEÍNAS. 2.2.1 Definición. GUILLÉN M. (2009, línea) manifiesta que las proteínas son biomoléculas formadas básicamente

por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. Pueden además contener azufre y en algunos tipos

de proteínas, fósforo, hierro, magnesio y cobre entre otros elementos.

2.2.2. Clasificación de las proteínas. Según RIEDEL M. (2005, en línea) Las proteínas se pueden clasificar atendiendo a diversos criterios: su composición química, su estructura y sensibilidad, su solubilidad… una clasificación que engloba dichos criterios es

Holoproteínas. -Formadas solamente por aminoácidos. Heteroproteínas.- Formadas por una fracción proteínica y por un grupo no

proteínico, que se denomina

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2.2.3 Estructura de las proteínas. De acuerdo a GUILLÉN M. (2009), todas las proteínas poseen una misma estructura química central, que consiste en una cadena lineal de aminoácidos. Por tanto, podemos distinguir cuatro niveles de estructuración en las proteínas: 2.2.3.1 Estructura primaria. La estructura primaria viene determinada por la secuencia de aminoácidos en la cadena proteica, es decir, el número de aminoácidos presentes y el orden en que están enlazadas. Las posibilidades de estructuración a nivel primario son prácticamente ilimitadas. Como en casi todas las proteínas existen 20 aminoácidos diferentes, el número de estructuras posibles viene dado por las variaciones con repetición de 20 elementos tomados de n en n, siendo n el número de aminoácidos que componen la molécula proteica.

2.2.3.2 Estructura secundaria. La estructura secundaria de las proteínas es el plegamiento que la cadena polipeptídica adopta gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre los átomos que forman el enlace peptídico. Los puentes de hidrógeno se establecen entre los grupos -CO- y -NH- del enlace peptídico (el primero como aceptor de H, y el segundo como donador de H). De esta forma, la cadena polipeptídica es capaz de adoptar conformaciones de menor energía libre, y por tanto, más estables. 2.2.3.3 Hélice alfa En esta estructura la cadena. Esta estructura se mantiene gracias a los enlaces de hidrógeno intracatenarios formados entre el grupo -NH de un enlace peptídico y el grupo -C=O del cuarto aminoácido que le sigue.

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2.2.3.4 Hélice de colágeno. El colágeno es una importante proteína fibrosa presente en tendones y tejido conectivo con función estructural ya que es particularmente rígida. Presenta una secuencia típica compuesta por la repetición periódica de grupos de tres aminoácidos. El primer aminoácido de cada grupo es Gly, y los otros dos son Pro (o hidroxiprolina) y un aminoácido cualquiera: -(G-P-X)-. 2.2.3.5 Estructura terciaria. Se llama estructura terciaria a la disposición tridimensional de todos los átomos que componen la proteína, concepto equiparable al de conformación absoluta en otras moléculas. La estructura terciaria de una proteína es la responsable directa de sus propiedades biológicas, ya que la disposición espacial de los distintos grupos funcionales determina su interacción con los diversos ligandos. Para las proteínas que constan de una sola cadena polipeptídica (carecen de estructura cuaternaria), la estructura terciaria es la máxima información estructural que se da cuando los dominios se pliegan por separado a medida que se sintetiza la cadena polipeptídica. 2.2.3.6 Estructura cuaternaria

Cuando una proteína consta de más de una cadena polipeptídica, es decir, cuando se trata de una

proteína oligomérica, decimos que tiene estructura cuaternaria, cuando se considerar.

El número y la naturaleza de las distintas subunidades o monómeros que integran el

oligómero.

La forma en que se asocian en el espacio para dar lugar al oligómero.

La estructura cuaternaria deriva de la conjunción de varias cadenas peptídicas que, asociadas,

conforman un multímero, que posee propiedades distintas a la de sus monómeros componentes.

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2.2.4 REACTIVO DE BIURET. 2.2.4.1 Definición. FERNANDEZ E. GALVAN A. (2006), manifiesta que biuret es un grupo químico con fórmula R2NC(O) NHC (O) NHR2. Es un producto formado por la reacción de isocianatos con ureas. Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. 2.2.4.2 Identificación de proteínas de la reacción el Biuret De acuerdo a REINALDO (2009) manifiesta que a reacción de biuret, es una molécula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla que da positiva esta reacción, La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del Biuret, que contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos presentando un máximo de absorción a 540 nm.

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3 MATERIALES Y MÉTODOS.

3.1. LUGAR DE ENSAYO.

El presente ensayo de investigación formativa se realizó en el laboratorio de ciencias químicas de

la Universidad Estatal Península de Santa Elena, ubicada en La Libertad, vía Santa Elena – La

Libertad, provincia de Santa Elena.

3.2. MATERIALES. Cuadro 1. Materiales y reactivos utilizados en la práctica.

3.3 MÉTODOS.

3.3.1 PROTOCOLO DE PROTEINAS. Enumerar seis tubos de ensayos.

Prepara una solución buffer con ácido bórico (colocando 0.5 g de ácido bórico, más 50 ml

de agua destilada).

Colocar 0.5 ml de leche en los tubos de ensayo, excepto el cero.

Añadir 4ml de reactivo de BIURET a todos los tubos.

Mezclar el contenido de cada tubo.

Esperar 5 min para que se desarrolle el color. Medir la absorbancia ajustado a cero con el

(tubo 1 tubo cero)

Colocar en el tubo de los granos de lenteja, mas solución buffer (0.1 ml) de la solución

más 0.9 ml de agua destilada.

Colocar en el tubo de ensayo la solución de frejol, solución buffer (0.1 ml) más 0.9 ml de

agua destilada, más 0.5 del reactivo de biuret y colocar en el baño de María por 15

minutos.

MATERIALES REACTIVOS

Balanza analítica Capsula Centrifuga Gradilla de tubos de ensayo Mortero Tubos de Ensayo Tubo de centrífuga Varilla de vidrio Vaso de precipitación

Agua destilada Biuret. Leche. Frijol. Lenteja.

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Calibramos el colorímetro a cero, colocamos la sustancia obtenida para medir la

absorbancia de cada una de las muestras anotando el resultado obtenido en cada caso.

El mismo procedimiento es para los 5 tubos en el tubo 1 se le puso (0.1 ml de leche y 0.9 ml de

agua) y se toma 0.5 ml de cada uno de los 4 tubos que faltaban para ir mezclando y pasando a

cierto a cada tubo se le puso 0.1ml de leche.

Tomar los respectivos datos de acuerdo al proceso realizado.

4 RESULTADOS.

4.1 RESULTADOS. CUADRO 2. DATOS DE ABSORBANCIA.

mg/ml Asorvancia 1 Asorvancia 2

0 0 0 0

0,1 0,032 0,153 0,0925

0,2 0,026 0.223 0,013

0,3 0,142 0,171 0,1565

0,4 0,226 0,174 0,2

0,5 0,025 0,236 0,1305

CUADRO 3. CURVA PATRÓN

y = 0,032x - 0,0131 R² = 0,5631

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Ab

sorv

anci

a

Valores de concentracion mg/ml

Curva patrón

Series1

Lineal (Series1)

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CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. CONCLUSIONES.

Mediante el proceso de investigación y práctica, determinamos que el reactivo de Biuret

es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos u otros compuestos con dos o

más enlaces peptídicos.

De acuerdo a los principios químicos de las proteínas determinamos que están

constituidas por aminoácidos, por los cual todo el proceso se basa en el reconocimiento

de aminoácidos.

En La cuantificación de proteínas que se basa en el colorímetro, concluimos que el color

obtenido será más intenso cuanto mayor sea la concentración de proteínas en la muestra,

es decir nos da un valor correspondiente de absorbancia. Pero en este caso no se pudo

obtener los resultados esperados debido a una falla técnica del colorímetro.

En el proceso de reacción se determinó que el color azul se trasforma en violeta por la

presencia de proteínas y se torna color rosa cuando se interna con polipéptidos de

cadena, lo cual se evidencia en los resultados de acuerdo al proceso realizo en la prácticas.

RECOMENDACIONES.

Al momento de realizar el buffer se debe tener en cuenta la cantidad exacta de cada una

de las soluciones.

Que colorímetro presenta problema técnico, ya que no se puede dar un resultado exacto

de absorbancia.

Basados al proceso de práctica, recomendamos que al realizar el proceso de pipeteo en

cada uno de los tubos de ensayo, se debe tomar toda la sustancia y luego depositarla para

que se dé un buen resultado al momento de obtener la absorbancia.

Recomendamos que para llevar un registro de cada una de las sustancia, que stan

colocadas en cada uno de los tubos de ensayo, se enumere para dar un debido proceso en

la práctica.

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BIBLIOGRAFÍA:

RIEDEL M. (2005, en línea).PROTEINAS. Consultado el 12 de julio del 2014. Disponible en: http://avdiaz.files.wordpress.com/2008/11/proteinas.pdf GUILLÉN M. (2009, en línea) PROTEINAS. Consultado el 12 de julio del 2014. Disponible en: http://www.uv.es/tunon/pdf_doc/proteinas_09.pdf Reinaldo (2009) Reacción de Biuret. Consultado el 11 de julio del 2014. Disponible en: http://catedras.quimica.unlp.edu.ar/qo3/Apuntes/Biuret.pdf FERNANDEZ E. GALVAN A. (2006), método para la cuantificación de proteínas. Consultado el 13 de julio del 2014. Disponible en: http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol mol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS%20PARA%20LA%20CUANTIFICACI%C3%93N%20DE%20PROTE%C3%8DNAS.pdf

“ANEXOS”

FIGURA 1 A. SOLUCION DEL REACTIVO DE BIURET MAS EL BUFFER

FIGURA 3 A. COLOCACION DE LA SOLUCION DE LECHE EN CADA UNO DE LOS TUBOS DE ENSAYOS.