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. L $ INFORME FINAL DE SERVICIO SOCIAL TRIMESTRE LECTIVO HOlW S E W 4OLO DEL TRAMO /, ASESORA: LUW DE RWlZAClON FECHA DE INlClO /FECM DE TERMINACION CLAVE: NOMBRE DEL PROYECTO I ALUMNA N Marbella Maine Gonzdlez Iiigeriieria de los Alimentos u lziapalapa 6 IV c B 5 'i 4' . 7- / , 96-1 20 h EVAL.IJKION DE LA INFLUENCIA DE NGUIGOS ADITIVOS EN CULTIVOS PXENICOS DE AiblIQON DF L?ciflbacillus acidophilus PARA DETERMINAR LA PRWUCCION DE DIACETILO Y OlROS COblPUESTOS AROM4TIzAN [ES Maria de Lourdes Aurora Escamilla HwMdo. Profesora Titular C. Tiempo completo Universidad Aiit6flonia M~tropolitana-l~tapalapa. Depto Biotecnologla. Area de Alimentos - Laboratorio S-I 52. U Iztapalapa 3 I de mayo de I995 9 de ;.hril rie 1996 1 IA 23 Y5 CINETIC4 DE PRODUCCION DE DlACETlLO Y OTROS METADOLITOS AROMArlZANTES POR BAClEPW LACTICfi EN SUSTRATOS A WE DE WZ . ' i /* I ASESORA c M er, C Ma de Lourdes Escariiilla Hurtado

INFORME SERVICIO SOCIAL - 148.206.53.84148.206.53.84/tesiuami/UAM LOTE 5/UAM21048.pdf · entrega del informe final de SCMCIO social denominado " EVALUAClON DE LA INFLUENClA DE

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. L

$ INFORME FINAL DE SERVICIO SOCIAL

TRIMESTRE LECTIVO

HOlW S E W

4 O L O DEL TRAMO

/, ASESORA:

L U W DE RWlZAClON

FECHA DE INlClO

/FECM DE TERMINACION

CLAVE:

NOMBRE DEL PROYECTO

I A L U M N A

N Marbella Maine Gonzdlez

Iiigeriieria de los Alimentos

u lziapalapa 6 IV c B 5

'i 4' . 7 -

/ ,

96-1

20 h

EVAL.IJKION DE LA INFLUENCIA DE NGUIGOS

ADITIVOS EN CULTIVOS PXENICOS DE AiblIQON

DF L?ciflbacillus acidophilus PARA DETERMINAR LA PRWUCCION DE DIACETILO Y OlROS

COblPUESTOS AROM4TIzAN [ES

Maria de Lourdes Aurora Escamilla HwMdo.

Profesora Titular C. Tiempo completo Universidad

Aiit6flonia M~tropolitana-l~tapalapa. Depto

Biotecnologla. Area de Alimentos

-

Laboratorio S-I 52. U Iztapalapa

3 I de mayo de I995

9 de ;.hril rie 1996 1

IA 23 Y5

CINETIC4 DE PRODUCCION DE DlACETlLO Y OTROS

METADOLITOS AROMArlZANTES POR BAClEPW

LACTICfi EN SUSTRATOS A W E DE W Z

.' i /*

I

ASESORA c

M er, C Ma de Lourdes Escariiilla Hurtado

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Móxko D.F. a 8 de a W d. 1 Mb .

M . m C . R o S 8 u m ~ n Q .

Dlirctsra d4 la D.C.B.S.. UMM

P r e s e n t e .

Por medio de la presente me dirijo a usted, la alumna de la carrera de lngenierla de los Alimentos:

Natividad Marbella Mame Gonzdlez, con matrlcui8 9223 1753, para solicitar el registro del repone

flnal del Servicio Social, con clave lA.23.95. denominado:

El servicio social fue asesorado por la M en C Marla de Lourdes Aurora Escamilla Hurtado. Profesora

titular C. Tiempo completo. adscrita al Area de Productos Nawrales. Depto Eiotecmk@a, Div

Ciencias Biol6gicas y de la Salud, Unidad btapalapa. de la Universidad Aut6noma Metropolitana

El proyecto se llev6 a cabo en el laboratorio 5-1 52 de la Unidad iztapa!apa. teniendo como fecha de

inicio el 3 1 de mayo lde 1995 y fue finalizado el 8 de abril de 1996

Por la atenci6n que de sirva prestar. quedo de usted agradecida:

Natividad Marbella Adarne Gonzdlez I

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A T E N i A W t W T E

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Mirico D.F. a I da abrii da 1996.

M. on C. €bsaura Gm8hor Q.

Dlrata i do la D.C.B.S.. ullw

P r a s o n t 0.

Por medio de la presente me dinJ0 a usted, con lllotlvo de exponerle bs razones por las cuales la entrega del informe final de SCMCIO social denominado " EVALUAClON DE LA INFLUENClA DE

ALGUNOS ADITNOS EN CULTIVOS AXENICOS DE ALMIDON DE Ldcíob,3c~//u5 dc1ctqin&5 PARA

DETERMINAR LA PROWCCION DE DlACETlLO Y OTROS COMPUEST05 ARObMTIZAMES". se efectua

4 meses posteriores a la fecha serialada para su finalizacm (30 de noviembre de 1995)

En primer término. en la fecha serialada de la enwega del informe final. yo me encontraba en el

onceavo trimestre que es cuando se inicia el llamado "Paquete termnal" y la carga de trabajo

aumenta, por lo que el tiempo dedicado al Servicio Social twe que reducirlo

Además. se present6 un paro de labores por motlva de estallkb de huelga efectuado a cargo de los

trabajadores y personal ac&mco de 1.3 UAM. haoiendo impouble ei aCce50 a sus instalaciones y

laboratorios Dtcho evento provoc6 aun mas el atram en la entrega del presente trabzjo -

Esto provoc6 finalmente el retardo del Cual hago de su conocimiento

Por la atenci6n que se sirva prestar, quedo de usted agradecida:

ATENTAMENTE

Natividad Marbella Mame üonzdlez

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m. .n c ~ o u v n 6 1 r r * ~ 1 ~ .

oburor8 de la D.C.B&:. UAlM

P r e s e n t e .

IEEtwi8m Iitd

El diacetilo confiere un aroma tipo mantequilla a los SUStrdtOS que tradicionalmente son lácteos En el presente ttaabajo se realizaron Cultivos sumergidos a base de aknidbn utilizando Lb acidophiJus para evaluar el efecto de la temperatura, regulacidn de pH. y 5 factores de compostci6n en la produccdn de diacetilo, utilizando un diseño experimental ortogonai de I6 ensayos [por triplicado), según el método de Taguchi Los resulhdos obtemdos mostraron que las condiciones de fermentaci6n mas favorables para la acidificaci6n del medio y consumo de ácido cltrico fueron los experimentos que contenlan extracto de levadura al O 2 '16, glucosa y 35 "C Tambien se observ6 que la adicdn de glucosa fue necesaria para inducir la actividad aniilolitica. as1 como para el mqor consumo de almid6n y carbohidratos totales. por el microorganismo Sin embwgo, no se presentó la produccion de diacetilo en estas coiidiciones de fermentacdn. a pesar de que previamente habla mostrado reaction (+) en la tecnm de Voges Proskauer en medio de dlmidon, aunque en otras condiciones Además, se feat126 una fermentación mixta utilizando al Lb acidophi/u para la hidr61iws del aJmid6n y Pediococc~ penfosxeus, cepa que fue capaz de formar 30 mg/i de diaceolo + aceíolna a una temperatura de 35 "C

En conclusibn, no se present6 la producción de diacetilo por el Lb. acidophilus. por lo que queda claro que, al menos en las condiciones de ferrnentacidn que se utilizaron, no favorecieron la formacibn de este aromatizante. Sin embargo, se puede obener el diacetilo; si se realizan cuitivos mixtos, utilizando al Lb. acidoph/u para hidrolizar el almid6n. y así proporcionar azúcares a otro microorganismo que sl sea capaz de producir este compuesto aromatizante, como se pud6obsetvar en la fermentacibn mixta presentada en este trabajo.

Alumna Mame González Natividad Marbella Matrkula 9223 I753 Licenciatura ingenieria de los Alimentos Aresor Maria de Lourdes Aurora Escamilla Hurtado. Depto. Biopcnología

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Las formulaciones artificiales con aroma tipo mantequilla eran hasta hace poco las únicas disponibles en el mercado, pero no es fácil obtener sinteticamente un perfil que se asemeje al natural, dando origen a productos con detectable aroma artificial (Hatchwell, 1994, Lindsay I 966, Margalith I98 1, Sandine eta/ 1972).

Lo anterior ha originado una demanda de aromatizantes preparados por procedimientos alternativos a la slntesis qulrnica, como son los formados durante los procesos biotecnológicos. Entre éstos destaca la nota aromática a mantequitla, cuyo componente mas importante es sin duda el diacetilo o 2.3-butanodiona (CH3COCOCH3).

. La producción de diacetilo por las bacterias Iácticas se ve acompañada por una mezcla compleja de otros como son: la acetolna, el 2.3.butanodiol. la acetona, los ácidos grasos volátiles, y algunos mas en concentraciones traza, que en amjunto se percibe como un aroma natural a mantequilla (Cachon y Divies, 1993; Dziezak, 1986, Pollock, 1994).

Al utilizar el diacetilo en los alimentos se aprovecha otro atributo relevante, que es su capacidad de impartir una sensación de cremosidad y delicadeza, logrando matizar, .suavizar y engobtar a otras notas aromdticas en productos como yoghurt, helados, leches malteadas y otras bebidas (Giese, 1994, Hatchwell, 1994).

Por otro lado, si se desea impartir un aroma tipo mantequilla a los productos de panificación, la concentraci6n de diacetilo necesaria en el producto terminado es generalmente muy baja (2.5 mgiKg); pero debido a que las pérdidas durante el horneado pueden alcanzar hasta 96 %, este compuesto debe estar presente en excemen las formulaciones iniciales. (Prost Hal., 1993).

Las industrias del sector lácteo y las de productos de panificación son las que utilizan mas los aromas a mantequilla en Mexico; y en menor proporción, las que elaboran botanas. productos de confiterla y atoles. El diacetilo forma parte también de otros sabores, como un componente menor.

La Secretarla de Salud mexicana (5 5.. 1988) regula el uso de "saboreadores o aromatizantes", clasificándolos en 9 categorlas. El diacetilo sintético puede entrar en varias de ellas basándose en su presentación al mercado, mias que en su origen de

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obtención; pero esta legislación no considera expllcitamente a los saboreadores o aromatizantes elaborados por fermentación.

El diacetilo no se produce en Mexico [INEGI. 1986). Debe considerarse entonces, que actualmente los palses altamente tecnificados son los que poseen la tecnologla para desarrollar aromas tipo mantequilla por los procesos biotecnológicos de punta, de lo que se deriva que controlen SU elaboración y comercialización en todo el mundo, generalmente a traves de sus filiales.

Entre las bacterias Iácticas se encuentra, la cepa utilizada en el presente trabajo, Lactobacillus acidopbilus que es de la colección Hansen 1 748 [ CHR. Hansen , 1982). Esta cepa tiene forma de bacilo con tamaAo regular, en pares y cadenas cortas y largas, no esporulados y sin organelos de locomoción, gram positivo, tinción de cápsula y gránulos negativo. Carece de la enzima catalasa. Puede crecer a un rango de 15 a 45°C aunque a bajas temperaturas su metabolismo se ve disminuido. Es tolerante a 4% de NaCI. Reduce el tornasol y el tatrezolium. En la placa de almidón, se obtuvo desarrollo pero no hubo la formación de halo de hidrólisis (Escamilla, 1995).

Este trabajo forma parte de un proyecto mayor de investigación, el cual se titula “Cinética de producción de diacetilo y otros metabolitos aromatizantes por bacterias Iácticas en sustratos a base de malz”. Aprobado por el Consejo Divisional de C.B.S. en la sesión 12.94 para el bienio 1994-1 995.

En el presente proyecto se pretende evaluar el efecto de dos factores ambientales (T y regulación interna de pH, con Caco,), y tres factores de composición [glucosa, citrato, extracto de levadura), en la producci6n de mcetilo por Io cepa I Lb. acidopbiiuj en medios sumergidos de almidón, y probar &te efecto en un cultivo láctico mixto.

Por Io expuesto, se considera que el tema propuesto en este estudio puede considerarse útil, novedoso y con un nivel cientlfico suficientemente profundo.

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11. OBJETIVOS GENERALES Y ESPECIFICOS

Colaborar al conocimiento de la prgducción de diacetilo y otros compuestos aromatizantes producidos por la cepa: Lactobaciilus acidophius Hansen 1748, utilizando un cultivo axénico de almidón semidefinido.

t3WStiV438 ES?EGWiCOSr

I. - Adaptar y desarrollar tecnicas para la determirtaci6n qulmka de diacetilo y otros compuestos aromatizantes.

2. - Estudiar el efecto de la adición de glucosa y del extracto de levadura, as1 como el de la temperatura y pH en la producción de diacetilo. en un medio semidefinido de almidón.

Wt. oliiriwnnilor Y mffw 1 Se determinó que Lb acidophilus en cultivo axémco y sumergido de ahmdón, en

las presentes condiciones de fermentaciibn no produjó diacetilo. a pesarde que los antecedentes indicaban que en otrab condiciones de cultivo, esta cepa daba reacciones (c) a la prueba de VOgeS Proskauer en medio de almidón

2 Sin embargo, se observó que este microorganismo SI pudo acidincar el medio y consumir almidón

3 Por otro lado, se determinó que en cultivos mixtos. esta bacteria Iáctica contribuyó hidrolizando almidón: proporcionando as1 azSicares libres a Pediococcus pentosaceus, cepa que SI fue capaz de formar el diacetilo.

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IV. MATEWALES Y METODOS

DISENO EXPERIMENTAL

Los experimentos realizados se disenaron utilizando el procedimiento de Taguchi (Ross, 1989) Esta metodología sirve para evaluar el efecto de muchos factores e interacciones en una varlable de respuesta, obteniendo resultados confiables con un reducido número de experimentos

En el presente proyecto se eVa~UarOn varios factores en la producción de diacetilo, los cuales se muestran en Cuadro No. 1.

O 2B O O

0.05 O

0.3 % 35 OC 1 .o % 0.02 % 0.2 % o. 1 %

I I I I

Se considera que existen relaciones mas cercanas entre los siguientes factores: citrato, glucosa y extracto de levadura, también entre los dos factores ambientales (temperatura y control interno de pH con CaC03J y los tres nutncionales mencionados. La treonina es un precursor reconocido para la formación de acetaldheido (Marshall, 1983). pero no se ha evaluado si este metabolito tiene alguna influencia en el diacetilo por lo que se presenta como un factor independiente.

El diseño experimental utilizado consistió en un diseño ortogonal L-16, con 6 factores (de 2 niveles) y 6 interacciones bifactc)riales, que se presenta en el diagrama de espina de pescado (Fig. 1 y en la gráfica ii&ai (Fig. 2).

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Para determinar las interacciones del modelo se utilizó el Cuadro triangular de interacciones L-16 de Taguchi (Ross, 1989). mostrándose en el Cuadro 2. La asignacion de los factores e interacciones a las columnas del arreglo ortogonal L-16 de Taguchi (Ross. 1989). se presenta en el Cuadro No. 3.

t I u*jurtck. OirnUPJo. 1 2 3 I I b 1 o , 9 ta i t ix sa I I i s

I I 3 2 5 4 7 6 9 8 I 1 I O 13 12 15 14 2 . I 6 I 4 5 . 1 0 I 1 8 9 14 15 12 13 3 - 7 6 5 4 I 1 I O 9 8 15 ' 1 4 13 12 4 I 2 3 12 13 14 15 8 9 I O I I 5 - 3 2 13 12 15 14 9 8 II IO 6 I 14 15 12 13 IO I I 8 9 7 - 15 14 13 12 I 1 I O 9 8 8 1 2 3 4 5 6 7 9 - 3 2 5 4 7 6 I O - 1 6 7 4 5 I 1 - 7 6 5 4 12 1 2 3 13 - 3 2

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 I I I I 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 I I I I

1 2 2 1 1 2 2 I I 2 2 2 2 l 1 2 2 I 1 I I 2 2 2 2 I 1 2 2 1 1 I I 2 2 I 2 I 2 I 2 1 2

1 2 1 2 2 1 2 1 2 1 2 1 I 2 1 1 2 1 2 2 I 2 I

2 1 2 1 I 2 1 2 1 2 2 1 I 2 2 1 2 1 1 2 2 1 1 2

L

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~ROPARMION DBL CU~LTWQ DB coIysswncmu La cepa utilizada en el presente trabajo, Lactobacillus acidophilus tiene el No,

1748 en la colección Hansen { CHR. Hansen , 1982). Esta cepa tiene forma de bacilo con tamaño regular, en pares y cadenas cortas y largas, no esporulados y sin organelos de locomoción, gram positivo, tinciones de cápsula y gránulos negativas. Puede crecer a un rango de 15 a 45°C. aunque 3 bajas temperaturas su metabolismo se ve disminuido. Es tolerante a 4% de NaCI. Reduce el tornasol y el tatrarolium. En placa de almidón se desarrolla pero no forma halo de hidrólisis (Escamilla, 19951.

Para la conservación de la cepa Lactobacillus acidophilus se utilizó un medio de agar de microinoculación - almidón, el cual se preparó con la composición que se muestra en el Cuadro No. 4.

Almidón soluble Caldo de microinoculación (media fuerza). /Agar Sol. vitaminas y minerales @

1 Biotina + IAc. f6lico i.

5.0 g

18.5 g

, 80 c19 40 )rg

15.0 g 5.0 ml

I

1 I I pH= 6 5-6 7 + Se utilizaron so1uciones de 10 )ig/rnl EtOH al 20 96 69 Una cápsula de Viterra Plus y una de Calwda disueltas en

40 in1 de So1 etav5lica al 20 96. filtrada

En la elaboración del cultivo de conservación, el almidón utilizado debe disolverse por separado. Éste se dispersó en un pequeño volumen de agua destilada y frla, luego se vertió en un matraz con agua destilada y se calentó a ebU&K¡bn, agitando constantemente. De forma semqjante el agar se disolvió, hirviendo la solución. A continuación se disolvieron los demás componentes, se ajustó al pH indicado con soluciones' de NaOH o H 2 S 0 4 al 10% y finalmente se ajustó el voiumen. ,

De este medio se adicionaron 7 ml a tubos de cultivo con tapón roscados de I5 X I20 mm. y se esterilizaron a 12 1 "C. por 15 minutos. Se dejaron enfriar en forma inclinada. Se sembraron con estria superficial y picada con la cepa mencionada y se incubaron durante 48 h a una temperatura de 28 "C.

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PREPARACION DEL CULTiVO DE INOCULO

Pala la elaboración del medio de inóculo. la composición base se presenta en el Cuadro No 5, a la cual se le adicionaron O 2% de extracto de levadura Este medio fue preparado de manera semejante al de conservación, pero no contiene agar, utilizando para ello dos matraces de 125 mi A cada uno de ellos se le adicionó I O0 mi de este cultivo

Almidón soluble Peptona de casefna. KzHP04 MgS04 07Hz0 Sol. vitaminas y minerales. Biotina. Ac. fólico.

15.0 g 2.0 g 0.2 g 0.1 g

80 Pg 3.0 ml

40 pta

Una vez esterilizados, se inocularon con una asada cargada del cultivo de conservación (de 48 horas) en condiciones asepticas y se incubaron por 48 horas, a una temperatura de 28 "C.

lmuAmw#mI -I. cuL%vw#m u Se realizaron cultivos sumergidos de almid6n. cuya composici6n base se

encuentra en el Cuadro No. 5. Los medios.se esterilizaron a I2 I "C, durante I5 min. Se utiliz6 un volumen de trabajo de 80 ml, en matraces erlenrneyer de 12.5 ml. con tap6n de algodón.

La inoculación se realiz6 aplicando asépticamente I 96 de un cultivo sumergido axénico de 48 horas.

Los matraces se incubaron con agitación ligera (50 rpm), para mantener un redox alto y para evitar que las bacterias Ikticas formen conglomerados.

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FE RMENTACION PRlNCl PAL

Las muestras iniciales consistieron en caldos de cultivo recién inoculados Las muestras finales fueron cultivos de 5 dlas de fermentación. en las condiciones que indica el diseño (Cuadro No 1 J

mM$E.JOaelAlrNwmm?As

Todos los experimentos (cultivos) se tealizaron por triplicado, se muestreó al i,nicio y al final de la fermentación, y cada anAiisis se realizó por duplicado. El caldo de cultivo de cada matraz (inicial o final) se dividió en dos porciones, una de 20 ml y otra de 60 ml (Fig. No. 3). En la porción de 20 ml se midió el pH y se posteriormente se congeló. Posteriormente se descongeló y; se calentó a 60OC durante 30 min. con agitación, para homogeneizar el almidón. he enfrió a temperatura ambiente y se analizaron los carbohidratos totales. I,$ porción de 60 ml se congeló inmediatamente, y posteriormente se descoqgeló sin calentar hasta una temperatura de 5°C. El caldo se centrifugó en una centrifuiga refrigerada Sowail Superspeed RCZ-B a 5000 rpm (2552.63 9) por 30 min en fkascos de 50 ml, y el sobrenadante se congeló nuevamente, y se destinó para abalizar azúcares reductores. citroto y el diacetilo.

Flg. 3 Diagrama de procedhnicrnto. IMes d. cuttlm axhkes

*

I f

Aziic. Red. (D.N.S.) *ato (A.O.A.C.) Lilacst. (V.P. Moálf.) clt.bah. Tot. (entfwm)

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Ecuación utilizada para calcular la fuerza centrlfuga relativa

RCF 19) = 1 I. I8 x rx (N/1000j2 . . . . . . . . . . . . . , . Ec. ( I j

r = radio en cm desde el centro del rotor al punto en el cual el valor RCF es requerido. N = velocidad del rotor en rpm

En esta centrifugación los datos fueron los siguientes: r = 9. I4 cm N = 5000 rpm, obteniendo un valor de RCF 191 igual a 2552.63.

Se analizaron los contenidos de citrato únicamente en los cultivos en donde se adicionó este compuesto, además del correspondiente al experimento No I, como blanco de composición del medio

0 WCH (A O A C 1985 Omcial methods of onaiysisl

La medición del pH de las muestras iniciales y las fnales se realizó ron un potencihetro Conductronic pH 20

Preparación de la solución de antrona

I - Se pesaron O 2 g de reactivo de antrona an un vaso de prectpitados de 1 O0 ml

2 - Se colocó el vaso en un baño de hielo, se adicionaron 75 ml de H2S04 y se disovi6 la antrona

3 -Se transfirió a un matraz volum6trico de 100 mi y se aforó con H,SO,

4 -La solución se vertió a un frasco ámbar

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Preparacdn de la solución estándar de glucosa

I - Se deshidrató aproximadamente I g de glucosa en una estufa a 6OoC. hasta peso constante, colocándola posteriormente en un desecador.

2.- Se pesaron exactamente 0.25 g de glucosa anhidra en balanza analltica

3.- La glucosa se disolvió en un vaso de precipitados de 100 ml, que contenía aproximadamente 25 ml de agua destilada.

4.- La mezcla se transfirió a un matraz voiurn6trico de 50 ml y se aforó con agua destilada.

5.- Se tomó I ml y se colocó en un matraz volumétrico de 100 ml, el cual se aforó con agua destilada.

Las soluciones anteriores fueron preparadas el'mismo dla de su uso

I

Dearrollo de color en la curva estándar

El desarrollo de color para la curva estdndar se llev6 a cabo en tubos de ensayo de 15x 1 50 mm ó 20x 1 70 mm . Las indicaciones para cada accidn del Cuadro No. 6 se presentan a continuación:

1 .- Se adicionó a cada tubo la soluci6n de antrono e inmediatamente se colocaron en baño de hielo y se mantienen en este hasta antes del mezclado en vortex.

2.- Posteriormente se agregó la solución de glucosa en las cantidades señaladas en el cuadro de desarrollo de color, se tuvo cuidado de que la solución resbalara por las paredes del tubo lentamente para evitar que la reacci6n se iniciara antes del calentamiento,

3 - Se adicionó agua destilada a cada uno de los tubos con el fin de completar un volumen de 7 5 ml.

4 - El mezclado en vortex Super Mer . se realizó a una velocidad rdpida durante 5 seg para evitar que la temperatura se ekvara demasiado, provocando una reaccibn entre los azúcares y el ácido. los tubos se colocaron inmediatamente en baño de hielo

5 - Se taparon los tubos con canicas para evitar que los vapores que se generan durante la reacción se evaporen, o arrastren impurezas que pudieran interferir en el desarrollo de color

6 - El calentamiento se efectuó en baño marla a 98 C durante 1 O min exactos para dar lugar a que se dé la reacción quJmica completa. Posteriormente los tubos se colocaron raptdamente en baño de hielo para detener la reaccf6n

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-', I

7 - La lectura se efectuó en un espectrofotórnetro Spectronic 20 Milton Roy. a 625 nrn utilizando filtro rojo, tornando corno blanco al tubo No. 1 de la curva de desarrollo de color

I iiho No

Cluci~co (inq/tubo)

Sol oiiiiono O 2%

coi. giiicosa O. i % (mi)

Aguu destilado (mi)

Mezclado en vórtex

Topudo con canicas

Colentoiiiieiito a 98'C

Fiiliiciinierito e11 hielo hoslo lei iipei (I tiii ii oiiibieii te

Reposo 10 min

Lectura 625 nm (utilizando

Preparacidn de la muestra para deteminarion de cxbohidratvs torales, (Escamita, 199 I J

1 -Se tornó 1 O rnl de la solución problema que era el caldo no centrifugado (previamente calentado) Esta se vertió en un matraz vdwnétrico de 100 ml. aforhndo con agua destilada

2 -Se tomó 1 rnl de la solución anterior y se vertió en un tubo de ensaye de 20 X 170 rnrn, adicionando 9 rnl de agua destilada, de forma que se aproximara a una concentración de I5 rngirnl)

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3.-Se tornaron 2.5 ml de la dilución anterior y se colocarlon en un tubo de ensayo 20 X 170 mm el cual ya contenla los 5 rnl de solución de antrona.

4.- Se procedió como en la curva estándar desde el mezclado en vórtex.

5.-Se calculo la concentración de -carbohidratos totales interpolando en la curva estándar, previamente ajustada por mlnimos cuadrados. aplicando la ecuación No 2:

X =A (pg/ml) * I Oml/2.5ml * I 00ml/ml * 1 000ml/l * 1 g/l E6 pg . . , I , . . .Ec. (2)

X = Contenido de carbohidratos totales (gil) A = Valor obtenido de la interpolación en la cuma estandar (pgflubo)

Con el Objeto de determinar si habla alguna interferencia de las proteinas en el desarrollo de color para la determinación de carbohidratos totales al uttlizar este método en una mezcla almidón-proteina, se realizó el siguiente ensayo preliminar

Preparación de solución de almidón

I .- Se pesaron exactamente 0.5 g de almidón

2.- Se disolvió en un vaso de precipitados de 50 ml en frío con aproximadamente 25 ml de agua destilada y se calentó en parrilla 'hasta ebullicibn con agitaci6n coristante.

3.- Se enfrió hasta temperatura ambiente y se aforó en un matraz volum&rico de 50 ml con agua destilada.

Preparación de solución de almidón con prateha

I - Exactamente se pesó I g de almidón y se procedió igual que en la sokicbn anterior.

2.- Se enfrió hasta temperatura ambiente y se adicionó 0.29 de proteína /aibilmina bovina).

3.- La solución se vertió en un matraz volumétnco de 100 ml y se aforó con agua destilada.

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Determinación de A#Kams Raductores por ei &todo dd ácido dlnWr0 saiicílico (D.N.S.) (Miller. 1959)

Preparación de la solución de D N 5

Acido 3,s dinitrosalkllico ’ Na OH Na2S03 Fenol

Aqua destil?da, hervida y.fríp

Reactivos Cantidad 19) I 1 .o0 1 .o0 0.05 0.20 1 O0

Procedimiento

I Se pesó y se mezcló cada reactivo hasta la diiución completa, en el orden indicado en el Cuadro No. 7

2 - La solución se aforó a 100 mi con agua destilada, hervida y frla, se conservó en frasco color ámbar hasta el momento de su uso La solución no debe gwdarse más de 24 h

Preparación de la soluciidn estándar de glucosa

Procedimiento

1 .-Se deshidrataron aproximadamente 1.5 g de glucosa en una estufa a 60° C, hasta peso constante, colocando la muestra en un desecador.

2.- Se pesó exactamente O. 1 O00 g de glucosa anhidra en balanza analltica OHAUS Galaxy.

3.- Se disolvió la glucosa en un vaso de precipitados de 100 ml conteniendo aproximadamente 50 ml de agua destilada.

4.-Esta solución se vertió en un matraz wolumétrico de 100 mi, lavando con pequeñas porciones de agua destilada.

5.- La solución se afor6 a 1 O0 mi con agua destilada

Esta solución se preparó en el momento de su uso

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Desarro//o de color en b curva estandar de glucosa

procedimiento del Cuadro No. 8 en tubos de ensayo de 15 x 150 rnm.

~

I

El desarrollo de color para la curva estandar se llevó a cabo de acu rdo ai

En presencia de calor el ácido 3.5 dinitrosalisilico se reduce a ácido 3-a ¡no-5 nitrosalisllico por los azúcares reductores presentes, desarrollándose un color 1" rnarilio café.

I .- Se adicionó a cada tubo la solución de glucosa en las cantidades indicad& en el Cuadro de desarrollo de color.

2.- Se agregó agua destilada hasta completar un volumen de 1 rnl en cada tutlo. y se procedió a mezclar en un vortex Super Mixer, durante 5 Seg

3.- Se colocó en cada tubo 1 mi de la soluc,ión de DNS previamente preparadía y se mezcló nuevamente durante 5 seg.

4.- Los tubos se taparon con canicas para que los vapores de reacción Que se generan durante el calentamiento no se evaporen y no arrastren impurezas que pudieran interferir en el desarrollo de color.

5.- El calentamiento se efectuó en b a h marla a 98' C durante 5 min exactds para que se llevara a cabo la reacción completamente, e inmediatamente los tuDos se colocaron en baño de hielo con el fin de derener la reacción.

fi

I

!

6 - Se adicionó agua destilada hasta completar un volumen de 1 O ml en cad-bo.

7 - Se mezcló en vortex durante 5 seg para que la mezcla se homógenice y de dejó reposar durante 5 min.

8 - La lectura se realizó a 575 nm utilizando un espectrofotómetro Spectropic 20 Milton Roy, tomando como blanco el tubo No. I de la cutw de desarrollo de ciolor.

P~paracidn de la muestra para defemiincidn de azúcares [email protected].(Escamiiba! I 9% I

I .-Se efectuó una dilución 2.7: 1 OO. para lo cual se tomó una allcuota de 2.7 Mi de la solución problema (sobrenadante de la c,entrifugación), la cual se vertió kn url matraz volu&trico de I O0 rnl, aforando con agua destilada.

2.-Se tomó 1 ml de la solución anterior y se vertió en un tubo de ensayo de 20 X I70 rnm.

3.-Se procedió al desarrollo de color como en la curva est6ndar a partir de la idición de la solución de DNS.

~

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4 -Se calculo la concentración de azúcares reductores interpolando en la curva estándar. previamente ajustada por mlnirnos cuadrados, y aplicando la ecuación No 3

X = A (pg/rniJ * IOOrn1/2.7ml * 1000rnl/l * 1 g/l E6 pg , . . . . . . . . . .Ec. p)

X = Contenido de azúcares reductores en 1g/i) A = Valor obtenido de la interpolación en la curva estandar {pg/rnl)

- lubo No

'I ocediiniento

Solucion de ylucoso [ t1ii)

Aqua destiloda (mi)

Mezclado

Solución de DNS

Mezclado

lopodo con cónicos

Colenlomiento a 98' C

nfriamiento en hiela hosta temperaturo

ambienle

\i]iia destilado (ml)

Mezclodn

Reposo

Lecturo 5!5 iiin.

1 2

O 200

O 0.2

I .o 0.8

1 0 1 .o

8 0 8 0

T+ __I

400

- 0.4

0.6

1.0

v

__i 8.0

- d

4 1 ' ' . '

600 800

0.6 0.8

0.4 02

1 0 I .o

8.0 8.0

- Vol tot' -

- o - 1.c

o - 1.0

1.0

2 0

- 2.0

- 10.0

- 10.0

-

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Determirución de -0 úMco (AOAC. I980 Metodo No 57, IDF. 1976)

PREPAR4CION DE LA CURVA ESTANDAR

O Reactivos

a) Solución de ácido tricloroacético 1.836 M. Se disolvieron I5 gramos de ácido tricloroacético (CC1,COOHJ en agua y se diiuyeron a 100 ml ( Precaución: éste reactivo precipita protelnas, causa daños a la piel y al tract0 respiratorio. Usar guantes de hule, protección en los ojos, y usar equipos efectivos para remover los vapores generados J

b) Solución estandar de ácido cltrico 0.003252 M. Se pesaron 0.5467 gramos de ácido cltrico anhidro y se disolvieron en 50 ml de agua destilada en un vaso de precipitado de I O0 ml. Posteriormente 51 añadieron 3.12 ml de una soluci6n de NaOH al 1 O % ( preparada con agua hervida y frla ). Se dlsol\/.ieron los reactivos y se transfirieron a un matraz vdumétrico, &orando a 100 ml con agua destilada. Se tomó ur)a alicuota de I O ml, se adicionó ‘a un matraz volumetrico de 1 O0 ml y se aforó con agua destilada, obteniendo un4 concentración equivalente a Ac. cltrico anhidro de 500 pg/ml.

Nota: Se podria utilizar citrato de sodio Virectamente f C, H5 O7 Na3 , 2 H,O 1 3.252 mM.

- c) Piridina.- Se us6 el reactivo directo. Pureza 99 %. I J.T. Baker J

d) Anhldrido acético.- Se usó el reactivo directo. Pureza 98 %. ( J:T: Baker )

O hnetodo

Se preparó la CUNñ estandar de acuerdo a IRs indicaciones mostradas en el Cuadro No. 9 en el orden propuesto. Este ConsIa de tres etapas. En la primera se utilizaron tubos de ensayo de 20 x I70 mm. con 1% pfkcauciones previamente indicadas. Para la segunda etapa se utilizaron tubos de ensayo de la misma dimensión, los cuales estaban en hielo cuando se añadió el anhldrido acético con una bureta de 50 ml; al igual que la piridina. (Precaución: durante la adición de piridina. y anhMrido acético se deben utilizar mascarilla de proteccióh y equipo para remover los gases generados). En la tercera etapa se llevó a cabo el desarrollo de color, utilizando para ello un baño marla Grant lnstrumenb JB3. La mezcla de los reactivos se realizó con un vdrtex Lab-Line Instruments modelo Sup+Mixer. Las lecturas de absorbancia se realizaron en un espectrofotómetro Milton Roy Company Spectronic 20. Se ajustaron por mlnimos cuadrados los resultados obtenidos.

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O Preparación de la muestra para la cuantificación de Ac. cltrico

Se tornó una alicuota de I rnl del sobrenadante con una pipeta volumétrica de I ml, se adicionó a un tubo de ensayo, se aforó a 15 ml de caldo de cultivo con agua destilada y se mezcló con vortex. De Pste se tomaron exactamente 5 ml y se colocaron en un tubo de centrlfuga de vidrio 15x 1 O0 mm y se añadieron 3 rnl de Ac. tricloroacético ( T U ) al 5%. llegando a un volumen total de 8 ml. Se centrifugó en una centrifuga Sot-Bat el contenido a 3000 rpm (I 509 gJ durante 1 O minutos a temperatura ambiente. Se obtuvo el valor de RCF por medio de la Ec. 1, teniendo que r = I5 crn y N= 3000 rpm.

El sobrenadante se pasó a un vaso de precipitados de 30 ml, del cual se tomó I ml y se recibió en un tubo de ensayo de 20 x 1 70 mm.

A partir de este paso se siguió con el procedimiento de la etapa No. 2 del Cuadro No. 9.

Una vez obtenida ia ecuación de la recta, se interpolaron los data para obtener las concentraciones en (~(g/ml). Tomando en cuenta las operaciones realizadas a la muestra (allcuotas, aforos), la siguiente fórmula sirvió para obtener las concentraciones iniciales y finales de la fermentación.

Ecuación para calcular la concentración [gil) de Ac. cltrico en las muestras

Ac. cltrico @/I) =A kg x BmL x lLml x i.QQQd x 1 0 . . . . . . . . Ec. (4)

- ml 1 ml 5 ml 1 1 1 x 106pg

A = concentración de la muestra, obtenida en la interpolación de la cuwa estandar.

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- mmw?

la

Sol Ac.

-

citric0

+ T.C. A.

- 2'

En baiío

Je hielo.

- 3'

Desarro- 'lo de :olor.

-

Sol. estandar Ac. cltrico (mi)

Conc. Ac. cítrico (mg/tubo)

HZ O destilada (mil

501. Ac. tricloroacetico (mil

Y2 O destilada /mi)

Llezclar 30 seq

Vicuota Sols. de l a etapa

Ionc. Ac. cítrico (pg/mll

'iridina (mil

\nhidrido adtico (mil

viezclar 1 O seg

Enfriado hasta Temp. Amb.

rapar con parafilm.

Calentar a 32' C, 30 min

Znfriar a Temp. Amb.

kledir absarbancia, 428 nm

- I

O

O

6.25

5

1.25

-

- I

O

I .3

5.7

I

- 8

I

0.5

5.25

5

1.25

-

1

40

1.3

5.7

- 3

2

1 .O

4.25

5

I .25

-

- 1

80

I .3

5.7

-

- * 3

1.5

3.25

5

I .25

-

- I

120

I .3

5.7

-

- S

4

-

2 0

2.25

5

1.25

- 1

160

1.3

5.7

-

- 6

5

2.5

I .2f

5

I .25

-

- t

ZOO

1.3

5.7

-

- vd. Tcit.

rirta

0-5

6 25

1 1 2s

12 5

1

2.3

8

8 -

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Determinación- * ica de QkCeWo

La variable de respuesta para el diseño ortogonal de esta serie de experimentos. fue el diacetilo producido (concentración final-concentración inicial), el cual fue determinado por un método fotocolorimétrico basado en el de Voges Proskauer (McFaddin, 1980). modificado para analizar solamente diacetilo y no acetolna. El cambio consistió en utilizar una solución de KOH al I% /para dar un medio aicalinoJ, en lugar de 40%. que se usa para oxidar a la acetolna.

O Reactivos

A. a- Naftol 1.396.- SI? pesaron 1.3 g disolviendo en 60 ml de etanol absoiuto, la solución se aforó a 100 ml con agua idestilada. Se adicionó I g de carbón activado, se agitó y se mantuvo cubierto 4 4 OC durante 30 minutos para eliminar el color, luego se filtró y se guardó en'un frasco ámbar. Esta solución puede utilizarse hasta por tres dlas, si se conserva en refrigeración.

B. Solución de KOH al 1% y creatinina al:0.3%.- Se pesaron 0.3 g de creatinina disolviendo en 30 ml de agua destilada vervida y fria. Se pesó 1 g de KOH y se disolvió en 30 mi de agua destilada, hewifla y fria. Ambas soluciones se mezclaron y aforaron a 1 O0 ml con la misma agua.

C.' Solución estandar de diacetilo para la cjiva estandar.- Se preparó una solución acuosa de 50 pg de diacetilo por mililitro.l En un vaso de precipitados de IO m( se vertieron aproximadamente 3 ml de agqa destilada. El vaso se cdocó en una balanza analítica y se ajustó a cero. Con un espátula pequeña se adicionó exactamente 0.1 g de diacetilo. El coNenido se vació inmediatamente a un matraz volumétrico de 100 ml que ya coStenla aproximadamente 20 ml de agua destilada y se aforó a la marca. Este prdcedimiento debe realizarse muy rápido para evitar pérdidas por evaporación. De Bsa primera solución se tomaron 5 ml, se vertieron en otro matraz volumétrico y se aforó a I O0 ml.

O Método

Se realizó una curva estandar añadiendo a 'una serie de tubos de O a I mi de la soiución estandar de diacetilo, obteniendo; concentraciones de O - 50 pg/tubo. Posteriormente se añadió agua hasta cornplt$ar un volumen de 2 ml/tubo, luego se adicionaron 2 ml de la solución A y 2 ml de lla solución B, agitando durante I O seg después de cada adición, en un vbrtex Lab- dine lnstrumenb modelo Super-Mixer. Se leyó la absorbancia a 530 nm en un espectrdfotómetro Milton Roy Company modelo Spectronic 20, después de 50 minutos.

Para analizar las muestras, se tomó I mi del sobrenadante de cada caldo de cuitivo centrmigado. y se vertió a los tubos ,de ensayo en lugar de la solución de diacetilo. Posteriormente se procedid como eb la técnica mencionada.

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FBRMENTACION MIXTA

cuFt4vo a5[.(HI/co mixto de -ut m- y Lwliailrirrñuur acid-)knmn i7W em mmm ttmwqgeo d. .bsklrkr. (McFaddin. J F 1980)

ObJothm

Comprobar que una fermentación 16ctica mixta /que incluye a la cepa estudiada factobaci//us actdophduq es capaz de producir diacetdo en un medio de almklón

Cepas utilizadas: Fediococcus Pntosactus aislada de sidra. en el' Lab. de Enologla (Depto. Biotecnologla, UAMI) y Lacmbaciíb. acidophilus de la colección Hansen 6 1738. En los procesos de selección y carackrización de estas cepas, se mostró que la cepa de /? pentosaceus tuvo mas producFión de diacetilo. y la de Lb. acidophilus, mas hidr6lisis de almid6n.

Se prepararon matraces erlenmeyer,de 250 ml de capacidad nominal, cada uno conteniendo I50 ml del medio basal Ue almidón indicado en el Cuadro No. 5. Los matraces se esteriliza.ron a I2 1 "C, por 1 $ min.

' Adicionalmente se utilizaron compuestos especiales, que según los antecedentes en leche y vino. podían llegarla estimular la formación de aromas en el medio de almidón. como son: Ac. cítrico 3 d/l; Extr. Lev. I .5 g; y CaCO,. 0.2 g/i. Se ajustb el pii a 6.5.

Los medios estériles se inocularon COP asadas cargadas de cultivos sólidos de 48h de ambas cepas, en condiciones aséptkas, y se incubaron con agitación ligera (60 rpm) a 28°C y a 35°C. El contenido de un matraz se congeló (-15T) inmediatamente después de inocular para SU arARsis posterior, en calidad de muestra inicial. El resto de los matraces se iban retirando cada 24 h de las incubadoras, congelando su contenido.

Posteriormente las muestras se descongelaron hasta llegar a una temperatura de 2°C. y se centrifugaron a 5000 rpm (2552.63 g) por 30 rnin, para eliminar céluias y almidón residual. En el sobrenadante se diterminó la concentración de diacetilo + acetolna por el método forocolorimétricb convencional de Voges-Proskauer (McFaddin. 1980). para lo cual se utilizó la rnuiestra sin diluir

Amdllmr cistdi*a+,t.

Se aplicaron los andlisis de estadístida descriptiva desviacion estándar/

a los datos (media y

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V. S

E n general, se observó al final de las fermentaciones un cambio en el olor en todos los caldos de cultivo, desarrollando algunos un aroma mas fuerte probablemente debido a la formación de acetato de etilo. También se presentó turbidez, pudiendo observar pequeñas partkulas en suspensi6in en el medio, as1 también aumento ligeramente el tinte amariltento. Adcmdis de estos cambios, no se observaron otros, como podría ser la evoluci6n de gases. ,

C.Iw0 k pn. En el Cuadro No I O se pqesentan los valores de pH obtenidos en las muestras iniciales y finales durante la fermentación, y su diferencia

Como puede observarse, se present6 una disminuci6n en el pH durante la fermentación debido a Io formación de ácido láctico, a partir de los carbohidratos. En los experimentos a los que se les adicion6 glucosa (3, 4, 7, 8. 1 1, 12, 1 5 y 16). el pH disminuyó aún mas: indicando con ésto. qye la presencia d e glucosa favorece el crecimiento de este microorganismo. Entre eiips. el fernwntador No. 7, present6 una diferencia de pH mayor que todos los demái. Este tenla el nivel alto de extracto de

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I I 1 1 I t I

levadura, as1 como una temperatura de 35 "C y no se le añadió CaCO,. Confirmando lo anterior, Verde et al, 1995) determinaron que en un medio de anaerobiosis con glucosa, esta cepa desarrollada a una temperatura de 35 "C, presentó mejor capacidad de acidificar el medio que a 28 'C. Además, el Lb. acidophiluspudó utilizar el almidón como fuente de carbohidratos para acidificar el medio. For otro lado, puede observarse en el mismo Cuadro que en tres cultivos (experimentos 2, 9 y 1 O) sin glucosa. y que tenlan una temperatura de fermentación de 28OC. no disminuyó el pH. Es evidente que estas ultimas condiciones no favorecieron el buen desarrolló del microorganismo y por lo tanto, no produjó la cantidad suficiente de ácido láctico para poder disminuir el pH: además de que los experimentos No: 2 y 10 contenian CaCO,, ayudando as1 a regutar cualquier cambio ligero.

T-. El Cuadro No 1 I representa los datos obtenidos a partir de los anAlius de carbohidratos totales, que se realizaron en las muestras iniciales y finales de la fermentación Entre estos compuestos se incluyen, el almidón del medio original. as1 como la glucosa añadida o producida por hidrólisis

cwilro Alo. 11

c- clrollpbMlarwlo.uls on ucylok, s-*r-*iJI.rdkyiuá.

i

Conc inicial

En terminos generales, podemos decir que se -presentó durante la fermentación el consumo de carbohidratos totales por el microorganismo

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I I I I I ill I O '1 I

II 0 c

Lacrobacilus acidophilus, observando una mayor disminución de éstos en los experimentos que contenlan glucosa añadida (3, 4,. 7, 8. 1 1, 12, 15 y I 6). Tambien influyó ligeramente la presencia del nivel alto del extracto de levadura (experimentos 2, 4, 5, 7 , I O. 12. I3 y 15). Entre estas fermentaciones, las que por afiadidura fueron efectuadas a 28 "C (3, 4, 1 1. 12). presentaron una mayor diferencia de carbohidratos totales, encontrando en el experimento No. 11 el mas alto consumo. Este contenia sin embargo, el nivel bajo de extracto de levadura.

kuc.rrs R&wta#s. En el Cuadro No I2 se muestran los resultados obtenidos en el andlisis de azúcares reductores Estas determinaciones se realizaron en las muestras iniciales [sin incubación) y en las muestras finales (incubadas)

cuci*rewp. 12

c.4Lkde- Ilcil#fms.A.Iooqky

COK inicial

En los experimentos a los que no se les abdió glucosa ( I , 2, 5, 6, 9, I O, I3 y 14). no se observó la presencia de azúcares rediictores ni en las muestras iniciales ni en las finales; en contraste con las que si contenlan glucosa; debiendose probablemente a que la presencia de glucosa indujó la actividad amilolftica. También se observa que los experimentos que content& inicialmente glucosa, no variaron notablemente en su concentración de azúcares reductores final, Sin embargo, la conclusión aqul no es simple, pues durante los cultivos se presentan sirnultaneárnente el consumo y la producción de giucosa por la hidrólisis de almidón.

F

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Por otro lado. el experimento No 15, el cual contenla los niveles altos de extracto de levadura y glucosa. y utilizó 35 OC, presentó el mayor consumo de azúcares reductores

V de Ac. .csclca En el Cuadro No 13 se muestran las concentraciones iniciales y finales de ácido citrtco obtenidas durante la fermentaci6n. en los experimentos que contenlan este fattor nutricional, así cam0 el experimento No 1, como blanco de composici6n del medio

currko@m. 13

c:onosm d. b u m . piurñarin., eu*tv, S . u n r c l ) l + + . ~ s u W U & # S @ W M S

In kW.. I 1 c*krity.. R J x I J

Conc. inicial

En base a los datos del Cuadro No. 13, se determinó que a pesar de que Lb. acidophiilus consumió un poco de ácido dftrico durante las fermentaciones; no se presentó la formación del diacetilo. Diwrsos esnidios han mostrado que el aromatizante es sintetizado por algunas bacterias Iácticas a partir del consumo de citrato, mediante una descarboxilaci6n oxidativa y por otras rutas (Kempler y McKay 198 I, Klaver ef a/., 1992). aunque otras badterias Iácticas consumen el ácido para el crecimiento microbiano y sin formar aromas. como en este caso También se puede ver que el factor ambiental de la tempehtura influyó, observándose un mayor consumo a 35 "C (experimentos 13, 14, 1 5 1 y 16); al igual que para el extracto de levadura. El experimento No. 13 presentó el mayor consumo conteniendo el nivel alto de extracto de levadura 0.296, la tenhperatura de fermentación de 35 "C y careciendo de glucosa y CaCO,.

DHmrrimlon-,kjlkortlk . En base a los análisis realizados, la producción fue negligible o nula en todas las fermentaciones, y por eso

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no se i-ealizó el andlisis estadistico de Taguchi para esta variable de respuesta. Por io tanto, se puede decir que la cepa no produjó diacetilo en estas condiciones de fermentación. a pesar de que previamente SI habla mostrado reacción positiva de Voges Proskauer en medio de almidón, aunque no en medio de glucosa (Verde et a/, 1995). Existen reportes en la literatura de la formación de diacetilo por alqunas bacterias Iácticas (no incluyen a Lb. acidophihq, en cultivos heterogéneos a base de maíz durante 8 dlas, sin que hubiera terminado el desarrollo microbiano (Escamilla et a/, 1992). También se reporta que algunas bacterias Iácticas poseen la enzima diacetil reductasa que transforma ai diacetilo en acetoha, cuando disminuye el pH del medio a un valor inferior a 5.2 (Escamilla eral., 1996). Cabe mencionar que las enzirnas que reducen el diacetilo y la acetoha (a 2.3-butanodiolj no son iguales en todos los microorganismos (Cogan, 198 I ) . Estas podrlan ser producidas por Lb. acidophilus.

AkiddCn. En el Cuadro No 14 se presentan los resultados calculados de carbohidratos no reductores. considerados como almidón Estos valores se determinaron sustrayendo al contenido de Carbohidratos totales (Cuadro No I 1 ), el de azúcares reductores (Cuadro No 12)

Conc inicial

Por los datos del Cuadro No 14, se puede observar que sí se presentó consumo de almid6n en todos los experimentos por el microorganismo durante la

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fermentación. por lo que se puede decir que el almidón consumido lo utilizó el Lac~obacillus acidophilus para su crecimiento y reproducción. En general, se observa en este Cuadro, que este microorganismo es capaz de hidrolizar el almidón mediante las enzimas amilollticas que posee, proporcionando una mejor disponibilidad de azúcares.

Así mismo. los experimentos que contenlan glucosa 13, 4. 7, 8. I 1, 12, I5 y 16). presentaron un mayor consumo de almidón, notándose una mas alta diferencia entre algunas de las fermentaciones realizadas a 28 "C (2 - 4. I 1 y 12) El experimento No I 1 el cual contenla citrato además de gkicosa. con una temperatura de fermentación de 28 "C y careciendo de CaCO,, presentó el mas alto consumo de almidón

v c r s i a u r a u c y - mdD.yYnlw* aríruu-

Como no hubo producción de diacetilo se realizó un cultivo mixto, con el objeto de determinar la contribución de esta cepa al hidrolizar el almidón que prove de azúcares reductoKes a Pediococcus pffrosaceus, cepa que sf forma diacetilo.

El perfil de producción de diacetilo + acetolna se presenta en la Fig. No. 4, en donde se observa que la formación de estos compuestos se inicia desde el primer dla, alcanzando sus valores máximos en el quinto día, para ambas temperaturas. El valor mdximo 30 mg/lJ correspondió al cultivo de 35°C.

En la cepa de L. acidophilus puede hidrolizar el almidón. proporcionando una mejor disponibilidad de carbohidrato$ simples, que estimularon la formación de diacetilo + acetoina por P. penfo~aceus. contrarrestando el efecto inhibitorio de una temperatura alta.

La desaparición de los metabolites analizados que se observó en el sexto dla se ha explicado en otros alimentos por la actbación de la enzima diacetil-reductasa, y por la inhibición de las permeasas que transpottan algunos sustratos a través.de la membrana citoplásmica. Esta desaparición depende de cada sistema, y a partir de que ocurre, se ha observado que la cinética de formación de diacetilo I+ acetoha) se desacopla de la de crecimiento microbiano .

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Fig. 4 Formación de diacetils+actdnr en un cultivo Iáctlco mixto en medio swnergi9lo de rvlmidón

+

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1, Se presentó disminución de pH por efecto de la fermentación Iactica. encontrando que las mejores condiciones para la disminución de este parámetro fueron: la presencia de glucosa al 1 96 y del extracto de levadura al 0.2 96, con una temperatura de 35 "C. Esto es debido a que el microorganismo al utilizar el almidón como fuente de carbohidratos, acidifrcó el medio'.

2 Se presentó la mayor disminución de carbohidratos totales en el experimento que contenla glucosa, O 2% de extracto de levadura, aunque con una temperatura de 28 "C, que no correspondió a la de acidificación

3. Evidentemente al realizar la determinaci4n de azúcares reductores fue necesaria la presencia de glucosa para su determinación. ya que esta indujó la actividad amilolítica. Unicamente los cultivos que contenían glucosa inicialmente, mostraron un cambio debido a la fermentación el cual fue.siempre negativo, aiin cuando existieran los fenómenos sinwltzlneos de,consumo y producción de glucosa por la hidrólisis del almidón. El experimento que la contenía. así como 0.2 de extracto de levadura y 28 "C. presentó el mayor con4umo

4 Se presentó el consumo de ácido cítrico probablemente para crecimiento microbian0 sin formar diacetilo, encontrando la disminución mayor en el experimento realizado a 35 "C y que contenía el nivel ato de extracto de levadura No se encontró gran diferencia con los factores glucosa y Caco,

5. No se present6 la producción de diacetilo por el microorganismo en esta5 condiciones de fermentación, a pesar de que previamente había mostrado reacci6n (+J en la técnica de Voges ProSkauer en medio de almidón, aunque en otras condiciones.

6 El microorganismo consumió almid6n (carbohidratos no reductores) en todas las condiciones de fermentación, utiiizhndolo para su crectmlento y reproducción, presentándose mas consumo entre los experimentos que contenían glucosa, con una temperatura de 28 "C

7. En el cultivo axénico mixto se presentó la producción de diacetilo + acetolna. notándose la contribucidn de Io cepa de Lb. acidophilus, que al hidroiizar el almidón, proporcionaba azúcares y as1 estimulaba a Pediococcus pentosaceus, para formar diacetilo.

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Vtl. R&C S

AI realizar este proyecto no se pnsmtr5 la p"alucribn de diacetiio por el Lb. acidophilu por lo que queda claro Que: al m(ln0s ep las condiciones Ctio fermentación que se utilizaron, no f a w m fa consiguiente, si se desea la prod en cultivos mixtos, utilizando al proporcionar azlicares a otro micrm compuesto aromatizante, como se presentada en este trabajo. I

Además, para obtener condiciones óptimas de actividad

1

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