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INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n
INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO 2008
MEDIANTE EL USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
Jorge Echegaray Félix Martínez de Lecea
Iratxe Covela Alberto Hernando
Juan Ángel de la TorreAndres Illana
Diana Paniagua
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 1 8
2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
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INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES
DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO 2008 MEDIANTE EL USO DE TÉCNICAS
GENÉTICAS NO INVASIVAS
INFORME REALIZADO
CON LA COLABORACIÓN DE LA LA DIRECCIÓN DE BIODIVERSIDAD Y
PARTICIPACIÓN AMBIENTAL DEL GOBIERNO VASCO Y
LA CAJA DE AHORROS DE NAVARRA (CAN)
Marzo 2009
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 3 8
* A efectos bibliográficos, el informe debe citarse como sigue: Echegaray, J., Martinez de Lecea, F., Covela, I., Hernando, A., De la Torre, J.A., Illana, A. y Paniagua, D. (2009). Seguimiento de las poblaciones de lobos (Canis lupus L., 1758) en la Comunidad Autónoma del País Vasco en 2008 mediante el uso de técnicas genéticas no invasivas. Vitoria-Gasteiz. Informe inédito. 75 pp.
GRUPO
LOBO DE EUSKADI
Apartado de correos 899
www.loboeuskadi.org [email protected] EUSKADIKO
OTSO
TALDEA
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n “Hay algunos que pueden vivir sin elementos salvajes y otros que no” Aldo Leopold, A Sand County Almanac, 1949
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n AGRADECIMIENTOS
La realización de este estudio no hubiera sido posible sin la estrecha colaboración de
varias personas y entidades, a las que desde aquí queremos dar las gracias. Entre las personas
colaboradoras destacamos especialmente a Mª Ángeles Arribas, que realizó
desinteresadamente itinerarios de registro de excrementos a lo largo de la geografía vasca y
del entorno circundante. A Carles Vilà, Jennifer A. Leonard, Günilla Karf, Robert-Jan den
Tex, Maria Nord, Santiago Castroviejo y Violeta Muñoz, del Departamento de Biología
Evolutiva de la Universidad de Uppsala (Suecia), donde se han realizado los análisis de
laboratorio.
Entre las entidades que han financiado este estudio, agradecemos a la Dirección de
Biodiversidad y Participación Ambiental del Departamento de Ordenación del Territorio y
Medio Ambiente del Gobierno Vasco, así como a la la Caja de Ahorros de Navarra (CAN),
entes que nos han brindado la posibilidad de continuar con los seguimientos genéticos no
invasivos que venimos efectuando de forma ininterrumpida desde 2003.
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n ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓN 9 II. ANTECEDENTES 11 III. OBJETIVOS 15 IV. ÁREA DE ESTUDIO 17 V. MATERIAL Y MÉTODOS 21 V.1. Muestreos de campo. 21 V.2. Recolección, caracterización y conservación de las muestras fecales. 23 V.3. Análisis de laboratorio. 26 V.3.1. Extracción de ADN de heces. 26 V.3.2. Amplificaciones de ADN: PCR. 27 V.3.3. Secuenciación de ADN. 29 V.3.4. Identificación de especie. 31 V.5. Análisis de datos. 32 VI. RESULTADOS 33 VI.1. Caracterización de las muestras. 33 VI.2. Identificación de la especie 40 VI.3. Caracterización de los excrementos, identificación y comparación entre
especies. 43
VI.4. Distribución del lobo. 55 VII. DISCUSIÓN 59 VIII. BIBLIOGRAFÍA 67
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n I. INTRODUCCIÓN
La gestión del lobo debe basarse en argumentaciones científicas y socioeconómicas
rigurosas, cimentadas en datos técnicos sobre la especie (Boitani 2000). Estos datos deben
englobar aspectos multidisciplinares (Mech y Boitani 2003), como por ejemplo: la ecología
de la especie, su área de distribución en un contexto territorial definido según características
naturales y no sociopolíticas (Bessa Gómez y F. Petrucci-Fonseca 2003, Cayuela 2004), los
usos del medio natural (no sólo agroganaderos), las estimas serias de tamaño poblacional
(Barrientos 2000, Barrientos y Fernández 2002), la abundancia y evolución de la especie en
tiempos recientes (Naves 2002), el estado de conservación actual, la idoneidad del hábitat
para sustentar de forma natural poblaciones de lobos (Echegaray et al. 2005a), la
conflictividad y los daños ganaderos (Vilà y Echegaray 2007, Talegón, en prensa) y la
percepción social hacia este depredador en el área de estudio.
Por otra parte, no debemos olvidar que la ley Estatal 42/2007 de Patrimonio Natural
y Biodiversidad establece diciembre de 2010 como fecha límite para la redacción y
aprobación de instrumentos de gestión para los espacios protegidos de la Red Natura 2000,
espacios en los cuales, el lobo como Especie de Interés Comunitario cobra especial
protagonismo. Los espacios naturales que albergan poblaciones de lobo, situados en los
sectores más occidentales del País Vasco, abarcan el 31% del total de la superficie propuesta
por las Administraciones Vascas como Red Natura 2000 (Echegaray et al. 2008a).
Resulta evidente que la problemática que genera en la sociedad algunos de los
aspectos relacionados con la gestión del lobo (Fritts et al. 1997, Breitenmoser 1998,
Naughton-Treves et al. 2003, Nie 2003) y particularmente en Euskadi (Sáenz de Buruaga et
al. 1994, Echegaray et al. 2004, 2006, Askacíbar y Ocio 2006). Por todo ello, es necesario
adoptar un plan de conservación y gestión de la especie en el País Vasco que abarque todas y
cada una de las cuestiones anteriormente mencionadas, así como la actualización y revisión
periódica de la información disponible sobre esta especie.
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nDentro de cualquier plan de gestión es fundamental conocer el tamaño aproximado
de la población y unos mínimos parámetros demográficos (Fuller 1995). La UICN, en el
Manifiesto y Directrices sobre la Conservación del Lobo del Grupo de Expertos en Lobo,
indica en su punto “d” la necesidad de conocer y actualizar el estatus y distribución de la
especie. Dentro de esta línea de investigación, en este estudio se ha prolongado el seguimiento
de poblaciones de lobo ibérico mediante técnicas genéticas no invasivas en el País Vasco y su
entorno durante 2008, continuando así con las investigaciones iniciadas en el año 2003
(Echegaray et al. 2005a, 2008b).
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n II. ANTECEDENTES
El lobo es un depredador emblemático que ha dejado una profunda huella en la
cultura y mitología vascas (Altuna 1971, Barandiarán 1972, Murga 1978), y cuya presencia en
la Comunidad Autónoma del País Vasco está sometida a fuertes variaciones temporales, tanto
en lo que se refiere a número de efectivos como a su área de distribución (Álvarez et al. 1985,
1998), debido principalmente a su conflictividad con la ganadería extensiva de ovino de raza
“latxa” (Sáenz de Buruaga et al. 1994, Echegaray et al. 2005a, Askacibar y Ocio 2006, Vilà y
Echegaray 2007).
El método habitualmente utilizado, en el contexto internacional para estimar las
poblaciones de lobos, consiste en el conteo de grupos familiares y en la evaluación de la
densidad y tamaño de sus poblaciones durante el período otoño-invierno (Barrientos y
Fernández 2002, Mech y Boitani 2003), debido a la mayor cohesión de los grupos en esta
época (Fuller y Snow 1988).
En el País Vasco resulta difícil conocer su tamaño poblacional debido a su elevada
movilidad e inestabilidad espacio-temporal,, como consecuencia de la ecología espacial de la
especie y de la elevada presión humana a la que está sometida.
La búsqueda de indicios es un modo habitual para intentar detectar la presencia y
abundancia de lobos en una zona, pero la existencia de perros asilvestrados, incontrolados o
mastines que acompañan al ganado ovino, puede dificultar en gran manera la identificación de
los indicios. Debido al avance de las técnicas genéticas no invasivas durante la última década,
es posible confirmar la especie que ha depositado un excremento, así como determinar el
tamaño de una población aún cuando su baja densidad, su comportamiento esquivo y la
humanización del medio dificultan su detección directa.
Para estudiar el tamaño de la población de lobos existente en el País Vasco y zonas
limítrofes, Echegaray et al. (2005a, 2008b) analizaron genéticamente excrementos de cánidos Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 11
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nrecogidos en las zonas donde se acumulan los indicios de presencia de la especie para
determinar el número mínimo de lobos que la habitan. Desde 2003 a 2007 se recopilaron r185
muestras fecales susceptibles de ser de lobo en un área de 2700 km2 en el límite nororiental
del área de distribución del lobo en la Península Ibérica. Dichas muestras fueron recogidas a
lo largo de casi 874 kilómetros de itinerarios para registro de indicios. En 159 casos (85% del
total) se pudo identificar la especie, mediante la secuenciación de un fragmento de la región
control del ADN mitocondrial, correspondiendo en 51 casos a lobo (Canis lupus signatus C.,
1908), 8 a zorro (Vulpes vulpes L., 1758) y 68 a perro (Canis familiaris L., 1758).
Mediante el análisis de 20 microsatélites localizados en cromosomas no sexuales y con
datos completos para al menos 12 loci, se detectaron al menos 17 genotipos diferentes que
asociamos a diferentes individuos (Echegaray et al. 2005b, 2007a, 2008b). El número
máximo de genotipos diferenciados con al menos 10 loci fue de 23.
Por otra parte, la presencia de lobo fue detectada en 13 cuadrículas UTM de 100 km2
del País Vasco (11,7% del total; N=111), correspondiendo el 84,6% de las mismas a Álava y
el 15,4% a Vizcaya.
AÑO
Nº MUESTRASFECALES
ESFUERZO (Km)
Nº HECES IDENTIFICADAS
ADNMIT (%)
Nº HECES LOBOS
(%)
Nº HECES PERROS
(%)
Nº HECES ZORROS
(%)
Nº DE LOBOS
DISTINTOS
2003 27 137 10 (37%) 4 (40%) 6 (60%) 0 3
2004 109 553 76 (70%) 27 (35%) 47 (62%) 2 (3%) 13-18
2005 9 34 9 (100%) 6 (67%) 2 (22%) 1 (11%) 2
2006 12 45 9 (75%) 3 (33%) 4 (44%) 3 (33%) 2
2007 28 105 22 (79%) 11 (50%) 9 (41%) 2 (95) 2-3 TOTAL 202 874 159 (79%) 51 (32%) 68 (43%) 8 (55) -
Tabla II.1.
Síntesis de los muestreos genéticos efectuados en el período 2003-2007.
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Figura II.1. Distribución del lobo según los estudios basados en análisis genéticos efectuados en el período 2003-2007.
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n III. OBJETIVOS
Teniendo en cuenta que en los anteriores estudios (Echegaray et al. 2005a, 2008b)
quedó demostrada la imposibilidad de distinguir “a visu” entre los excrementos de lobo y los
de algunos perros en determinadas circunstancias, los objetivos concretos que nos planteamos
para este estudio han sido los siguientes:
- La recolección del mayor número posible de excrementos con tipología
compatible con lobo.
- La identificación de la especie, de las muestras fecales recogidas y la detección
de individuos de lobos durante el año 2008 con técnicas moleculares como
metodología estandarizable no invasiva.
- La caracterización de los excrementos encontrados e identificados en función de
parámetros ambientales y geográficos.
- Estima de la distribución mínima del lobo en la Comunidad Autónoma Vasca
durante el período de estudio.
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n IV. ÁREA DE ESTUDIO.
El área de estudio está situada en el límite nororiental de la distribución del lobo
ibérico (Blanco et al. 2002) y comprende el occidente de la Comunidad Autónoma del País
Vasco, nordeste de Burgos (Castilla y León) y una pequeña parte del sureste de Cantabria
(incluyendo el enclave de Trucíos). Tiene una extensión total de 2.700 km2 (Figura IV.1) e
incluye las comarcas alavesas de Estribaciones de Gorbea, Valles Alaveses y Cantábrica, la
vizcaína de Encartaciones, la burgalesa de Las Merindades y la cántabra de Asón. Esta zona
de estudio fue seleccionada tomando en consideración los datos oficiales de daños al ganado
atribuidos al lobo cedidos por las Diputaciones Forales de Vizcaya y Álava durante el período
1999-2002. Se han añadido zonas adyacentes de otras comunidades autónomas en las que la
presencia de lobo era probable, por tratarse de territorios con las mismas características
naturales y ecológicas.
La distribución de esta superficie corresponde al País Vasco en un 62%, el 35% a
Castilla y León y el 3% a Cantabria. Forma parte de dos regiones biogeográficas:
eurosiberiana y mediterránea. La disposición de la mayor parte de sus sierras acentúa y marca
etapas de transición bioclimáticas entre las anteriores regiones biogeográficas que se reflejan
en la variedad de ecosistemas presentes. La altitud media es de 652 metros, con una máxima
de 1.482 y una mínima de 79 m. Destaca por la heterogeneidad de ambientes producto de la
transformación humana y predomina la superficie ocupada por bosques (46%), tanto de pino
silvestre (Pinus silvestris), haya (Fagus sylvatica), encina (Quercus ilex) y roble marojo
(Quercus pyrenaica), como de coníferas exóticas de repoblación. También aparecen etapas de
degradación de bosques (18%), pastizales en los altiplanos serranos (20%), que albergan una
numerosa cabaña ganadera durante casi todo el año, y fondos de valle dedicados a la
agricultura y ganadería (12%) en los valles aluviales más desarrollados.
Dentro de territorio vasco, el lobo aparece en al menos 13 cuadrículas UTM 10x10
km, de las cuales el 85% (N=11) son alavesas (Echegaray et al. 2005a). El Territorio
Histórico de Álava es la mayor de las provincias que forman la Comunidad Autónoma del
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nPaís Vasco y cuenta con 301.926 habitantes (INE-Anuario Estadístico de España 2007) en
una extensión 3.047 km2, lo que supone una densidad de 99,1 hab/km2. No obstante, la
distribución poblacional es desigual y el 75,4% de sus habitantes se concentra en su capital
Vitoria-Gasteiz. En cambio, el 75% de la superficie con presencia lobuna presentan una
densidad inferior a los 50 hab/km2.
Para una descripción e información mas detallada del área de estudio, consultar
Echegaray et al. (2005a).
Figura IV.1. Localización del área de estudio.
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Figura IV.2. Topografía del área de estudio.
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n
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V. MATERÍAL Y MÉTODOS .
V.1. Muestreos de campo.
La detección de poblaciones en baja densidad es una tarea difícil; en primer lugar por
una sencilla cuestión de azar, pero también porque estos carnívoros territoriales son escasos,
no están adscritos a grupo o manadas estables y dejan entonces, proporcionalmente, menos
indicios que aquellos que viven en densidades normales o elevadas (Rothman y Mech 1979),
dificultades que se incrementan en zonas humanizadas (Ayuso y Vilà 2001).
La utilización actual de métodos genéticos no invasivos representa un considerable
avance para determinar presencia y ausencia real de una especie en numerosas zonas evitando
la subjetividad de la identificación de indicios indirectos (Guzmán 2002). Esta subjetividad se
acentúa en zonas de baja densidad de una especie y donde haya varias especies con un
evidente grado de solapamiento y/o confusión a la hora de identificar y adscribir
específicamente indicios indirectos (huellas y excrementos) de lobo, como atestiguaron
Echegaray et al. (2005a, 2008b)
El trabajo de campo, se ha llevado a cabo a lo largo de 2008 y ha consistido en la
búsqueda de excrementos de cánidos compatibles por sus características con los de lobo, en
recorridos prefijados no sistemáticos en zonas donde la probabilidad de detección de muestras
fecales fuera mayor según la información previa disponible (Echegaray et al. 2005a, 2008b).
Así, se han realizado transectos por caminos, pistas y cortafuegos que transcurren por los ejes
de las sierras, revisándose collados y cruces de caminos que constituyen lugares querenciosos
para el marcaje de los lobos (Llaneza 1996). Aunque Echegaray et al. (2005a) demuestran que
los excrementos de lobo y perro no son indiferenciables a visu por las características y
contenido de los mismos en el área de estudio, hemos utilizado preferentemente los criterios
empleados por Balmori et al (2000) a la hora de la asignación de excrementos de lobo frente a
los de otros cánidos. El esfuerzo en los muestreos de campo de este trabajo ha sido dirigido
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nhacia aquellos lugares donde la probablidad del hallazgo de excrementos de lobo era mayor,
seleccionando preferentemente las zonas donde Echegaray et al. (2008b) detectaron más
muestras fecales y ejemplares de lobos.
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n V.2. Recolección, caracterización y conservación
de las muestras fecales.
Como acabamos de mencionar, las muestras fecales han sido recogidas en el campo
durante la realización de los itinerarios de muestreo, por personal instruido, que siguió
meticulosamente un protocolo previamente establecido, para evitar contaminaciones y
asegurar el “buen estado de conservación” de las muestras de ADN, así como la propia
seguridad de los investigadores. Para la recogida de heces evitando contaminaciones y
problemas sanitarios, se utilizaron guantes de látex y bolsas de congelados desechables, así
como mascarillas.
Cada excremento recogido se individualizaba en bolsas herméticas, y se etiquetaba
convenientemente para su identificación y localización. Para cada muestra se rellenaba una
ficha con los siguientes campos:
• Autor: identificación del recolector
• Fecha: según el modelo día, mes y año (mm.dd.aaaa)
• Estación: Se agruparon los registros según las estaciones naturales.
o Primavera
o Verano
o Otoño
o Invierno.
• Coordenadas: Se registraban las coordenadas UTM con el Sistema de
Posicionamiento Global (Global Positioning System, G.P.S.).
• Altitud: En metros sobre el nivel del mar registrados con GPS. Después, los
datos se agruparon para un mejor análisis según unas categorías establecidas
en función de las cotas altitudinales existentes en el área de estudio:
o Menos de 800 metros
o Entre 800 y 1.000 metros
o Más de 1.000 metros.
• Vegetación: Según las siguientes categorías de vegetación predominante:
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no HAY: hayedo
o ENC: encinar
o PSI: pinar de pino silvestre
o MAT: matorral
o PAS: pastizal montano
o CUL: cultivos
o MEPR: melojar y pinar de repoblación
o ENPS: encinar y pinar silvestre
o PRPAS: pinar de repoblación y pastizal
o MEPS: melojar y pinar silvestre
o QUE: quejigal
o OTROS: indicando cuales.
• Antigüedad: Con la lógica prudencia que una variable de este tipo implica al
tratarse de un carácter subjetivo y orientativo, las muestras fecales se
clasificaron según las siguientes categorías:
o Muy reciente: Menos de 1 día.
o Reciente: Más de 1 día, pero aún con materia orgánica en
descomposición.
o Vieja: Secos y sin materia orgánica en descomposición.
• Localización/Emplazamiento: Según las siguientes categorías:
o Pistas forestales.
o Senderos.
o Otros: indicando cuales.
• Ubicación: Se clasificaron según fueran hallados en el Centro, los Laterales
(márgenes) o en los Cruces (intersecciones) de las pistas forestales, caminos
o senderos.
• Elevación de la deposición: los excrementos se clasificaron según estuvieran
depositados al nivel del suelo o en algún tipo de elevación (sobre plantas,
montículo del terreno, piedras, troncos, etc.).
INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
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n • Componentes: Según un examen a visu, los componentes de cada
excremento fueron caracterizados según su naturaleza:
o Indeterminado: su composición es desconocida.
o Pelos.
o Huesos y/u otros componentes de carácter oseo o queratinoso
(pezuñas).
o Vegetales.
o Combinaciones de elementos anteriores.
• Tipo de contenido: Según se observaran a simple vista componentes
pertenecientes a las tres categorías siguientes: Silvestre (ungulados silvestres
como el corzo, etc.), Doméstico (reses de ganado) e Indeterminado
(desconocido).
Los datos recogidos en el campo se trasladan a una base de datos informática para su
posterior tratamiento estadístico.
Todas las muestras (excrementos y tejidos) se conservaron en etanol 96% hasta su
procesamiento en el laboratorio y se almacenaron en un congelador a -20º C.
Cada muestra fecal se dividió en dos porciones. Una pequeña parte de ellas pasó a
ser llevada al Departamento de Biología Evolutivo de la Universidad de Uppsala (Suecia),
para la realización del análisis molecular y la otra quedó como reserva en congelación para
poder repetir los análisis oportunos en caso de que fuera necesario.
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nV.3. Análisis de laboratorio.
V.3.1. Extracción de ADN de heces.
La extracción de ADN a partir de excrementos es posible gracias a las células
epiteliales que se desprenden y se adhieren a los excrementos al pasar por el intestino (Hoss et
al. 1992).
Para estas extracciones se han utilizado los equipos QIAamp® DNA Stool Mini Kits
de la casa QIAGEN, siguiendo las instrucciones establecidas por los fabricantes.
A un trozo de excremento de entre 180-220 mg se le añade 1,6 ml de buffer o
soluciones tampón de extracción ASL que sirven para desnaturalizar las proteínas celulares, y
se agita en vortex hasta que la muestra se homogenice aproximadamente durante un minuto.
Se centrifuga a 13.000 revoluciones por minuto (rpm) durante un minuto para desagregar las
partículas.
Se transfiere 1,4 ml de lo sobrenadante y se le añade una pastilla de InhibitEX, para
permitir que los inhibidores de las reacciones de PCR absorban la matriz de InhibitEX. Se
agita en vortex y la suspensión resultante se deja un minuto a temperatura ambiente y en
reposo. Posteriormente se centrifuga a 13.000 rpm durante tres minutos, se extrae lo
sobrenadante y se vuelve a centrifugar durante otros tres minutos a más de 13.000 rpm. Se
extrae una alícuota de 600 µl y se añade 25 µl de proteinasa K para su digestión enzimática, y
se mezcla agitándola convenientemente hasta que la solución se homogenice.
La disolución resultante es sometida a incubación a 70ºC durante diez minutos, se
agita y se añaden 600 µl de etanol 95%. Se vuelve a agitar convenientemente y se centrifuga a
alta velocidad (13.000 rpm) durante un minuto.
El extracto obtenido pasará ahora por un proceso por triplicado de limpieza a través
de unos tubos con columnas de purificación de productos de PCR (QIAkick de QIAGEN)
para eliminar mayor cantidad de inhibidores enzimáticos que impidan la amplificación de
ADN durante la PCR. Para ello, se extrae tres alícuotas del producto sobrenadante resultado
de otras tantas centrifugaciones de un minuto de duración.
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MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 27 8
n Posteriormente, se añaden 500 µl de dos buffers (AW1 y AW2) en una doble etapa
de limpieza, centrifugando uno y tres minutos respectivamente. Por último, el producto final,
que sumará unos 1,6 ml, se centrifuga durante un minuto más, y se le añade 200 µl de un
buffer AE de lavado, que se someterá a la última centrifugación de 1 minuto, cuyo precipitado
será el extracto final de la extracción. Se incluye un control negativo, que es tratado de la
misma manera que el resto de tubos con excrementos, pero en este caso sin excremento, para
detectar las contaminaciones por ADN extraño durante la extracción.
Fueron realizadas al menos dos extracciones independientes por cada muestra fecal.
V.3.2. Ampliación de ADN: PCR (Reacción en cadena por la polimerasa).
Para comprobar si las extracciones realizadas fueron positivas, se procedió a la
amplificación por PCR. La PCR es una técnica in vitro (Mullis y Faloona 1987) basada en
una reacción en cadena por la enzima polimerasa que permite producir importantes cantidades
de ADN a partir de muestras que sólo contienen pequeñas cantidades de ADN. En el caso de
muestras biológicas con escasa cantidad de ADN o elevada contaminación, este proceso es
altamente importante porque ya se parte de cantidades ínfimas de ADN extraído.
Para este proceso se utilizan cebadores o “primers” descritos por Vilà et al. (2003),
que son secuencias perfectamente definidas de ADN, con longitudes 20 a 30 nucleótidos que
coinciden con los extremos de la secuencia deseada. Cada uno de ellos es complementario con
una de las dos hebras del ADN problema. La reacción tiene tres etapas:
1. Desnaturalización o separación de las dos cadenas de la doble hélice de
ADN; se efectúa en un corto período de tiempo a temperatura elevada.
2. Los cebadores se hibridan específicamente con la secuencia correspondiente
de las hebras de ADN sencillas, a temperatura más baja.
3. La ADN polimerasa, en presencia de los desoxirribonucleótidos trifosfato
(dNTP) alarga los cebadores sintetizando una secuencia complementaria al
ADN problema.
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28 Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 8
nLos cebadores utilizados para esta amplificación han permitido construir secuencias
superpuestas de fragmentos de la región control del ADN mitocondrial de un cierto número
de nucleótidos (ver Tabla V.3.2.1) necesarios para poder identificar inequívocamente
secuencias de lobos y perros, por su divergencia genética en tiempo reciente, evolutivamente
hablando.
Primer Secuencia (5´-3´) Primer Secuencia (5´-3´) Fragmento (bp)
Thr L CAATTCCCCGGTCTTGTAAACC DL H CCTGAAGTAGGAACCAGATG 470
Tabla V.3.2.1. Secuencia de los cebadores o primers utilizados y de los fragmentos de ADN mitocondrial amplificados para la
identificación específica.
Para la realización de las PCRs se utilizaron termocicladores (PCT 225 DNA Engine
Tetrad, PCT 100 Perkin Elmer), cuya función es amplificar ADN mediante ciclos combinados
a diferentes temperaturas para desnaturalizar las hebras de ADN, activar la replicación y la
enzima polimerasa clave en la reacción. Todo el proceso se realiza automáticamente.
Las polimerasas que se utilizan son enzimas que actúan a temperaturas muy elevadas
como ocurre durante la desnaturalización. En nuestro caso fue la HotStarTaq (Qiagen).
Los parámetros de temperatura (ciclos, temperatura de anillamiento), concentración
de los reactivos (magnesio, agua, etc.), volumen de ADN de la muestra y de la disolución
problema), número y duración de los ciclos, fueron modificados, ensayados y optimizados
para obtener un mayor rendimiento y una mayor especificidad de la reacción de PCR.
Las amplificaciones se realizaron en un volumen final 10 µl de disolución acuosa
usando: 0,2 mM dNTP (PCR Nucleotide Mix), 1x PCR buffer HotStar (Qiagen), 25 mM Mg
Cl2, 10 µM del primer “forward”, 10 µM del primer “reverse”, 0,5 U/µl HotStarTaq
polimerasa (Qiagen), y 2 µl de extracto biológico de la muestra problema. Se incluyó un
control negativo, que es tratado de la misma manera que el resto de tubos, pero en este caso
sin muestra biológica, para detectar las contaminaciones por ADN extraño durante la
amplificación.
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MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 29 8
n En caso de contaminación, los productos de PCR resultante no son fiables y son
descartados. También se añadió un control positivo, que como en el caso del control negativo,
es tratado de la misma manera que el resto, pero con una muestra biológica de lobo conocida
a priori y de elevada concentración de ADN, para detectar el éxito del proceso de
amplificación de ADN de la reacción de PCR.
Se emplearon ciclos combinados con un primer proceso de desnaturalización de 95ºC
durante 7-15 minutos, 95ºC, un minuto, entre 50 y 57ºC durante 2 minutos, 35 ciclos de 72ºC
durante un minuto y medio, y 72ºC durante 10 minutos, seguidos de una extensión final de
4ºC.
Los productos de la PCR se hicieron migrar mediante electroforesis durante 30
minutos y a 90 Voltios de intensidad de corriente continua, en geles de azarosa (1-2%) usando
marcadores de tamaño de 100 nucleótidos DNA Ladder (Promega, Madison, WI).
Posteriormente se lavaron en bromuro de etidio y se visualizaron con un escáner de luz UV
para comprobar el éxito de dicha reacción.
Las muestras que resultaron amplificadas positivamente se seleccionaron y se
conservaron en congeladores de -20ºC para posteriores tratamientos.
Posteriormente, los productos de la PCR se trataron para la eliminación de los
cebadores y dNTPs no deseados cara a la secuenciación, mediante los QIAQuick PCR
Purification Kits de QIAGEN (ExoSAP-IT™ PCR Purification Kit y DYEnamic™ ET
Terminator Cycle Sequencing Kit), siguiendo las instrucciones de los fabricantes.
V.3.3. Secuenciación de ADN. Todos los productos de amplificación de ADN se secuenciaron en la MegaBACETM
1000 (Amersham Biosciences), que usa un sistema de detección de ADN de 96 capilares.
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nMEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
Figura V.3.3.1.
Ejemplo de una secuencia de ADN mitocondrial de 30 bp de la muestra fecal denominada 74.
Figura V.3.3.2. Ejemplo de una secuencia de ADN mitocondrial de 40 bp de la muestra fecal denominada I02, en la cual se
puede comprobar la contaminación existente, lo cual hace difícil la lectura e interpretación de dicha secuencia para su identificación.
30 Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea
8
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MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
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n V.3.4. Identificación de especie.
Las secuencias parciales del citocromo b y/o la región D-loop de la región control
mitocondrial de las muestras biológicas objeto de estudio se ordenaron y se alinearon
mediante el programa SequencherTM 4.1 (Gene Code Corporation, Inc.).
Para la identificación de esas secuencias de adscripción específica indeterminada, se
emplearon secuencias de perros y lobos de referencia (Vilà et al. 1999, C. Vilà, datos
propios), con la ayuda del programa PAUP 4.0 b10 (Swofford 2002) y de las secuencias
homólogas disponibles de cánidos de una base de datos pública (Gene Bank), a través de la
función BLAST 2.0 en la web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.
Esto nos ha permitido conocer la identidad de la especie de la que procede la muestra
por porcentajes de similitud.
2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
32 Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 8
nV.4. Análisis de datos.
Utilizamos el Sistema de Información Geográfica ArcGIS.9 para el análisis de datos
geográficos así como para el cálculo de las distintas variables y categorías seleccionadas.
Hemos utilizado distintos tipos de cartografía digital como los mapas de vegetación de la
Comunidad Autónoma del País Vasco a escala 1:25.000, las hojas de los mapas topográficos
del área de estudio correspondientes a Álava y Vizcaya escala 1:10.000, y los mapas de
Cultivos y Aprovechamientos del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación.
Para el análisis de los datos genéticos se ha utilizado el programa Microsatellite
Toolkit para Microsoft Excel (Park 2001).
No se ha efectuado ningún tipo de caracterización de la variabilidad genética debido
a que estos análisis requieren el estudio de poblaciones y no de individuos, lo cual significa
un tamaño de muestra significativamente mayor que el obtenido en el presente estudio
Para el análisis estadístico de los datos se ha empleado el programa estadístico SPSS
versión 15.0.
Para comprobar la normalidad de las variables cuantitativas se realizó el test de
Kolmogorov-Smirnov (Sokal y Rohlf 1969). Para analizar las posibles relaciones entre
variables y teniendo evidencias en contra de la normalidad, aplicamos el coeficiente de
correlación de Spearman.
Se utilizó la prueba chi cuadrado para el análisis de las frecuencias y de las
relaciones entre las variables categóricas. La significación se calculó a partir de la técnica de
Monte Carlo, que permite simular 10.000 muestras aleatorias con igual distribución que la
dada y obtener una significación promedio mucho más exacta y con un intervalo de confianza
del 99%.
INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 33 8
VI.1. Caracterización de las muestras. El material biológico recopilado y objeto de análisis en este trabajo está constituido
por 26 excrementos, con tipología propia de la especie objeto de estudio.
Como resultado de los transectos no sistemáticos efectuados, se han recorrido 123,2
kilómetros y se han recogido 26 excrementos, lo cual supone una media de un excremento
cada 4,74 kilómetros recorridos y un IKA de 0,21 excrementos/km.
Hemos muestreado todas las cuadrículas del área de estudio, aunque con esfuerzos
muy dispares. La media ha sido de 4,56 kilómetros prospectados por cuadrícula.
Hemos conseguido recoger muestras de 8 de las 27 cuadrículas que forman el área de
estudio (29,6%; N=27). En la tabla siguiente se muestra las frecuencias de muesttras
recogidas en las 27 cuadrículas objeto de estudio.
Nº de muestras
Frecuencia cuadrícula Porcentaje
0 19 70,4 1 2 7,4 2 3 11,1 5 1 3,7 6 1 3,7 7 1 3,7
Total 27 100,0
VI. RESULTADOS .
Tabla VI.1.1
Frecuencia de las muestras recogidas en las 27 cuadrículas UTM de 10x10 km, del área de estudio.
2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
nSe ha apreciado una correlación moderada entre los kilómetros recorridos en cada
cuadrícula UTM de 10 km de lado y el número de muestras recogidas (rs =0,645; p= 0,000).
CUADRÍCULA KM RECORRIDOS NÚMERO DE EXCREMENTOS
VN57 1,5 0
VN67 2,0 0
VN68 1,6 0
VN74 2,39 0
VN75 6,50 6
VN76 4,64 1
VN77 6,91 0
VN78 5,99 0
VN84 11,6 2
VN85 8,32 2
VN86 7,12 5
VN87 4,45 0
VN88 9,65 0
VN93 2,78 0
VN94 1,98 0
VN95 10,0 7
VN96 4,68 0
VN97 3,12 0
WN03 2,75 0
WN04 4,87 2
WN05 5,82 1
WN06 2,70 0
WN14 1,54 0
WN15 0,87 0
WN16 2,43 0
WN25 1,24 0
WN26 5,75 0
TOTAL 123,2 26
Tabla VI.1.2.
Kilómetros recorridos y muestras recogidas en cada una de las cuadrículas estudiadas.
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INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n
De 1 a 2 km De 2 a 5 km
De 5 a 10 km
> 10 km
Figura VI.1.1. Esfuerzo de muestreo en cada una de las cuadrículas UTM de 10x10 km del área de estudio.
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2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
n
Cantabria Burgos Álava Vizcaya
Área de estudio Muestras recogidas en 2008
Figura VI.1.2. Localización de las muestras recogidas durante el año 2008.
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MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS. 2008
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea
n
0 Excrementos
1 Excremento
De 2 a 3 Excrementos
De 3 a 5 Excrementos
> 5 Excrementos
Figura VI.1.3. Categorización de las cuadrículas según los excrementos recogidos
37 8
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nLa distribución mensual de las 26 muestras recogidas durante el periodo de estudio se
ha reflejado en la tabla siguiente. Puede observarse que los meses con más excrementos
recogidos han sido Agosto (38,5%), Mayo (15,4%) y Abril (11,5%).
MES 2008 %
Enero 1 3,9
Febrero 2 7,7
Marzo 1 3,9
Abril 3 11,5
Mayo 4 15,4
Junio 1 3,9
Julio 3 11,5
Agosto 10 38,5
Noviembre 1 3,9
Total 26 100
Tabla VI.1.3.
Distribución mensual de los excrementos recogidos en 2008.
En cuanto a la altitud, 15 excrementos (57,7%; N=26), fueron recogidos en altitudes
comprendidas entre los 800 y 1.000 metros y 10 (38,5%) a menos de 800 metros. La muestra
fecal restante (3,8%) fue recogida a más de 1.000 m.
Entre los distintos tipos de vegetación prospectados, donde más excrementos se
recogieron, fue en las formaciones de pastizales montanos, en concreto 8 (30,8%; N=26),
seguido de formaciones arbustivas y quejigales, con 5 heces cada una de ellas (19,2%). Tanto
en encinares (Quercus ilex ballota) como en zonas cultivadas, se han recopilado 2 muestras
(7,7%). El resto se ha repartido entre formaciones mixtas de roble melojo (Quercus
pyrenaica), pinos silvestres (Pinus silvestris) y plantaciones de coníferas exóticas
En lo que atañe a la antigüedad, la mitad de los excrementos fueron considerados
como Recientes, el 46,2% como Viejos y sólo el 3,8% de los excrementos fueron clasificados
como Muy Recientes.
Los itinerarios han sido realizados preferentemente a lo largo de pistas forestales
puesto que en ellas es más factible la localización de excrementos atribuidos al lobo. Es por
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MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n ello que el 88,5% de los excrementos han sido localizados en ese tipo de vías, el 7,7% en
carreteras y tan sólo el 3,8% en senderos. En lo que se refiere a la ubicación de los
excrementos, un total de 11 muestras fueron recogidas tanto en los márgenes de las pistas
como en el centro de las mismas (42,3%; N=26). Las 4 restantes fueron halladas en cruces de
pistas (15,4%).
También es de destacar que solamente 4 muestras fecales fueron localizadas en
lugares con una cierta elevación en cuanto a su deposición (15,4%; N=26). De ellos, todos se
situaban a menos de 5 cm. En cuanto al sustrato sobre el que se elevaban, 3 se encontraban
sobre plantas (75%; N=4) y 1 sobre otros sustratos (25%; N=4).
En el examen a visu de los excrementos se observaron como componentes
principales la combinación de pelos y huesos con pezuñas en el 46,2% (N=26) y únicamente
pelos en el 26,9% de los casos. La combinación de pelos con vegetales, pelos con hueso y
pezuñas y vegetales, así como la imposibilidad de determinación a visu de componente
alguno se produjo en el 7,7% de los casos. La aparición de heces con únicamente huesos y
pezuñas como elementos principales se da en el 3,8% de los casos.
También a visu se estableció que en el 46,2% de los casos (N=26) no se pudo
determinar si los componentes de los excrementos (a partir de pelos, fundamentalmente) eran
presas silvestres o ganado doméstico. Las presas silvestres aparecieron en el 23,1% de los
casos mientras que restos de ganado doméstico fueron identificados en el 30,8% de las heces.
El corzo fue el tipo de presa silvestre encontrado con más frecuencia (80% de los casos) y lo
hizo en el 19,2% del total de excrementos recogidos (N=26).
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 39 8
2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
nVI.2. Identificación de la especie.
En la secuenciación de su ADN mitocondrial, se ha obtenido el resultado positivo de
identificación de la especie en el 96,1% de los casos (N=26), tan sólo en una muestra no se
pudo identificar la especie. Todas las muestras fecales identificadas pertenecieron a especies
de la familia Canidae. De ellas, 14 correspondieron a lobo ibérico (Canis lupus), 6 a perro
(Canis familiaris) y 5 a zorro (Vulpes vulpes).
Especie Muestras %
Lobo 14 56
Perro 6 24
Zorro 5 20
Total 25 100
Tabla VI.2.1. Distribución de número y de porcentajes de las muestras según la especie identificada con secuencias de ADN
mitocondrial.
En las muestras fecales de lobo identificados se han encontrado dos haplotipos
distintos (lu1 y lu4), lo cual constituye un hecho relevante y novedoso en estos análisis de
ADN mitocondrial, puesto que Echegaray et al. (2005a, 2008b) encontraron un único perfil
genético, que constituye uno de los dos más frecuentes de la Península Ibérica (Vilà et al.
1999).
Estos resultados se pueden apreciar en el mapa de la figura VI.2.1, donde se constata
la presencia inequívoca de lobos en al menos 5 cuadrículas UTM de 10x10 km, lo que supone
el 185% del área de estudio (N=27).
De las cinco cuadrículas con presencia de lobo, cuatro tienen parte total o parcial de
su ámbito geográfico en Álava y la otra restante se localiza fuera del ámbito geográfico de la
CAPV.
Los seis excrementos asignados a perro según los análisis se han localizado en 4
cuadrículas del área de estudio (14,8%; N=27).
40 Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 8
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MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n Por último, los cinco excrementos de zorro se han localizado en 3 cuadrículas UTM
del área de estudio (11,1%; N=27), una en la provincia de Burgos y dos en Álava.
Figura VI.2.1. Localización de los excrementos recogidos que han correspondido a lobo (Canis lupus).
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 41 8
INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA 2008 COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
nMEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
Figura VI.2.2. Localización de los excrementos recogidos que han correspondido a perro (en negro) y zorro (en rojo).
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MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n VI.3. Caracterización de los excrementos identificados y comparación entre especies.
Distribución mensual: observamos que en los meses de marzo y junio, todas las
muestras recogidas e identificadas correspondieron al lobo. En el mes de agosto, mes con más
muestras recogidas e identificadas, el porcentaje de muestras correspondientes a lobo es del
67% y es el mes en el que se recogen el 36% de todas las muestras y el 42,9% de las de lobo.
En enero y noviembre, la única muestra identificada correspondió a perro y las únicas dos
muestras identificada del mes de abril, correspondieron a zorro. No se observaron diferencias
significativas (χ2=18,350; gl=16; p=0,304), ni cuando las muestras de zorro se eliminan del
análisis (χ2=6,508; gl=7; p=0,482).
LOBO PERRO ZORRO TOTAL
N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % ** Enero - - - 1 16,6 100 - - - 1 4
Febrero - - - - - - 2 40 100 2 8
Marzo 1 7,1 100 - - - - - - 1 4
Abril 2 14,2 67 - - - 1 20 33 3 12
Mayo 2 14,2 50 1 16,6 25 1 20 25 4 16
Junio 1 7,1 100 - - - - - - 1 4
Julio 2 14,2 67 1 16,6 33 - - - 3 12
Agosto 6 42,6 66,6 2 33,3 22,2 1 20 11,1 9 36
Noviembre - - - 1 16,6 100 - - - 1 4
TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100
Tabla VI.3.1.
Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y el mes en el que fueron recogidas (* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de mes).
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 43 8
2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
n
44 Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 8
Gráfico VI.3.1. Distribución comparativa de los porcentajes de mes de las muestras según la especie identificada
Distribución estacional: De todas las muestras recogidas en Verano, el 75%
correspondían a lobo y de las recogidas en Primavera, el 57,1%. En Otoño no se recoge
ninguna muestra de lobo y en Invierno, la mayor parte de las recogidas fueron de perro y de
zorro.
No se han encontrado diferencias estadísticamente significativas en la comparación
por especies y estaciones (χ2=8,25; gl=6; p=0,220), ni cuando solamente comparamos perro y
lobo (χ2=5,224; gl=3; p=0,156).
Tabla VI.3.2
Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y la estación en la que fueron recogidas (* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de estación).
ALTITUD LOBO PERRO ZORRO TOTAL
N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % ** Primavera 4 28,5 57,1 1 16,7 14,3 2 40 28,6 7 28
Verano 9 64,3 75 2 33,3 16,6 1 20 8,3 12 48
Otoño - - - 1 16,7 100 - - - 1 4
Invierno 1 7,2 20 2 33,3 40 2 40 40 5 20
TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100
0255075
100
Enero
Febrer
o
MarzoAbril
MayoJunio
Julio
Agosto
Noviembre
% d
e es
peci
e
Lobo Perro Zorro
INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n
0
25
50
75
100
Primavera Verano Otoño Invierno
% d
e es
peci
e
Lobo Perro Zorro
Gráfico VI.3.2.
Distribución comparativa de los porcentajes de estación de las muestras para las distintas especies identificadas.
Distibución altitudinal: Los excrementos de lobo, perro y zorro se han encontrado a
una altitud media de 813,3 metros (DS=92,3; Max.=939; Min.=705), 802,2 m. (DS=201,6;
Max.=1.090; Min.=561) y 867,8 m. (DS=57,8; Max.=949; Min.=802), respectivamente. Las
muestras de lobo se encontraron en cotas altitudinales inferiores a los 1.000 m, las de perro
aparecen repartidas en las tres categorías, aunque el 50% se localiza entre 800 y 1.000 m. Por
otra parte, las heces de zorro aparecen entre 800 y 1.000 m. El único excremento recogido a
más de 1.000 m correspondia a perro. No obstante, estas diferencias no resultan significatívas
(χ2=8,486; gl=4; p=0,075) y tampoco cuando eliminamos del análisis al zorro (χ2=6,707;
gl=2; p=0,035).
ALTITUD LOBO PERRO ZORRO TOTAL
N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % **
< 800 m 7 50 77,8 2 33,3 22,2 - - - 9 36
800-1.000 m 7 50 46,7 3 50 20 5 100 33,3 15 60
> 1.000 m - - - 1 16,7 100 - - - 1 4
TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100
Tabla VI.3.3 Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y
la altitud donde fueron localizadas (* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de altitud).
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 45 8
2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
n
0
25
50
75
100
< 800 m 800-1.000 m > 1.000 m
% d
e es
peec
ie
Lobo Perro Zorro
Gráfico VI.3.3.
Distribución comparativa de los porcentajes de altitud de las muestras para las distintas especies identificadas.
En cuanto a los tipos de vegetación, los únicos tipos donde encontramos a las tres
especies son en el matorral y en pastizal montano y es en este último donde las muestras de
lobo sobresalen. Los hábitats donde el número de muestras de lobo es mayor que el de los
otros cánidos es en el quejigal, en el melojar con pino y en el pastizal. No se encuentran
muestras de lobo ni en los cultivos ni en los encinares. Podemos resaltar que los excrementos
asignados a lobo aparecen distribuidos entre más tipos de vegetación que los de zorro o perro.
Las muestras de perro aparecen distribuidas en matorrales, cultivos y pastizales
mientras que las de aparecen en casi todos los tipos salvo en los cultivos, quejigales y
melojares. No obstante, las diferencias no han sido significativas (χ2=18,098; gl=14;
p=0,202). Tampoco se han observado diferencias significativas (χ2=8,435; gl=6; p=0,208) en
la comparación entre lobos y perros.
46 Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 8
INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n
VEGETACIÓN LOBO PERRO ZORRO TOTAL
N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % **
MAT 2 14,3 40 2 33,3 40 1 20 20 5 20
CUL - - - 2 33,3 100 - - - 2 8
ENC 1 7,1 50 - - - 1 20 50 2 8
QUE 4 28,6 100 - - - - - - 4 16
MEPR 1 7,1 100 - - - - - - 1 4
ENCPS - - - - - - 1 20 100 1 4
PAS 5 35,7 62,5 2 33,3 25 1 20 12,5 8 32
MEPS 1 7,1 50 - 1 20 50 2 8
TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100
Tabla VI.3.4. Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y
el tipo de vegetación donde fueron localizadas (* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de tipo de vegetación).
0
2550
75100
MAT CUL ENC QUE MEPR ENCPS PAS MEPS
% d
e es
peci
e
Lobo Perro Zorro
Gráfico VI.3.4.
Distribución comparativa de los porcentajes de tipo de vegetación de las muestras para las distintas especies identificadas.
En lo que respecta a la antigüedad de los excrementos, podemos observar que el
único excremento recogido como “muy reciente” fue identificado genéticamente como lobo, y
que en las otras dos categorías analizadas, los porcentajes son claramente superiores en el
caso de los lobos que en los de perros y zorros. No se encontraron diferencias significativas
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 47 8
2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
ncomparando las tres especies (χ2=1,796; gl=4; p=0,773), ni tampoco si efectuamos dicha
comparación entre lobos y perros exclusivamente (χ2=1,164; gl=2; p=0,559).
ANTIGÜEDAD LOBO PERRO ZORRO TOTAL
N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % **
Muy reciente 1 7,1 100 - - - - - - 1 4
Reciente 7 50 58,3 2 33,3 16,7 3 60 25 12 48
Vieja 6 42,9 50 4 66,7 33,3 2 40 16,7 12 48
TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100
Tabla VI.3.5.
Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y la antigüedad que tenían al ser recogidas
(* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de antigüedad).
0
25
50
75
100
Muy reciente < 1 día Reciente < 7 días Vieja > 7 días
% d
e es
peci
e
Lobo Perro Zorro
Gráfico VI.3.5.
Distribución comparativa de los porcentajes de antiguedad de las muestras para las distintas especies identificadas.
En cuanto al emplazamiento, esta variable no es relevante ya que el grueos de las
muestreos se ha realizado en pistas. No se observan diferencias estadísticamente significativas
(χ2=4,843; gl=4; p=0,304). Ni tampoco cuando se elimina del análisis al zorro (χ2=3,193;
gl=2; p=0,203).
48 Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 8
INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n
EMPLAZAMIENTO LOBO PERRO ZORRO TOTAL
N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % **
Pistas forestales 12 85,7 54,4 5 83,3 22,2 5 100 22,2 22 88
Otros 2 14,3 66,7 1 16,7 33,3 - - - 3 12
TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100
Tabla VI.3.6.
Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y el emplazamiento en el que fueron localizadas
(* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de Emplazamiento).
0
25
50
75
100
Pistas Otros
% d
e es
peci
e
Lobo Perro Zorro
Gráfico VI.3.6. Distribución comparativa de los porcentajes de emplazamiento de las muestras para las distintas especies
identificadas.
En lo que respecta a la ubicación de las muestras, la mayor parte de los excrementos
recogidos en los “cruces de caminos” corresponden a lobos, en menor cantidad a perros y
ninguno correspondía al zorro. De los encontrados en la sección “Central” y en los “laterales
de los caminos”, aunque también mayoritariamente son de lobo, las diferencias son menores.
A pesar de ello, estas diferencias no han resultado significativas (χ2=1,724; gl=4; p=0,786), ni
comparando lobo y perro solamente (χ2=0,357; gl=2; p=0,836).
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 49 8
2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
nUBICACIÓN
LOBO PERRO ZORRO TOTAL
N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % **
Laterales 5 35,7 50 3 50 30 2 40 20 10 40
Centro 6 46,1 54,4 2 33,3 18,3 3 60 27,3 11 44
Cruces 3 30,8 75 1 16,7 25 - - - 4 16
TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100
Tabla VI.3.7.
Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y la ubicación en la que fueron localizadas
(* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de Ubicación).
0
25
50
75
100
Laterales Centro Cruces
% d
e es
peci
e
Lobo Perro Zorro
Gráfico VI.3.7.
Distribución comparativa de los porcentajes de ubicación de las muestras para las distintas especies identificadas.
En la variable elevación de la deposición, observamos que casi el 86% de los
excrementos de lobo, no estaban depositados sobre ningún tipo de elevación y únicamente el
14,3% restante se hallaba sobre plantas. En el caso de los perros y zorros un 16,7% y un 20%
estaban sobreelevados, respectivamente. No hemos encontrado ninguna muestra fecal sobre
sustrato rocoso. La mitad de las muestras encontradas sobreelevadas correspondía a lobo.
Tampoco hemos observado diferencias significativas (χ2=0,092; gl=2; p=0,955) en el análisis
comparativo.
50 Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 8
INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n ELEVACIÓN
DEPOSICIÓN
LOBO PERRO ZORRO TOTAL
N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % **
Si 2 14,3 50 1 16,7 25 1 20 25 4 16
No 12 85,7 57,1 5 83,3 23,8 4 80 19,1 21 84
TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100
Tabla VI.3.8.
Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y la elevación de la deposición
(* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de Elevación).
0
25
50
75
100
Si No
% d
e es
peci
e
Lobo Perro Zorro
Gráfico VI.3.8.
Distribución comparativa de los porcentajes de elevación de la deposición de las muestras para las distintas especies identificadas.
En cuanto al tipo de sustrato sobre el que se localizaban los excrementos
sobreelevados tampoco se encuentran diferencias significativas, ni entre las tres especies
(χ2=4,229; gl=4; p=0,376), ni comparando exclusivamente lobo y perro (χ2=3,193; gl=2;
p=0,203). Además, tampoco se observan diferencias estadísticamente significativas cuando se
comparan las diferentes magnitudes de elevación en cm (χ2=0,19; gl=1; p=0,891) para el caso
de lobos y perros.
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 51 8
2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
n
52 Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 8
Tabla VI.3.9.
Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y el sustrato sobre el que se elevaban
(* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de Tipo de elevación).
Gráfico VI.3.9.
Distribución comparativa de los porcentajes de tipo de elevación de las muestras para las distintas especies identificadas.
Entre los componentes identificados “a visu”, de los excrementos, hemos encontrado
que en las muestras correspondientes a lobo, un 28,6% tenían sólo pelos y un 57,2% pelos y
huesos/pezuñas, lo cual supone casi el 86% del total de las heces correspondientes a esta
especie.
La combinación de pelos y vegetales solo se manifiesta en las muestras de lobos y
zorros, y la incertidumbre en cuanto a los componentes se observa por igual en el 7,1% de las
muestras de lobos y perros. En las tres especies encontramos excrementos con sólo pelos y
excrementos con pelos, huesos y pezuñas. Pero, las diferencias encontradas no han resultado
significativas (χ2=8,988; gl=10; p=0,533), ni cuando se elimina al zorro del análisis (χ2=6,19;
gl=5; p=0,288).
TIPO DE ELEVACIÓN
LOBO PERRO ZORRO TOTAL
N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % **
Plantas 2 100 66,7 - - - 1 100 23,3 3 75
Otros - - - 1 100 100 - - - 1 25
TOTAL 2 100 1 100 1 100 4 100
0
25
50
75
100
Plantas Otros
% d
e e
spec
ie
Lobo Perro Zorro
INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n
COMPONENTES LOBO PERRO ZORRO TOTAL
N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % **
Huesos/pezuñas - - - 1 16,7 100 - - - 1 4
Pelos 4 28,6 66,7 1 16,7 16,7 1 20 16,7 6 24
Pelos y huesos/pezuñas 8 57,2 66,7 2 33,3 16,7 2 40 16,7 12 48
Pelos y vegetales 1 7,1 50 - - - 1 20 50 2 8
Pelos y vegetal y huesos/pezuñas - - - 1 16,7 50 1 20 50 2 8
Indeterminado 1 7,1 50 1 16,7 50 - - - 2 8
TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100
Tabla VI.3.10. Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y
los restos encontrados en los excrementos o Componentes. (* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de Componentes).
0
25
50
75
100
Hue
sos/
Pezu
ñas
Pelo
s
Pelo
s y
hues
os
Pelo
s y
vege
tale
s
Pelo
s, V
eget
ales
yH
ueso
s/Pe
zuña
s
Inde
term
inad
o
% d
e ex
crem
ento
s Lobo Perro Zorro
Gráfico VI.3.10.
Distribución comparativa de los porcentajes de los componentes de las muestras para las distintas especies identificadas.
En cuanto la identificación de la presa o tipo de presa, lo más destacado es la
aparición de presas silvestres y domésticas, tanto en lobos (21,4% y 35,7% respectivamente
como en perros (en ambos casos, 16,7%), y la existencia de un elevado porcentaje de
excrementos cuyo contenido es de adscripción inespecífica a simple vista, con un 43% y un
67%, respectivamente. De entre todos los restos de presas silvestres, el 50% fue encontrado
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 53 8
2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
nen excrementos de lobo y un 17% en las de perro. De entre todos los restos de presas
domésticas, el 71,4 % fueron identificadas en excrementos de lobo y el 14,3% en las de perro.
Pero las diferencias no han resultado estadísticamente significativas (χ2=1,973; gl=4;
p=0,741), ni eliminando del análisis al zorro (χ2=1,032; gl=2; p=0,597).
El corzo, la única presa identificada representativa en el conjunto de muestras fecales
identificadas genéticamente, no ha sido identificado a visu en las heces de perros, pero si
aparece en el 21,4% de los excrementos de lobos (N=14) y en el 40% de los excrementos de
zorro (N=5), aunque las diferencias no resultan significativas (χ2=2,768; gl=2; p=0,251).
TIPO DE
CONTENIDO
LOBO PERRO ZORRO TOTAL
N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % **
Silvestre 3 21,4 50 1 16,6 16,7 2 40 33,3 6 24
Doméstica 5 35,7 71,4 1 16,6 14,3 1 20 14,3 7 28
Indeterminado 6 42,9 50 4 66,7 33,3 2 40 16,7 12 48
TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100
Tabla VI.3.11. Distribución de las muestras con especie identificada y porcentajes de especie y de tipo de contenido
(* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de Componentes).
0
25
50
75
100
Silvestre Doméstica Indeterminada
% d
e es
peci
e
Lobo Perro Zorro
Gráfico VI.3.11.
Distribución comparativa de los porcentajes de tipos de presa de las muestras para las distintas especies identificadas.
54 Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 8
INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n VI.4. Distribución del lobo.
Los datos obtenidos en el presente trabajo nos confirman la presencia inequívoca de
la especie en 5 cuadrículas UTM de 10x10 km, todas ellas pertenecientes, total o
parcialmente, al Territorio Histórico de Álava (Figura VI.2.1). Esto supone el 4,5% del total
de cuadrículas que forman la CAPV (N=111) y el 8,8% de las que conforman Álava (N=57).
Dado el esfuerzo y el tipo de muestreos efectuados, los datos obtenidos sobre la
presencia y ausencia de lobos en cuadrículas UTM de 10x10 km suponen una aproximación a
la distribución real de la especie y pueden servirnos para establecer algunos patrones de
preferencia en cuanto a la ocupación espacial y territorial más o menos permanente que se
observan en los lobos en la CAPV y su entorno. Debemos resaltar que la distribución del lobo
no es uniforme ni homogénea debido a la persecución humana a la que es sometido en
Euskadi y a otros factores relacionados con su propia autoecología, como por ejemplo, que
estos depredadores no ocupan ni seleccionan uniformemente el espacio que ocupan sus
territorios (Mech et al. 1998, Mech y Boitani 2003).
3
28
4 3
1014
1
11
2 2 25
0
5
10
15
20
25
30
2003 2004 2005 2006 2007 2008
Periodos estudiados
Nº
Muestras UTM
Gráfico VI.4.1. Número de muestras de lobo recogidas y número de de cuadrículas UTM de 10x10 km con presencia de la
especie a lo largo de los años en los que se han usado técnicas genéticas no invasivas. Fuentes: Temporadas 2003 y 2004, Echegaray et al. (2005a); Temporadas 2005, 2006 y 2007, Echegaray et al.
(2008b); Temporada 2008, presente trabajo.
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 55 8
2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
n
Figura VI.4.1. Distribución mínima del lobo en la CAPV en cuadrículas UTM de 10x10 km a lo largo de los años en los que se
han usado técnicas genéticas no invasivas. Fuentes: Echegaray et al. (2005a), Echegaray et al. (2008b), presente trabajo.
56 Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 8
INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n
Figura VI.4.2. Número total de muestras de lobo (número superior) y porcentaje (número inferior) sobre el total de excrementos
recogidos (N=62), durante el período 2003-2008 usando técnicas genéticas no invasivas. Fuentes: Echegaray et al. (2005a), Echegaray et al. (2008b), presente trabajo.
.
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 57 8
2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
n
58 Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 8
INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n
La Estrategia para la Conservación y Gestión del lobo en España aprobada en 2005,
siguiendo las recomendaciones de la UICN, indica la necesidad de conocer y actualizar el
estatus y distribución de la especie. Continuando con estas directrices marcadas, hemos
utilizado técnicas genéticas no invasivas en el seguimiento de las poblaciones de lobos de la
CAPV como continuación de un trabajo emprendido en 2003 (Echegaray et al. 2005a,
2008b). De esta manera hemos podido confirmar la presencia de lobos en el País Vasco y su
entorno y estimar su distribución.
VII. DISCUSIÓN .
Las mejoras técnicas y metodológicas experimentadas en los últimos años han
satisfecho las necesidades específicas de los análisis genéticos y han diversificado el campo
de acción de los estudios de la genética de la conservación de poblaciones. La utilización de
una metodología basada en técnicas genéticas no invasivas es la única que permite la
identificación segura de una especie a partir de indicios indirectos, tales como excrementos,
pelos, uñas, etc. (Ayuso 1999, Ayuso y Vilà 2001, Luccini et al. 2002, Creel et al. 2003).
Los métodos genéticos no invasivos han sido utilizadas para el seguimiento de
poblaciones de especies tan dispares como osos pardos (Taberlet et al. 1997, García et al.
2003, Bellemain et al. 2005), coyotes (Kohn et al. 1999), elefantes (Eggert et al. 2003),
tejones (Wilson et al. 2003) y por supuesto, lobos (Ayuso 1999, Luccini et al. 2002, Valière
et al. 2003, Creel et al. 2003). Incluso se ha comparado la eficacia de los muestreos genéticos
no invasivos como alternativa al radiomarcaje masivo para censar las poblaciones de lobo
(Creel et al. 2003). Además, los métodos no invasivos presentan indudables beneficios frente
a otros (como el radiomarcaje) que implican un coste económico y humano más elevado
(Ayuso y Vilà 2001permitiendo acceder a una gran cantidad de información sin representar
una molestia a las poblaciones objeto de estudio.
En la Península Ibérica es frecuente utilizar métodos basados en la identificación
visual de excrementos en trabajos de detección, estima de la abundancia y alimentación de
lobos. Mientras que la asignación específica visual de excrementos de lobo ha de tomarse con
cautela en numerosos lugares, la asignación genética permite confirmar la identidad de los
excrementos (Ayuso 1999, Ayuso y Vilà 2001). A tenor de los resultados obtenidos en
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 59 8
2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
ntrabajos anteriores (Echegaray et al. 2007b) y en otros estudios sobre la alimentación de los
lobos efectuados a finales del s. XX en la Península Ibérica, habría que asumir la existencia de
posibles errores en la atribución de excrementos asignados a lobo, especialmente en áreas de
baja densidad de carnívoros, elevada antropización, abundancia de perros, etc.
Ayuso y Vilà (2001) destacan que a pesar de que el trabajo genético requiere un
análisis muy cuidadoso es posible detectar diferencias entre individuos, algo que es difícil con
otros métodos indirectos (indicios, IKAs, foqueos nocturnos, daños, etc.). Estos métodos de
genética no invasivos se han convertido en una herramienta habitual para el seguimiento de
carnívoros ya que representan una alternativa viable frente a otros métodos, especialmente en
zonas donde su presencia resulte dudosa o se hallen en baja densidad (Ayuso y Vilà 2001,
Vilà y Ayuso 2001, Palomares et al. 2002, Eggert et al. 2003, Flagstad et al. 2003, 2004). De
hecho, Vilà y Ayuso (2001) sostienen que los métodos genéticos no invasivos representan una
herramienta útil en el seguimiento de las poblaciones ibéricas de lobo, especialmente si se
restringen a áreas bien delimitadas y se efectúa un diseño óptimo de muestreo (Taberlet et al.
1999).
Las limitaciones más importantes vienen determinadas por la calidad y cantidad de
ADN de excrementos con la que se trabaja en estos análisis. En todos los casos se trata de un
ADN de baja calidad, fragmentado y con presencia de inhibidores enzimáticos de las
reacciones de PCR. La reducida cantidad y la baja calidad del ADN que se obtiene de
muestras fecales es una fuente de errores, así como la posibilidad de contaminación de las
muestras. En general, las propuestas para minimizar estos errores vienen determinadas por la
realización de un elevado número de réplicas independientes (Ayuso 1999, Taberlet et al.
1999, Waits et al. 2001).
Sobre el éxito de secuenciación de ADN mitocondrial, en el presente estudio se ha
obtenido casi un 93% de éxito, lo cual supone una mejora del 29,8% y del 11% en cuanto a la
tasa obtenida en trabajos previos (Echegaray et al. 2007b, 2008). Esta tasa de éxito, aún
provienente de un tamaño de muestra reducido (n=26), mejora los resultados obtenidos
previamente por nosotros, así como los de otros que han analizado un número de heces
considerablemente mayor y diversas especies, tales como coyotes (Kohn et al. 1999), osos
pardos (Taberlet et al. 1996, Rey et al. 2000, Marshall y Ritland 2002, García et al. 2003,
60 Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 8
INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n Bellemain et al. 2005), e incluso lobos (Valière et al. 2003, Lucchini et al. 2002, Adams et al.
2003).
El éxito conseguido en el presente trabajo, que supone un avance aún sobre los datos
de 2008, es justificable debido a la mejora en los protocolos de recolección y tratamiento de
las heces (Frantzen et al. 1998), a la repetición de los procesos de extracción y de
amplificación de ADN cuando los resultados no son satisfactorios y al reducido tamaño de
muestra (26 excrementos recopilados).
En Echegaray et al. (2005a) se identificaron 86 muestras fecales, de las cuales 31
correspondieron a lobo (36%), 53 a perro (61,6%) y 2 a zorro (2,3%). En el trienio 2005-
2007, dichos autores identificaron 40 muestras, de las que el 50% pertenecían a lobo, el
37,5% a perros y 12,5% a zorros. En el presente trabajo, el porcentaje de las muestras
identificadas como de lobo, experimenta un aumento con respecto a los dos trabajos
anteriores, de 20 y 6 puntos porcentuales, respectivamente. En cuanto a las muestras
identificadas como de perros, se observa una disminución de 37,6 y 16,5 puntos porcentuales
con respecto a ambos trabajos. Por otra parte, el confundir excrementos de lobo y zorro
también ha aumentado (17,7 y 7,5 puntos porcentuales).
2003-2004
N=86 2005-2007 % N= 40
2008 % N= 26
Lobo 36 50 56 Perro 61,6 37,5 24 Zorro 2,3 12,5 20
Tabla VII.1.1 Distribución de los porcentajes de muestras con identificación específica en
los distintos periodos de estudio.
Las causas de estas variaciones pueden explicarse por el contexto y el tipo de
muestreos efectuados. La mayor experiencia e información del equipo de investigadores,
junto con la cautela en la recopilación de excrementos que deben ser analizados
genéticamente podría estar influyendo. No obstante, a juicio del equipo técnico de este
trabajo, el factor condicionante podría derivar de la necesidad de optimizar esfuerzos y de la
información acumulada en trabajos previos (zonas donde más lobos se han venido detectando
porque su presencia espacio-temporal es más estable y continua) lo que ha encauzado los
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2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
nmuestreos a territorios donde la probabilidad de hallazgo de excrementos de lobo fuera más
elevada .
Hay que señalar que este tipo de proyectos no podría realizarse sin la financiación de
entidades públicas y/o privadas y por lo tanto la planificación de los muestreos de campo está
condicionada por el tipo de convocatoria, regulación y condiciones que establecen dichas
entidades.
Esto no nos permite la realización de muestreos sistemáticos y con una continuidad
temporal, lo que ha significado una pérdida notable en el número de muestras de lobo
recogidas en territorios menos prospectados, y cuyo resultado podría reflejarse en la
distribución de la especie.
Por otra parte, uno de los hechos más relevantes de este trabajo ha sido el hallazgo de
un nuevo perfil genético (haplotipo lu1) en los muestreos efectuados. Este haplotipo es uno de
los cuatro descritos en lobos ibéricos por Vilà et al. (1999), y constituye uno de los más
frecuentes, aunque en trabajos previos durante 5 años nunca había sido detectado en nuestro
área de estudio. De hecho, este haplotipo corresponde a un lobo no muestreado previamente e
incluso podría tratarse de un individuo emigrante al territorio limítrofe entre Burgos y Álava,
donde ha sido encontrado, o un ejemplar dispersante procedente de los vecinos núcleos
castellano y leoneses más occidentales (Vilà y Sundqvist, en preparación).
En cuanto a la caracterización de los excrementos identificados, no hemos
encontrado diferencias significativas entre las tres especies de cánidos en cuanto a las
variables de localización y composición de los excrementos. A pesar de esta circunstancia,
podemos observar algunas diferencias con respecto a la información previa disponible para el
período 2003-2008 (Echegaray et al. 2005a, 2008b).
Echegaray et al. (2008b) encontraron que era más frecuente de lo esperado el
hallazgo de excrementos de lobos y zorros en infraestructuras viarias semi o totalmente
asfaltadas, pero este hecho no ha sido observado en el presente trabajo, lo cual podría haberse
debido a un hecho azaroso. Por otra parte, en el presente trabajo se ha observado como el 75%
de los excrementos recogidos en los cruces de caminos corresponden a lobo mientras que este
hecho aconteció en el 42,9% de los excrementos considerados en el anterior estudio.
Con frecuencia los excrementos de lobos se localizan en cruces de pistas, sustratos
conspicuos y lugares relativamente más elevados (Vilà et al. 1994). Se ha sugerido que estos
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INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n hechos están relacionados con conductas de marcaje territorial visual y/u olfativo en diversas
especies de cánidos (Kleiman 1966, Allen et al. 1999, Zub et al. 2003). Dichas pautas
también han sido documentadas en los lobos ibéricos (Vilà et al. 1994, Barja et al. 2005).
También se ha propuesto que la elección de sustratos elevados, tales como plantas, en las
cuales los lobos depositan sus excrementos, pueden ser un elemento importante relacionado
con la probabilidad de maximizar la localización visual de las muestras fecales por parte de
otros individuos. Así, dichas heces situadas elevadas en plantas actuarían como balizas
olorosas territoriales entre lobos residentes y no residentes (Barja 2009). En el anterior trabajo
efectuado por nuestro equipo, paradójicamente observamos una aparición mayor de lo
esperado de excrementos de perro en sustratos elevados y en cambio, heces de lobo en zonas
“sin elevación”. Esta situación no ha sido constatada en nuestros muestreos de 2008, lo cual
podría resultar un artefacto estadístico o azar, aunque tampoco se habían registrado
diferencias destacables entre las conductas de marcaje y deposición de heces entre perros y
lobos en ambos períodos. De hecho, si abordamos un análisis conjunto que englobe todas las
muestras recopiladas por nosotros en el período 2005-2008 no observamos diferencias
estadísticamente significativas (χ2=2,55; gl=2; p=0,279) que sustenten la hipótesis de Barja
(2009), a pesar de que en nuestro trabajo hemos contado con excrementos identificados con
técnicas moleculares. Tampoco hemos observado diferencias en cuanto a las categorías de
elevación cuantificadas en número de centímetros (χ2=4,305; gl=3; p=0,230).
Por otra parte, no se han observado diferencias en cuanto a la comparación entre los
componentes identificados a simple vista que integran los excrementos de lobos y perros,
queremos destacar que en el caso de los perros, huesos/pezuñas y la combinación de pelos y
huesos/pezuñas aparece en el 50% de las muestras frente al 13,3% citado en el trabajo
anterior.
En lo que respecta a la categoría de detección a visu de los componentes en las
muestras fecales analizadas, observamos una evolución positiva creciente en cuanto a la
identificación de los mismos si efectuamos una comparación con trabajos previos. Este hecho
puede deberse a un mayor esfuerzo de los muestreadores en el proceso de inventariado y
clasificación de dichos componentes, aunque esta circunstancia no se ha visto reflejada en la
mejoría en la identificación del tipo de contenido o presa (silvestre o doméstica). Esto puede
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2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
nreflejar, tal y como hemos demostrado en nuestros trabajos de genética no invasiva, la
imposibilidad de discernir los excrementos de cánidos en determinados ambientes a partir de
su tipología y contenido, sin mediar un análisis genético por medio, al contrario de lo
señalado por algunos autores (Sáenz de Buruaga et al. 1994, Askacíbar y Ocio 2006). De
hecho, la detección a visu de restos de presas silvestres frente a restos de ganado doméstico
sigue siendo destacable: en el caso de los perros, un 40% (Echegaray et al. 2008b) frente a un
16,7% en el presente trabajo y en el caso de lobos, un 35% frente a un 21,4%.
En cuanto a la distribución del lobo, no es razonable utilizar los datos obtenidos en
el presente trabajo para caracterizar y establecer comparaciones espacio-temporales precisas
en cuanto a la presencia de la especie y la evolución de su distribución en el País Vasco
(Madoz 1845, Álvarez et al. 1985, Sáenz de Buruaga et al. 1994, 2000). Esto es debido a que
la información que ha servido para estudiar la distribución del lobo en el País Vasco procede
de metodologías y escalas temporales distintas. De hecho, tampoco se pueden extraer
conclusiones significativas si efectuamos una comparación entre los trabajos efectuados con
técnicas genéticas no invasivas en Euskadi, por la gran diferencia existente en cuanto al
esfuerzo de recopilación de muestras de lobo (Echegaray et al. 2005a, 2008b). Además, en el
presente trabajo no se ha encontrado ninguna muestra fecal atribuible a lobo en el entorno de
la sierra de Ordunte y/o en territorio vizcaino.
No obstante, tal y como señalan Echegaray et al. (2007b), la distribución del lobo en
Euskadi no parece experimentar en los últimos tiempos un cambio notable aún efectuando
comparaciones con los trabajos realizados en las últimas décadas (Sáenz de Buruaga et al.
1994, 2000), lo cual sugiere un cierto estancamiento en la distribución del lobo. A la hora de
hablar de tendencias hay que referirse a escalas temporales concretas y no elegidas
arbitrariamente (Naves 2002). Si consideramos períodos históricos (de centenares de años), la
tendencia de las poblaciones ibéricas de lobos es regresiva (Rico y Torrente 2000). Lo que
puede resultar significativo o evidente para un periodo de tiempo dado puede no serlo para
otro e incluso las tendencias pueden ser contrarias (Naves 2002). Los cambios en los límites
del área de distribución, como es el caso de los lobos que habitan Euskadi, no aportan los
mejores indicios sobre la evolución de sus poblaciones.
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INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n Como conclusión final a este trabajo, al igual que hemos manifestado anteriormente
(Echegaray et al. 2008b), consideramos que con una planificación adecuada (Taberlet et al.
1999) y el apoyo institucional y financiero de las diferentes administraciones vascas, es
posible realizar un seguimiento a corto y medio plazo de las poblaciones de lobo en Euskadi
mediante técnicas genéticas no invasivas, sin descartar otras que pudieran servir de apoyo. La
información así obtenida tiene que servir para establecer las bases científicas del plan de
conservación y gestión de una “Especie de Interés Comunitario”, el único gran depredador
presente en la Comunidad Autónoma Vasca.
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2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
n
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INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n VIII. BIBLIOGRAFÍA .
ADAMS, J. R., B. T. KELLY Y L. P. WAITS (2003). Use faecal DNA sampling and
GIS to monitor hibridization between Red Wolves (Canis rufus) and Coyotes (Canis latrans).
Molecular Ecology, 10: 2175-2186.
ALLEN, J. J., M. BEKOFF Y R. L. CRABTREE (1999). An observational study of coyote
(Canis latrans) scent-marking and territoriality in Yellowstone National Park. Ethology, 105:
280-302.
ALTUNA (1971). Fauna de mamíferos de los yacimientos prehistóricos de Guipúzcoa.
San Sebastián.
ÁLVAREZ, A. BEA, J. M. FAUS, E. CASTIÉN E I. MENDIOLA (1985). Atlas de los
Vertebrados Continentales de Álava, Vizcaya y Guipúzcoa (excepto Chiroptera). Ed.
Gobierno Vasco. Vitoria-Gasteiz. 464 pp.
ÁLVAREZ, J., J. M. FERNÁNDEZ DE MENDIOLA Y A. BEA (1998). Vertebrados
Continentales: situación actual en la Comunidad Autónoma del País Vasco. Ed. Gobierno
Vasco. Vitoria-Gasteiz.
ASKACÍBAR, M. Y J. A. OCIO (2006). La ganadería extensiva y el lobo (Canis lupus)
en Euskadi. Sustrai, 78: 56-60.
AYUSO, A. (1999). Use of non-invasive sampling techniques for microsatellite
genotyping of Swedish wolves. Tesis de Licenciatura. Universidad de Uppsala, Suecia.
AYUSO, A. Y C. VILÀ (2001). Uso de ADN fecal para la identificación de lobos en
Suecia. Resúmenes V Jornadas de la SECEM, 5-8 de Diciembre de 2001, pag. 35.
BALMORI, A., M. RICO, J. NAVES Y E. LLAMAZARES (2000). Contribución al estudio
de endoparásitos del lobo en la Península Ibérica: una investigación coprológica. Galemys, 12
(NE): 13-27.
BARANDIARÁN, J. M. (1972). Diccionario ilustrado de mitología vasca. Bilbao.
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 67 8
2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
nBARJA, I., F. J. DE MIGUEL Y F. BÁRCENA (2005). Faecal marking behaviour of
Iberian wolf in different zones of their territory. Folia Zoologica, 54 (1-2): 21-29.
BARJA, I. (2009). Decision making in plant selection during the faecal-marking
behaviour of wild wolves. Animal Behaviour, 77: 489–493
BARRIENTOS, L. M. (2000). Tamaño y composición de diferentes grupos de lobos en
Castilla y León. Galemys, 12: 249-256.
BARRIENTOS, L. M. Y A. FERNÁNDEZ (2002). ¿Cómo estimar el tamaño de grupo en
las poblaciones ibéricas de lobos?. En: Seminario Propuestas para el estudio de la dinámica
de las poblaciones de lobo en la Península Ibérica. Fuentes de Nava (Palencia), 1 y 2 de
Noviembre de 2002. Asociación para la Conservación y Estudio del Lobo Ibérico (ASCEL).
11 pp.
BELLEMAIN, E., J. E. SWENSON, D. TALLMON, S. BRUNVERG Y P. TABERLET (2005).
Estimating population size of elusive animals with DNA from hunter-collected feces: four
methods with brown bears. Conservation Biology, 15 (1): 150-161.
BERGER, K. M. (2006). Carnivore-Livestock Conflicts: Effects of Subsidized
Predator Control and Economic Correlates on the Sheep Industry. Conservation Biology, 20
(3): 751-761.
BESSA GOMEZ, C. Y F. PETRUCCI-FONSECA (2003). Using artificial neural networks to
assess wolf distribution in Portugal. Animal Conservation, 6: 221-229.
BOITANI, L. (2000). Action plan for the conservation of wolves (Canis lupus) in
Europe. Consejo de Europa, Estrasburgo, 86 pp.
BOITANI, L. (2006). The future of large carnivores in 21st century Europe. How far
can we push their reintegration in our landscapes. I European Congress of Conservation
Biology, Eger (Hungary). Pp 46.
BLANCO, J. C., M. SÁENZ DE BURUAGA Y L. LLANEZA (2002). Canis lupus Linnaeus,
1758. Pp.: 234-237. En: L.J. Palomo y J. Gisbert (eds.) 2002. Atlas de los Mamíferos
Terrestres de España. Dirección General de Conservación de la Naturaleza. SECEM-
SECEMU, Madrid.
68 Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 8
INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n BREITENMOSER, U. (1998). Large predators in the Alps: The fall and the rise of man´s
competitors. Biological Conservation, 89 (3): 279-289.
CAYUELA, L. (2004). Habitat evaluation for the Iberian Wolf Canis lupus in Picos de
Europa National Park, Spain. Applied Geography, 24: 199-215.
CLARK, T. W., CURLEE, A. P., MINTA, S. C. Y KAREIVA, P. (EDS) (1999). Carnivores
in Ecosystems: The Yellowstone Experience. Yale University Press, New Haven, CT. 429 pp.
CREEL, S., G. SPONG, J. L. SANDS, J. ROTELLA, J. ZEIGLE, L. JOE, K. MURPHY Y D.
SMITHS (2003). Population size estimation in Yellowstone wolves with error-prone
noninvasive microsatellite genotypes. Molecular Ecology, 12: 2003-2009.
ECHEGARAY, J. (2002). El lobo en Euskal Herria. La administración está ignorando
intencionadamente la presencia de este cánido salvaje. Ecologista, 30: 56-57.
ECHEGARAY, J. (2004). Percepción social de los grandes mamíferos en la Montaña de
Riaño (León). Galemys, 16: 25-41.
ECHEGARAY, J., A. ILLANA Y D. PANIAGUA (2004). El lobo intenta asentarse en la
provincia de Álava. Quercus, 217: 22-27.
ECHEGARAY, J., A. ILLANA, A. HERNANDO, F. MARTÍNEZ DE LECEA, J. BAYONA, J. A.
DE LA TORRE, D. PANIAGUA Y C. VILÁ (2005A). El Lobo (Canis lupus Linnaeus, 1758) en la
C.A.P.V. Uso de ADN fecal para el seguimiento de sus poblaciones. Departamento de
Ordenación del Territorio y Medio Ambiente. Informe inédito. 252 pp.
ECHEGARAY, J., ILLANA, A., HERNANDO, A., MARTÍNEZ DE LECEA, F., BAYONA, J.,
DE LA TORRE, J. A., PANIAGUA, D. Y VILÀ, C. (2005B). Evolución y análisis de la distribución
del lobo (Canis lupus) en el País Vasco (norte de España) durante el período 1850-2004.
Resúmenes II Congreso Hispano-Luso del lobo ibérico. Castelo Branco (Portugal). Pp: 65.
ECHEGARAY, J., A. ILLANA, A., F. MARTÍNEZ DE LECEA, J. BAYONA, J. A. DE LA
TORRE Y C. VILÀ (2006). Análisis de la problemática del lobo (Canis lupus) en Euskadi.
Sustrai, 76: 48-51
ECHEGARAY, J., ILLANA, A., HERNANDO, A., MARTÍNEZ DE LECEA, F., BAYONA, J., I.
COVELA, DE LA TORRE, J. A., PANIAGUA, D. Y VILÀ, C. (2007A). Uso de técnicas genéticas no
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 69 8
2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
ninvasivas para estimar el tamaño de la población de lobo (Canis lupus L., 1758) en el País
Vasco (N. España). Galemys, 19 (2): 3-18
ECHEGARAY, J., D. PANIAGUA, A. ILLANA Y J. A. DE LA TORRE (2007B). Estudio
comparativo de la ecología trófica de lobos (Canis lupus) y perros (Canis familiaris) en la
Comunidad Autónoma del País Vasco mediante el análisis de heces identificadas con técnicas
genéticas. Dirección de Biodiversidad y Participación Ambiental del Departamento de Medio
Ambiente y Ordenación del Territorio del Gobierno Vasco. Vitoria-Gasteiz. Informe inédito.
81 pp.
ECHEGARAY, J., ILLANA, A. HERNANDO, A., MARTÍNEZ DE LECEA, F., BAYONA,
COVELA, I. Y DE LA TORRE, J.A. (2008A). Corredores de dispersión de los lobos (Canis lupus)
a través del País Vasco (N. España). Estudios del Museo de Ciencias Naturales de Álava, 22:
137-142.
ECHEGARAY, J., ILLANA, A., MARTÍNEZ DE LECEA, F., DE LA TORRE, J. A. Y
PANIAGUA, D. (2008B). Seguimiento de las poblaciones de lobos (Canis lupus L., 1758) en la
Comunidad Autónoma del País Vasco mediante el uso de técnicas genéticas no invasivas.
Departamento de Medio Ambiente y Ordenación del Territorio del Gobierno Vasco. Informe
inédito. 84 pp.
EGGERT, L. S., J. A. EGGERT Y D. S. WOODRUFF (2003). Estimating population size
for elusive animals: for the forest elephants of Kalum National Park, Ghana. Molecular
Ecology, 12: 1389-1402.
FLAGSTAD, O., C. W. WALKER, C. VILÀ, A. K. SUNDQVIST, B. FERNHOLM, A. K.
HUFTHAMMER, O. WIIG, I. KOYOLA Y H. ELLEGREEN (2003). Two centuries of the
Scandinavian wolf: patterns of genetic variability and migration during an era of dramatic
decline. Molecular Ecology, 12: 869-880.
FLAGSTAD, O., E. HEDMARK, A. LANDA, H. BROSETH, J. PERSSON, P. SEGERSTRÖM Y
H. ELLEGREEN (2004). Noninvasive Monitoring of a Reestablished Wolverine Population.
Conservation Biology, 18 (3): 676-688.
70 Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 8
INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n FOPPEN, R. P. B., BOUWMA, I. M., KALKHOVEN, J.T.R., DIRKSEN, J. Y VAN POSTAL, S.
(2000). Corridors of the Pan-European Ecological Network. European Centre for Nature
Conservation. Tillburg.
FRANTZEN, M. A. J., J. B. SILK, J. FERGUSON, R. K. WAYNE Y M. H. KOHN (1998).
Empirical evaluation of preservation methods of baboon faecal DNA. Molecular Ecology, 7:
1423-1428.
FRITTS, H., E. E. BANGS, J. A. FONTAINE, M. K. PHILLIPS, E. D. KOCH, J. R. GUNSON
(1997). Planning and Implementing a Reintroduction of Wolves to Yellowstone National Park
and Central Idaho. Restoration Ecology Vol. 5, No. 1: 7-27.
FULLER, T. K. Y W. J. SNOW (1988). Estimating winter wolf density using
radiotelemetry data. Wildlife Society Bulletin, 16: 367-370.
FULLER, T. K. (1995). Guidelines for Gray Wolf Management in the Northern Great
Lakes Region. International Wolf Center, Technical Publication nº 27.
GARAYO, J. M. (2008). Lobo y pastoreo de ganado ovino en el País Vasco. Lurralde,
31: 1-24.
GARCÍA, J. L., I. REY E I. DOADRIO (2003). Estudio genético del oso pardo cantábrico
en Asturias. CSIC, Principado de Asturias. Informe inédito. 60 pp.
GURRUTXAGA, M. (2005). Red de Corredores Ecológicos del País Vasco. Memoria
IKT S.A. Gobierno Vasco. 145 pp.
GUZMÁN, N. (COORD.) (2002). Censo-diagnóstico de las poblaciones de lince ibérico
Lynx pardinus en España. Informe inédito. 207 pp.
HABER, G. (1996). Biological Conservation and Ethical Implications of Exploiting
and Controlling Wolves. Conservation Biology, 10 (4): 1068-1091.,
HÖSS M., M. KOHN, F. KNAUER, W. SCHRÖEDER Y S. PÄÄBO (1992). Excremental
analysis by PCR. Nature, 359: 199.
KLEIMAN, D. (1966). Scent marking in the Canidae. Symposium of the Zoological
Society of London, 18: 167-177.
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 71 8
2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
nKOHN, M., E. C. YORK, D. A. KAMRADT, G. HAUGHT, R. M. SAUVAJOT Y R. K.
WAYNE (1999). Estimating population size by genotyping feces. Proceedings of Royal Society
of London, Series B, 266: 657-663.
LINNELL, J.D.C. (2006). Conserving Large Carnivores in European Landscapes: the
challenge and opportunity of coexistence. I European Congress of Conservation Biology,
Eger (Hungary). Pp 46.
LLANEZA, L. (1996). Selección de presa y alimentación del Lobo Ibérico (Canis
lupus L.) en el Parque Natural de Somiedo (Asturias). Departamento de Biología de
Organismos y Sistemas. Informe inédito. Universidad de Oviedo. 89 pp.
LUCCHINI, V., E. FABBRI, F. MARUCCO, S. RICCI, L. BOITANI Y E. RANDI (2002). Non-
invasive molecular tracking of colonizing wolf (Canis lupus) in the western Italian Alps.
Molecular Ecology, 11: 857-868.
MADOZ, P. (1845-1850). Diccionario Geográfico-Estadístico-Histórico de España y
sus posesiones de ultramar. Ediciones facsímil de Álava, Vizcaya y Guipúzcoa.
MARSHALL, H. D. Y K. RITLAND (2002). Genetic diversity and differentiation of
Kermode bear populations. Molecular Ecology, 11: 685-697.
MECH, L. D, L. G. ADAMS, T. J. MEIER, J. W. BURCH Y B. W. DALE (1998). The
Wolves of Denali. Minnesota University Press. 227 pp.
MECH, L. D. Y L. BOITANI (2003). Wolves. Behaviour, Ecology and Conservation.
The University of Chicago Press. 448 pp.
MULLIS, K. Y F. FALOONA (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a
polymerase, catalyzed chain reaction. Methods Enzymol., 155: 335-350.
MURGA, F. (1978). Catálogo de loberas de las provincias de Álava, Burgos y León.
Kobie, 8: 159-189.
NAUGHTON-TREVES, L., R. GROSSBERG Y A. TREVES (2003). Paying for Tolerance:
Rural Citizen´s Attitudes toward wolf depredation and compensation. Conservation Biology,
17: 1500-1511.
72 Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 8
INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
n NAVES, J. (2002). Propuestas para el seguimiento de las tendencias de las
poblaciones de lobos en la Península Ibérica. En: Seminario Propuestas para el estudio de la
dinámica de las poblaciones de lobo en la Península Ibérica. Fuentes de Nava (Palencia), 1 y 2
de Noviembre de 2002. 10 pp.
NIE, M. A. (2003). Beyond wolves: the politics of wolf recovery and management.
Unniversity of Minnesota Press, Minneapolis. 266 pp.
PALOMARES, F., J. A. GODOY, A. PIRIZ, S. J. O´BRIEN Y W. E. JONSON (2002). Faecal
genetic analysis to determine the presence and distribution of elusive carnivores: design and
feasibility for the Iberian Lynx. Molecular Ecology, 11: 2171-2182.
PARK, S. D. E. (2001). Trypanotolerance in West African Cattle and the Population
Genetic Effects of Selection. Ph.D. thesis. University of Dublin. 129 pp.
RAY, J.C.., REDFORD, K. H., STENECK, R. S. Y BERGER, J. (2005). Large Carnivores
and the Conservation of Biodiversity. Island Press. Washington. 525 pp.
REY, I., I. DOADRIO, G. PALOMERO, P. TABERLET Y L. WAITS (2000). Identificación,
determinación de sexo y variabilidad genética del núcleo oriental de oso pardo en la
Cordillera Cantábrica. En: La conservación del oso pardo en Europa: un reto de cara al siglo
XXI. Ed. Fundación Biodiversidad. 123 pp.
RICO, M. Y TORRENTE, J. P. (1997). Caza y rarefacción del lobo en España;
investigación histórica y conclusiones biológicas. Galemys, 12 (NE): 163-181.
RIPPLE, W. J. Y BESCHTA, R. L. (2005). Linking wolves and plants: Aldo Leopold on
trophic cascades. BioScience, 55 (7): 613-621.
ROTHMAN, R. J. Y L. D. MECH (1979). Scent-marking in lone wolves and newly
formed pairs. Animal Behaviour, 27: 750-760.
SÁENZ DE BURUAGA, M., A. ONRUBIA, M. A. CAMPOS, E. ARBERAS, A. J. LUCIO Y F.
J. PURROY - CONSULTORA DE RECURSOS NATURALES (1994). El lobo en Euskadi. Informe
inédito. Gobierno Vasco y Diputaciones Forales de Álava y Vizcaya. 324 pp.
SÁENZ DE BURUAGA, M., M. A. CAMPOS, E. ARBERAS Y A. ONRUBIA (2000). Últimos
datos sobre el lobo (Canis lupus) en el País Vasco y Navarra. Galemys, 12 (NE): 149-162.
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 73 8
2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS
nSÁENZ DE BURUAGA M., M. A. CAMPOS, F. CANALES Y E. ARBERAS - CONSULTORA
DE RECURSOS NATURALES (2008). Información sobre la situación actual del lobo en Álava y
la problemática con la ganadería. Informe inédito. Marzo 2008.
SOKAL, R. R. Y F. J. ROHLF (1969). Biometría. Principios y métodos estadísticos en la
investigación biológica. H. Blume Ediciones. 185 pp. Madrid.
SWOFFORD, D. L. (2002). PAUP. Phylogenetic analysis using parsimony and other
methods. Version 10. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts.
TALEGÓN, J. (en prensa). La utilidad de los expedientes de daños en la gestión y
conservación del lobo en la península ibérica. En: Fernández, A, Ordiz, A., Vilà, C. y Alvares,
F. (Eds.). Propuestas para el estudio de la dinámica de las poblaciones de lobo en la
Península Ibérica. Asociación para la Conservación y Estudio del Lobo Ibérico (ASCEL).
Fuentes de Nava (Palencia), Noviembre 2002.
TABERLET, P., S. GRIFFIN,, B. GOOSSENS, E. UHRES, O. HANNOTE, L. P. WAITS, C.
DUBOIS-PAGANON, T. BURKE Y J. BOUVET (1996). Reliable genotyping of samples with very
low DNA quantities using PCR. Nucleic Acid Research, 24 (16): 3189-3194.
TABERLET, P., J. J. CAMARRA, S. GRIFFIN, E. UHRÈS, O. HANNOTE, L. P. WAITS, C.
DUBOIS-PAGANON, T. BURKE Y J. BOUVET (1997). Non-invasive genetic tracking of the
endangered Pyrenean brown bear population. Molecular Ecology, 6: 869-871.
TABERLET, P., L. WAITS Y G. LUIKHART (1999). Noninvasive genetic sampling: look
before you leap. Trends in Ecological Evolution, 14: 323-327.
VÀLIERE, N., L. FUMAGALLI, L. GIELLY, C. MIQUEL, B. LEQUETTE, M. L. POULLE, J.
M. WEBER, R. ARLETTAZ Y P. TABERLET (2003). Long-distance wolf recolonization of France
and Switzerland inferred from non-invasive genetic sampling over a period of 10 years.
Animal Conservation, 6: 83-92.
VILÀ, C., V. URÍOS Y J. CASTROVIEJO (1994). Use of faeces for scent marking in
Iberian Wolves. Canadian Journal of Zoology, 72: 374-377.
VILÀ, C., I. R. AMORIM, J. A. LEONARD, D. POSADA, J. CASTROVIEJO, F. PETRUCCI-
FONSECA, K. A. CRANDALL, H. ELLEGREEN Y R. K. WAYNE (1999). Mitochondrial DNA
74 Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 8
INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.
MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.
2008
Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 75 8
n philogeography and population history of grey wolf Canis lupus. Molecular Ecology, 8: 2089-
2103.
VILÀ, C. Y A. YUSO (2001). Uso de métodos no invasivos para estimar el tamaño de
la población de lobos (Canis lupus). Galemys, 14 (2): 60-63.
VILÀ, C., A.-K. SUNDQVIST, Ø. FLAGSTAD, J. SEDDON, S. BJÖRNERFELDT, I. KOJOLA,
A. CASULLI, H. SAND, P. WABAKKEN Y H. ELLEGREEN (2003). Rescue of a severely
bottlenecked wolf (Canis lupus) population by a single immigrant. Proceedings of the Royal
Society of London, Series B., 270: 91-97.
VILÀ, C. Y ECHEGARAY, J. (2007). Fighting wolves in Western Europe. A fair cause?.
Abstracts XXVIII Congress International Union of Game Biologists. Pp: 353.
WAITS, L., G. LUIKHART Y P. TABERLET (2001). Estimating the probability of identity
among genotypes in natural populations cautions and guidelines. Molecular Ecology, 10:
249-256.
WILSON, G. J., A. C. FRANTZ, L. C. POPE, T. J. ROPER, T. A. BURKE, C. L.
CHEESEMAN Y R. J. DELAHAY (2003). Estimation of badger abundance using faecal DNA
typing. Journal of Applied Ecology, 40: 658-666.
ZUB, K., J. THEUERKAUF, W. JEDRZEJEWSKI, B. JEDRZEJEWSKA, K., SCHMIDT Y R.
KOWALCYZK (2003). Wolf pack territoriality marking in the Bialowieza Primeval Forest
(Poland). Behaviour, 140: 635-648.