Ingenuity Variant Analysis - Amazon S3 · ⑤データ解析のための統計の基礎 (9)! NGS基本用語解説 (4) Level 2(実践編) ①練習用公開データの選び方 (19)

© 2015 DBCLS Licensed under CC BY 2.1JAPAN

公共データベースの再解析を例とした Ingenuity Variant Analysis による変異データの絞り込み

坊農秀雅情報・システム研究機構

ライフサイエンス統合データベースセンター(DBCLS)

http://creativecommons.org/licenses/by/2.1/jp/


本日の話•公共DBの現状とその再利用

•次世代シークエンサー(NGS)の普及

• NGSデータの検索

•エクソームデータ再利用解析の実例–(Academic)freeなツールでの解析–Ingenuity Variant Analysis

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公共DBの現状とその再利用



次世代シークエンサー (NGS)• 2015年現在、普通に使われるようになった

–ほぼIllumina社の• HiSeq2500 -> その後継機種

• Miseq -> NextSeq–長読みはPacBio

•「もう『次世代』ちゃうやろ」–NGS: Now Generation Sequencer

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Togo picture gallery by DBCLS is licensed under a Creative Commons Attribution 2.1 Japan license (c)

http://g86.dbcls.jp/togopic/


http://g86.dbcls.jp/togopic/


• PublicなNGSデータを把握するため、DBCLSが活動–DBCLS SRA–http://sra.dbcls.jp/

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NGSデータの現状

領域融合レビュー, 4, e008 (2015) DOI: 10.7875/leading.author.4.e008Hidemasa Bono: Sequence data analysis in life science utilizing next generation sequencers.図1

Nakazato T, Ohta T, Bono HPLOS ONE. 8, e77910, 2013doi: 10.1371/journal.pone.0077910


http://sra.dbcls.jp/

© 2015 DBCLS Licensed under CC BY 2.1JAPAN6


© 2015 DBCLS Licensed under CC BY 2.1JAPANhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/7


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/


参考: raw data at NCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/


SRA以外にもpublicなNGSデータが

•制限公開データ–例: NBDCヒトデータベース

•大型プロジェクトのデータ–例: TCGA(The Cancer Genome Atlas)

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領域融合レビュー

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無料で使えます•基本的にユーザー登録なし• for profit(企業の方)もタダ

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歴史

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http://dbcls.rois.ac.jp/about/history


http://dbcls.rois.ac.jp/about/history


DBカタログ

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http://integbio.jp/dbcatalog/



3つの「センター」

• DDBJ: DNAデータアーカイブ• DBCLS: データベース統合基盤技術開発• NBDC: 戦略立案、funding

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http://dbcls.rois.ac.jp/about日本版NCBI



ROIS

NIG,DDBJ,DBCLS,NBDC…• DDBJ: DNA Data Bank of

Japan• DBCLS: Database Center for

Life Science• NBDC: National Bioscience

Database Center

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NIG DDBJ DBCLS NBDC

hono, bono, nakazato, meso, iNut



Refseq

三島のDBCLSは何をしているのか?

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Data in DDBJ

GEO ArrayExpress

1. Annotated sequences 2. Samples(BioSample) 3. Studies(BioProject) 4. Capillary reads 5. Next generation

reads(SRA) RNAseq ChIPseq microarray (GeneChip,

Oligoarray)

Ref: http://www.insdc.org/

DDBJにあるデータの

「知の巡り」を良くしています


http://www.insdc.org/


#NGLSBI

DBCLS SRA

• NGSデータ(SRA)の電話帳–メタデータで整理• 動的な統計レポート• SRAデータと論文との対応表

• Taxonomy–Direct link to original DB(SRA)

•前もって計算されたQCデータ

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Search data

Download

Quality Check

Data processing

Analysis

公共NGSデータを利用するためのシステム

http://SRA.dbcls.jp/



論文が紐付いているデータだけ

18 http://bit.ly/sra2pubmed



前もって計算されたQCデータ

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データモデル

20http://trace.ddbj.nig.ac.jp/dra/submission.html



NGS関連ファイルフォーマット

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フォーマット名

読み方拡張子用途

FASTA ふぁすた or ふぁすとえー

.faや.fasta 1行目に“>”で始まるヘッダ行，2行目以降に実際の塩基配列文字列という配列データ形式

FASTQ ふぁすときゅー .fqや.fastq NGS配列データ形式のデファクトスタンダード．配列クオリティ値付き，４行1エントリ

SRA えすあーるえー .sra NGS配列データ配布フォーマット．NCBI SRA-toolkitを使ってFASTQを生成できる

SAM さむ .sam ゲノムマッピングした時に生成されるアラインメントのフォーマット．プレーンテキスト形式

BAM ばむ .bam ゲノムマッピングした時に生成されるアラインメントのフォーマット．バイナリ形式

GTF(GFF) じーてぃーえふ (じえふえふ)

.gtf(.gff) ゲノム上のどこに遺伝子があるかなどが記述されたゲノムアノテーションのフォーマット

BED べっど .bed ゲノム上のどこに遺伝子があるかなどが記述されたゲノムアノテーションのフォーマット

VCF ぶいしーえふ .vcf Variant Call Format．配列の多型を記述するフォーマット．bcfはvcfのバイナリ版


© 2015 DBCLS Licensed under CC BY 2.1JAPAN22

データ解析のハブとなるFASTQ形式



次世代シーケンサからのデータ• FASTQフォーマットのファイル

–4行/readが基本単位

–MiSeq v3• 5000万リードx4行

• =2億行

•ファイルサイズも2Gbyte/file超–FAT32フォーマットでは扱えない

•いわゆる「開く」ことが不可能23

SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 length=33 TGTCGGTCCAGCTCGGCCTTGGGCTCCGTTTTC +SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 length=33 -IIIIIIII8IIIIIIIIIII6IIIIIIIII9I @SRR001356.2 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33 TCTGAACCCGACTCCCTTTCGATCGGCCGCGGG +SRR001356.2 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGIIIIIII-III @SRR001356.3 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33 GTGGCAGCGTTTTTGGGCCCGCCGCTTGCCGTT +SRR001356.3 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33 IIIII&IIIIIIIIIIIIIIIIHI1IIIIIIII



塩基配列情報を使って様々な応用1. ゲノムの解析(Exome, WGBS)WGBS: Whole Genome Bisulfite Sequence

2. トランスクリプトームの解析(RNA-seq)

3. DNA結合タンパク質の結合配列の解析(ChIP-seq)

4. メタゲノムの解析などなど

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必要メモリの目安

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NGS 解析手法

必要メモリ関連項目

RNA-seq 4G 2Exome 8G 1ChIP-seq 8G 3WGBS 16G 1



ゲノムの解析• DNA-seqとはあまりいわず、主にExome

–Exon + -ome => Exome(エクソーム)

–Exon部分だけResequence

•ごく簡単な解析の流れ(ヒトやマウス)1. データのクレンジング2. Reference genomeへのmapping (BWA)

3. 変異(SNV:Simple Nucleotide Variation)をcall

4. 変異のアノテーション26

⇒ FASTQ

⇒ BAM

⇒ VCF



初心者向け次世代DRY解析本発刊• 10月8日日本癌学会学術総会にて先行発売

• 10月14日日本人類遺伝学会大会にて先行発売

• 10月15日全国発売

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これからは生命科学者がデータ解析する時代です



目次■Level 1(準備編)①Macの買い方 (7)②コマンドラインの使い方 (20)③Rの使い方 (17)④データベースの選び方 (4)⑤データ解析のための統計の基礎 (9)● NGS基本用語解説 (4)

■Level 2(実践編)①練習用公開データの選び方 (19) ②発現解析(35)● 発現解析・手順書 (1)●【再現・検証】研究者の妻のDRY解析奮闘日記(9)

③疾患ゲノム解析(52)● 疾患ゲノム解析・手順書 (2)●【再現・検証】疾患ゲノム解析実習レポート (7)●【再現・検証】有償ソフトウェアならここまでできます(24)

④エピゲノム解析(ChIP-seq/FAIRE-seq/ATAC-seq) (30)

● エピゲノム解析(ChIP-seq)・手順書(3)●【再現・検証】ウェットなPIのChIP-seqことはじめブログ(8)⑤エピゲノム解析(WGBS) (22)● エピゲノム解析(WGBS)・手順書① (2)●【再現・検証】ギーク女優のWGBSガチ実況 (8)

● エピゲノム解析(WGBS)・手順書② (2)●【再現・検証】担当編集者のつぶやき検証レポート(11)

■Level 3(論文別・作図コマンド解説)A. R pairs.panels (3)B. R vioplot (2)C. R ggplot2 grid (3)D. R rGADEM (4)E. R biomaRt reshape2 ggplot2 grid entropy (4)F. R KEGGgraph (18)G. R trisomy.R (4)H. R edgeR hclust (8)I. R beanplot boxplot barplot IGV (7)J. Perl R ChromHMM IGV (5)K. R python visMut2sp.R (4)L. Velvet Murasaki GMV (5)M. Perl gc_contentSkew Tcl/Tk (3)N. imlib2 distriSNP (4)O. SQLite3 R Ruby Univa Grid Engine (5)

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エクソームデータ再利用解析の実例

DRR006760を例に 1. vcfがある時 2. vcfがない時



vcfファイルがある時•共同研究者がすでに作成•自前で作成–フリーウェアを組み合わせて作成可能?

–GATKなどはアカデミックフリー

–for-profitには有償なものが多くなっている

⇒ IVAをウェブインターフェースから利用

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エクソームデータ解析の概略

• https://www.broadinstitute.org/gatk/guide/article?id=3238 より

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FASTQ

BAM VCF


https://www.broadinstitute.org/gatk/guide/article?id=3238

vcfファイルをアップロードすると…

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validating…

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active! then analyze

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IVAでやれること

• https://www.broadinstitute.org/gatk/guide/article?id=3238 より50




vcfファイルがない時Biomedical Genomics Workbench(BxWB)

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BxWBいい点、悪い点• FASTQファイルからスタートできる

–vcfファイルを自ら生成しなくていい

• BxWBですべて完結–IVAもBxWBからプラグインで利用できる

•リファレンスゲノムなどすべてダウンロードしてこないといけない

•マッピング等、計算が自前でやるため重い52



BxWBを使うワークフロー•トリミング•バリアント検出

•フィルタリング

•ナレッジベースからの情報付加

•候補となったバリアントの精査

Biomedical Genomics Workbench (BxWB)

↓

Ingenuity Variant Analysis　(IVA)

↓

Biomedical Genomics Workbench (BxWB)

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IVA＋BxWB

• https://www.broadinstitute.org/gatk/guide/article?id=3238 より54




詳しい手順は次世代DRY解析本に■Level 2(実践編)③疾患ゲノム解析(52)

● 疾患ゲノム解析・手順書 (2)

●【再現・検証】疾患ゲノム解析実習レポート (7)

!【再現・検証】有償ソフトウェアならここまでできます(24)

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IVAはプラグインとして使える

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Verification in genome browser

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これからは、生物学者自身がデータ解析する時代なんです


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