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Abbildungsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis ............................................................................................................................ III
Tabellenverzeichnis ................................................................................................................................. V
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................................................... VI
1 Einleitung .............................................................................................................................................. 1
1.1 Mesenchymale Stammzellen, Adipozyten und Osteoblasten ....................................................... 2
1.2 Quantitativer Vergleich der mesenchymalen Stammzellen .......................................................... 3
1.2.1 Quantifizierung der Osteoblasten .......................................................................................... 3
1.2.2 Quantifizierung der Adipozyten ............................................................................................. 5
1.2.3 Durchflusszytometrie ............................................................................................................. 5
1.2.4 Polymerase Kettenreaktion, quantitative realtime PCR und cDNA - Synthese ...................... 7
1.3 Alterung (Seneszenz) ................................................................................................................... 11
2 Material und Methoden ..................................................................................................................... 14
2.1 Material ....................................................................................................................................... 14
2.2 Methoden .................................................................................................................................... 19
2.2.1 Zellisolation und Zellkultur ................................................................................................... 19
2.2.2 Vergleich der Multipotenz durch adipogene Differenzierung ............................................. 20
2.2.2.1 Differenzierung zu Adipozyten ...................................................................................... 20
2.2.2.2 Methoden zum Vergleich der Multipotenz der Adipozyten ......................................... 21
2.2.3 Vergleich der Multipotenz durch osteogene Differenzierung ............................................. 22
2.2.3.1 Differenzierung zu Osteoblasten ................................................................................... 23
2.2.3.2 Methoden zum Vergleich der Multipotenz der Osteoblasten ...................................... 23
2.2.4 cDNA – Synthese .................................................................................................................. 25
2.2.5 Analyse der Expression von MSC´s – spezifischen Genen .................................................... 26
2.2.6 Flow Cytometry .................................................................................................................... 27
2.2.7 Nachweis der Seneszenz ...................................................................................................... 27
2.2.7.1 Analyse der Proliferationsfähigkeit ............................................................................... 28
2.2.7.2 Nachweis der Telomerlängen ........................................................................................ 28
3 Ergebnisse und Auswertung ............................................................................................................... 30
3.1 Adipogene Differenzierung ......................................................................................................... 30
3.2 Osteogene Differenzierung ......................................................................................................... 31
3.3 Durchflusszytometrie .................................................................................................................. 33
Abbildungsverzeichnis II
3.4 Quantitative realtime PCR ........................................................................................................... 34
3.5 Seneszenz .................................................................................................................................... 36
3.5.1 Passagierung ......................................................................................................................... 36
3.5.2 Nachweis der Telomerlängen ............................................................................................... 39
4 Zusammenfassung und Ausblick ........................................................................................................ 41
5 Quellen ............................................................................................................................................... 42
6 Anhang ................................................................................................................................................ 45
6.1 RNA - Aufreinigung ................................................................................................................... A - 1
6.2 Bilder Oil Red O - Färbung ........................................................................................................ A - 2
6.2 Ergebnisse der adipogenen Differenzierung ............................................................................ A - 4
6.3 Bilder von Kossa – Färbung ...................................................................................................... A - 5
6.4 Ergebnisse der osteogenen Differenzierung ............................................................................ A - 6
6.4.1 Proteinkonzentrationsbestimmung .................................................................................. A - 6
6.5 Ergebnisse Durchflusszytometrie ............................................................................................. A - 8
6.6 Ergebnisse der Zellzählung (Passagierung) ............................................................................ A - 10
Selbstständigkeitserklärung
Abbildungsverzeichnis III
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Adipogenese [5] ................................................................................................................. 2
Abbildung 2: Osteogenese [5] ................................................................................................................. 3
Abbildung 3: Nachweisreaktion [10] ....................................................................................................... 3
Abbildung 4: Hydrolyse von Phosphorsäureester [11]............................................................................ 4
Abbildung 5: Hydrolyse von 4 – NPP [13] ................................................................................................ 4
Abbildung 6: Oil Red O [10] ..................................................................................................................... 5
Abbildung 7: Forward scatter [20] .......................................................................................................... 6
Abbildung 8: Side scatter [20] ................................................................................................................. 6
Abbildung 9: Fluoreszenz [20] ................................................................................................................. 6
Abbildung 10: Aufbau Flow Cytometer [20] ............................................................................................ 6
Abbildung 11: ein kompletter PCR – Zyklus [27] ..................................................................................... 8
Abbildung 12: cDNA – Synthese [31] ..................................................................................................... 10
Abbildung 13: lineare DNA - Enden - Problem [6] ................................................................................. 12
Abbildung 14: Bearbeitungsschema adipogene Differenzierungsplatten + Kontrollplatten ................ 21
Abbildung 15: Bearbeitungsschema osteogene Platten + Kontrollplatten ........................................... 23
Abbildung 16: Vergleich juvenil - adult (adipogen) ............................................................................... 30
Abbildung 17: Vergleich juvenil - adult (osteogen) ............................................................................... 32
Abbildung 18: Schmelzkurvenanalyse aller Ansätze ............................................................................. 35
Abbildung 19: F10 #12 Tag 3 ................................................................................................................. 36
Abbildung 20: F15 #12 Tag 3 ................................................................................................................. 36
Abbildung 21: F10 #13 Tag 3 ................................................................................................................. 36
Abbildung 22: F15 #13 Tag 3 ................................................................................................................. 36
Abbildung 23: F10 #14 Tag 3 ................................................................................................................. 37
Abbildung 24: F15 #14 Tag 3 ................................................................................................................. 37
Abbildung 25: F10 #18 Tag 3 ................................................................................................................. 37
Abbildung 26: F15 #18 Tag 3 ................................................................................................................. 37
Abbildung 27: Vergleich Lebend - Tod .................................................................................................. 38
Abbildung 28: Durchschnitt Vitalität ..................................................................................................... 38
Abbildung 29: Durchschnitt Generationszeiten .................................................................................... 39
Abbildung 30: Primerdimer ................................................................................................................... 40
Abbildung 31: : #9 Oil Red O - Färbung d8 400x ................................................................................ A - 2
Abbildung 32: Kontrolle #9 Oil Red O - Färbung d8 400x ................................................................... A - 2
Abbildung 33: #12 Oil Red O - Färbung d8 400x ................................................................................ A - 2
Abbildungsverzeichnis IV
Abbildung 34: Kontrolle #12 Orl Red O - Färbung d8 400x ................................................................ A - 2
Abbildung 35: #13 Oil Red O - Färbung d8 400x ................................................................................ A - 2
Abbildung 36: Kontrolle #13 Oil Red O - Färbung d8 400x ................................................................. A - 2
Abbildung 37: #14 Oil Red O - Färbung d8 400x ................................................................................ A - 3
Abbildung 38: Kontrolle #14 Oil Red O - Färbung d8 400x ................................................................. A - 3
Abbildung 39: #17 Oil Red O - Färbung d8 400x ................................................................................ A - 3
Abbildung 40: Kontrolle #17 Oil Red O - Färbung d8 400x ................................................................. A - 3
Abbildung 41: #18 Oil Red O - Färbung d8 400x ................................................................................ A - 3
Abbildung 42: Kontrolle #18 Oil Red O - Färbung d8 400x ................................................................. A - 3
Abbildung 43: Standardkurve Oil Red O ............................................................................................. A - 4
Abbildung 44: #12 von Kossa - Färbung d27 100x ............................................................................. A - 5
Abbildung 45: Kontrolle #12 von Kossa - Färbung d27 100x .............................................................. A - 5
Abbildung 46: #13 von Kossa - Färbung d27 100x ............................................................................. A - 5
Abbildung 47: Kontrolle #13 von Kossa - Färbung d27 100x .............................................................. A - 5
Abbildung 48: #14 von Kossa - Färbung d27 100x ............................................................................. A - 5
Abbildung 49: Kontrolle #14 von Kossa - Färbung d27 100x .............................................................. A - 5
Abbildung 50: #18 von Kossa - Färbung d27 100x ............................................................................. A - 6
Abbildung 51: Kontrolle #18 von Kossa - Färbung d27 100x .............................................................. A - 6
Abbildung 52: Standard Proteinkonzentrationsbestimmung ............................................................ A - 7
Tabellenverzeichnis V
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Fluoreszenzfarbstoffe Durchflusszytometrie [26] .................................................................. 7
Tabelle 2: adipogene Primer ................................................................................................................... 9
Tabelle 3: osteogener Primer .................................................................................................................. 9
Tabelle 4: Primer für Seneszenznachweis ............................................................................................. 13
Tabelle 5: verwendete Patienten für die adipogene Differenzierung ................................................... 20
Tabelle 6: Zusammensetzung der Chemikalien für Oil Red O - Färbung ............................................... 21
Tabelle 7: verwendete Patienten für die osteogene Differenzierung ................................................... 22
Tabelle 8: Volumina cDNA - Synthese ................................................................................................... 25
Tabelle 9: Zusammensetzung Mastermix qRT PCR ............................................................................... 26
Tabelle 10: Ablauf qRT PCR ................................................................................................................... 26
Tabelle 11: verwendete Patienten für den Nachweis der Seneszenz ................................................... 27
Tabelle 12: Zusammensetzung Mastermix PCR Telomerlägen ............................................................. 29
Tabelle 13: PCR - Programm Telomerlängen......................................................................................... 29
Tabelle 14: Anteil der gefärbten Zellen + Standardabweichung in Prozent ......................................... 33
Tabelle 15: Ergebnisse qRT PCR ............................................................................................................ 34
Tabelle 16: Werte adipogene Differenzierung ................................................................................... A - 4
Tabelle 17: Werte Kontrolle adipogene Differenzierung ................................................................... A - 4
Tabelle 18: Werte für Standardkurve ................................................................................................. A - 4
Tabelle 19: Mittelwerte der ALP - Messungen bezogen auf die Proteinkonzentration (mmol/g) ..... A - 6
Tabelle 20: Werte der Proteinmessung ............................................................................................. A - 6
Tabelle 21: Standard Proteinkonzentrationsbestimmung ................................................................. A - 7
Tabelle 22: Konzentration AK #9 - #18 ............................................................................................... A - 8
Tabelle 23: Ergebnisse Flow Cytometry ............................................................................................. A - 9
Tabelle 24: Werte der Zellzählungen der Seneszenz ....................................................................... A - 10
Abkürzungsverzeichnis VI
Abkürzungsverzeichnis
4 – NPP 4 - Nitrophenylphosphat
4 – NP 4 - Nitrophenolat
ß – GP ß – Natriumglycerolphosphat
ALP alkalische Phosphatase
ASAP Ascorbinsäure – 2 – Phosphat
Aqua bidest. bidestilliertes Wasser
BCA Bicinchoninsäure
CD Cluster of Differentiation
cDNA komplementäre DNA (engl.: complementary DNA)
DEPC Diethylpyrocarbonat
Dexa Dexamethason
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DNA Deoxyribonucleic acid (dt.: Desoxyribonukleinsäure)
dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate
dsDNA doppelsträngige DNA (engl.: double stranded DNA)
EDTA Ethyldiamintetraessigsäure
ELISA Enzym - linked Immunosorbent Assay
Fn Zahl der Passage (F2 = 2. Passage)
FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
FCS Fötales Rinderserum
FITC Fluorescein-Isothiocyanat
Abkürzungsverzeichnis VII
FSC Vorwärtsstreulicht (engl.: Forward scatter)
fwd forward
GAPDH Glyceraldehyde - 3 - phosphate dehydrogenase
G/C - Gehalt Guanin/Cytosin - Gehalt
IBMX Isobutyl – 1 - methylxanthine
IG Intraglobulin
Indo Indomethacin
ITS Insulin – Transferrin – Selenium
mRNA messenger RNA
MSC´s mesenchymale Stammzellen
MW Mittelwert
NaOH Natriumhydroxid
OD Optische Dichte
Oligo – dT – Primer Desoxythyminidin – Nukleotiden
ORO Oil Red O
PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Polymerase – Chain – Reaction (dt.: Polymerase -
Kettenreaktion)
PE Phycoerythrin
PerCP Peridinin Chloropyll Protein
Pen/Strep Penicillin/Streptomycin
PPARγ Peroxisomal proliferator-activated receptor gamma
qRT PCR quantitative realtime Polymerase - Kettenreaktion
rev reverse
Abkürzungsverzeichnis VIII
RNA Ribonucleic acid (dt.: Ribonukleinsäure)
rpm rounds per minute
RS Rabbitserum
RT Raumtemperatur
SSC Seitwärtsstreulicht (engl.: Side scatter)
ssDNA einzelsträngige DNA (engl.: single stranded DNA)
w/o Ca2+
Mg2+ ohne Calcium und Magnesium
ZKF Zellkulturflasche
1 Einleitung 1
1 Einleitung
Der Begriff Multipotenz beschreibt die Fähigkeit von Stammzellen sich in verschiedene Zellen einer
bestimmten Linie zu entwickeln. Ein Beispiel für multipotente Zellen bildet die Gruppe der
mesenchymalen Stammzellen (MSC´s), die sich in unseren Körpern durch diese Eigenschaft
auszeichnen. Sie entstammen dem mittleren Keimblatt (Mesoderm) des Menschen und sind
gekennzeichnet als undifferenzierte, sich selbst erneuerbare und proliferationsfähige Zellen. [1]
MSC´ s können sich zu allen Zellen der mesodermalen Linie, jedoch nicht keimblattübergreifend, d.h.
in Zellen der ektodermalen bzw. endodermalen Linie entwickeln. [2] Sie dienen der Regeneration von
mesenchymalen Geweben wie z.B. Knochen, Fett oder Knorpel und sind somit in unseren Körpern
unabhängig vom Alter vorhanden. Verschiedene Studien belegten die Isolation von dermalen
Stammzellen und die positive Differenzierung zu Adipozyten, Osteoblasten und Chondrozyten. [43]
[44] Jedoch gibt es Unterschiede in ihrer Aktivität. Es ist bekannt, dass z.B. Knochenbrüche bei
älteren Personen schlechter verheilen als bei jüngeren Patienten. Das lässt darauf schließen, dass
womöglich die Multipotenz vom Alter der jeweiligen Person abhängt. Um dies zu überprüfen wurden
Fibroblasten von juvenilen Vorhautproben und adulten Hautproben von kosmetischen Operationen
(z.B. Brustverkleinerung) auf ihre Multipotenz untersucht und diese dann miteinander verglichen.
Dabei wurden die Fibroblasten zu Knochen (Osteoblasten) – und Fettzellen (Adipozyten)
ausdifferenziert und durch spezifische qualitative bzw. quantitative Untersuchungen analysiert und
verglichen. Weitere molekularbiologische Vergleiche wurden durch eine quantitative realtime PCR
(qRT PCR) gezogen. Dazu wurde die RNA aus den ausdifferenzierten Zellen isoliert und auf die
Expression ihrer spezifischen adipogenen bzw. osteogenen Marker hin untersucht. Desweiteren
wurde die Expression von MSC´s – spezifischen Oberflächenantigenen mit Hilfe der
Durchflusszytometrie untersucht.
Welchen Einfluss hat das Alter nun noch auf die Effizienz der Multipotenz? Der Prozess des Alterns ist
auf das lineare DNA – Enden – Problem, speziell auf die Verkürzung der Telomere zurückzuführen.
Die Telomere bilden die Enden der linearen Chromosomen, welche sich bei jeder Zellteilung so
kritisch verkürzen, dass es zum sofortigen Abbruch der Zellteilung kommt. [1] [6] Somit kommt es bei
jeder Teilung zu einem Verlust der Stabilität und Integrität der Chromosomen. Dies bedeutet, dass
nach vielen Zellteilungen (im hohen Alter) diese nur noch sehr selten oder gar nicht mehr
vorkommen (Apoptose). [1] [6] Um dies zu überprüfen wurden verschiedene juvenile und adulte
Zellen auf diese Eigenschaften untersucht. Dazu wurden sie über mehrere Passagen kultiviert und
nach jeder Passage die Generationszeit bestimmt, um Unterschiede in der Proliferationsfähigkeit fest
zu stellen. Desweiteren wurde die DNA aus einer frühen und späteren Passage isoliert, um die
1 Einleitung 2
Telomerverkürzung mittels qRT PCR nachzuweisen. Somit können nun Rückschlüsse auf die
Seneszenz und deren Einfluss auf die Multipotenz gezogen werden.
1.1 Mesenchymale Stammzellen, Adipozyten und Osteoblasten
Als MSC´s werden die Zellen bezeichnet, die aus dem lockeren embryonalen Bindegewebe des
Mesoderms (mittleres Keimblatt) hervorgehen. Sie werden als Vorläuferzellen der verschiedensten
Gewebe gehandelt und können sich innerhalb der Zelllinie des Mesoderms in unterschiedliche
Gewebe entwickeln (z.B. Knochen – bzw. Fettzellen). Diese Eigenschaft der MSC´s, sich nur in Zellen
der mesodermalen Linie zu differenzieren, wird als Multipotenz bezeichnet. Das heißt sie können sich
nicht in Zellen des äußeren Keimblattes (Ektoderm) bzw. inneren Keimblattes (Endoderm)
entwickeln. [2] [3]
Die Induktion der Differenzierung zu Adipozyten (Fettzellen) oder Osteoblasten (Knochenzellen) wird
über verschiedene Stimuli erreicht. Durch Zugabe von Differenzierungsmedien mit spezifischen
Wachstumssubstanzen differenzieren die Zellen in die gewünschte Richtung. Beide Medien
(adipogen und osteogen) enthalten die Stoffe Dexamethason (Dexa), zur Unterstützung der
Proliferation und Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep), um eine mögliche Kontamination zu verhin-
dern. [4]
Unterschiede zwischen den Medien bestehen in den jeweiligen Stimuli. Durch die beiden Stoffe 3 –
Isobutyl – 1 - methylxanthine (IBMX) und Indomethacin (Indo) im adipogenen Medium, kommt es zur
Induktion der Bildung von Fettzellen. Jedoch haben die Stoffe Insulin, Rabbitserum (RS) und die darin
befindlichen Fettsäuren den größten Einfluss auf die MSC´s. [1] [7] Durch diese verschiedenen
adipogenen Stimuli prägen die Stammzellen einen für den Adipozyten charakteristischen
Stoffwechsel. Somit kommt es zur sukzessiven Ablagerung von Lipiden und über verschiedene
Formen von Vorläuferzellen bilden sich aus den MSC´s die Adipozyten. Die Zelle besitzt nun die für
einen Adipozyten typische Zellmorphologie, d.h dass das Zellplasma fast vollständig von einer großen
Fettvakuole verdrängt wurde. Dieser Vorgang wird als Adipogenese bezeichnet (Abb. 1). [5] [7]
Abbildung 1: Adipogenese [5]
1 Einleitung 3
Die Induktion der Knochenzellenbildung wird ebenfalls durch bestimmte osteogene Stimuli induziert.
Dazu zählen ß - Natriumglycerolphosphat (ß – GP) und Ascorbinsäure – 2 – Phosphat (ASAP). Diese
Stoffe spielen eine wichtige Rolle bei der Mineralisierung der Zellen, sie führen zu einem
Aktivitätsanstieg der alkalischen Phosphatase (ALP) und dienen als Phosphatdonor. [8] [9] Durch
diese Stoffe wird die osteogene Differenzierung eingeleitet und es kommt zur Akkumulation von
Kalziumphosphat in der Zelle. Über verschiedene Vorläuferzellen (Osteoprogenitorzellen) bilden sich
aus MSC´s die Präosteoblasten, die sich bei zunehmender Verkalkung zu Osteoblasten umformen.
Diese Zellen bilden nun knochenspezifische Enzyme (z.B. Osteocalcin). Durch diese Enzyme kommt es
zur sukzessiven Verkalkung der Osteoblasten und werden diese in eine Matrix eingebunden, spricht
man von Osteozyten. Die Bildung von Osteoblasten aus MSC´s wird als Osteogenese (Abb. 2)
bezeichnet. [5] [8] [9]
Abbildung 2: Osteogenese [5]
1.2 Quantitativer Vergleich der mesenchymalen Stammzellen
1.2.1 Quantifizierung der Osteoblasten
Nach erfolgreichem Verlauf der Differenzierung zu Osteoblasten bilden sich Kalziumcarbonat – und –
phosphatablagerungen, welche als kleine schwarze Punkte sichtbar werden. Diese können durch die
von Kossa – Färbung nachgewiesen werden. Diese Färbung ist jedoch ein indirekter Nachweis des
Kalziums, da nur die Carbonat – und Phosphat – Ionen nachgewiesen werden. Durch die Zugabe einer
silberionenhaltigen Lösung werden die Carbonat – und Phosphat – Ionen gegen diese Silberionen
ausgetauscht und unter Einfluss von Sonnenlicht und einer Reduktionslösung (Pyrogallollösung) zu
metallischem Silber (schwarze Färbung) reduziert (Abb. 3). [10]
Abbildung 3: Nachweisreaktion [10]
1 Einleitung 4
Die Fixierung des Ergebnisses und das Auswaschen von nicht reduziertem Silber erfolgt mit einer
Natriumthiosulfatlösung. Als Gegenfärbung wird Kernechtrot für eine rote Kernfärbung eingesetzt.
[10]
Durch den osteogenen Stimulus ASAP kommt es zu einem Aktivitätsanstieg der ALP. Dieses Enzym
dient in unseren Körpern der Hydrolyse von Phosphorsäureestern, in dem sie Phosphatgruppen von
vielen verschiedenen Arten von Molekülen entfernen (Dephosphorylierung, Abb. 4). [11] [12]
Abbildung 4: Hydrolyse von Phosphorsäureester [11]
Eine quantitative Bestimmung kann nun auf dem Weg der Messung der optischen Dichte (OD)
erfolgen. Durch die Zugabe von 4 - Nitrophenylphosphat (4 – NPP) wird dieses zu 4 - Nitrophenolat (4
– NP) hydrolysiert und im alkalischen Milieu bildet sich das gelbliche 4 – NP – Anion. Durch das
Mitführen von mehreren Standards in verschiedenen Konzentrationen, kann eine Standardkurve
erstellt werden, anhand derer dann die Konzentration der zu messenden Probe berechnet werden
kann. [13]
Abbildung 5: Hydrolyse von 4 – NPP [13]
Da eine korrekte Zellzählung nach längerer Zeit bei der osteogenen Differenzierung nicht möglich ist,
wird anstelle der Zellzahlbestimmung die Konzentration, der in den Zellen enthaltenen
Proteinmenge, gemessen. Dazu wurde der Bicinchoninsäure (BCA) – Test durchgeführt, dessen zu
Grunde liegende Reaktion die Biuret – Reaktion ist. Im alkalischen Milieu werden vorhandene Kupfer
– II – Ionen (Cu2+) von den Proteinen zu Kupfer – I – Ionen (Cu+) reduziert. Diese bilden mit den
Natriumsalzen der BCA einen intensiv violettfarbenen Komplex, der photometrisch detektiert
werden kann. Mit einer Kalibrationsreihe verschiedener BCA – Lösungen bekannter Konzen-
trationen, kann die Proteinkonzentration einer Probe bestimmt werden. [14]
Somit konnten die Werte der ALP – Messungen quantitativ auf die Proteinmenge bezogen werden.
1 Einleitung 5
1.2.2 Quantifizierung der Adipozyten
Eine Methode zum Nachweis des positiven Verlaufes der adipogenen Differenzierung ist die Oil Red
O (ORO) – Färbung. Diese dient zur Darstellung von Neutralfetten. Dazu werden die Fettzellen mit
dem öllöslichen Lysochrom – Diazofarbstoff Oil Red O (Abb. 6) angefärbt. Dieser Farbstoff ist in
lipiden Substanzen (Fettvakuolen) besser löslich als im eigentlichen Lösungsmittel selbst (z.B.
Isopropanol). So diffundiert er vom Ort der höheren Konzentration (Lösungsmittel) zum Ort der
niedrigeren Konzentration (Lipidtropfen), geht aber dabei keine Bindung mit den Lipiden ein. [10]
Abbildung 6: Oil Red O [10]
Bei positiver Färbung erscheinen die Lipide rot. Als Gegenfärbung werden die Zellkerne durch eine
Hämalaun – Lösung gefärbt, welche die Zellkerne bläulich anfärbt. [10]
Um nun eine Quantifizierung der Adipozyten zu erreichen, muss der diffundierte Farbstoff wieder
eluiert werden. Durch die Zugabe von 100 %igem Isopropanol wird der Farbstoff wieder aus den
Zellen herausgelöst und dieses Farbstoff – Isopropanol – Gemisch kann nun mittels Photometer auf
seine OD hin untersucht werden. Um die Werte der OD´s quantifizieren zu können, wurden in dieser
Arbeit zusätzlich die Zellzahlen bestimmt, sodass die OD – Werte auf die Zellzahlen bezogen werden
konnten.
1.2.3 Durchflusszytometrie
Mit Hilfe der Durchflusszytometrie (engl.: Flow Cytometry) können in kürzester Zeit eine Vielzahl von
Zellen auf physiologische Eigenschaften untersucht werden. [15] Im Rahmen dieser Arbeit sollen die
MSC ´s der jeweiligen Biopsien hauptsächlich in Hinblick auf Morphologie (Größe und Granularität)
und die Expression verschiedener Oberflächenantigene detektiert und quantitativ erfasst werden.
[16] [17] Die flowcytometrische Detektion der Zellparameter erfolgt durch Streulicht - und Fluores-
zenzmessungen. Durch den sogenannten Hüllstrom wird der Durchmesser des Probenstroms im
Mikrokanal der Durchflusskammer eingestellt und die Zellen werden ähnlich einer Perlenkette
1 Einleitung 6
aufgereiht. [18] [19] Dies nennt man hydrodynamische Fokussierung. Anschließend passieren die
Zellen einen (bzw. mehrere) fokussierten Laserstrahl(en). [16] [18] [19] Hierbei werden die Zellgröße
durch quantitative Messung der Beugung des Streulichts in der Vorwärtsrichtung im flachen Winkel
(Vorwärtsstreulicht (FSC, engl.: Forward scatter), Abb. 7), sowie die Granularität durch quantitative
Detektion der Brechung des Lichts rechtwinklig zur Laserachse (Seitwärtsstreulicht (SSC, engl.: Side
scatter), Abb.8) erfasst. [18] [19] Wurden die Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelt, so können
gleichzeitig (zu FSC und SSC) die emittierten Fluoreszenzsignale der Farbstoffe, welche molekulare
Eigenschaften der Zelle widerspiegeln, analysiert werden (Abb. 9). [16] [18]
Abbildung 7: Forward scatter [20]
Abbildung 8: Side scatter [20]
Abbildung 9: Fluoreszenz [20]
Die Fluorophore sind in der Lage, nach Absorption energiereicher Strahlung, die dabei auf-
genommenen Photonen über energieärmere Strahlung wieder abzugeben. [21] Zur optischen
Trennung der Fluoreszenzsignale der einzelnen Farbstoffe werden dichroitische Spiegel
(Farbteilerspiegel) und Spektralfilter (Kurzpass-, Langpass - und Bandpassfilter) eingesetzt. Die farb-
stoffspezifischen Emissionen (Photonen) werden durch verschiedene Detektorsysteme mit Photo-
multipliern (engl.: photomultiplier tube) erfasst und in elektrische Signale umgewandelt. [16] [18]
In Abbildung 10 ist der gesamte Aufbau des Flow Cytometers noch einmal zusammengefasst.
Abbildung 10: Aufbau Flow Cytometer [20]
1 Einleitung 7
In dieser Arbeit wurden die spezifischen Oberflächenantigene der MSC´s nachgewiesen. Dabei macht
man sich das Antigen – Antikörper – Bindungs – Prinzip zunutze: Ein antigenspezifischer Primär-
antikörper bindet an sein Epitop auf dem Antigen. Nachdem die Antikörper, die mit einem
Fluoreszenzfarbstoff versehen sind, an das spezifische Antigen gebunden haben, können diese durch
die Fluoreszenzanregung im entsprechenden Wellenlängenbereich gemessen werden. [22] [23]
Es ist noch kein eindeutiges Antigen für MSC´s bekannt, was sie als solches identifiziert. Deswegen
werden immer verschiedene Antigene nachgewiesen, die zum einen zum Expressionsprofil der MSC´s
gehören und deren Existenz zum anderen schon mehrfach nachgewiesen wurde. Sogenannte Cluster
of Differentiation (CD) kennzeichnen die spezifischen Epitope auf den Antigenen. Die in dieser Arbeit
nachgewiesenen CD´s, welche positiv für MSC´s sind, waren: CD105, CD29, CD73, CD166, CD90. Zur
Kontrolle wurden die Zellen noch auf CD45, CD34 und CD31 hin untersucht, die nicht zum
Expressionsprofil der MSC´s gehören. [25] [22] [23] [24]
Die verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe sind in Tabelle 1 mit ihren jeweiligen Absorptions – bzw.
Emissionspektren dargestellt.
Tabelle 1: Fluoreszenzfarbstoffe Durchflusszytometrie [26]
Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszenzanregung
in nm
Emission in
nm
Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) 488 530
Phycoerythrin (PE) 496 575
Peridinin Chloropyll Protein (PerCP) 482 675
Alexa 700 633 719
1.2.4 Polymerase Kettenreaktion, quantitative realtime PCR und cDNA - Synthese
Die Polymerase Kettenreaktion (PCR, engl.: Polymerase Chain Reaction) ist im Allgemeinen eine
Methode zur in vitro Vervielfältigung (Amplifikation) definierter DNA - Stücke mit Hilfe des Enzyms
DNA - Polymerase. Die PCR beruht auf drei grundlegenden Schritten, die zyklisch wiederholt werden:
Denaturierung, Anlagerung (Annealing) und Elongation. [27] [28]
Grundlegend für die PCR ist eine intakte DNA – Matrize, die die Sequenz der DNA enthält, die
amplifiziert werden soll. Neben der Ausgangs – DNA befinden sich noch die Taq – Polymerase,
Magnesiumionen (Katalysatoren oder Cofaktoren), Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs),
nukleasefreies Wasser und die Primer (forward und reverse) in der Reaktionslösung. Ein Salzpuffer
garantiert optimale Bedingungen (z.B. pH – Wert).
1 Einleitung 8
Bei der Denaturierung wird die Ausganglsösung auf ca. 94 °C erhitzt, wodurch die doppelsträngige
DNA - Matrize in zwei einzelsträngige Moleküle aufgeschmolzen wird. Durch die hohen Tempera-
turen werden die Wasserstoffbrückenbindungen in der DNA aufgebrochen und es liegen die beiden
Einzelstränge vor. [27] [29]
Bei dem Annealing wird die Temperatur auf ca. 60 °C herabgesetzt. Dadurch verbinden
(hybridisieren) sich die Primer mit den komplementären Einzelsträngen, wobei das eine
komplementär zu einem Abschnitt auf dem 5` - 3` DNA - Strang ist und das andere komplementär zu
einem Abschnitt auf dem 3` - 5` DNA - Strang. Die genaue Temperatur wird hierbei durch die Länge
und die Sequenz der Primer bestimmt. Diese Primer dienen als Startpunkte für die DNA Amplifikation
(Elongation).
Bei der Elongation werden die neu entstandenen Stränge weiter durch die DNA – Polymerase
aufgefüllt, die die einzelnen dNTPs einbaut (Amplifizierung). Dabei wird die Temperatur auf ca. 72 °C
erhöht, was die ideale Arbeitstemperatur für die verwendete Polymerase ist.
Dieser Ablauf (Abb. 11) wird mehrmals wiederholt. [27]
Abbildung 11: ein kompletter PCR – Zyklus [27]
Als DNA – Polymerasen können die Enzyme von verschiedenen Mikroorganismen verwendet werden.
Solche Mikroorganismen können unter anderem Thermus aquaticus, Thermus thermophilus und
Pyrococcus furiosus sein. [27]
Die qRT PCR ist eine Weiterentwicklung der klassischen PCR. Sie beruht auf dem Prinzip der normalen
PCR, jedoch kann mit dieser Methode neben der Vervielfältigung auch die DNA in Echtzeit
1 Einleitung 9
quantifiziert werden. Die Quantifizierung wird mit Hilfe von Floureszenzfarbstoffen ermöglicht. Als
Fluoreszenzstoffe können u.a. Sybr Green oder Ethidiumbromid verwendet werden. Diese
interkalieren (binden) innerhalb doppelsträngiger DNA, was zu einem Anstieg der Fluoreszenz führt.
Dieser Anstieg ist proportional zu dem Anstieg der Target – DNA und die Messung der Fluoreszenz
kann z.B. am Ende jedes Elongationszykluses durchgeführt werden. [29] [30] Ein Nachteil dieser
Methode ist die geringe Spezifität, da nicht zwischen verschiedenen PCR - Produkten unterschieden
wird (z.B. unspezifisches Produkt). Dieser Nachteil kann durch die Schmelzkurvenanalyse, bei der die
Spezifität anhand der Fragmentlängen bestimmt wird, beseitigt werden. Bei der Schmelz-
kurvenanalyse wird durch langsame kontinuierliche Temperaturerhöhung die DNA aufgeschmolzen.
Bei einer für das Amplifikat spezifischen Temperatur wird der Doppelstrang in seine Einzelstränge
aufgespalten. Dabei wird der Fluoreszenzstoff freigesetzt, wodurch es zu einer Abnahme der
Fluoreszenz kommt. So hat ein spezifisches Produkt eine höhere Schmelztemperatur als ein
unspezifisches Produkt (z.B. Primerdimere), sodass eine Unterscheidung möglich ist. [29] [30]
Für den Vergleich der Multipotenz wurden in dieser Arbeit jeweils ein adipogenes und osteogenes
Gen auf seine Expression hin untersucht. Tabelle 2 zeigt die Sequenz der Primer für das adipogene
Gen Peroxisomal proliferator - activated receptor gamma (PPARγ) und des Housekeeping – Gens
Glyceraldehyde - 3 - phosphate dehydrogenase (GAPDH). Dieses dient als Referenzgen, da es in jeder
Zelle gleich exprimiert wird und später die Werte der Schmelzkurvenanalyse auf die Werte des
GAPDH bezogen werden.
Tabelle 2: adipogene Primer
adipogene Gene Sequenz der Primer
PPARγ
fwd: GCA GGA GCA GAG CAA AGA GG
rev: CCA GGA ATG CTT TTG GCA TAC
GAPDH
fwd: CTGCACCACCAACTGCTTAG
rev: AGCTCAGGGATGACCTTGC
Tabelle 3 zeigt die Sequenzen des Primers für den Nachweis des osteogenen Gens Osteocalcin. Als
Referenzgen dient hier auch das GAPDH.
Tabelle 3: osteogener Primer
Gen Sequenz der Primer
Osteocalcin fwd: GGCAGCGAGGTAGTGAAGAGAC
rev: GGCAAGGGGAAGAGGAAAGAAG
1 Einleitung 10
Bevor jedoch die PCR durchgeführt werden kann, muss die isolierte RNA noch in ihre komplementäre
DNA (cDNA, Abb. 12) umgeschrieben werden, da nur eine doppelsträngige DNA – Matrize als
Grundlage für die PCR genutzt werden kann. Diese Umwandlung kann durch das Enzym Reverse
Transkriptase erreicht werden. Diese spezifische, RNA - abhängige DNA - Polymerase benötigt wie
andere DNA - Polymerasen einen Primer zur Synthese, welcher an die RNA bindet. [32] [33] In
eukaryotischen Zellen wird die DNA von den Genen im Zellkern in die pre – mRNA umgeschrieben.
Nach der Entfernung der Introns (Spleißen) wird der pre – mRNA ein Poly – A – Schwanz hinzugefügt.
Dieser schützt die mRNA vor Degradation und gibt ihr zusätzliche Stabilität. [33] Allgemein bestehen
die Primer für die cDNA – Synthese aus mehreren Desoxythyminidin – Nukleotiden (Oligo – dT –
Primer). Es können aber auch spezifische Primer eingesetzt werden, um ein bestimmtes Transkript zu
isolieren. [33] [34] Die Oligo – dT – Primer binden an komplementären Poly – A – Schwanz der pre –
mRNA und bilden somit den Startpunkt für die Reverse Transkriptase. Diese verlängert den
komplementären DNA - Strang, in dem sie die passenden Nukleotide einbaut. Um nun eine
doppelsträngige DNA zu erhalten, wird die pre – mRNA durch das Enzym RNase abgebaut und es
bleibt die einzelsträngige DNA (ssDNA) zurück. Da ssDNA jedoch hydrophob ist, bildet sie am 3‘ –
Ende eine Haarnadelschleifen um sich selbst. Diese dient der DNA – Polymerase als Ausgang und sie
bildet den komplementären DNA – Strang. So wurde zu der mRNA die dazu gehörige doppelsträngige
DNA (dsDNA) mit gleicher Sequenz gebildet. [33] Im Gegensatz zur natürlichen eukaryotischen DNA
befinden sich keine Introns mehr auf der cDNA, da die pre – mRNA den Vorgang des Spleißen schon
durchlaufen hat.
Abbildung 12: cDNA – Synthese [31]
1 Einleitung 11
1.3 Alterung (Seneszenz)
Für den Begriff des Alterns gibt es noch keine einheitliche Definition. Jedoch wird das Altern mit der
zeitlichen Entwicklung eines Organismus von der Geburt bis hin zum Tod gleichgesetzt. [35] Im
Allgemeinen sind die Alterungsprozesse als irreversibel zu betrachten. Die Seneszenz hingegen
beschreibt nur einen Teilaspekt des Alterns bzw. der Entwicklung, d.h. sie beschreibt die Zunahme
der Wahrscheinlichkeit zu sterben. [36] Dies bedeutet, dass mit zunehmendem Alter auch die Wahr-
scheinlichkeit steigt, eines natürlichen Todes zu sterben. Aufgrund des linearen DNA – Enden –
Problems kommt es bei jeder Zellteilung zur Verkürzung der Enden der Telomere an den
Chromosomen. [35] [36] Als Telomere werden die besonderen Strukturen an den Enden linearer
Chromosomen bezeichnet. Ihre Aufgaben bestehen in der Bewahrung der Integrität und Stabilität
der Chromosomen, Schutz der Chromosomen vor Abbau durch Endonukleasen (Degradation),
Verhinderung der Fusion der Chromosomenden mit anderen Chromosomen und Schutz vor
Rekombination. Wäre dieser Schutz nicht gegeben, könnten die genannten Probleme zur Beendigung
der Zellteilung und zum programmierten Zelltod (Apoptose) führen. [37] [38] Weiterhin hat die
Länge der Telomere einen großen Einfluss auf das Replikationspotential einer Zelle, d.h. wie häufig
sie sich noch teilen kann. Mit abnehmender Länge der Telomere nimmt auch das
Replikationspotential ab. [6] [37]
Bei der Sequenz der telomerischen DNA handelt es sich um die Wiederholung der repetitiven
Sequenz 5'-TTAGGG-3'. Diese Sequenz ist hoch konserviert, d.h. sie befindet sich bei fast allen
Säugetieren einschließlich des Menschen am Guanin – reichen Strang. [6] [39]
Vor jeder Zellteilung muss zunächst die DNA repliziert werden. Dazu wird der Doppelstrang in seine
beiden Einzelstränge aufgespalten, die nun als Matrize für die DNA – Polymerase dienen. Diese stellt
zu jedem Mutterstrang den komplementären Tochterstrang her. Jedoch wird das Ende des einen
Tochterstranges nicht vollständig verdoppelt. Ursächlich hierfür ist die Replikationsrichtung der
DNA – Polymerase (5‘ - 3‘ - Richtung, unidirektional) und die Tatsache, dass die beiden Einzelstränge
sich antiparallel zueinander verhalten. Während der Leitstrang (Leadingstrand) vollständig in 5‘ - 3‘ -
Richtung synthetisiert wird, wird der Folgestrang (Laggingstrand) nur stückweise in Form kleiner
DNA – Fragmente (Okazaki – Fragmente) verdoppelt. Diese Fragmente werden miteinander
verknüpft. Als Startpunkt für die DNA – Polymerase dienen RNA – Primer, an denen die Polymerase
andockt und beginnt die Tochtersträng mit komplementären Nukleotiden aufzufüllen. Während für
den Leitstrang nur ein RNA – Primer notwendig ist, sind bei dem Folgestrang mehrere RNA – Primer
von Nöten, da die DNA – Polymerase für jedes Okazaki – Fragment neu an dem zu synthetisierenden
1 Einleitung 12
Tochterstrang ansetzen muss. Wenn die Replikation abgeschlossen ist, werden die RNA – Primer
entfernt und durch DNA ersetzt. Nur am 3‘ – Ende des parentalen Stranges kann der RNA – Primer
nicht durch Nukleotide ersetzt werden, sodass es bei jeder Zellteilung zu einer Verkürzung der
Telomere am 5‘ – Ende des Tochterstranges kommt. Der komplette Ablauf der Replikation ist in
Abbildung 13 dargestellt. [6] [37] [38]
Abbildung 13: lineare DNA - Enden - Problem [6]
In dieser Arbeit soll die Verkürzung der Telomere durch eine qRT PCR nachgewiesen werden. Dazu
werden Primer, die komplementär zur Sequenz der Telomere sind, eingesetzt. Der interkalierende
Farbstoff (Sybr Green) bindet dabei an die doppelsträngige DNA und je größer das Fluoreszenzsignal
ist, desto mehr Produkt ist entstanden und umso länger sind die Telomere.
Desweiteren kann in vivo die Seneszenz durch die Passagierung der Zellen über einen längeren
Zeitraum hin untersucht werden. Dadurch kann die Generationszeit bestimmt werden. Die
Generationszeit ist die Zeit, die für eine Verdopplung der Zellzahl benötigt wird. Sie berechnet sich
aus der Zahl der ausgesäten Zellen (N0) und der gezählten Zellen (N) nach einem bestimmten
Zeitintervall (∆t in h oder d) mit folgender Formel:
1 Einleitung 13
Somit lassen sich Rückschlüsse auf die Proliferationsfähigkeit der juvenilen und adulten Zellen ziehen.
Mit zunehmender Zahl der Passagierungen altern die MSC´s, was zu einer Verkürzung der Telomere
führt. Dies kann durch die Isolation der DNA und mit Hilfe einer qRT PCR nachgewiesen werden. [40]
Tabelle 4 zeigt die Sequenzen der forward und reverse Primer zum Nachweis der Telomerlängen. Wie
auch schon bei der qRT PCR der MSC´s – spezifischen Gene wird bei dem Nachweis der Telomer-
längen ein Housekeeping – Gen (Albumin) verwendet.
Tabelle 4: Primer für Seneszenznachweis
Nachweisgen bzw. -
abschnit Sequenz der Primer
Telomer fwd: ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT
rev: TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA
Albumin fwd: CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGaaatgctgcacagaatccttg
rev: GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGgaaaagcatggtcgcctgtt
2 Material und Methoden 14
2 Material und Methoden
2.1 Material
Zellkultur
• Trypan blue stain 0,4 % (15250, Gibco, Carlsbad – USA)
• Neubauerzählkammer (Neubauer improved, 0,100 mm Tiefe, 0,0025 mm², Laboroptik, Bad
Homburg – DE)
• Betaisodona (5564-0509, Mundipharma GmbH, Limburg – DE)
• Dispase II (165859, Roche, Grenzach-Wyhlen –DE)
• Collagenase A (1088793, Roche, Grenzach-Wyhlen –DE)
• Phosphate buffered saline (PBS) ohne Calcium und Magnesium (w/o Ca2+ Mg2+) (L182-10,
Biochrom AG, Berlin – DE)
• Zellsieb 100 µm (REF 352360, , BD Bioscience, Berlin – DE)
• Phosphate buffered saline (PBS) ohne Calcium und Magnesium (w/o Ca2+ Mg2+) (L182-10,
Biochrom AG, Berlin – DE)
• Zentrifuge Labofuge 400R (40281392, Heraeus, Thermo Scientific, Waltham – USA )
• Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), High Glucose, Natriumpyrovat, Glutamax
(31966, Invitrogen, Carlsbad – USA)
• 175 cm² Zellkulturflasche (REF 353112, BD Bioscience, Berlin – DE)
• Trypsin/EDTA (0,5 % / 0,2 %) (w/v) (65368, Biochrom AG, Berlin – DE)
• Fötales Rinderserum (FCS) (F7524, Lot 047K3395, Sigma, St. Louis – USA)
• Pen/Strep (P11-010, PAA, Pasching – AUS)
• Lichtmikroskop Nikon Eclipse TE 2000 S (501149,Nikon, Tokyo – JP)
• Brutschrank Heraeus Cytoperm 2 (40309866, Kendro, Langenselbold – DE)
• Thermomixer comfort (535508129, Eppendorf, Hamburg – DE)
• 12 Well – Platte (353043, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes – USA)
• Rabbitserum (R-4505, Sigma, St. Louis – USA)
• IBMX (I-5879, Sigma, St. Louis – USA)
• Indomethacin (Indo) (I-7379, Sigma, St. Louis – USA)
• Dexamethason (Dexa) (D-2915, Sigma, St. Louis – USA)
• Insulin (I-9278, Sigma, St. Louis – USA)
2 Material und Methoden 15
• Ascorbinsäure – 2 – Phosphat (ASAP) (A-8960, Sigma, St. Louis – USA)
• ß – Natriumglycerolphosphat (ß GP) (G-9891, Sigma, St. Louis – USA)
• Mikroskop Olympus IX51 (5H07510, Olympus, Tokio – JP)
• RNeasy Mini Kit (74106, Qiagen, Berlin – DE)
• Zellschaber (20080296, TPP – CH)
• Gefrierschrank -86 °C ULT Freezer (Thermo Forma, Thermo Scientific, Waltham – USA)
Chemikalien
• 10 % DMEM – Medium (DMEM + 50 ml FCS + 5 ml Pen/Strep)
• adipogenes Medium mit RS und Insulin (RS + Insulin)
� 15 % Rabbitserum (v/v)
� 1 % Pen/Strep (100x) (v/v)
� 0,5 mM IBMX (250x) (v/v)
� 0,1 mM Indo (1000x) (v/v)
� 1 µM Dexa (100x) (v/v)
� 700 nM Insulin (2500x) (v/v)
� bis zum Endvolumen auffüllen mit DMEM – Medium
• osteogenes Medium
� 10 % FCS (v/v)
� 1 % Pen/Strep (100x) (v/v)
� 100 nM Dexa (1000x) (v/v)
� 0,05 mM ASAP (1000x) (v/v)
� 10 mM ß - GP (100x) (v/v)
� bis zum Endvolumen auffüllen mit DMEM – Medium
Oil Red O – Färbung + von Kossa - Färbung
• Mikroskop Olympus IX51 (5H07510, Olympus, Tokio – JP)
• 4 % Formaldehyd (4979.1, Roth, Frankfurt – DE)
• Oil Red O – Pulver (O-0625, Sigma, St. Louis – USA)
• Isopropanol (9866.2, Roth, Frankfurt – DE)
• Mayer´s Hämatoxylin (Lillie´s Modified) (S3309, DakoCytomation, Hamburg – DE)
• Phosphate buffered saline (PBS) ohne Calcium und Magnesium (w/o Ca2+ Mg2+) (L182-10,
Biochrom AG, Berlin – DE)
2 Material und Methoden 16
• Ethanol (K928.2, Roth, Frankfurt – DE)
• Schüttler MS2 Minishaker Duomax (543-32210-00-3, IKA, Staufen – DE)
• Spektralphotometer UV/VIS S22 (89924, Libra Biochrom, Berlin – DE)
• Silbernitrat (31630, Sigma, St. Louis – USA)
• Pyrogallol (1,2,4 – Trihydroxybenzol) (1.00612.0050, Merck, Darmstadt – DE)
• Sodium Thiosulfat (S-1648, Sigma, St. Louis – USA)
• Kernechtrot – Aluminiumsulfatlösung (N069.1, Roth, Frankfurt – DE)
ALP – und Proteinkonzentrationsbestimmung
• PBS (L182-10, Biochrom AG, Berlin – DE)
• Triton X (X-100, Sigma, St. Louis – USA)
• Homogenisator Ultraturrax + Dispergierwerkzeug (T 25 basic + S 25 N-8G, 10.006680,
Omnilab-Laborzentrum, Bremen – DE)
• 96 Well – Platte (353936, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes – USA)
• 4 – NPP (020M8214, Sigma, St. Louis – USA)
• Platten – Reader (Safire, Tecan, Männedorf – CH)
• peqGold Trifast (30-2020, peqlab, Erlangen – DE)
• Chloroform (3313.1, Roth, Frankfurt – DE)
• Zentrifuge fresco Heraeus (40338868, Kendro, Langenselbold – DE)
• Isopropanol (9866.2, Roth, Frankfurt – DE)
• Guanidinhydrochloride (2702575, OMNI – Life Science, Bremen – DE)
• Rotations-Vakuum-Konzentrator + LABOVAC-Membranvacuumsystem (100225 + 103042,
Christ + ILMVAC, Osterode am Harz + Ilmenau – DE)
• Thermomixer comfort (535508129, Eppendorf, Hamburg – DE)
• BCA Protein Assay Kit (23227, Pierce, Bonn – DE)
cDNA - Synthese
• dNTP´s (201900, Qiagen, Berlin – DE)
• Oligo – dt – Primer (S0132, Fermentas, St. Leon - Rot – DE)
• 5x First Strand Buffer (M531A, Promega, Madison – USA)
• M – MLV – Reverse Transkriptase (M170B, Promega, Madison – USA)
• RNase Inhibitor (N211B, Promega, Madison – USA)
• DEPC – Wasser (K028.2, Roth, Frankfurt – DE)
2 Material und Methoden 17
• Thermomixer comfort (535508129, Eppendorf, Hamburg – DE)
qRT PCR
• Quantifast Sybr Green PCR Kit (204052, Qiagen, Berlin – DE)
• Rotor – Gene 3000 (Corbett Research, Berlin – DE)
Primer
• PPARγ (eurofins mwg|operon, Ebersberg – DE)
• GAPDH (eurofins mwg|operon, Ebersberg – DE)
• Osteocalcin (eurofins mwg|operon, Ebersberg – DE)
Durchflusszytometrie
• Trypsin/EDTA (0,5 % / 0,2 %) (w/v) (65368, Biochrom AG, Berlin – DE)
• FACS – Puffer ( auf 1 l: 80 g Natriumchlorid, 2 g Kaliumchlorid, 12,2 g
Natriumhydrogenphosphat, 2 g, Kaliumdihydrogenphosphat, 10 m 0,5 M EDTA und bis zum
Schluss mit aqua bidest. auffüllen
• 96 Well – Platte (353936, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes – USA)
• Neubauerzählkammer (Neubauer improved, 0,100 mm Tiefe, 0,0025 mm², Laboroptik, Bad
Homburg – DE)
• Plattenzentrifuge Multifuge 3 S-R (40286002, Kendro, Langenselbold – DE)
• FACS – Messgerät LSR II Cell Analyzer (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes – USA)
Primärantikörper
• CD73 PE (550257, BD Bioscience, Berlin – DE)
• CD90 Fitc (555593, BD Bioscience, Berlin – DE)
• CD105 Fitc (01993, Biozol, Eching – DE)
• IgG1 (Fitc) (M075-4, MBL, Madison – USA)
• CD105 (Fitc) (01993, Biozol, Eching – DE)
• IgG1 (PE) (550617, BD Bioscience, Berlin – DE)
• CD29 (PE) (303004, Biolegend, San Diego – USA)
• CD31 (PE) (303106, Biolegend, San Diego – USA)
• CD45 (PE) (P7687, Sigma, St. Louis – USA)
• CD73 (PE) (550257, BD Bioscience, Berlin – DE)
• CD166 (PE) (343903, Biolegend, San Diego – USA)
2 Material und Methoden 18
• IgG1 (Alexa 700) (400143, Biolegend, San Diego – USA)
• CD90 (Alexa 700) (328119, Biolegend, San Diego – USA)
• IgG1 (PerCP) (400147, Biolegend, San Diego – USA)
• CD34 (PerCP) (343519, Biolegend, San Diego – USA)
Seneszenz
• 175 cm² Zellkulturflasche (REF 353112, BD Bioscience, Berlin – DE)
• 25 cm² Zellkulturflasche (REF 353014, BD Bioscience, Berlin – DE)
• Trypan blue stain 0,4 % (15250, Gibco, Carlsbad – USA)
• Neubauerzählkammer (Neubauer improved, 0,100 mm Tiefe, 0,0025 mm², Laboroptik, Bad
Homburg – DE)
• Phosphate buffered saline (PBS) ohne Calcium und Magnesium (w/o Ca2+ Mg2+) (L182-10,
Biochrom AG, Berlin – DE)
• Zentrifuge Labofuge 400R (40281392, Heraeus, Thermo Scientific, Waltham – USA)
• Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), High Glucose, Natriumpyrovat, Glutamax
(31966, Invitrogen, Carlsbad – USA)
• Trypsin/EDTA (0,5 % / 0,2 %) (w/v) (65368, Biochrom AG, Berlin – DE)
• Brutschrank Heraeus Cytoperm 2 (40309866, Kendro, Langenselbold – DE)
• peqGold Trifast (30-2020, peqlab, Erlangen – DE)
• Chloroform (3313.1, Roth, Frankfurt – DE)
• Ethanol (K928.2, Roth, Frankfurt – DE)
• Thermomixer comfort (535508129, Eppendorf, Hamburg – DE)
• Rotations-Vakuum-Konzentrator + LABOVAC-Membranvacuumsystem (100225 + 103042,
Christ + ILMVAC, Osterode am Harz + Ilmenau – DE)
• Zentrifuge fresco Heraeus (40338868, Kendro, Langenselbold – DE)
• Natriumcitrat (1.06448.1000, Merck, Darmstadt – DE)
• NanoDrop ND – 100 (5354, peqlab, Erlangen – DE)
• Natriumhydroxid (6771.1, Roth, Frankfurt – DE)
• Thermocycler Primus 96 (1539021812, eurofins mwg|operon, Ebersberg – DE)
• AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase (4398833, Applied Biosystems, Darmstadt – DE)
Primer
• Telomer (eurofins mwg|operon, Ebersberg – DE)
• Albumin (eurofins mwg|operon, Ebersberg – DE)
2 Material und Methoden 19
2.2 Methoden
Alle sterilen Arbeiten wurden unter der Sterilwerkbank der Firma Heraeus durchgeführt. Die
verwendeten Chemikalien wurden bevor sie genutzt wurden auf 37 °C vorgewärmt und die
Zellzählungen erfolgten im Verhältnis 1 : 10 oder 1 : 5 (Analyse der Proliferationsfähigkeit, Abschnitt
2.2.7.1) mit Trypanblau. Dabei gelangt der Farbstoff nur in tote Zellen, da diese keine intakte
Zellmembran mehr besitzen. Desweiteren betrug die zu pipettierende Menge an Lösungen, wenn
nicht anders angegeben, für ein Well einer 12 - Well – Platte 1 ml.
2.2.1 Zellisolation und Zellkultur
Die Hautbiopsien stammten aus Kliniken in Leipzig und wurden nur nach dem Einverständnis der
Patienten und gemäß den ethischen Richtlinien der Universität Leipzig verwendet.
Diese wurden direkt nach der Operation in sterilem PBS bei 4 °C gelagert. Für die Weiterverarbeitung
der Hautbiopsien wurden diese zunächst gesäubert und desinfiziert. Dazu wurden die Hautproben
mit frischem PBS gewaschen und für 20 min mit Betaisodona desinfiziert. Anschließend wurden die
Hautbiopsien nochmals mit PBS gespült, bis diese frei von dem Desinfektionsmittel waren. Mit Hilfe
einer Pinzette und eines Skalpells wurde die subkutane Fettschicht entfernt und die Hautbiopsien in
5 x 5 mm große Stücke zerschnitten.
Um nun das Ablösen der Epidermis von der Dermis zu erleichtern, wurden die Hautstückchen in
Dispase II – Lösung (2,5mg/ml in DMEM) gelegt und bei 4 °C für minimal 18 und maximal 24 h
inkubiert. Danach wurden die Biopsien für 30 min bei 37 °C inkubiert, um die Proben zu erwärmen.
Nun konnte die Epidermis mittels Pinzette von der Dermis abgezogen werden.
Für die Isolierung der Fibroblasten aus den Dermisstücken wurden diese in 15 ml Collagenase
(0,075% in PBS) über Nacht bei 37 °C und 300 rounds per minute (rpm) inkubiert. Danach wurde die
Zellsuspension durch ein 100 µm Zellsieb gegeben und für 5 min bei 1800 rpm zentrifugiert.
Anschließend wurde das Pellet in 10 %igem DMEM resuspendiert und in 175 - cm² -
Zellkulturflaschen (ZKF) mit DMEM bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.
Bei konfluentem Zellwachstum der Zellen (ca. 85 % des ZKF – bodens bedeckt) wurden diese
subkultiviert. Dazu wurde das Medium abgesaugt und die ZKF zweimal mit PBS gespült. Um die Zellen
abzulösen, wurden diese mit 5 ml Trypsin für 5 min bei 37 °C inkubiert. Nachdem sich die Zellen
vollständig abgelöst hatten, wurde die Enzymreaktion durch die Zugabe von 15 ml 10 %igen DMEM
gestoppt und die Zellsuspension wurde für 5 min bei 1800 rpm zentrifugiert. Anschließend wurde das
2 Material und Methoden 20
Pellet in 10 ml 10 %igem DMEM resuspendiert und die Zellzahl bestimmt. Es wurden immer
1 – 1,5 ∙ 106 Zellen pro 175 cm² ZKF ausgesät und bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.
2.2.2 Vergleich der Multipotenz durch adipogene Differenzierung
Für den Vergleich der Multipotenz durch adipogene Differenzierung wurden Zellen von drei juvenilen
und drei adulten Hautproben eingesetzt. Tabelle 5 zeigt um welche Art der Hautbiopsie es sich
handelt. Desweiteren wird noch das Alter des Patienten und welche Passage für die Differenzierung
genutzt wurde, angegeben.
Tabelle 5: verwendete Patienten für die adipogene Differenzierung
Patient Alter des
Patienten Art der Biopsie Passage Alterung
# 9 43 Jahre Brust F5 adult
# 12 24 Jahre Schamlippe F5 adult
# 13 10 Jahre Vorhaut F5 juvenil
# 14 5 Jahre Vorhaut F5 juvenil
# 17 10 Jahre Vorhaut F5 juvenil
# 18 40 jahre Brust F5 adult
2.2.2.1 Differenzierung zu Adipozyten
Zunächst wurden zwei 12 - Well – Platten (RS + Insulin und Kontrolle) pro Patient mit jeweils 30 000
Zellen pro Well ausgesät. Nach zweitägiger Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2 wurde das
Differenzierungsmedien RS + Insulin hinzugegeben. Die Platten wurden bei 37 °C und 5 % CO2
inkubiert und alle 3 – 4 Tage wurde das adipogene Differenzierungsmedium gewechselt. Die
Differenzierung erstreckte sich über einen Zeitraum von 8 Tagen. Nach Ablauf dieser Zeit wurden die
Platten wie folgt behandelt: 3 Wells dienten der Zellzählung, 3 Wells wurden mit Oil Red O angefärbt
und 6 Wells dienten der RNA – Isolation. Die Kontrollplatten wurden mit 10 %igen DMEM kultiviert.
Auch hier wurde aller 3 – 4 Tage das Medium gewechselt. Abbildung 14 fasst noch einmal das
Bearbeitungsschema der adipogenen Differenzierungsplatten und ihrer jeweiligen Kontrollplatten
zusammen.
2 Material und Methoden 21
Abbildung 14: Bearbeitungsschema adipogene Differenzierungsplatten + Kontrollplatten
2.2.2.2 Methoden zum Vergleich der Multipotenz der Adipozyten
Um die Zellen färben zu können, wurden zunächst die Oil Red O – Stammlösung, - Gebrauchslösung
und die Mayers´s Hämatoxylin – Lösung hergestellt. Tabelle 6 zeigt in welchem Verhältnis und in
welchen Substanzen die verwendeten Chemikalien gelöst wurden.
Tabelle 6: Zusammensetzung der Chemikalien für Oil Red O - Färbung
Lösung Zusammensetzung Volumen
Oil Red O - Stammlösung Oil Red O – Pulver + Isopropanol 530 mg + 150 ml
Oil Red O -
Gebrauchslösung Stammlösung + Aqua bidest. 36 ml + 24 ml
Mayer´s Hämatoxylin –
Lösung Hämatoxylin + PBS 20 ml + 40 ml
Nach dem Absaugen der Differenzierungsmedien wurden die Wells zweimal mit PBS gewaschen und
die Zellen mit 4 %igen Formaldehyd für 10 min fixiert. Danach wurden die Zellen einmal mit Aqua
bidest. und einmal mit 50 %igen Ethanol gewaschen. Anschließend wurden die Zellen für 15 min mit
der Oil Red O – Gebrauchslösung angefärbt. Um überschüssige Färbelösung zu beseitigen, wurden
die Wells erneut zweimal mit 50 % Ethanol gewaschen. Im Anschluss daran erfolgte die
Gegenfärbung der Zellkerne mit Mayer´s Hämatoxylin – Lösung für 2 min bei RT. Die Wells wurden
danach vorsichtig unter Leitungswasser abgespült und unter dem Mikroskop ausgewertet. Wichtig
dabei war, dass immer etwas Wasser auf den Zellen war, damit sie nicht austrockneten.
Um nun den Farbstoff wieder herauszulösen, wurde zunächst das Wasser abgesaugt und die Wells
leicht angetrocknet. Danach wurde der Farbstoff mit 100 %igem Isopropanol für 10 min und bei
2 Material und Methoden 22
300 rpm eluiert. Von dieser eluierten Lösung wurde nun 1 ml in eine Küvette pipettiert und für jedes
Well die Absorption bei 500 nm gemessen. Der 100 %ige Isopropanol diente dazu als Leerwert. Um
später die Konzentration des Oil Red O´s zu bestimmen, wurde eine Standardkurve angelegt. Diese
wurde aus 3 verschiedenen Verdünnungen (0,75; 0,1; 0,05 mM) angelegt. Anhand der
Regressionsgerade (Anhang Kapitel 6.2 Ergebnisse der adipogenen Differenzierung, Abb. 43) und der
gemessenen OD´s, konnten nun die Konzentrationen für die einzelnen Wells bestimmt werden.
Für die Quantifizierung der gemessenen OD - Werte wurden zunächst die Zellzahlen von 3 Wells pro
Patient bestimmt. Dafür wurde das Differenzierungsmedium abgesaugt und die Wells mit 500 µl
Trypsin/EDTA bei 37 °C und 5 % CO2 für 5 min inkubiert. Wenn nach dieser Zeit die Zellen noch nicht
vollständig abgelöst oder vereinzelt waren, wurde dies durch leichtes Klopfen an der Platte oder
durch einen Zellschaber erreicht. Danach wurden in die Wells jeweils 500 µl FCS pipettiert und die
Zellsuspension mehrfach resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen mittels Neubauer-
zählkammer gezählt.
Für die Isolation der RNA wurde das RNeasy® Mini Kit von Qiagen verwendet. Dazu wurde zu dem
mitgelieferten RLT – Puffer im Verhältnis 1 : 100 ß – Merkaptoethanol hinzugegeben. Von dieser
Lösung wurde dann in jedes Well, aus dem RNA isoliert werden sollte, 150 µl hinein pipettiert.
Zusätzlich wurden die Zellen noch mit einem Zellschaber zerstört. Der Puffer wurde aus den Wells in
ein 1,5 ml Eppi überführt und bei -80 °C bis zur Weiterverarbeitung gelagert. Es wurden immer 3
Wells einer Platte miteinander gepoolt, um so eine ausreichende Menge an RNA zu erhalten.
Zur Aufreinigung der RNA wurde das bereitgestellte Protokoll des Kits genutzt (6.1 RNA -
Aufreinigung).
2.2.3 Vergleich der Multipotenz durch osteogene Differenzierung
Für die osteogene Differenzierung wurden 2 juvenile und 2 adulte Patienten verwendet. Tabelle 7
zeigt welche Patienten genutzt wurden.
Tabelle 7: verwendete Patienten für die osteogene Differenzierung
Patient Alter des
Patienten
Art der Biopsie Passage Alterung
# 12 24 Jahre Schamlippe F5 adult
# 13 10 Jahre Vorhaut F5 juvenil
# 14 5 Jahre Vorhaut F5 juvenil
# 18 40 Jahre Brust F5 adult
2 Material und Methoden 23
2.2.3.1 Differenzierung zu Osteoblasten
Wie auch bei der adipogenen Differenzierung wurden bei der osteogenen Differenzierung 30 000
Zellen pro Well einer 12 Well – Platte ausgesät. Nach 2 Tagen Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2
wurde das osteogene Medium auf die Zellen gegeben. Zu jeder Differenzierungsplatte wurde eine
Kontrollplatte mit 10% DMEM angelegt. Aller 3 – 4 Tage wurde das osteogene Medium bzw.
Kontrollmedium gewechselt und die Differenzierung erstreckte sich über einen Zeitraum von
27 Tagen. Die Inkubation der Platten erfolgte über den gesamten Differenzierungszeitraum bei 37 °C
und 5 % CO2. Nach Beendigung der Differenzierung wurden 3 Wells zur Bestimmung der ALP –
Aktivität, 1 Well für die von Kossa – Färbung, 6 Wells zur RNA – Isolierung und bei 2 Wells die
Proteinkonzentration bestimmt. Abbildung 15 zeigt noch einmal das Bearbeitungsschema der
osteogen Platten + Kontrollplatten.
Abbildung 15: Bearbeitungsschema osteogene Platten + Kontrollplatten
2.2.3.2 Methoden zum Vergleich der Multipotenz der Osteoblasten
Für die qualitative Kontrolle der Osteoblasten wurden diese durch die von Kossa – Färbung
angefärbt. Zunächst wurden die zu färbenden Wells zweimal mit PBS gewaschen und anschließend
für 10 min mit 10 % Formaldehyd fixiert. Danach wurden die Zellen einmal mit PBS und zweimal mit
Aqua bidest. gewaschen. Zum Austausch der Carbonat – und Phosphationen wurden die Wells für
30 min mit einer 5 %igen Silbernitratlösung bei Tageslicht inkubiert. Anschließend wurden die Wells
zweimal mit Aqua bidest. gewaschen. Die Reduzierung der Silberionen erfolgte durch eine 1 %ige
Pyrogallollösung für 2 – 3 min. Nach einem erneutem Waschvorgang (2 mal mit Aqua bidest.) wurden
die Zellen mit einer 5 %igen Natriumthiosulfatlösung inkubiert (2 – 3 min), um das Ergebnis der
Färbung zu fixieren. Nach einem letzten Waschschritt mit Aqua bidest. wurden die Zellkerne mit
Kernechtrot für 7 min und bei RT angefärbt. Nachdem die Wells kurz mit Aqua bidest. gespült
wurden, konnten die Zellen unter dem Mikroskop ausgewertet werden.
2 Material und Methoden 24
Die Quantifizierung der Osteoblasten erfolgte durch die Bestimmung der Alkalischen Phosphatase –
Aktivität. Dazu wurde das Differenzierungsmedium abgesaugt und die Zellen einmal vorsichtig mit
PBS gewaschen. Danach wurden die Zellen mit 0,5 %igen Triton X (in PBS) abgelöst (2 ml bei 12 Well
– Platte) und in ein 15 ml Falcon überführt. Die Zellsuspension wurde mittels eines Homogenisators
lysiert und 3 Wells mit je 50 µl des Lysats in eine 96 Well – Platte als Dreifachbestimmung gegeben.
Um später die aufgenommene ALP – Konzentration zu bestimmen, wurde einmal ein Standard
verschiedener Konzentrationen mitgeführt. Dieser setzte sich aus Nitrophenol in 0,5 % Triton X in PBS
zusammen. (Konzentrationen: 0; 0,5; 0,075; 0,1; 0,5; 0,75; 1 mM). In jedes Well, das Lysat enthielt,
wurden 200 µl des Substrats (4 – NPP) gegeben. Danach wurde die Platte bei 37 °C in den Platten -
Reader gestellt. Die Absorption wurde bei 405 nm und nach 5, 10, 15, 20, 25 und 30 min gemessen.
Für die Berechnung wurden letztendlich die ALP-Werte nach 30 min Inkubation verwendet.
Um die gemessenen ALP – Werte zu quantifizieren, wurden zusätzlich aus 2 Wells pro Platte, die
Proteine isoliert und gemessen. Dazu wurde in die Wells jeweils 500 µl Trifast gegeben, die Zellen mit
Hilfe eines Zellschabers abgelöst und die Suspension in ein 2 ml - Eppi überführt. Danach wurden zu
jeder Zellsuspension 100 µl Chloroform hinzu gegeben, die Eppis für 15 sec fest geschüttelt und für
5 min bei RT inkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt bei 12 000 rpm, 4 °C und für 5 min waren in
dem Eppi 3 Phasen zu erkennen: untere rote Phase (Phenol – Chloroform – Phase) beinhaltet
Proteine und DNA, die mittlere – oder Interphase beinhaltet ebenfalls Proteine und DNA und die
farblose wässrige obere Phase enthält die RNA. Diese farblose Phase wurde vorsichtig entfernt und
nun konnten aus den anderen beiden Phasen die Proteine isoliert werden. Dazu wurde zunächst die
DNA aus der Phenol – Chlorofom – Phase ausgefällt. Dafür wurde zu den beiden Phasen 150 µl
100 %iger Ethanol hinzu gegeben und alles gut durchmischt. Die Lösung wurde für 3 min bei RT
inkubiert und danach bei 1800 rpm und für 15 min bei 4 °C zentrifugiert, um die DNA zu
sedimentieren. Anschließend konnte der Überstand (enthält Proteine) entfernt werden und in ein
neues Tube überführt werden.
Als nächstes wurden die Proteine ausgefällt, gewaschen und gelöst. Für das Ausfällen der Proteine
wurde die überführte Lösung mit 1 ml Isoproponal versehen und für 10 min bei RT inkubiert. Danach
erfolgte ein Zentrifugationsschritt für 10 min bei 12 000 rpm und 4 °C. Der Überstand wurde
verworfen und das Pellet in 1 ml 0,3 M Guanidinhydrochlorid (in 95 % Ethanol) gewaschen. Während
jedes Waschzykluses wurde das Pellet für 20 min bei RT gelagert und anschließend für 5 min bei
7 300 rpm und 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde insgesamt zweimal gewaschen. Nach dem letzten
Waschschritt wurde das Pellet in 1 ml 100 %igen Ethanol gevortext und ebenfalls für 20 min bei RT
inkubiert und anschließend für 5 min bei 5500 rpm und bei 4 °C zentrifugiert. Zur Trocknung des
Proteinpellets wurde nach dem Zentrifugationsschritt der Überstand verworfen und das Pellet bei
50 °C und für 5 min in einer Vakuumzentrifuge getrocknet. Um das Pellet aufzulösen wurde es in 1 %
2 Material und Methoden 25
SDS resuspendiert und bei 50 °C für 5 min inkubiert. Die Entfernung von unlöslichen Bestandteilen
und extrazellulären Matrixbestandteilen erfolgte durch eine letzte Zentrifugation für 10 min bei
10 000 rpm und 4 °C. Danach wurde der Überstand in ein neues Tube überführt und konnte für die
Proteinkonzentrationsbestimmung verwendet werden.
Für die Bestimmung der Proteinkonzentration wurden das BCA Protein Assay Kit von Pierce
verwendet. Es wurden immer 2 Wells einer 96 Well - Platte mit der Probe eines Patienten gefüllt.
Anschließend wurden 200 µl der Nachweisreagenz (enthält Albumin) zu den Wells pipettiert und die
Platte für 30 min bei 37 °C inkubiert. Im Anschluss daran wurde die Platte in den Platten – Reader
gestellt und die OD bei 562 nm gemessen. Wie auch bei der ALP – Bestimmung wurde hier ein
Standard (wie im Handbuch beschrieben) mitgeführt, um anschließend die Konzentration des
Proteins zu bestimmen.
Die RNA wurde wie bei der adipogenen Differenzierung aus den Wells isoliert und mit dem RNeasy
Mini Kit von Qiagen aufgereinigt und gemessen.
2.2.4 cDNA – Synthese
Für die cDNA – Synthese wurden pro Patient 0,5 µg isolierte und aufgereinigte RNA mit 0,5 µl Oligo –
dT – Primern vermischt und mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) – Wasser auf 13,5 µl aufgefüllt. Die
Lösungen wurden kurz herunter zentrifugiert und für 5 min bei 70 °C inkubiert, um die
Sekundärstrukturen zu zerstören. Danach erfolgte die Zugabe von 11,5 µl Mastermix zu jedem
Ansatz. Tabelle 8 zeigt die Zusammensetzung des cDNA – Mastermixes.
Tabelle 8: Volumina cDNA - Synthese
Ansatz zu pipettierende Volumen
cDNA – Synthese
Mastermix
5 x First Strand Buffer
dNTP – Mix
RNase Inhibitor
M – MLV – Reverse Transkriptase
Gesamtvolumen
5 µl
5 µl
0,5 µl
1 µl
11,5 µl
Die Proben wurden vorsichtig vermischt und herunter zentrifugiert. Der Gesamtansatz von 25 µl
wurde für 1 h bei 42 °C inkubiert. Danach wurden die Proben noch einmal kurz zentrifugiert und
anschließend bei 70 °C für 10 min inkubiert. Im Anschluss daran wurden die Proben, bis zum
Nachweis durch die qRT PCR, bei -20 °C eingefroren.
2 Material und Methoden 26
2.2.5 Analyse der Expression von MSC´s – spezifischen Genen
Für den Nachweis der adipogen bzw. osteogen spezifischen Genen wurden die Patienten #12, #13,
#14 und #18 verwendet. Als Nachweisgen für alle adipogenen Proben diente das PPARγ und für die
die osteogenen Proben das Osteocalcin. Alle Proben wurden als Doppelbestimmung durchgeführt.
Desweiteren wurde jede osteogene bzw. adipogene Probe auf das GAPDH untersucht und pro Gen
wurde eine Wasserprobe als Negativkontrolle angelegt.
Für die qRT PCR wurde das Quantifast SYBR Green PCR Kit von Qiagen verwendet. Zunächst wurde
der Reaktionsmix für alle Proben hergestellt. Tabelle 9 zeigt die Zusammensetzung des Mastermixes.
Als Template diente die in 2.2.3 hergestellte cDNA.
Anschließend wurden alle Proben auf die PCR – Gefäße verteilt und sorgfältig durchmischt. Die
Tabelle 10 zeigt nach welchem Programm die qRT PCR durchgeführt wurde. Nach jedem
Elongationsschritt wurde die Fluoreszenz gemessen.
Tabelle 9: Zusammensetzung Mastermix qRT PCR
Komponente Volumen/Reaktion Finale Konzentration
2x QuantiFast SYBR Green 10µl 1x
Primer fwd (10µM) 1 1µM
Primer rev (10µM) 1 1µM
cDNA 2µl 50ng/Reaktion
RNase-freies Wasser 6µl
Gesamtreaktionsvolumen 20µl
Tabelle 10: Ablauf qRT PCR
Schritt Zeit Temperatur
1. Initiale Denaturierung 5 min 95 °C
2. Denaturierung 10 s 95 °C
3. Annealing und Datenaufnahme 30 s 60 °C
4. Extension und Datenaufnahme 20 s 80 °C
Die Schritte 2 bis 4 wurden in 40 Zyklen wiederholt
Nach dem Ende der qRT PCR wurde noch eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt, um die Spezifität
der Proben zu bestimmen. Dabei wurde die Temperatur der Proben immer um 5 °C erhöht von 70 °C
bis auf 95 °C. Nach jeder Erhöhung wurde die Fluoreszenz gemessen.
2 Material und Methoden 27
2.2.6 Flow Cytometry
Für die Messung mittels Flow Cytometry wurden die Zellen mit Trypsin abgelöst, herunter
zentrifugiert (1800 rpm, 5 min), in 3 ml FACS – Puffer wieder aufgenommen und gezählt
(Neubauerzählkammer). Es wurden 100 000 – 150 000 Zellen pro Well einer 96 - Well – Platte
ausgesät. Die Platten wurden bei 1 800 rpm, RT und für 5 min zentrifugiert. Anschließend wurde der
Überstand verworfen und die Luftblasen mittels einer Kanüle zerstört. Danach erfolgte die Zugabe
von Intraglobulin (IG) direkt in die Wells. Die Primärantikörper, welche mit einem Fluoreszenz-
farbstoff gekoppelt waren, wurden direkt nach der Zugabe des IG´s dazu pipettiert und bei 4 °C und
350 rpm für 60 min im Dunkeln inkubiert. Es wurden immer insgesamt 10 µl (IG + Primärantikörper)
in die Wells pipettiert. Im Kapitel 6.6 Ergebnisse Durchflusszytometrie des Anhangs wird in der
Tabelle 22 die Konzentration der einzelnen Primärantikörper angegeben.
Im Anschluss daran wurden die Platten zweimal gewaschen. Die Waschschritte hatten folgenden
Ablauf. Zuerst wurden 150 µl FACS – Puffer in jedes Well pipettiert, die Zellen in diesem
resuspendiert und die Platten anschließend bei 1 800 rpm, RT und für 5 min zentrifugiert. Der
Überstand wurde verworfen und die Luftblasen wieder zerstört. Nach dem zweimaligen Waschen
wurden die Zellen in 250 µl FACS – Puffer aufgenommen und in die FACS – Röhrchen überführt. Die
Messungen fanden am Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) Leipzig in der
Abteilung für Fluoreszenz - Technologien statt. Bei der Analyse wurden immer 10 000 Zellen
gemessen.
2.2.7 Nachweis der Seneszenz
Tabelle 11 zeigt welcher Patient, welche Passage, welches Alter und die Art der Biopsie für den
Nachweis der Alterung der MSC´s genutzt wurde. Alle Zentrifugationsschritte der DNA - Isolation
wurden, wenn nicht anders angegeben, bei 4 °C durchgeführt.
Tabelle 11: verwendete Patienten für den Nachweis der Seneszenz
Patient Alter des Patienten Art der Biopsie Passage
# 12 24 Jahre Schamlippe F1
# 13 10 Jahre Vorhaut F1
# 14 5 Jahre Vorhaut F1
# 18 40 Jahre Bauch F1
2 Material und Methoden 28
2.2.7.1 Analyse der Proliferationsfähigkeit
Bei der Proliferationsfähigkeit handelt es sich um das in vitro Wachstum der Zellen. Dieses sollte über
mehrere Passagen untersucht und Rückschlüsse auf Effizienz der Proliferation und somit die
Seneszenz der MSC´s gezogen werden.
Dazu wurden die Patienten in Tabelle 11 als Passage 1 (F1) ausgesät und solange kultiviert, bis die
Zellkulturflaschen (ZKF, 175 cm²) konfluent gewachsen waren. Alle Ablösungsschritte wurden mit
Trypsin/EDTA durchgeführt. Dafür wurden die jeweiligen ZKF zuerst mit PBS gespült und danach mit
5 ml (175 cm²) oder 2 ml (25 cm²) für 5 min bei 37 °C inkubiert. Die Enzymwirkung wurden mit
10 %igem DMEM abgestoppt (dreifaches Volumen an Trypsin/EDTA) und anschließend die Zellen mit
Hilfe der Neubauerzählkammer gezählt.
Für den Vergleich der Proliferationsfähigkeit wurden die konfluent gewachsenen Zellen in den
175 cm² ZKF abgelöst, gezählt und pro Patient wurden 100 000 Zellen in je eine 25 cm² ZKF gegeben
und bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Aller 3 bis 4 Tage wurden die Zellen aus den 25 cm² ZKF
abgelöst, gezählt und als neue Passage mit 100 000 Zellen ausgesät. Diese Prozedur wurde bis zur
Passage 15 durchgeführt.
2.2.7.2 Nachweis der Telomerlängen
Für den Nachweis der Telomerlängen wurde aus der Passage 1, 10, und 15 die DNA isoliert. Dazu
wurden die Zellen mittels Trypsin/EDTA abgelöst und in 500 µl Trifast gelöst. Wie auch schon bei der
Extraktion der Proteine wurde zu der Suspension 100 µl Chloroform gegeben. Nach kurzem kräftigen
Schütteln und der Inkubation für 3 – 5 min bei RT, wurde die Lösung für 5 min bei 12 000 rpm
zentrifugiert. Die entstandene obere RNA – Phase wurde entfernt und zu den anderen beiden Phasen
wurde 500 µl 100 %iger Ethanol gegeben. Alles wurde gut durchmischt und bei RT für 3 min
inkubiert. Danach erfolgte ein Zentrifugationsschritt für 15 min bei 4 500 rpm. Nachdem sich die DNA
abgesetzt hatte, konnte der Überstand entfernt und das Pellet zweimal in 1 ml 0,1 M Natriumcitrat
(in 10 % Ethanol) gewaschen werden. Bei jedem Waschschritt wurde die DNA für 30 min bei RT in
0,1 M Natriumcitrat inkubiert und anschließend für 5 min bei 4 500 rpm zentrifugiert. Danach wurde
die DNA in 1 ml 75 %igen Ethanol aufgenommen und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die
Lösung wurde wiederholt geschüttelt und anschließend für 5 min bei 4 500 rpm zentrifugiert. Der
Überstand wurde entfernt und das DNA – Pellet wurde für 5 min bei 50 °C in einer Vakuumzentrifuge
getrocknet. Im Anschluss daran wurde das Pellet in 100 µl 8 mM Natriumhydroxid (NaOH) – Lösung
2 Material und Methoden 29
gelöst, für 5 min bei 50 °C inkubiert und nochmals für 10 min bei 12 000 rpm zentrifugiert. Zum
Schluss wurde der DNA – Gehalt der einzelnen Proben mittels NanoDrop bestimmt.
Durch eine Probe – PCR wurde überprüft, ob die Primer an die jeweiligen Sequenzen der isolierten
DNA binden. Dazu wurde das Programm der qRT PCR (Tabelle 13) für eine normale PCR angewendet.
Für die PCR wurde das AmpliTag Gold 360 DNA Polymerase Kit von Applied Biosystems verwendet.
Tabelle 12 zeigt die Zusammensetzung des Mastermixes und die Konzentration der einzelnen
Komponenten. Nach dem Mischen der einzelnen Komponenten wurde die PCR nach dem Programm
in Tabelle 13 durchgeführt.
Tabelle 12: Zusammensetzung Mastermix PCR Telomerlängen
Komponente Volumen bzw. Konzentration
DNA 20 ng
SYBR Green I 0,75 x
AmpliTaq Gold Puffer 10 x
MgCl2 25 mM
dNTP´s 2 mM
GC – Enhancer 0,25 x
AmpliTaq Gold Polymerase 5 U/µl
Primer (rev. und fwd.) 10 µM von jedem Primer
Tabelle 13: PCR - Programm Telomerlängen
Schritt Temperatur Zyklenzahl
1. Initiale Denaturierung 15 min bei 95 °C 1
2. Denaturierung 15 s bei 94 °C,
15 s bei 49 °C 2
3. Annealing/Extension
15 s bei 94 °C,
10 s 62 °C,
15 s bei 74 °C
32
3 Ergebnisse und Auswertung 30
3 Ergebnisse und Auswertung
3.1 Adipogene Differenzierung
Eine positive Differenzierung zu Adipozyten wurde bei jedem einzelnen Patienten erreicht. Die Bilder
(Abb. 31 – 42) der Differenzierungen befinden sich im Anhang (6.2 Bilder Oil Red O – Färbung). Man
erkennt, dass keine relevanten Unterschiede zwischen den einzelnen Patienten aufgetreten sind.
Qualitativ gesehen haben sich die Proben in etwa gleich differenziert.
Für die quantitative Auswertung der Daten wurden jeweils die Daten der OD – Messung jedes Wells
auf die gezählte Zellzahl des gleichen Wells bezogen. Für jede Differenzierungsplatte wurden die
Werte der 3 Wells zusammengefasst, zwischen juvenil und adult unterschieden und die Ergebnisse
anschließend graphisch dargestellt (Abb. 16).
Abbildung 16: Vergleich juvenil - adult (adipogen)
Dabei ist zu erkennen, dass mit zunehmendem Alter der Patienten die Menge an aufgenommenen
Oil Red O stark abnimmt. Dies ist auf die geringere Proliferationseffizienz der adulten Zellen bzw. auf
die Effizienz der Multipotenz zurückzuführen. Durch das RS wird im Allgemeinen eine schnelle
Induktion der Adipozytenbildungen hervorgerufen, jedoch erfolgt bei den adulten Zellen eine sehr
langsame Bildung dieser Fettzellen. Die Messungen der OD ergaben desweiteren, dass bei den
juvenilen MSC´s viel mehr Farbstoff eingelagert wurde und somit auch die Bildung der Adipozyten
viel effizienter und ergiebiger ausfällt. Daraus lässt sich schließen, dass die Multipotenz, speziell die
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,035
0,04
RS juvenil Kontrolle juvenil RS adult Kontrolle adult
c(O
RO
) /
Ze
llza
hl
in m
M
Differenzierung
Vergleich juvenil - adult
3 Ergebnisse und Auswertung 31
Bildung der Fettzellen, im Alter wahrscheinlich nachlässt. Durch Alterungsprozesse der Zellen nimmt
die Fähigkeit der Multipotenz stetig ab, da die Zellen zunehmend ihre Vitalität verlieren.
Einzige Abweichung lieferten die Ergebnisse der beiden Kontrollansätze. Zu erwarten wäre gewesen,
dass beide Kontrollansätze annähernd gleiche Werte zeigen, da bei der OD – Messung nur das wieder
eluierte Oil Red O gemessen wird und beide Ansätze keine Adipozyten bilden. Jedoch können bei der
Färbung einige Farbreste unspezifisch an den Zellen gebunden haben oder wurden nicht richtig
ausgewaschen. Da nun die juvenilen Proben schneller proliferieren und somit mehr Zellen als bei den
adulten Proben vorhanden sind, kann auch mehr Farbstoff unspezifisch binden. Daraus folgt, dass bei
der OD – Messung auch ein höherer Wert bei den juvenilen Proben als bei den adulten Proben
gemessen wurde.
Ein weiterer Nachteil dieser Methode ist die Subjektivität des Zählens. Durch das Trypanblau werden
lebende Zellen hellblau und tote dunkelblau gefärbt. Jedoch erscheinen manche Zellen als Mischung
aus beiden. Diese werden dann manchmal als lebend oder tot mitgezählt. Bezogen auf die OD
können da beträchtliche Unterschiede entstehen.
3.2 Osteogene Differenzierung
Alle Differenzierungen zu den Osteoblasten sind positiv verlaufen. Die Abbildungen 44 – 51 im
Kapitel 6.3 Bilder von Kossa - Färbung des Anhangs zeigen die mikroskopischen Aufnahmen der
gefärbten Wells. Diese erlauben eine qualitative Auswertung der Färbungen. Zu sehen ist, dass
deutliche Unterschiede jeweils zwischen den juvenilen und adulten Zellen aufgetreten sind. Patient
#13 zeigt eine deutlich geringere Bildung von Osteoblasten als Patient #14. Qualitativ gesehen ist
auch Patient #12 effektiver gewesen als #13. Wie auch schon bei den adipogenen Differenzierungen
zeigt Patient #18 die geringste Effektivität.
Um die gemessen ALP – und Proteindaten quantitativ zu erfassen, wurden die ALP – Werte durch die
jeweiligen Proteinkonzentrations – Werte geteilt. Somit konnte die Aktivität des Enzym (ALP)
bestimmt werden. Die Ergebnisse dieser Aktivität wurde in Abbildung 17 graphisch dargestellt. Alle
für die Auswertung verwendeten Werte sind im Kapitel 6.4 Ergebnisse osteogene Differenzierung
dargestellt.
3 Ergebnisse und Auswertung 32
Abbildung 17: Vergleich juvenil - adult (osteogen)
Wie in Abbildung 17 zu erkennen ist, ist die Aktivität des Enzyms ALP bei den juvenilen Proben höher
als bei den adulten Proben. Jedoch ist der Unterschied nicht so deutlich wie bei den adipogenen
Differenzierungen. Da Patient #14 mehr als viermal so viel Substrat umgesetzt hat wie Patient #13, ist
nach dem Zusammenfassen der Werte der Wert der juvenilen Proben niedriger. Dies könnte zum
einen an einer schlechten Homogenisierung der Knochenhäutchen liegen oder zum anderen, dass bei
Patient #13 in seinem Alter weniger ALP produziert wird. Jedoch kann der erste Punkt
ausgeschlossen werden, da die qualitative Auswertung (Abb. 46) auch eine geringe Färbung aufweist.
Das weist generell auf eine geringere Aktivität der ALP hin.
Zusammenfassend ist zu sagen, dass die juvenilen Proben mehr Substrat umgesetzt haben als die
adulten Proben. Dies könnte wahrscheinlich am Alter der Patienten liegen. Da im Alter von 5 bzw. 10
Jahren die Knochen der Kinder noch wachsen, wird bei Ihnen wahrscheinlich die Aktivität der ALP
höher sein. Jedoch unterscheiden sich die Werte des Patienten #12 (24 Jahre) und #14 (5 Jahre) nicht
sehr von einander (Tabelle 19, Kapitel 6.4). Dies könnte auf eine Verschleppung der ALP während der
Homogenisierung zurückzuführen sein. Nach jedem Homogenisierungsvorgang wurden die
Homogenisierungswerkzeuge mit Wasser und Ethanol gereinigt. Jedoch könnten Reste der ALP noch
vorhanden gewesen sein und auf den Patienten #12 übertragen worden sein.
Da die Kontrollproben kein ALP enthalten, sind diese auch negativ.
-0,2
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
juvenil juvenil Kontrolle adult adult kontrolle
c(A
LP)/
c(P
rote
in)
in m
mo
l/g
Patient
Vergleich juvenil - adult
3 Ergebnisse und Auswertung 33
3.3 Durchflusszytometrie
Die Färbung der Oberflächenantigene erbrachte die erwarteten Ergebnisse der positiven (CD29,
CD73, CD90, CD105, CD166) und negativen Färbungen (CD31, CD34, CD45). Die Werte der einzelnen
Ergebnisse sind im Kapitel 6.5 Durchflusszytometrie des Anhangs dargestellt.
Tabelle 14 zeigt den prozentualen Anteil der gefärbten CD´s der einzelnen Zellen und die dazu
gehörigen Standardabweichungen (in Prozent).
Tabelle 14: Anteil der gefärbten Zellen + Standardabweichung in Prozent
CD juvenil adult
CD29 (pos.) 98,2 ± 1,9924 97,5 ± 1,9052
CD31 (neg.) 0,0333 ± 0,2309 0,2333 ± 0,20816
CD34 (neg.) 0,1333 ± 0,3214 0,5667 ± 1,1590
CD45 (neg.) 0,0667 ± 0,1154 0,0333 ± 0,2081
CD73 (pos.) 99,2667 ± 0,1527 97,8667 ± 1,4742
CD90 (pos.) 97,9333 ± 0,3214 91,6333 ± 1,8009
CD105 (pos.) 95,9667 ± 2,4006 97,1 ± 1,2767
CD166 (pos.) 99,4667 ± 0,2516 97,5333 ± 2,0599
Zu erkennen ist, dass die Ergebnisse der Färbungen der juvenilen Zellen ein besseres Ergebnis
lieferten als die adulten Zellen. Jedoch sind die Unterschiede sehr gering. Ursache dafür könnte das
Alter der juvenilen Proben sein und somit die Antikörper besser an die CD´s der juvenilen Proben
binden konnten.
Im Vergleich zu den anderen Methoden ist diese Methode weniger aussagekräftig und geeignet für
den Vergleich der Multipotenz. Da diese Methode auf dem Antigen – Antikörper – Bindungs – Prinzip
beruht und jede MSC´ s, ungeachtet deren Alters, solche Oberflächenantigene ausbildet, ist ein
Vergleich zwischen jung und alt kaum möglich. Da nachdem der Sekundärantikörper gebunden hat,
die Zellen im gleichem Maße fluoreszieren und von den Messgeräten auch nur als fluoreszierende
Zelle erfasst werden, können Unterschiede kaum erfasst werden. Die Oberflächenantigene bleiben
bis zum Zelltod erhalten und sind, wie bei den juvenilen, auch bei den adulten Zellen vorhanden.
3 Ergebnisse und Auswertung 34
3.4 Quantitative realtime PCR
Die qRT PCR lieferte nur Ergebnisse der osteogen Proben #13, #14 und #18 und aller GAPDH –
Proben. Alle adipogenen Ansätze bzw. der osteogene Ansatz des Patienten #12 lieferten keine
relevanten Ergebnisse. Der Grund für die negativen Ergebnisse der adipogenen Ansätze liegt
vermutlich in der nicht gebildeten PPARγ – mRNA oder an den PPARγ - Primern. Durch das RS wird
relativ schnell eine Induktion der Adipozyten hervorgerufen. Es könnte sein, dass die Bildung der
Fettvakuolen innerhalb der 8 Tage erfolgte, jedoch die Zellen nicht die endgültigen Charakteristika
eines Adipozyten ausgebildet haben. Für das fehlende Ergebnis des osteogenen Patienten #12 ist
vermutlich eine zu geringe Menge an Ausgangs – DNA verantwortlich, da die restlichen Bedingungen
bei den anderen osteogenen Proben die gleichen waren.
Bei der Quantifizierung durch die qRT PCR handelt es sich genauer um eine relative Quantifizierung,
da die Werte der PCR mit denen des Housekeeping – Gens normalisiert werden. Dies erbringt
mehrere Vorteile (z.B. eine Verringerung der Varianz der Expressionsergebnisse), da das GAPDH in
jeder Zelle homogen exprimiert wird. [41]
Für die Berechnung der Werte wurde die ∆CT – Methode eingesetzt. Der CT – Wert gibt an, bei
welcher Zyklenzahl die Hälfte der maximal erreichten Fluoreszenz eintritt. Für die Berechnung
werden die Mittelwerte (MW) CT – Werte der Kontrollgene (GAPDH) von den Mittelwerten der
Zielgene (Osteocalcin) abgezogen und somit normalisiert. [41] Tabelle 15 zeigt die CT – Werte der
einzelnen Patienten und zusammengefasst die ∆CT – Werte für die juvenilen und adulten Proben. Da
leider nur die osteogenen Ansätze ein Ergebnis erbrachten, kann ein Vergleich zwischen juvenil und
adult auch nur auf die osteogene Differenzierung gezogen werden.
Tabelle 15: Ergebnisse qRT PCR
Patient CT – Wert (MW) GAPDH – Wert (MW) ∆CT - Wert
#12 Ost. kein Ergebnis 28,525 kein Ergebnis
#13 Ost. 25,84 22,135 3,705
#14 Ost. 21,945 20,295 1,65
#18 Ost. 31,43 27,795 3,635
juvenil osteogen adult osteogen
∆CT - Wert 2,6775 3,635
3 Ergebnisse und Auswertung 35
Abbildung 18 zeigt die Zyklusanalyse der gesamten Ansätze. Dabei wurde die Zyklenzahl gegenüber
der Fluoreszenz aufgetragen. Je weiter vorne eine Kurve ist, desto schneller wurde ein Produkt
gebildet und umso mehr Target – DNA war vorhanden. Leider ist die Abbildung sehr unübersichtlich,
da zu wenig Zeit zur Verfügung stand, um die Proben einzeln nach adipogen oder osteogen und
deren Kontrollgenen zu analysieren und darzustellen.
Abbildung 18: Schmelzkurvenanalyse aller Ansätze
Zu erkennen ist, dass die CT – Werte der juvenilen Proben kleiner sind als die der adulten (Tabelle
15). Dies weist auf eine schnellere Bildung des Produkts hin. Daraus lässt sich schließen, dass die
juvenilen Proben effektiver waren als die adulten. Grund dafür könnte wahrscheinlich das Alter der
Patienten sein. Da diese aufgrund ihres jungen Alters vitaler sind, konnten vermutlich mehr
Osteocalcin – Gene gebildet werden.
Eine qRT PCR ist eine sehr sensible Methode, bei der vorher viele Optimierungsversuche gemacht
werden müssen. Zum Einen könnte man über eine Gradienten – PCR die Spezifität der Primer
überprüfen. Die Primer für das Osteocalcin und PPARγ besitzen unterschiedliche Annealing-
temperaturen, jedoch wurde bei der qRT – PCR nach dem Fast – Protokoll (QuantiFast von Qiagen)
nur eine Annealingtemperatur bei 60°C verwendet, um die PCR mit dem gleichen Programm laufen
lassen zu können. Zum Anderen könnte man über eine Verdünnungsreihe der cDNA, die Spezifität
der Produkte erhöhen und die Effizienz der Primer bestimmen und damit weitere quantitaive
Berechnungen durchführen.
Da die Zeit für diese Tests nicht mehr ausreichte, wurde in dieser Arbeit nur eine einzige qRT PCR
durchgeführt.
3 Ergebnisse und Auswertung 36
3.5 Seneszenz
Alle hier gezeigten Diagramme beziehen sich auf die Ergebnisse, die im Kapitel 6.6 Ergebnisse der
Zellzählung (Passagierung) des Anhangs aufgelistet sind.
3.5.1 Passagierung
Nach achttägiger Kultivierung konnten die Zellen das erste Mal subkultiviert werden. Zu diesem
Zeitpunkt waren ausreichend Zellen vorhanden, um diese weiter zu passagieren und die DNA zu
isolieren.
Zwischen den Primärkulturen der einzelnen Patienten konnte bereits mikroskopisch ein teilweise
deutlicher Unterschied in der Zelldichte zwischen der 10. und 15. Passage festgestellt werden. Die
Abbildungen 19 - 26 zeigen deutlich, dass in der 10. Passage mehr Zellen als in der 15. Passage
vorhanden sind (jeweils am 3. Tag der Kultivierung). Eine Ausnahme bildet hier der Patient #18.
Zwischen den beiden Passagen sind keine großen Unterschiede in der Zelldichte zu erkennen.
Abbildung 19: F10 #12 Tag 3
Abbildung 20: F15 #12 Tag 3
Abbildung 21: F10 #13 Tag 3
Abbildung 22: F15 #13 Tag 3
3 Ergebnisse und Auswertung 37
Abbildung 23: F10 #14 Tag 3
Abbildung 24: F15 #14 Tag 3
Abbildung 25: F10 #18 Tag 3
Abbildung 26: F15 #18 Tag 3
Wie schon angesprochen verkürzen sich mit jeder Zellteilung die Telomere, was die Zellen altern
lässt. Dadurch nimmt mit zunehmender Passage die Proliferation (Zellwachstum) ab und die Zellen
sind nicht mehr so vital, wie am Anfang der Kultivierung. Auch durch den „Stress“ der Passagierung
(Ablösen, Zählen und Aussäen) werden die Zellen beeinflusst, was wiederum Auswirkung auf das
Wachstum der Zellen hat. Die juvenilen Patienten (#13 und #14) weisen in Passage 10 eine noch
höhere Zelldichte auf als Patient #12 oder #18 (adult). Dies ist wahrscheinlich auf das Alter der
Patienten und auf die längeren Telomere zurückzuführen. Jede Zelle besitzt einen programmierten
Zelltod (Apoptose), der nach einer bestimmten Verkürzung der Telomere eintritt. Da die juvenilen
Patienten noch längere Telomere besitzen, ist das Zellwachstum hier auch noch höher als bspw. bei
Patient #18.
Auch zwischen den adulten Proben können Unterschiede in der Zelldichte festgestellt werden.
Patient #12 ist mit seinen 24 Jahren 16 Jahre jünger als Patient #18. Aus diesem Grund sind die
Telomere vermutlich noch nicht so verkürzt und die Zellen sind in ihrer Proliferation noch durchaus
effektiver und vitaler.
Da mikroskopische Aussagen aber sehr ungenau und subjektiv sind, wurde nach jeder Passage die
Generationszeit, Vitalität und der Anteil der lebenden bzw. toten Zellen erfasst. In den Abbildungen
27 – 29 werden genau diese Kriterien zusammengefasst und verglichen.
3 Ergebnisse und Auswertung 38
Abbildung 27: Vergleich Lebend - Tod
In Abb. 27 ist der Vergleich der Durchschnittswerte der lebenden und toten Zellen zu sehen. Es ist zu
erkennen, dass mit zunehmendem Alter auch die Zahl der lebenden Zellen abnimmt. Durch die
Verkürzung der Telomerlängen bei jeder Zellteilung wird auch die Proliferation beeinflusst.
Abbildung 28: Durchschnitt Vitalität
Die Vitalität der Patienten (Abb. 28) nimmt mit zunehmendem Alter auch ab. Dies ist wahrscheinlich
auf die höhere Apoptoserate der adulten Zellen zurückzuführen. Je höher das Alter, desto kürzer die
Telomere und desto mehr Zellen sterben ab. Da die Zellen auch in einer geringeren Intensität
wachsen und mehr Zellen absterben, ist die Vitalität bezogen auf die Gesamtzellzahl geringer als bei
den juvenilen Proben.
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
#14 (5 Jahre) #13 (10 Jahre) #12 (24 Jahre) #18 (40 Jahre)
Ze
llza
hl
Patient
Vergleich Lebend - Tod
Tod
Lebend
82
84
86
88
90
92
94
96
#14 (5 Jahre) #13 (10 Jahre) #12 (24 Jahre) #18 (40 Jahre)
Vit
ali
tät
in %
Patient
Vitalität
3 Ergebnisse und Auswertung 39
Abbildung 29: Durchschnitt Generationszeiten
Abbildung 29 zeigt die Durchschnittswerte der Generationszeiten. Zu sehen ist, dass mit
zunehmendem Alter auch die Generationszeit zunimmt. Somit braucht Patient #18 mehr als doppelt
so lange wie Patient #14, um eine Verdopplung der Zellzahl zu erreichen. Vermutlich liegt auch hier
der Grund in der Vitalität der Zellen, die wiederum auf die Verkürzung der Telomere zurück zu führen
ist. Je kürzer die Telomere sind, desto langsamer wachsen die Zellen und sie brauchen viel länger um
die doppelte Zellzahl zu erreichen.
3.5.2 Nachweis der Telomerlängen
Der Nachweis der Seneszenz über die Telomerlängen verlief leider negativ. Eine durchgeführte Test –
PCR (normale PCR), die den Bedingungen des verwendeten Kits entsprach, erbrachte kein positives
Ergebnis. Verwendet wurden die Patienten #13 (5 Jahre) und #18 (40 Jahre). Aufgrund der großen
Altersdifferenz zwischen den beiden, wurde diese ausgewählt, um einen ersichtlichen Unterschied
zwischen den PCR – Produkten zu bekommen. Da sich die Telomere pro Zellteilung um 50 – 100 bp
verkürzen, hätte diese Altersdifferenz ausgereicht, um genaue Aussagen über die Effektivität dieser
Methode zu machen.
Anstelle der spezifischen Amplifikate bildeten sich nur Primerdimere (Abb. 30). Gründe dafür
könnten sein, das die gewählten Primer oder PCR – Merkmale nicht passend für die Proben waren, zu
wenig Ausgangsmaterial für die Primer bzw. Polymerase vorhanden waren oder die
Homogenisierung der Proben nicht effektiv genug war.
Ein weiterer Grund könnte der hohe Guanin/Cytosin (GC) – Gehalt der Primer darstellen. Dies hat
vermutlich zu einer Selbsthybridisierung der Primer geführt, was der mitgelieferte GC – Enhancer
0
1
2
3
4
5
6
#14 (5 Jahre) #13 (10 Jahre) #12 (24 Jahre) #18 (40 Jahre)
Ge
ne
rati
on
sze
it i
n d
Patient
Generationszeiten
3 Ergebnisse und Auswertung 40
auch nicht ausgleichen konnte. In weiterführenden Tests könnte man die Konzentration des GC-
Enhancers erhöhen und optimieren, so dass das Problem der Primerselbsthybridisierung beseitigt
werden kann.
Zum Anderen kann man noch die einzelnen Abschnitte der Zyklen verändern, d.h. die Temperaturen
und Zeitintervalle für Denaturierung, Annealing, Elongation und weiterhin die Gesamtzyklenzahl
können variiert werden. Dabei ist darauf zu achten, dass nicht zu viele Zyklen gewählt werden, da es
sonst zum Verlust des PCR – Produktes kommen kann (Depurinierung).
Desweiteren könnte das TriFast – Protokoll für die Isolierung der DNA ungeeignet sein, da bei den
Isolationen nur sehr geringe und unreine DNA-Konzentrationen (z.B. Phenolverunreinigungen)
erreicht wurden. Besser wäre es, spezielle Kits zur DNA-Isolation zu verwenden, die ohne Phenol
funktionieren. Die humane DNA – Isolierung ist eine sehr sensible Methode, die viel Erfahrung,
Übung und genaue Schritte der Aufreinigung voraussetzt. Es benötigt viel Zeit diese Methode zu
perfektionieren, jedoch war die Zeit für diese Arbeit nicht ausreichend.
Abbildung 30: Primerdimer
4 Zusammenfassung und Ausblick 41
4 Zusammenfassung und Ausblick
Zusammenfassend ist zu sagen, dass der Nachweis der Multipotenz von humanen dermalen
Fibroblasten zur vollsten Zufriedenheit erreicht wurde und somit gezeigt werden konnte, dass die
isolierten Fibroblasten sich wie MSC’s verhalten. Alle Multipotenznachweise über die
Differenzierungsvorgänge (adipogen und osteogen) erbrachten die Ergebnisse, dass die juvenilen
Proben effektiver bzw. besser differenzierten als die adulten Proben. Lediglich der Nachweis der
Oberflächenantigene mittels Durchflusszytometrie zeigte keine Unterschiede im Expressionsprofil
der juvenilen bzw. adulten MSC’s.
Dies lässt eine Verallgemeinerung zu, dass die juvenilen MSC´s ein größeres Multipotenzpotential
besitzen als adulte MSC´s. Um signifikante Daten bei allen Tests zu erhalten, wird empfohlen die
Patientenanzahl für die adipogene und osteogene Differenzierung zu vergrößern.
Um bessere Ergebnisse durch eine qRT PCR zu erhalten, wären die angesprochenen Tests von großer
Wichtigkeit. Es muss sichergestellt werden, dass die Primer spezifisch binden, denn erst so lassen sich
eindeutige Schlüsse aus den Ergebnissen ziehen. Auch der Nachweis der Telomerlängen durch eine
qRT PCR sollte durch erneute Tests etabliert werden können. Jedoch sollte das Augenmerk zunächst
auf die korrekte Isolierung der DNA aus den Zellen geworfen werden. Danach könnten die einzelnen
Komponenten des Mastermixes bzw. die Schritte des PCR – Programmes perfektioniert werden. Erst
dann können auch hier publizierbare Aussagen über die Alterung der MSC´s gezogen werden.
In den nächsten Jahren wird die Forschung an Stammzellen, die aus der Haut isoliert wurden,
deutlich zu nehmen. Zum einen ist die gute Zugänglichkeit der Hautbiopsien ein Grund für die
Forschung an dermalen MSC´s. [42] Zum anderen könnten womöglich Untersuchungen gemacht
werden, die belegen, dass Stammzellen aus der Haut nicht nur multipotent sondern auch pluripotent
sind. Das heißt, dass aus diesen Zellen sich alle Zellen des humanen Mesenchyms bilden könnten,
was ein erheblicher Fortschritt im Bereich des Tissue Engineering wäre.
5 Quellen 42
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6 Anhang 45
6 Anhang 6.1 RNA - Aufreinigung .................................................................................................................. A - 1
6.2 Bilder Oil Red O - Färbung ........................................................................................................ A - 2
6.2 Ergebnisse der adipogenen Differenzierung ............................................................................ A - 4
6.3 Bilder von Kossa – Färbung ...................................................................................................... A - 5
6.4 Ergebnisse der osteogenen Differenzierung ............................................................................ A - 6
6.4.1 Proteinkonzentrationsbestimmung .................................................................................. A - 6
6.5 Ergebnisse Durchflusszytometrie ............................................................................................. A - 8
6.6 Ergebnisse der Zellzählung (Passagierung) ............................................................................ A - 10
6 Anhang 1
6.1 RNA - Aufreinigung Die Aufreinigung erfolgte nach dem Protokoll des RNeasy® Micro Kit von Qiagen:
1. Add 1 volume of 70% ethanol to the lysate, and mix well by pipetting. Do not centrifuge. Proceed
immediately to step 2.
Note: The volume of 70% ethanol to add may be less than 350 μl if some lysate was lost during
homogenization.
Note: Precipitates may be visible after addition of ethanol, but this does not affect the procedure.
2. Transfer the sample, including any precipitate that may have formed, to an RNeasy spin column
placed in a 2 ml collection tube (supplied). Close the lid gently, and centrifuge for 15 s at 8000 x g
(10,000 rpm). Discard the flowthrough. Reuse the collection tube in step 3.
3. Add 700 μl Buffer RW1 to the RNeasy spin column. Close the lid gently, and centrifuge for 15 s at
8000 x g (10,000 rpm) to wash the spin column membrane. Discard the flow-through.
Reuse the collection tube in step 4.
4. Add 500 μl Buffer RPE to the spin column. Close the lid gently, and centrifuge for 15 s at 8000 x g
(10,000 rpm) to wash the spin column membrane. Discard the flow-through. Reuse the collection
tube in step 5.
Note: Buffer RPE is supplied as a concentrate. Ensure that ethanol is added to Buffer RPE before use.
5. Add 500 μl Buffer RPE to the spin column. Close the lid gently, and centrifuge for 2 min at 8000 x g
(10,000 rpm) to wash the spin column membrane. Discard the flow-through. Reuse the collection
tube in step 5.
Note: After centrifugation, carefully remove the RNeasy spin column from the collection tube so that
the column does not contact the flow-through. Otherwise, carryover of ethanol will occur.
6. Place the RNeasy spin column in a new 2 ml collection tube (supplied). Open the lid of the spin
column, and centrifuge at full speed for 5 min. Discard the flow-through and collection tube.
13. Place the RNeasy spin column in a new 1.5 ml collection tube (supplied). Add 15 μl RNase-free
water directly to the center of the spin column membrane. Close the lid gently, and centrifuge for 1
min at full speed to elute the RNA.
7. Store the RNA – Samples at -80 °C.
6 Anhang 2
6.2 Bilder Oil Red O - Färbung
Abbildung 31: : #9 Oil Red O - Färbung d8 400x
Abbildung 32: Kontrolle #9 Oil Red O - Färbung d8 400x
Abbildung 33: #12 Oil Red O - Färbung d8 400x
Abbildung 34: Kontrolle #12 Orl Red O - Färbung d8 400x
Abbildung 35: #13 Oil Red O - Färbung d8 400x
Abbildung 36: Kontrolle #13 Oil Red O - Färbung d8 400x
6 Anhang 3
Abbildung 37: #14 Oil Red O - Färbung d8 400x
Abbildung 38: Kontrolle #14 Oil Red O - Färbung d8 400x
Abbildung 39: #17 Oil Red O - Färbung d8 400x
Abbildung 40: Kontrolle #17 Oil Red O - Färbung d8 400x
Abbildung 41: #18 Oil Red O - Färbung d8 400x
Abbildung 42: Kontrolle #18 Oil Red O - Färbung d8 400x
6 Anhang 4
6.2 Ergebnisse der adipogenen Differenzierung
Tabelle 16: Werte adipogene Differenzierung
Patient #9 RS #12 RS #13 RS #14 RS #17 RS #18 RS
Mittelwert OD 0,127 0,308666667 0,148666667 0,306666667 0,204666667 0,071866667
Mittelwert Zellzahl 5,958333333 9,625 2,666666667 4,875 3,75 1,925
c(ORO) in mM 0,07070819 0,133176852 0,082714544 0,170268573 0,113746352 0,028501664
c(ORO)/Zellz. in
mM 0,011867109 0,013805387 0,031017954 0,034926887 0,030332361 0,014860591
Tabelle 17: Werte Kontrolle adipogene Differenzierung
Patient #9 Kontrolle #12 Kontrolle #13 Kontrolle #14 Kontrolle #17 Kontrolle #18 Kontrolle
Mittelwert OD 0,039666667 0,077333333 0,035 0,086 0,059 0,028666667
Mittelwert Zellzahl 1,729166667 2,183333333 1,25 2,116666667 1,9875 0,708333333
c(ORO) in mM 0,018903347 0,025185932 0,019727363 0,047988474 0,03302671 0,006957894
c(ORO)/Zellz. in mM 0,010904105 0,011529816 0,015781891 0,02267172 0,016617212 0,009895737
Tabelle 18: Werte für Standardkurve
c(ORO) in mM 1. Messung 2. Messung 3. Messung Mittelwert
0,75 1,35 1,359 1,35 1,353
0,1 0,178 0,178 0,177 0,177666667
0,05 0,091 0,092 0,092 0,091666667
Abbildung 43: Standardkurve Oil Red O
y = 1,8046x - 0,0006
R² = 1
0
0,5
1
1,5
0 0,2 0,4 0,6 0,8
OD
Konzentration in mM
Standardkurve Oil Red O
Standardkurve
Linear
(Standardkurve)
6 Anhang 5
6.3 Bilder von Kossa – Färbung
Abbildung 44: #12 von Kossa - Färbung d27 100x
Abbildung 45: Kontrolle #12 von Kossa - Färbung d27 100x
Abbildung 46: #13 von Kossa - Färbung d27 100x
Abbildung 47: Kontrolle #13 von Kossa - Färbung d27 100x
Abbildung 48: #14 von Kossa - Färbung d27 100x
Abbildung 49: Kontrolle #14 von Kossa - Färbung d27 100x
6 Anhang 6
Abbildung 50: #18 von Kossa - Färbung d27 100x
Abbildung 51: Kontrolle #18 von Kossa - Färbung d27 100x
6.4 Ergebnisse der osteogenen Differenzierung
Tabelle 19: Mittelwerte der ALP - Messungen bezogen auf die Proteinkonzentration (mmol/g)
Patient Osteogen Osteogen Kontrolle
#12 0,416947827 -0,091565911
#13 0,111684177 -0,095772955
#14 0,487802794 -0,078234165
#18 0,00778051 -0,09943061
juvenil 0,29974349 -0,08700356
adult 0,21236417 -0,09549826
6.4.1 Proteinkonzentrationsbestimmung
Tabelle 20: Werte der Proteinmessung
Patient Osteogen Osteogen Kontrolle
#12 1,078175 0,853245
#13 0,7671125 0,9525675
#14 1,041625 0,95987
#18 1,04787 0,89697
Tabelle 21: Standard Proteinkonzentrationsbestimmung
c(Standard) in g/l OD 1. Messung OD 2. Messung Mittelwert OD
2 2,1826 2,2482 2,2154
1,5 1,7842 1,7565 1,77035
1 1,3888 1,4273 1,40805
6 Anhang 7
0,75 1,174 1,3534 1,2637
0,5 1,0614 1,0445 1,05295
0,25 0,81143 0,87253 0,84198
0,125 0,71523 0,7545 0,734865
0,025 0,63388 0,62339 0,628635
0 0,5479 0,54099 0,544445
Abbildung 52: Standard Proteinkonzentrationsbestimmung
y = 0,198x + 0,1725
R² = 0,9355
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 2 4 6 8 10
OD
c(Standard) in g/l
Standardkurve
Standardkurve
Linear (Standardkurve)
6 Anhang 8
6.5 Ergebnisse Durchflusszytometrie
Tabelle 22: Konzentration AK #9 - #18
Konzentration AK
IgG1 (Fitc) 7,5µl für 1x106 Zellen
CD105 (Fitc) 7,5µl für 1x106 Zellen
IgG1 (PE) 7,5µl für 1x106 Zellen
CD29 (PE) 7,5µl für 1x106 Zellen
CD31 (PE) 7,5µl für 1x106 Zellen
CD45 (PE) 7,5µl für 1x106 Zellen
CD73 (PE) 7,5µl für 1x106 Zellen
CD166 (PE) 7,5µl für 1x106 Zellen
IgG1 (Alexa 700) 5µl für 1x106 Zellen
CD90 (Alexa 700) 5µl für 1x106 Zellen
IgG1 (PerCP) 3,75µl für 1x106 Zellen
CD34 (PerCP) 3,75µl für 1x106 Zellen
6 Anhang 9
Tabelle 23: Ergebnisse Flow Cytometry
Antigen #9 #12 #13 #14 #17 #18
CD29 PE 96,4 99,7 99,3 95,9 99,4 96,4
CD31 PE -0,4 0 -0,1 0,3 -0,1 -0,3
CD34 PerCp 0,2 0 -0,1 0 0,5 -1,9
CD45 PE -0,2 0,2 0 0,2 0 0,1
CD73 PE 96,2 99 99,3 99,1 99,4 98,4
CD90 Alexa 91,7 89,8 98,3 97,7 97,8 93,4
CD105 FITC 96 98,5 98,7 95 94,2 96,8
CD166 PE 95,6 99,7 99,2 99,5 99,7 97,3
juvenil adult
Mittelwert Stabw Mittelwert Stabw
CD29 (pos.) 98,2 1,99248588 97,5 1,90525589
CD31 (neg.) 0,03333333 0,23094011 -0,23333333 0,2081666
CD34 (neg.) 0,13333333 0,32145503 -0,56666667 1,15902258
CD45 (neg.) 0,06666667 0,11547005 0,03333333 0,2081666
CD73 (pos.) 99,2666667 0,15275252 97,8666667 1,47422296
CD90 (pos.) 97,9333333 0,32145503 91,6333333 1,80092569
CD105 (pos.) 95,9666667 2,40069434 97,1 1,27671453
CD166 (pos.) 99,4666667 0,25166115 97,5333333 2,05993527
Positiv juvenil 98,1666667 1,39602611
Negativ juvenil 0,07777778 0,05091751
Positiv adult 96,3266667 2,63769681
Negativ adult -0,25555556 0,30061665
6 Anhang 10
6.6 Ergebnisse der Zellzählung (Passagierung)
Tabelle 24: Werte der Zellzählungen der Seneszenz
Passage #12 #13 #14 #18
F2 206250 243750 213750 117500
18750 56250 22500 37500
F3 450000 356250 325000 131250
37500 18750 37500 75000
F4 375000 412500 262500 168750
37500 37500 75000 37500
F5 500000 543750 712500 225000
18750 18750 18750 0
F6 450000 450000 412500 225000
18750 37500 18750 0
F7 581250 618750 806250 300000
37500 18750 0 18750
F8 562500 450000 450000 225000
56250 37500 37500 18750
F9 562500 825000 656250 431250
18750 56250 18750 18750
F10 337500 562500 450000 375000
75000 18750 0 37500
F11 387500 993750 562500 225000
37500 18750 0 18750
F12 318750 412500 318750 168750
37500 18750 18750 18750
F13 375000 712500 588750 225000
37500 18750 37500 18750
F14 225000 356250 281250 158750
56250 0 37500 56250
F15 232500 528750 431250 171250
75000 75000 11250 18750
lebend
tot
Selbstständigkeitserklärung 11
Selbstständigkeitserklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und nur unter Verwendung der
angegebenen Literatur und Hilfsmittel angefertigt habe.
Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus Quellen entnommen wurden, sind als solche kenntlich
gemacht.
Diese Arbeit wurde in gleicher oder ähnlicher Form noch keiner anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Leipzig, den 11.09.2011
Eric Sonntag