Inleiding Biotechnologie 1

Inleiding Biotechnologie 1

Aan de module hebben bijgedragen:Eckhard R. Lucius (Coördinator)Catherine Adley, Jan Frings, Cecily Leonard, Dean Madden, Marcus Müller, UtaNellen, Patricia Nevers, John Schollar, Marleen van Strydonck, Paul Wymer.

MO

DU

LE

European Initiative for Biotechnology Education

Prof. Dr. Horst BAYRHUBER, Institut für die Pädagogik der Naturwissenschaften (IPN) an der Universität Kiel, Olshausenstr. 62, 24098 Kiel, Deutschland.Tel.: ++49-431-880-3129, Fax: +49-431-880-3132 email: [email protected].

Dr. Jens FRIEDRICH/Renate GLAWE, Institut für die Pädagogik der Naturwissenschaften (IPN) an der Universität Kiel, Olshausenstr. 62, 24098 Kiel, Deutschland.Tel.: +49-431-880 3151 and +49-431-880 5151, Fax +49-431-880 3132, email: [email protected], [email protected].

BELGIË/BELGIQUEProf. Dr. Vic DAMEN/ Marleen van STRYDONCK, UniversitaireInstelling Antwerpen (U.I.A.), Department Didactiek en Kritiek,Universitätsplein 1, 2610 Antwerpen, email [email protected],[email protected]. Maurice LEX, EC, GD XII E-1, SDME 9/38, Rue de la Loi 200,1049 Bruxelles, Fax 0032/2/299-1860

BULGARIAProf. Raytcho DIMKOV, University of Sofia “St. Kliment Ohridski’,Faculty of Biology, Dr. Tzankov blvd. No. 8, 1421 Sofia, [email protected]

CZECHÁ REPUBLIKADr. Hana NOVÀKOVÀ, Pedagprogram co-op Pedagogiká Fakulta UK,Konevova 241, 13000 Praha 3. Fax +420/2/684 5071

DANMARKDr. Dorte HAMMELEV , Association of Danish Biologists,Sønderjyllands Alle 2, 2000 Frederiksberg, email [email protected] Lisbet MARCUSSEN, Association of Danish Biologists,Skolebakken 13, 5800 Nyborg, email [email protected]

DEUTSCHLANDProf. Dr. Horst BAYRHUBER/ Dr. Jens FRIEDRICH/ Dr.

Eckhard R. LUCIUS/ Mrs Renate GLAWE, Institut für die Pädagogikder Naturwissenschaften (IPN) an der Universität Kiel, Olshausenstr. 62, 24098Kiel, email [email protected], [email protected], [email protected];[email protected]. Ognian SERAFIMOV, INCS-Centre of UNESCO, c/o Jörg-Zürn-Gewerbeschule, Rauensteinstr. 17, 88662 Überlingen, [email protected], [email protected]. Dr. Eberhardt TODT, Universität Giessen, FB Psychologie, Otto-Behagel Str. 10, 35394 Giessen, email [email protected]. Dr. Michael SCHALLIES, Pädagogische Hochschule, Heidelberg,FB Chemie, Im Neuenheimer Feld 561, 69120 Heidelberg, [email protected]

EESTIProf. Dr. Tago SARAPUU, Science Didactics, Dept., University of Tartu,Vanemuise 46-211, Tartu 51014, email [email protected].

EIREDr. Catherine ADLEY, University of Limerick, Biotechnology AwarenessCentre, Dept. of Chemical and Environmental Sciences, Limerick, [email protected]. Cecily LEONARD, University of Limerick, Dept. of Life Sciences,Limerick, email [email protected]

ELLADAProf. Vasilis KOULAIDIS/Ass. Prof. Vasiliki ZOGZA-

DIMITRIADI, University of Patras, Dept. of Education, Rion, 26500Patras, email [email protected], [email protected]

ESPAÑADr. María J. SÁEZ, Dr. Angela GÓMEZ-NIÑO/ Rosa

VILLAMANAN, Universidad de Valladolid, Dept. de Biologia Celular yFarmacologia, Geologo Hermandez Pacheco 1, Valladolid 47014, [email protected], [email protected], [email protected]

FRANCEProf. Gérard COUTOULY, LEGPT Jean Rostand, 18, Boulevard de laVictoire, 67084 Strasbourg Cedex, email [email protected]. Laurence SIMONNEAUX, ENFA, Toulouse, Boîte Postale 87,31326 Castanet-Tolosan Cedex, email [email protected]

ITALIAProf. A. BARGELLESI-SEVERI/Dr. Stefania UCCELLI/Dr. ssa.

A. CORDA-MANNINO, Centro di Biotecnologie Avanzate, LargoRosanna Benzi 10, 16132 Genova., email [email protected]

LUXEMBOURGMr. John WATSON/Mr. Laurent KIEFFER, European School, 23BLVD Konrad Adenauer, 1115 Luxembourg, [email protected], [email protected]

NEDERLANDDr. David J. BENNETT, European Federation of BiotechnologyWorking Party on Education, Cambridge Biomedical Consultants, OudeDelft 60, NL-2611 CD Delfte, email [email protected]. Fred BRINKMAN, Hogeschool Holland, Communication Project,P.O. Box 261, 1110 AG Diemen, email [email protected]. Liesbeth van de GRINT, Hogeschool van Utrecht,Coordinatiecentrum van het Landelijk Network voor Educatiecentra voorBiotechnologie, Postbus 14007, 3508 SB Utrecht, [email protected]. Jan F.J. FRINGS, Pr. Marijkelaan 10, 7204 AA Zutphen, [email protected]. Ana-Maria BRAVO-ANGEL, Secretariat of the Task Group onPublic Perceptions of Biotechnology, Oude Delft 60, NL-2611 CD Delfte,email [email protected]

RZECZPOSPOLITA POLSKADr. Anna STERNICKA, University of Gdansk, Dept.of Biology, AL.Legionow 9, 80952 Gdansk, Fax +48/58/341 20 16

SCHWEIZDr. Kirsten SCHLÜTER, ETH, Institut für Verhaltenswissenschaften,ETH Zentrum TUR, Turnerstr. 1, 8092 Zürich, [email protected]

SVERIGEMrs. Margareta JOHANSSON, Föreningen Gensyn, P.O. Box 37,26821 Svalöv, email [email protected]. Elisabeth STRÖMBERG, Östrabogymnasiet, Kämpegatan 36, 45181 Uddevalla, email [email protected]

THE UNITED KINGDOMDr. John GRAINGER/ Mr. John SCHOLLAR/ Dr. Caroline

SHEARER, National Centre for Biotechnology Education, TheUniversity of Reading, Whiteknights, P.O. Box 228, Reading RG6 6AJ.,email [email protected], [email protected], [email protected]. Wilbert GARVIN, The Queen’s University of Belfast, School ofEducation, 69 University Street, Belfast BT7 1HL, [email protected]. Jill TURNER, The Queen’s University of Beldfast, School ofNursing and Midwifery, 1-3 College Park East, Belfast BT7 1LQ, [email protected]. Paul WYMER, 6 Park Way, Whetstone London N20 0XP, [email protected]. Jenny LEWIS, University of Leeds, Centre for Studies in Scienceand Mathematics Education, Leeds LS2 9JT, [email protected]. Adam HEDGECOE, University College London, Dept. of Scienceand Technology Studies, Gower Street, London WC1E 6BT, [email protected].

˘

EIBE European Initiative for Biotechnology Education 2000 2

....

...

Het Europees Initiatief voor Biotechnologische Educatie (EIBE) stelt zichtot doel vakkennis te verspreiden, inzicht en begrip te vergroten en hetmaatschappelijk debat te bevorderen door middel van verbeterdbiotechnologisch onderwijs in scholen in de Europese Unie (EU).

EIBE Contactpersonen

E.I.B.E. co-ordinator

E.I.B.E. secretariat

Jan Frings

This (italian) page I deleted.

3EIBE European Initiative for Biotechnology Education 1998 MODULE N° 1: INLEIDING BIOTECHNOLOGIE

.......

Inleiding BiotechnologieIN

HO

UD


1MODULE

InhoudsopgaveInhoudsopgaveInhoudsopgaveInhoudsopgaveInhoudsopgaveH H H H H H H H H H H H H H H

| | | | | VVVVVeieieieieillllligheid, copigheid, copigheid, copigheid, copigheid, copyright enyright enyright enyright enyright enverantwoordingverantwoordingverantwoordingverantwoordingverantwoording 4

||||| Over Module 1Over Module 1Over Module 1Over Module 1Over Module 1Inleiding 5

||||| ModellenModellenModellenModellenModellenDNA bouwplaat 6Bacteriofaag bouwplaat 8

||||| DNA isolatieDNA isolatieDNA isolatieDNA isolatieDNA isolatieDNA isolatie uit bacteriën 10DNA isolatie uit uien 12

||||| ProductieProductieProductieProductieProductieAmylase productie 14Cellulase productie 16Antibioticum productie 18

||||| Micro-organismen in actieMicro-organismen in actieMicro-organismen in actieMicro-organismen in actieMicro-organismen in actieBrooddeeg 20Geïmmobiliseerde gistcellen 22Brandstofcel 25

||||| GenoverdrachtGenoverdrachtGenoverdrachtGenoverdrachtGenoverdrachtBacteriële conjugatie 27Genoverdracht door Agrobacteriumtumefac i ens 31

||||| Appendix 1Appendix 1Appendix 1Appendix 1Appendix 1Microbiologische media 34

||||| Appendix 2Appendix 2Appendix 2Appendix 2Appendix 2Microbiologische technieken 35

||||| Appendix 3Appendix 3Appendix 3Appendix 3Appendix 3Het openen van een ampul 40

WWWWWorld Wide World Wide World Wide World Wide World Wide WebebebebebH H H H H H H H H H H H H H H

Er zijn maar weinig gebieden die zich zo snelontwikkelen als de biotechnologie. De EIBEModules worden elektronisch gepubliceerdom ze te kunnen actualiseren en ze dan zogoedkoop mogelijk te verspreiden.

Deze pagina�s (en de andere EIBE Modules)zijn overal ter wereld beschikbaar via hetWorld Wide Web. Ze zijn te vinden onder:

http://www.eibe.rdg.ac.uk:8001/

Alle EIBE Modules op het World Wide Webzijn Portable Document Format (PDF) Files.Dit betekent dat de kwaliteit van deillustraties, kleuren, lettertypen en lay-out vandeze documenten gehandhaafd blijft,ongeacht welke computer wordt gebruikt(Macintosh -inclusief Power PC, Windows,DOS of Unix platforms).

Bovendien zijn PDF-files kleiner dan deoorspronkelijke files, zodat het minder tijdkost om de documenten te downloaden. Omdeze EIBE Modules te kunnen bekijken, iswel een programma van Adobe Acrobat®

(Reader) nodig. Het Reader programma vanAdobe Acrobat® is gratis verkrijgbaar indiverse talen (Nederlands, Engels, Frans,Duits en Italiaans). Het kan wordengedownload van de EIBE of Adobe WWWsite:

http://www.adobe.com/

Met behulp van deze software kunnen de EIBEModules bekeken en uitgeprint worden. Verder ishet mogelijk om rond te neuzen en rustig dedocumenten te doorzoeken.N.B.: Adobe en Acrobatzijn handelsmerken van Adobe Systems Incorpo-rated die in bepaalde rechtsgebieden kunnen zijngedeponeerd. Macintosh is een handelsmerk vanApple Computer Incorporated.

....

...

4 MODULE N° 1: INLEIDING BIOTECHNOLOGIE EIBE European Initiative for Biotechnology Education 1998

VeiligheidWe hebben geprobeerd alle EIBE Modules op allemogelijke gevaren te controleren en van passendeveiligheidsvoorschriften te voorzien. De wet - die in deEG geldt in de vorm van EG-richtlijnen - beperkt geenexperimenten waarbij natuurlijk voorkomendeparasexuele processen, zoals conjugatie, transductie offagenkruising, in het laboratorium toegepast worden,op voorwaarde dat de gebruikte organismen geengentechnologisch veranderd DNA bevatten.

De voorgestelde procedures zijn, indien mogelijk,in overeenstemming met de algemeen geldende risico-beoordelingsanalyses. Als er sprake is van eenverhoogd risico is dit aangegeven.

Voor het werken met micro-organismen gelden kortonderstaande veiligheidsmaatregelen. Deze staanbekend als VMT , Veilige Microbiologische Techniek.Appendix 2 in deze Module geeft nog eens uitgebreidveiligheidsvoorschriften op microbiologisch gebied.

De tien geboden van VMT:l Werk volgens de regels, speciaal als u denkt dat er

geen risico is.l Houd de deur dicht.l Houd uw jas dicht en binnen de practicumruimte.l Begin met schone handen en nagels, zonder ringen

of armbanden. (Vuil vermindert de weerstand vande huid en verbruikt desinfectans. De huid onderringen en banden kan niet worden gewassen ofontsmet.)

l Verzamel alles wat nodig is en stel dat ordelijk opvoor u begint.

l Vermijd hand-mond contact: niet roken, niet eten,niet drinken.

l Vermijd aërosolvorming. Aërosolvorming kanoptreden door:2 gieten van vloeistof,2 vallende druppels,2 uitblazen van pipetten,2 openen van vochtige stoppen,2 centrifugeren van open buizen,2 te warme entogen.

l Gebruik mechanische hulpmiddelen voor pipetteren.l Deponeer gebruikte pipetten in een desinfecterende

vloeistof.l Besteed volle aandacht aan opruimen, desinfectie,

afvoer van besmet materiaal en handen wassen.

©CopyrightCopyrightCopyrightCopyrightCopyrightDeze EIBE Module valt onder het copyright. Demedewerkers van deze Module benadrukken hun rechtom erkend te worden als copyright houders alsomschreven onder sectie 77 van de Designs, Patentsand Copyright Act, UK (1988).

Voor onderwijskundige doeleindenElektronische of schriftelijke kopieën van deze EIBEModule of pagina’s mogen worden gemaakt voorklassikaal gebruik, onder voorwaarde dat de kopieënzonder kosten, of tegen reproductiekosten wordenuitgedeeld, en dat de medewerkers van de Moduleworden erkend en genoemd als copyright houders.

Gebruik door derden voor andere doeleindenDeze Module mag worden doorgegeven aan individuenvoor niet-commerciële doeleinden, maar niet metbehulp van elektronische distributielijsten, mailinglists (listserv), nieuwsgroepen, bulletin boards ofongeautoriseerde World Wide Web plaatsingen. Het isevenmin toegestaan om met andere bulkdistributie,toegangs- of reproductiemechanismen die eenabonnement, of geautoriseerde individuele toegangvervangen, te gebruiken, of deze beperkingenanderszins te omzeilen.

Commercieel gebruikHet gebruik van materiaal van deze Module voorcommerciële doeleinden, zonder vooraf verkregentoestemming van de copyright houders, is striktverboden. Indien u dit materiaal voor commerciëledoeleinden wenst te gebruiken, in zijn geheel of eendeel ervan, of indien u het in de een of andere vormwenst te publiceren, dan dient u contact op te nemenmet:

EIBE secretariaat (Ute Harms)p/a Institut für die Pädagogik der NaturwissenschaftenUniversität KielOlshausenstraße 62D-24098 KIEL 1Duitsland

telefoonnummer: +49 (0)4318803166faxnummer: +49 (0)4318803132Email adres:[email protected]

Ontwikkelingsteaml Catherine Adley, Universiteit van Limerick, Ierlandl Jan Frings, Educatiecentrum voor Biotechnologie,

Hogeschool van Utrecht, Nederlandl Cecily Leonard, Universiteit van Limerick, Ierlandl Eckhard R. Lucius (coördinator), IPN, Kiel, Duitslandl Marleen van Strydonck, Universiteit van

Antwerpen, Belgiël Paul E.O. Wymer, Society for General

Microbiology, Groot-Brittannië.

Ontwerp, illustraties, vormgeving, additioneleteksten en editing:Dean Madden, NCBE, The University of Reading, TheUnited Kingdom. Illustrations and typography ©Dean Madden, 1997.

Verantwoording en dankDe EIBE wil in het bijzonder de volgende personen bedanken voor hun hulp bij de productie van deze Module. Liesbethvan de Grint (Hogeschool van Utrecht, EcB). en John Schollar (NCBE, Reading, Engeland) hebben een multinationaleworkshop opgezet en begeleid, waarbij de materialen van deze Module zijn getest. De volgende docenten hebbendeelgenomen en veel waardevolle commentaren geleverd op de concept versie: E. Vergauts, L. Daniels, L. Neels(België), Dorte Hammelev (Denemarken), Lucienne Diemer, Gérard Coutouly (Frankrijk),Thomas Jeb, Dr. U. Schnack;Dr. E. Lipkow (Duitsland),A. de Graaf, Guus Smid, J. Gradener (Nederland),Rebecca Weston, Jane Gent, Derek Mackie,Sarah Whitethread, Maggie Parson (Groot-Brittannië).


....

...

INLE

IDIN

GOver deze ModuleH H H H H H H H H H H H H H H

Deze Module bestaat uit een verzameling vanopdrachten die ontworpen zijn om,onafhankelijk van elkaar of in een serie, in hetlesprogramma te worden gebruikt. Ze zijnontworpen door leraren en onderwijskundigenuit diverse Europese landen, bijeen gebrachtmet ondersteuning en aanmoediging doorDGXII van de Europese Commissie, onderauspiciën van EIBE, het Europees Initiatiefvoor Biotechnologie Educatie.

All onderdelen zijn uitvoerig getest tijdenspraktijk-workshops, waaraan leraren uitdiverse delen van Europa hebben meegewerkt.De onderdelen van deze Module bestaan uit:

1. Goedkope modellen van DNA moleculenen diverse micro-organismen. Deze zijnbedoeld om de belangrijkste kenmerkenvan deze systemen te demonstreren en deleerlingen de mogelijkheid te bieden omde relatieve afmetingen van micro-organismen te bestuderen.

2. Eenvoudige, veilige en goedkope DNAisoleermethoden die de leerlingen inaanraking brengen met de hierbijgebruikelijke basistechnieken en ze demogelijkheid geven om het genetischmateriaal te bekijken.

3. Een reeks experimenten die benadrukt:a) de aanwezigheid van micro-organis-men in de omgeving en de selectie vanbruikbare stammen enb) een aantal producten die micro-organismen kunnen aanmaken (enzymenen antibiotica). Twee experimenten zijnkwalitatief van opzet; een derde leverteen kwantitatieve enzymproductie ana-lyse op.

4. Divers onderzoek naar de effecten vanmicrobiële groei, gerangschikt van eeneenvoudige proefje met brooddeeg, viafermentatie tot het direct meten van demetabolische activiteit van gist. In elkvan deze onderzoeken is er ruimemogelijkheid voor verdere uitbreiding.Om de leerlingen te stimuleren, zijnproeven vanuit theoretische principes,maar met een biotechnologischetoepassing uitgezocht.

5. Twee experimenten die de methoden vangenoverdracht in de natuur demonstreren.Deze zijn bedoeld als een praktischeintroductie tot de principes vangenetische modificatie.

De auteurs hebben geprobeerd een combinatieaan te bieden van zowel eenvoudige als meergeavanceerde experimenten, in de hoop datelke biologieleraar iets van zijn of haargading kan vinden. De gebruikte materialenzijn verkrijgbaar bij de gebruikelijke firma’s.Bacteriën, gisten en schimmels zijn inNederland te koop bij het Centraal Bureauvoor Schimmelcultures (C.B.S.) te Baarn, tel(035) 548 12 11, E-mail: [email protected] appendices geven de achtergrondinfor-matie over het gebruik van microbiologischetechnieken in het schoollaboratorium.

Aan- of opmerkingen op dit materiaal zijnzeer welkom, vooral van leraren, voor wiedeze Module in eerste instantie is ontwikkeld.Vragen en opmerkingen over deze Modulekunt u sturen naar:

Eckhard R. LuciusInstitut für die Pädagogik derNaturwissenschaftenUniversität KielOlshausenstraße 62D-24098 KIEL 1Duitslandtelefoonnummer: +49 (0)4318803137faxnummer: +49 (0)4318803132E-mail adres:[email protected]

of (voor Nederland) naar:Liesbeth van de GrintEducatiecentrum voor Biotechnologie,FEOHogeschool van Utrecht, Postbus 140073508 SB UtrechtTelefoon (030) 2547210E-mail: [email protected]

dan wel (voor België) naar:Prof. Dr. Vic Damen / Marleen VanStrydonckUniversiteit Antwerpen - Dept. DIKRUniversiteitsplein 1, 2610 Wilrijk.Telefoon: 03 / 820 29 74Fax: 03 / 820 29 75E-mail: [email protected]

[email protected]

....

...


PHE

LEU

SER TYR

STOP

CYS

TRP

PHE

LEU

SERSERSER

TYR

STOP

CYSSTOP

PRO HIS

GLN

ARGLEULEULEULEU

PROPROPRO

HIS

GLN

ARGARGARG

ILE

MET

THR ASN

LYSILEILE

THRTHRTHR

ASN

LYS

SERSERARGARG

VAL ALA ASP

GLU

GLYVALVALVAL

ALAALAALA

ASP

GLU

GLYGLYGLY

TCAG

TCAG

TCAG

TCAG

TCAG

T C A G

G

A

T

C

G

G

T

A

G

C

C

C

A T

suiker

fosfaatbase

nucleotide

Mo

de

llen

De genetische codeElke opeenvolging van drie basen op de dubbele spiraalvan het DNA codeert voor een van de twintig aminozuren.Deze worden -in het midden van de tabel- aangeduidmet een drielettercode.

N°1 N°2 N°3

DNA bouwplaatH H H H H H H H H H H H H H H

DoelInzicht krijgen in de belangrijksteeigenschappen van de structuur van DNA.

Benodigde tijdHet maken van dit model kost ongeveer eenhalf uur. Het eventueel inkleuren vergt watmeer tijd.

Benodigdhedenper leerling of groepje leerlingen

l Scharenl Papierlijm, lijmstick, plakband of een kleine

nietmachine. N.B. Dubbelzijdig plakband isook geschikt, hoewel dat vaak na een poosjeweer los laat.

l Stuk touw (om het model aan op te hangenals het klaar is)

Opmerking: Het model wordt steviger als tweesuiker-fosfaat strengen ruggelings op elkaargelijmd worden.

Werkwijze1. Knip de beide suiker-fosfaat strengen A

en B uit.2. Knip de baseparen uit.3. Vouw de uiteinden van de baseparen

zoals staat aangegeven op de paginahiernaast.

4. Lijm het ene omgevouwen stuk van elkbasepaar aan een nummer op streng A.De volgorde doet er niet toe. Welke kantvan het basepaar ook niet.

5. Lijm het andere stuk van elk basepaaraan het corresponderende nummer opstreng B. Dus wat aan nummer 1 op Awas gelijmd, komt met de andere kantaan nummer 1 op B.

6. Hang het label met DNA MODEL meteen stuk touw aan het model.

HerkomstDit model is een aanpassing van een modeldat is ontwikkeld door de CSIRO in Australiëvoor hun ‘Double Helix’ Science Club. DeEIBE dankt de CSIRO voor hetoorspronkelijke idee en voor huntoestemming dit model te mogen gebruiken.

De structuur van DNATwee strengen van suiker- en fosfaatmoleculen vormenhet �geraamte� van het DNA. Daartussen zitten vierbasen: thymine (T), cytosine (C), adenine (A) en guanine(G), twee aan twee verbonden door waterstofbruggen.


....

...

thymine

cytosineguanine

adenine

(S) suiker

(P) fosfaat

European Initiative forBiotechnology Education

MODELvan DNA

Str

eng

A

Str

eng

B Baseparen

....

...


Mod

elle

nBacteriofaagbouwplaatH H H H H H H H H H H H H H H

Leerlingen vinden het nogal eens moeilijkzich een beeld te vormen van de orde vangrootte van micro-organismen. Daarbijkomt ook nog dat het moeilijk is eendriedimensionaal beeld te krijgen opgrond van een tweedimensionaalmicroscopisch beeld.

Het maken van modellen kan leerlingenhelpen hier in inzicht te krijgen;bovendien bevordert dit het zicht op derelatieve afmetingen van micro-organismen.

Deze activiteit zal meer resultaat boekenals de leerlingen de mogelijkheid krijgenom hun eigen modellen te ontwikkelen,dan wanneer ze een bepaald plan moetenvolgen. Deze taak zal dan ook beter thuiskunnen worden uitgevoerd, waar eengrotere verscheidenheid aan materiaal zalzijn, en vermoedelijk ook meer tijd.

Opmerking: Voor de beklagenswaardigendie menen dat het bouwen van modellenbeneden hun waardigheid is, kan het nuttigzijn te wijzen op de lange, eerbiedwaardigegeschiedenis van het modellen maken in demoleculaire biologie. Hoewel ook opgemerktkan worden dat vandaag de dagmechanische modellen merendeels zijnvervangen door computermodellen

Doell Tonen van de meest essentiële onderdelen

van de structuur van de lambda-bacteriofaag en van een aantal bacteriën.

l Inzicht verschaffen in de relatieveafmetingen van virussen en bacteriën.

Benodigde tijdHet maken van het model van de bacteriofaag kostongeveer 30 minuten. Eventueel inkleuren kost watextra tijd. Het maken van bacterie-modellenkunnen wel een uur of meer kosten, afhankelijkvan de aandacht die er aan besteed wordt.Opmerking: Dit is een geschikte huiswerkopdracht.

Benodigdhedenper leerling of groepje leerlingenl Boeken met afbeeldingen van virussen en

bacteriënl Materiaal wat nuttig kan zijn bij het

maken van modellen, zoals karton,gebruikt verpakkingsmateriaal, pingpongballen, touw, enz.

l Scharenl Lijm, plakband of (kleine) nietmachine.l Viltstiften in diverse kleuren.

Aanwijzingen voor de leerlingen

Virus, BacteriofaagKnip het model uit; knip en vouw dat tot eenmodel van de lambda bacteriofaag.

BacteriënGebruik het beschikbare materiaal ommodellen te maken van verschillendebacteriën (coc en staaf).

Bij elk model:1. Ga na welke de belangrijke onderdelen

zijn en waar ze zich in de cel bevinden,zoals celmembranen en erfelijk materiaal.

2. Stel vast hoe groot het organisme is datje model voorstelt.

3. Ga na op wat voor eenvoudige manier jede relatieve grootte van dit model aan eenjongere leerling zou uitleggen,bijvoorbeeld: ‘als echte bacteriën zogroot waren, dan zou jij zo groot als eenhuis zijn.’

UitbreidingLeerlingen zouden modellen kunnen makenvan planten- en/of dier-cellen. Deze kunnendan gebruik maken om verschillen tussenprokaryoten en eukaryoten duidelijk te makenen om de endosymbiose theorie duidelijk temaken (met uitleg van de verondersteldeevolutionaire oorsprong van de eukaryoten).

Extra informatieHet maken van modellen is (o.a.) beschrevenin:Nicholl, L. & Nicholl, D. (1987), Modellingthe eukaryotic chromosome: a stepped ap-proach. Journal of Biological Education 21(2) 99-104.

9EI

BE

Eur

opea

n In

itiat

ive

for

Bio

tech

nolo

gy E

ducatio

n 1

99

8M

OD

ULE

N°

1: IN

LEID

ING B

IOT

EC

HN

OLO

GIE

.......

Bouwplaat voor de kop van de bacteriofaag λλλλλ

Fotokopieer dit op karton of op een sheet voor de overhead projector.

Knip uit langs de buitenkant. Vouw langs de lijnen. Plak dan debuitenste flappen vast met een goede, sneldrogende (papier)lijm.

De DNAstreng kan worden voorgestelddoor een dikke draad.

Gebruik een limonaderietje voor destaart (het buigbare uitgetrokken stukmaakt het model heel realistisch).

KopwaarinDNA

Staart

....

...


cytoplasm

celmembraan

celwand

ribosomen,waar deeiwitsyntheseplaats vindt

plasmiden,kleine DNA-ringen

chromosoom

DN

A i

sola

tie

DNA isolatie uitbacteriënH H H H H H H H H H H H H H H

In dit voorschrift wordt lysozym (eenenzym) gebruikt om bacteriecelwanden af tebreken en een huishoudafwasmiddel om demembranen kapot te maken en zo dekernzuren (RNA en DNA) vrij te maken.

DoelDoelDoelDoelDoelDNA (en RNA) isoleren uit de bacterieEscherichia coli K-12

VoorbereidingTenminste 4 dagen tevoren moetenbacteriecultures (op ‘nutrient broth’, ook welbekend als Nährbouillon of voedingsbouillondan wel basismedium, zie appendix 1)worden ingezet. (Alleen volgroeide culturesleveren behoorlijke hoeveelheden DNA op.)Minstens een etmaal tevoren ethanol in eenvriesvak zetten.

Benodigde tijdHet uitvoeren van deze activiteit kostongeveer 50 minuten, inbegrepen een half uurwaarin de bacteriën worden geïncubeerd methet enzym.

BenodigdhedenPer leerling of groepje leerlingen

l Volgroeide cultuur Escherichia coli K-12(zie Voorbereiding hier boven)

l Lysozym poeder- een spatelpuntje is genoegl 6 ml ijskoude ethanol (mag gedenatureer-

de zijn)l 0,5 ml huishoudafwasmiddel (de simpelste

is de beste)l Entoogl 3 ml gedistilleerd waterl 2 reageerbuizenl Pipetje om water en lysozym mengsel te

pipetterenl Waterbad 60 °Cl Incubator (broedstoof of waterbad) 37 °C

Werkwijze1 Start een Escherichia coli K-12 cultuur,

tenminste 4 dagen voor u de DNA wiltisoleren.

2 Voeg een klein beetje lysozym toe aan 5ml bacterie suspensie en meng goed.

3 Incubeer dit mengsel 30 minuten bij37 °C.

4 Voeg 0,5 ml afwasmiddel toe aan debacteriesuspensie

5 Incubeer dit mengsel 2 minuten bij 60 °Cin een beker water.

6 Laat dit mengsel enkele minuten in koudwater afkoelen.

7 Giet langzaam en voorzichtig een laagijskoude ethanol op het oppervlak van hetmengsel.

8 DNA en RNA slaan neer op de grens vanbeide lagen en trekken in de bovenste(ethanol)laag. Het is er dan uit te halenmet behulp van een draaiende roerstaaf.Op grond van het uiterlijk staat hetresultaat bekend als ‘snotje’.

UitbreidingKleur het DNA met bijvoorbeeld aceto-orceïne of methyleenblauw.

VeiligheidBij het omgaan met de bacteriecultures moetende gebruikelijke microbiologische veiligheids-procedures worden gevolgd. Wees ookvoorzichtig bij gebruik van heet water (stap 5).

HerkomstDit voorschrift is gebaseerd op een procedure die isontwikkeld door Hertel et al. en Süßmuth et. al. (1987)die DNA uit Bacillus subtilis isoleerden. Dank is ookverschuldigd aan Prof. Joseph Lengeler (Osnabrück)voor zijn suggestie om huishoudafwasmiddel tegebruiken.


....

...

ijskoude alcohol

lysozym

5 ml bacteriecultuur

afwasmiddel

koud water

DNA+RNA

60°C

1 2

3 4

5 6

87

1 Zet een E.coli K-12 cultuur in inbasismedium (zieappendix 1).

2 Voeg een kleinbeetje lysozymtoe aan 5 mlbacteriesuspensieen meng goed.

3 Incubeer ditmengsel 30minuten bij 37°C.

4 Voeg 0,5 mlafwasmiddel toeaan de bacterie-suspensie

5 Incubeer ditmengsel 2minuten bij 60°C(waterbad) ineen bekerglaswater.

6 Laat dit mengselenkele minutenin koud waterafkoelen.

7 Giet langzaam envoorzichtig eenlaag ijskoudeethanol op hetoppervlak vanhet mengsel.

8 de kernzuren(DNA en RNA)slaan neer op degrens van beidelagen en trekkenin de bovenste(ethanol)laag.

....

...


DN

A i

sola

tie

Isolatie van DNAuit uiH H H H H H H H H H H H H H H

Dit is een ruwe methode om DNA (en RNA) uitplantaardig weefsel te isoleren. Eerst wordt hetweefsel mechanisch fijn gemaakt. Dan gebruikenwe een huishoudafwasmiddel om de membranenom de cel en de kern af te breken. Door filtratieraken we brokstukken van de cellen kwijt en hetDNA en oplosbare eiwitten blijven over. Dieeiwitten worden dan met een enzym afgebrokenen tenslotte laten we het DNA neerslaan inijskoude ethanol.

DoelDNA isoleren uit ui-weefsel.Opmerking: De kernzuren die op deze manierverkregen worden zijn niet erg zuiver. Waar hethierbij echter om gaat is de hoofdlijnen te latenzien van het extraheren van DNA uit een weefsel.

VoorbereidingDe te gebruiken ethanol (mag gedenatureerdezijn) moet echt ijskoud zijn. Zet daartoe een(plastic) fles ethanol tenminste 24 uur tevoren ineen vriesvak.

TijdsduurDeze activiteit kost ongeveer 35 minuteninclusief een incubatietijd van 15 minuten.

MateriaalMateriaalMateriaalMateriaalMateriaalPer leerling of groepje leerlingen

l Keukenmachine, ‘blender’, staafmixer ofsapcentrifuge

l Groot, scherp mes en snijplankl Grote plastic trechterl Thermometerl Waterbad 60 °Cl IJs, in een groot bekerglasl 2 bekerglazen (250 ml)l Koffiefilter (geen laboratorium filtreerpapier)l Ui, ca 100 gl 10 ml Wasmiddel (gebruik niet de dikke,

geconcentreerde)l 3 g keukenzout (NaCl)l 100 ml gedistilleerd waterl Pipet of plastic spuit van 10 ml om

hoeveelheden vloeistof af te metenl Reageerbuisl Glazen staafl 2 à 3 druppels protease (bijv. Neutrase)l 6 ml ijskoude (gedenatureerde) ethanol.

Werkwijze1 Meng het zout met het wasmiddel. Vul aan met

water tot 100 ml.2 Hak de ui in kleine stukjes niet kleiner dan 10

mm x 10 mm.3 Doe de stukjes ui in een beker en giet het

wasmiddel-zout-mengsel er op.4 Meng het geheel en zet het in een waterbad

van 60 °C gedurende precies 15 minuten.5 Koel het mengsel af door het bekerglas

gedurende 5 minuten in ijswater te zettenonder voortdurend roeren.

6 Giet het mengsel in een keukenmachine endraai 5 seconden (niet langer!) op hoogtoerental.

7 Filtreer het mengsel in het andere bekerglas.Pas goed op dat het schuim op het oppervlakhet filtraat niet verontreinigt. Dit filtraat is hetuienextract dat oplosbare eiwitten en DNAbevat.

8 Doe 4 druppels protease bij ca 10 mluienextract in een reageerbuis. Meng goed.

9 Giet nu heel voorzichtig een laag ijskoudealcohol bovenop het extract-enzymmengseldoor de alcohol langzaam in de schuingehouden buis te gieten. Laat dit geheel 2 à 3minuten staan zonder aan te raken.

10 Het DNA (en ook RNA) slaat neer op hetgrensvlak. Dit is als volgt beter zichtbaar temaken: Draai zachtjes met het glasstaafje ophet scheidingsvlak. Probeer te voorkomen datde lagen al te zeer verstoord worden of dat hetfragiele DNA breekt. Er is een wit web vanslijmerig DNA te zien die met een Pasteursepipet uit de buis kan worden gehaald.

Uitbreidingl Het DNA is te kleuren met bijv.

karmijnazijnzuur, aceto-orceïne ofmethyleenblauw.

l Uit dierlijke weefsels (zoals kuit van vis, lever,kalfsthymus) of micro-organismen kan op eendergelijke manier DNA worden gehaald. Eenvijzel met stamper (met fijn zand) zijn dangeschikt als een wat elegantere methode dande blender om het weefsel open te breken; er isdan minder kans dat het DNA kapot gaat.

VeiligheidDit voorschrift levert geen bijzondere gevaarlijkesituaties op. Wel moet men natuurlijk zorgvuldigomgaan met het mes en de keukenmachine.

HerkomstDeze methode is een bewerking van een voorschrift uitAlison Rasmussen en Robert Matheson (1990), ASourcebook of Biotechnology Activities, National Associa-tion of Biology Teachers, North Carolina BiotechnologyCenter. ISBN: 0 941212 09 2. Dit boek is rechtstreeksverkrijgbaar bij: NABT, 11250 Roger Bacon Drive #19,Reston, Virginia 22090, USA.


.......

Detergent

1 2 3 4

765 8

9

Isolatievan DNAuit uien

DNA+RNA

10 ml afwasmiddel3 gr keukenzout100 ml water1 ui (middelmaat)

Meng het zout met het was-middel. Vul aan met watertot 100 ml. Meng goed omhet zout op te lossen.

Doe de stukjesui in een bekeren giet hetwasmiddel-zout-mengsel er op.

Het afwasmiddelbreekt de celmem-branen af; daardoorkomt het DNA vrij uitde kern die in elkecel zit.

Zet het bekerglas 15minuten bij 60 ºC

In de warmte gaan deprocessen sneller ....

.... en wordt het DNaseafgebroken dat andershet DNA zou afbreken

Koel het mengsel afdoor het bekerglasgedurende 5 minutenin ijswater te zettenonder voortdurendroeren.......... maar dat moet ookweer niet te lang duren,anders gaat het DNA stuk... daarom is een ijsbadnodig

Zet de machine 5seconden aan; nietlanger

NU worden de uiecellenopengebroken. Maar alsdit te lang doorgaat, gaatook het DNA kapot

Filtreren

Hiermee scheidenwe het celwand-materiaal van DNAen eiwitten die inoplossing zijn

Doe 2-3 druppelsenzym bij ca 10ml uienextractin eenreageerbuis

De protease (er ismaar heel weinignodig) breekt hetopgeloste eiwit af

Giet heel voorzichtig eengelijk volume aanijskoude ethanolbovenop het uienextract

De ethanol * MOET ijskoudzijn; bewaar het een nachttevoren in een vriesvak

* mag gedenatureerde zijn

DNA wordt zichtbaarin de (bovenstaande)ethanollaag

DNA lost niet op in dekoude ethanol; het trektuit de oplossing naar debovenlaag

Protease

Koffiefilter

IJSKOUDEethanol

KEUKENZOUT

IJS

....

...


a-1,6gluco-sidase

α-amylase

β-amylaseamyloglucosidase

ααααα(1-4)binding

α(α(α(α(α(1-6)binding

Pro

du

ctie

Amylase uitbodembacteriënH H H H H H H H H H H H H H H

Zetmeel is een polymeer, dat bestaat uitglucosemoleculen die aan elkaar gekoppeldzijn. Het kan een polymeer in een rechte ketenzijn, bijvoorbeeld amylose. Het kan ook eenvertakte polymeer zijn: amylopectine. Dezepolymeren kunnen worden afgebroken doorextracellulaire polymerases. Die enzymenworden gemaakt door talloze organismen,waaronder bacteriën en schimmels. Veelmicroben zijn gescreend om na te gaan of zegeschikt zijn voor commerciële enzym-productie. In dit onderzoek worden bacteriënuit de grond gescreend op extracellulaire amy-lase productie.

DoelIn de grond voorkomende bacteriën testen op deaanwezigheid van amylase productie.

VoorkennisDe leerlingen moeten op de hoogte zijn vanelementaire microbiologische technieken, zoalssteriel werken. Ook kennis van de zetmeel-jodium reactie wordt bekend verondersteld.

Voorbereiding.Grondmonsters. Per leerling is 1 g grond nodig,gestoken van ca 10 cm diep. Het beste is het alsde grondmonsters luchtdroog zijn.Zetmeelvoedingsbodem. (Zie ook appendix 1)Ga uit van in de handel verkrijgbare ‘Nutrientagar’. ‘Nutrient Broth’ (Nährbouillon of voe-dingsbouillon) kan ook, maar dan moet per literextra 20 g agar worden toegevoegd. Volg de aan-wijzingen die op de voorraadpot staan. Voeg perliter 2 g oplosbare zetmeel toe. Reken per leer-ling op 20 ml. In verband met het autoclaveren,afkoelen, steriel in de (steriele) Petrischalenschenken en verder afkoelen, moet dit ruim voorde les gedaan worden. Een snelkookpan is goedbruikbaar als autoclaaf.Steriel water moet eveneens voor de les gesteri-liseerd zijn. Reken per leerling op 15 ml.Jodiumoplossing: Los 1 g jodiumkristallen en3 g kaliumjodide op in 300 ml gedistilleerd wa-ter. Doe dit minstens een dag van tevoren; hetoplossen van de jodiumkristallen kost tijd.Steriele wattenstokjes. De plastic steeltjes vande in een winkel gekochte wattenstokjes smeltenbij autoclaveren. Sommige typen kunnen wordenbehandeld met een antimicrobieel middel. U kuntvoor deze proef uw eigen wattenstokjes makendoor een plukje wattenprop de wikkelen op depunt van een cocktailprikker. Autoclaveer ze ineen McCartney flesje of in losjes eromheengewikkeld aluminiumfolie bij 121 °C gedurende15 minuten.

TijdsduurVoorbereiding en beënten van de Petrischalen:

45 minuten.Bekijken van de resultaten na 2-3 dagen:

15 minuten.

BenodigdhedenPer student of groep studenten (aangenomen is datgebruikelijk practicummateriaal beschikbaar is)

l 1 gram luchtdroge grond van 10 cm diep.l Steriele Petrischaal waarin 15 à 20 ml

steriele zetmeelvoedingsagar.l 15 ml steriel water in een McCartney flesje.l Jodiumoplossing.l Een steriel wattenstokje.l Markeerpen (om op Petrischaal te schrijven).

Waar grijpenWaar grijpenWaar grijpenWaar grijpenWaar grijpende enzymende enzymende enzymende enzymende enzymenhet amylopectine aanhet amylopectine aanhet amylopectine aanhet amylopectine aanhet amylopectine aan

De glucosemoleculen in amylose en amylopectinezijn aan elkaar gebonden door α(1-4) bindingen; dezijtakken in amylopectine zijn aan deze ketensgebonden door α(1-6) bindingen. De belangrijkstein de handel verkrijgbare amylases zijn:

ααααα-amylase . Dit hydrolyseert α(1-4) bindingen inpolymeren van glucose, maar alleen binnen ketens; ditleidt tot korte ketens (dextrinen). Op industriële schaalwordt het gewonnen uit bacteriën(o.a. Bacillus spp.)βββββ-amylase . Dit hydrolyseert α(1-4) bindingen inpolymeren van glucose, zodanig dat aan het eindvan een keten maltose wordt afgesplitst. Het kanα(1-6) bindingen niet passeren. In de industriewordt het verkregen uit gerst en mout.amyloglucosidase . Dit enzym breekt α(1-4) bindin-gen zodanig dat steeds glucose wordt afgesplitst vande einden van ketens. Het kan α(1-6) bindingen nietpasseren. Industrieel wordt het verkregen uit deschimmels Aspergillus spp. en Rhizopus oryzae.α(1-6) glucosidase . Dit hydrolyseert α(1-6) bin-dingen. Het wordt industrieel verkregen uit debacteriën Bacillus acidopullulyticus en Klebsiellapneumoniae.


....

...

ZetmeelAgar

Steriel water

Zet de plaatop z’n kop

Geen zetmeel opde lichte plaatsen

Werkwijze1 Doe 1 gram droge grond in 15 ml steriel

gedistilleerd water. Schud krachtig opdat degrond goed wordt verdeeld.

2 Doop het steriele wattenstokje in de zojuistgemaakte suspensie. Strijk dat vervolgens overde agar in de Petrischaal.

3 Zet een teken op de Petrischaal (bijv. deinitialen) en de datum en waar hetgrondmonster vandaan kwam.

4 Zet de beënte plaat, op z’n kop, 2 à 3 dagenweg bij 30 °C.

5 Giet dan voorzichtig jodiumoplossing over deagar tot op het hele oppervlak een laagje vanca 1 mm staat. Waar nog zetmeel aanwezig is,wordt de agar blauwzwart (de jodium-moleculen kruipen in de spiraalvormige ketensvan de zetmeelmoleculen). Er ontstaanlichtbruine gebieden (de kleur van jodium)langs de randen van kolonies als de bacteriëndaar zetmeel hebben afgebroken.

VeiligheidBELANGRIJK . Als het niet toegestaan is of nietwenselijk wordt geacht met onbekendeorganismen te werken kan een cultuur van Bacil-lus subtilis worden gebruikt in plaats vanbodemorganismen. Bij de uitvoering van ditpracticum en het opruimen van de platen moetende gebruikelijke microbiologischeveiligheidsvoorschriften in acht worden genomen,hoewel steriel werken niet echt nodig is tot op hetmoment van de beënting. Het is niet verstandigcultures te kweken vanuit de (niet bekende)organismen op deze platen.Jodium is vergiftig en moet met zorg behandeldworden.

Amylasevorming doorbodembacteriën

Maak een Petrischaal metMaak een Petrischaal metMaak een Petrischaal metMaak een Petrischaal metMaak een Petrischaal metsteriele zetmeelagar klaar.steriele zetmeelagar klaar.steriele zetmeelagar klaar.steriele zetmeelagar klaar.steriele zetmeelagar klaar.

Suspendeer1 gram grond in15 ml sterielwater

Droge grond.

Veeg met een steriel wattenstokjeVeeg met een steriel wattenstokjeVeeg met een steriel wattenstokjeVeeg met een steriel wattenstokjeVeeg met een steriel wattenstokjegrondsuspensie over de agar.grondsuspensie over de agar.grondsuspensie over de agar.grondsuspensie over de agar.grondsuspensie over de agar.

Laat de plaat 2 tot 3 dagenstaan bij 30°C.

Kleur de plaat met jodium om tekijken waar zetmeel is afgebroken.

....

...


Pro

du

ctie

Cellulase productieH H H H H H H H H H H H H H H

Er is veel afval in de vorm van cellulose. Alsmen die zou kunnen omzetten in veevoer, zougoedkoop materiaal tot een waardevol productworden. De meeste cellulase in de handel isafkomstig van de schimmel Trichodermareesei en wordt geproduceerd in fermentoren.In een Petrischaal groeit de bacterieCellulomonas echter sneller. De productie vanextracellulaire cellulase is daarin makkelijkmeetbaar.

DoelEen kwantitatieve meting van cellulaseproductiedoor Cellulomonas.

VoorbereidingCellulomonas kan worden aangehouden inbasismedium (zie appendix 1). Ter voorbereidingmoeten Cellulomonascultures in basismedium(bijv. in McCartneyflesjes) twee à drie dagentevoren worden klaargemaakt. De culturesmoeten worden geïncubeerd bij 25-30°C. Perleerling is 1 ml voldoende.

CMC medium bevat per 100 ml:0,5 g carboxymethylcellullose (een oplosbarevorm van cellulose); 0,1 g NaNO

3; 0,1 g

K2HPO

4; 0,1 g KCl; 0,05 g MgSO

4; 0,05 g

gistextract; 0,1 g glucose; alles per 100 ml water.Voeg tenslotte per 100 ml water 1,7 g agar toe.Per leerling is ca 15 ml medium nodig.Steriliseer het mengsel en giet steriel 15 ml inelke steriele Petrischaal.

Steriliseer voldoende 1 ml pipetten

Zorg voor voldoende desinfectans bijv. 5%chlooroplossing.

TijdsduurVoorbereiding en beënten van de Petrischalen:

45 minuten.Bekijken van de resultaten na 2-3 dagen:

15 minuten.

BenodigdhedenPer student of groep studenten (aangenomenis dat gebruikelijk practicummateriaal even-eens beschikbaar is)l Cultuur van Cellulomonas sp. (suspensie)l Steriele Petrischaal, waarin 15 ml CMC

medium (zie Voorbereiding).l Steriel water (in McCartneyfles).l 2 Steriele 1 ml pipetten.l Afvalbeker waarin een 5% chlooroplossing.

l Congorood oplossing (1 mg per ml water)l 1M NaCl oplossing (5,85 g per 100 ml)l Ethanol (om de kurkboor te steriliserenl Kurkboor, diameter 5 mml Markeerpen (om op de Petrischaal te schrijven)l Broedstoof, 25-30°C

Werkwijze1 Doop de kurkboor in alcohol. Houd de

boor dan in een vlam en laat de alcoholverbranden. LET OP! Houd die boorhorizontaal; anders gaan de vlammen doorde boor heen als door een schoorsteen enverbranden de handen.

2 Til de deksel van een CMC plaat iets open maak met de boor een gat in de agar.Sluit de deksel. Haal de agarprop weg,zonodig met een entnaald.

3 Herhaal deze stap, zo ontstaan twee gatenin de agar.

4 Markeer elk gat aan de onderkant van dePetrischaal. Een geschikte code kan zijn:C (Cellulomonas) en W (steriel water, deblanco).

5 Pipetteer in het juiste gat 0,2 ml of van deCellulomonas suspensie of steriel water,telkens met een andere, steriele pipet. Zetde pipetten na gebruik in de afvalbekermet desinfectans.

6 Zet de platen ongeveer een week bij 25 à30°C. Na 48 uur bij 30°C maaktCellulomonas heldere zones van zo’n 16mm doorsnee.

Na de incubatie7 Giet wat Congorood-oplossing over de

plaat. Laat 15 minuten staan. Ontkleur danmet de zoutoplossing gedurende 10 à 15minuten. Waar de kleur weer verdwenenis, is de CMC afgebroken tot b-(1-4)glucaan. Deze stof bevat zeven of minderglucose-eenheden. De diameter van deheldere zone levert een kwantitatieve maatvoor de activiteit van cellulase.

UitbreidingUitbreidingUitbreidingUitbreidingUitbreiding1 Pipetteer een grondsuspensie (eventueel

voorgekweekt, bijv. in vloeibare CMC) inde gaten in de platen om microbiële florate screenen op cellulase-activiteit.

2 Deze techniek is ook geschikt omcommerciële cellulase producten teonderzoeken.

3 Het verloop van de afbraak door cellulase iste volgen door meer platen te gebruiken.


....

...

Cellulase

Sterielewattenprop

VeiligheidDe gebruikelijke veiligheidsproceduresmoeten in acht worden genomen.

1. Steriliseer eenkurkboor doorhem met alcoholte flamberen.

PAS OP. Alcoholis brandbaar.

2. Maak twee gaten inde agar in de plaat.

3. Beënt een gat metCellulomonas suspensie.

Doe water in het andere gat.Doe water in het andere gat.Doe water in het andere gat.Doe water in het andere gat.Doe water in het andere gat.

4. Incubeer de plaat48 uur bij 30°C Plak de deksel vast.

5. Kleur de plaatMeet de diameter van het gebiedwaar de cellulose is afgebroken.

....

...


Hieronder:Een drie dagen oude cultuur van Streptomycesgriseus (links, verticaal). De testorganismen zijn(van boven naar beneden):Candida utilis, Micrococcus luteus, Pseudomonasfluorescens, Bacillus mycoides, Escherichia coli.

Pro

du

ctie

AntibioticaH H H H H H H H H H H H H H H

Veel micro-organismen maken antibiotica.Dat zijn stoffen die het groeien van concur-rerende bacteriën verhinderen of ze zelfskunnen doden. Vanaf de ontwikkeling vanpenicilline (gemaakt door de schimmelPenicillium) in de jaren 40 zijn deze stoffenmet veel succes gebruikt bij de bestrijdingvan met name infectieziekten. Op hetogenblik zijn de belangrijkste antibioticaafkomstig van de bacterie Streptomyces.

DoelDe productie van het antibioticumstreptomycine door Streptomyces en het effectervan op enkele micro-organismen laten zien.

VoorkennisHerkomst en werking van antibiotica;ontstaan en verspreiding van resistentie tegenantibiotica.

VoorbereidingDe te gebruiken cultures van Streptomycesgriseus moeten in de groeifase zijn. Daartoemoeten ze 2 à 3 dagen worden gekweekt opPetrischalen met 15 à 20 ml basisagar.

Tevoren moet een cultuur worden gekweektom deze platen te beënten. Dit doet men hetbeste als volgt. Neem een oogje Streptomycesvan een schuine buis, suspendeer dit in 1 mlsteriel basaal medium en pipetteer dit weer ineen cultuurbuis met 5 ml steriel basismedium.Laat deze cultuur gedurende 24 uur bij 30 °Cstaan.

Beënt de Petrischalen met deze Streptomycescultuur met één enkele verticale streep, zovermogelijk naar links; zorg dat de rechterkantsteriel blijft.

Incubeer de platen gedurende 3 à 4 dagen bij30 °C.

Zet bovendien overnachtcultures klaar vantestorganismen. (Bijvoorbeeld Bacillusmycoides, Candida utilis, Escherichia coliK-12, Micrococcus luteus, Pseudomonasfluorescens).

TijdsduurKlaar maken media en cultuur: 60 min.Incubatie van Streptomyces cultuur: Eerst 24uur, daarna 72 - 96 uur.Platen beënten: 20 min.Incubatie 24-72 uur.

BenodigdhedenPer student of groepje studenten (aangeno-men dat het gebruikelijke practicummateriaalbeschikbaar is).

l Stoof van 30 °Cl Entoogl Steriele Petrischaal met 15 à 20 ml

basisagar, waarop geënt een streepStreptomyces griseus die 48-72 uur isvoorgekweekt. (zie Voorbereidinghierboven)

l Een keuze uit de volgend testorganismenop schuine buizen:- Candida utilis (gist)- Micrococcus luteus (bacterie)- Pseudomonas fluorescens (bacterie)- Bacillus mycoides (bacterie)- Escherichia coli K-12 (bacterie)


....

...

Antibiotica

Werkwijze

1. Beënt elke voorgekweekte Streptomycesplaat met de testorganismen als volgt:a) Maak een entoog steriel door hem uit tegloeien in een brandende vlam(bunsenbrander); laat hem kort afkoelen.b) Krab met deze steriele entoog wat afvan een schuine buis van eentestorganisme. Maak dan een horizontalestreep op het open stuk van de plaat (rechtsvan de Streptomyces). Deze streep moethaaks staan op de Streptomycesstreep en erzo dicht mogelijk bij beginnen.PAS OP! Raak de Streptomycesstreepzelf NIET met het oogje.c) Maak de entoog weer steriel door hemweer uit te gloeien.Herhaal a), b) en c) voor elk van debeschikbare testorganismen.

2. Zet de platen 2 dagen bij 30 °C.3. Bekijk de platen.

Veiligheid

Dit werk moet in een practicumlokaal wordenuitgevoerd. Men dient zich te houden aan denormale microbiologische veiligheidsvoor-schriften bij het uitvoeren van dit practicum enbij het verwijderen van de gebruikte cultures.De hoeveelheid antibioticum die tijdens dezeactiviteit wordt geproduceerd levert geen gevaarop.

UitlegStreptomyces griseus produceert het antibioticumstreptomycine. Dit diffundeert in het medium.Streptomycine en daarop gelijkende antibioticastoren de eiwitsynthese door een binding aan tegaan met het 30S-deel van bacterie-ribosomen.Sommige micro-organismen (Bacillus mycoides,Escherichia coli, Micrococcus luteus) zijn daargevoelig voor, andere (Pseudomonas fluorescens)niet. Gisten (Candida utilis) zijn niet gevoelig voorstreptomycine omdat dat eukaryoten zijn; diehebben een andere ribosoomstructuur.

Eén enkelestreep links

Maak 3-4 dagen tevoren eenPetrischaal met Streptomycesgriseus klaar.

Testorganismen opschuine buizen

Maak eenentoogsteriel

Raak niet aan deStreptomyces!

Strijk een van detestorganismen uit op deStreptomycesplaat.

Doe dit ook met de andere testorganismen.Vergeet niet tussen twee uitstrijkjes deentoog te steriliseren.

Plak de plaat dicht metplakband

Merk de plaat

Zet de plaat 2-3 dagenbij 30 °C op de kop.

....

...


Mic

ro-o

rganis

men in

act

ie Brooddeeg makenH H H H H H H H H H H H H H H

Brood bakken is een van de oudste vormenvan biotechnologie. De vroegst bekendevermeldingen ervan dateren uit het oudeEgypte, zo’n 4000 jaar voor Christus.Gewoonlijk maken we brood uit een deegdat, behalve gist, tarwemeel, water en zouten eventueel wat vet bevat. Dit vormt sameneen netwerk waarin de gist gevangen zit. Inhet meel zitten amylases, die zetmeel kun-nen omzetten in suikers. En die suikers zijnweer voedingsmiddel voor de gist.De gistcellen hebben ook een stikstofbronnodig. Die komt van peptiden en amino-zuren die ontstaan door gedeeltelijke hydro-lyse van gluten (meeleiwit). De stofwisse-ling van de gist leidt tot de ontwikkeling vanalcohol en kooldioxide.Gluten zorgt voor elasticiteit en plasticiteitvan het deeg. Daardoor komt het dat dekooldioxide, een gas immers, gevangenblijft, grote bellen in het deeg maakt enzodoende zorgt dat het deeg rijst. Het zalduidelijk zijn dat eiwitrijk meel (het duurstemeel) de meeste kans op succes geeft. Debakker gebruikt dit type meel voor krenten-brood; dit zou anders door alle andereingrediënten slecht rijzen.

DoelDit is een globaal recept, bruikbaar om teonderzoeken welk effect diverse ingredi-enten hebben.

TijdsduurUitvoering: 1 lesuur, eventueel meer,afhankelijk van de gekozen uitbreidingen.

MateriaalBasisrecept per portie deegl 1 g gedroogde gistl 75 g (eiwitrijk) tarwemeell 50 ml waterl extra ingrediënten als ascorbinezuur,

α-amylase, KBr.l Kleine bekerglazen om deeg in te

mengen

l Stevige spatels of lepels om in hetdeeg te roeren.

l 2 maatcylinders (100 ml)l KlokOpmerking: 75 g meel is ca. 125 mlvolume, 1 portie deeg is ongeveer 175 ml.

Werkwijze

1. Meng de gist met het water. Mengdan deze suspensie goed met hetmeel.

2. Rol het deeg tot een rol. Neemhiervan een stuk dat in een derde totde helft van de maatcylinder past. Zetde rol in een van de maatcylinders.

3. Noteer de hoogte van elke rol deeg inde maatcylinders aan het begin van deproef en vervolgens om de 10minuten gedurende een lesuur.

Uitbreidingen1. Hebben verschillende typen gedroog-

de gist invloed op de rijssnelheid?2. Hebben verschillende soorten meel

effect? (bloem, volkorenmeel, rog-gemeel enz. Volkorenmeel is rijk aanamylase; sommige meelsoorten bevat-ten weinig amylase maar veel gluten.)

3. Wat is het effect van de broodverbe-teraar ascorbinezuur (vitamine C) opde rijssnelheid? (Voeg per bovenaangegeven portie deeg 1 g toe.)

4. Wat is het effect van α-amylase? Alser verschil is, hoe is dat te verklaren?

5. Kaliumbromide is ook een bekendebroodverbeteraar. Het bevordert devorming van sulfhydryl-bindingentussen naast elkaar liggende eiwittenwat een elastischer, luchtiger deeggeeft. Maar teveel luchtigheid ver-zwakt het deeg weer. Wat heeft hetvoor effect?


....

...

gedroogdeGIST

6. Zout belemmert de activiteit vanproteases. En daarmee stoort het destructuur van gluten waardoor weerhet kooldioxide weer moeilijkerwordt vastgehouden. Zout maakt glu-ten minder rekbaar doordat dan sterkeionbindingen ontstaan en dat leidt toteen stug deeg. Overmaat aan zoutverstoort ook de groei van gistcellen.Probeer vast te stellen wat de optima-le zoutconcentratie van het deeg is.

BASISRECEPT VOOR BROODDEEG

1. Neem 1 g gedroogde gist op in 50 mlwater.

2. Laat de gist water opnemen; voegdan 75 g meel toe.

3. Meng goed.

1. Doe wat deeg in een maatcylinder.2. Noteer het volume om de 10

minuten.

VragenGaat het uitzetten van het deeg wel gelijkop met de groei of de stofwisseling vande gist? Hoe is je idee hierover tetesten?

Welke andere omstandigheden (behalvede activiteit van de gistcellen) zoudeninvloed kunnen hebben op het volumevan het deeg?

....

...


Foto: Dr D

uncan Casson

Gistcellen geïmmobiliserd in een matrixvan calciumalginaat

Mic

ro-o

rganis

men in

act

ie GeïmmobiliseerdegistcellenH H H H H H H H H H H H H H H

De gewone bakkersgist, Saccharomycescerevisiae, kan melksuiker (lactose), nietverwerken. Het enzym β-galactosidasebreekt lactose af tot glucose en galactose.Gist die samen met dit enzym is geïmmo-biliseerd kan wel groeien in een mediummet lactose. Van de beide suikers dieontstaan door de enzymwerking wordtglucose het gemakkelijkst opgenomen.Als nu de glucose is verbruikt stelt de gistzijn stofwisseling bij en gaat de galactoseopnemen en vergisten. De activiteit vande gist is gemakkelijk te zien aan dehoeveelheid gas (kooldioxide) die bij destofwisseling vrij komt.

DoelEen inleiding geven op het kwantitatiefbestuderen van fermentatie.

VoorbereidingNatriumalginaat is slecht oplosbaar in water.Om het op te lossen moet het water warm zijnen ook moet u flink roeren. Daarom moetnatriumalginaat van te voren klaargemaaktworden. Als u de oplossing wilt bewaren kandat tot zeker een half jaar in de koelkast;anders is het verstandig de oplossing teautoclaveren.Belangrijk: gebruik gedistilleerd ofgedeïoniseerd water omdat calciumionen inkraanwater storen.

BenodigdhedenPer leerling of groepje leerlingen.l 4% natriumalginaatoplossing, 10-15 mll 1,5% calciumchlorideoplossing, 100 mll 10 ml wegwerpspuit zonder naaldl theezeefjel 2 bekerglazen van 200 mll 2 erlenmeyers van 250 mll 2 doorboorde stoppen met glasbuis en

slangetjes voor op de erlenmeyersl 2 grote bekers van ca 500 mll 2 maatcylinders van 100 mll desinfectiemiddel, b.v.

natriummetabisulfiet of een

handelsprodukt als Milton (natriumhypochloriet oplossing, Procter &Gamble) of Stafilex chloortabletten(natrium dichloorisocyanaat, Hospidex)

l 13% NaCl oplossing, ca 1 l. (gewoonkeukenzout is geschikt)

l 100 ml medium waarin 2 g glucose, 1 ggistextract en 1 g pepton.

l 100 ml medium waarin 2 g lactose, 1 ggistextract en 1 g pepton.

l 2 ml β-galactosidase.l verse of gedroogde bakkersgist.

Werkwijze.Maak de bolletjes van geïmmobiliseerd

enzym en gist als volgt:1 Meng de gist met 25 ml gedistilleerd water

in een klein bekerglas. Dek het af en laathet 10 minuten staan.

2 Meng de natriumalginaatoplossing met deβ-galactosidase in het andere kleinebekerglas. Roer daar 10 ml van degistsuspensie door.

3 Zuig wat van het mengsel van alginaat,gist en enzym op in de spuit en voeg ditmengsel druppel voor druppel toe aan de


....

...

Ca2+

calciumchlorideoplossing in een van degrote bekerglazen.

4 Laat de nu ontstane bolletjes een minuutof 10 uitharden.

5 Zeef de bolletjes uit de vloeistof met hettheezeefje. Spoel ze met kraanwater.

De bolletjes kunnen zo nodig een dag of driein een koelkast in steriel water bewaardworden.

Maak de fermentatievaten als volgt gereed:1 Steriliseer de erlenmeyers met het bisulfiet

o.i.d.. Spoel daarna goed met water.2 Doe de steriele media in de erlenmeyers,

in de ene het glucosemedium (de blanco)en in de andere het lactosemedium.

3 Doe in beide vaten evenveel (of een gelijkemassa) bolletjes.

4 Doe de stoppen (met buisjes en slangen)op de erlenmeyers. (zie figuur)

5 Zet ze weg bij 21-25 °C. Verzamel hetgevormde gas boven een 13% NaCl-oplossing (kooldioxide lost hier niet inop). Meet de hoeveelheid gas opverschillende tijden (zie figuur).

6 Zet de resultaten in een grafiek (hetgasvolume tegen de tijd).

UitbreidingGebruik verschillende soorten gist (ze zijno.a. verkrijgbaar bij winkels diegespecialiseerd zijn in thuisbrouwerij.Varieer de concentratie van β-galactosidase,incubatietemperatuur of andere variabelen.

VeiligheidAls veel gas vrij komt in een fles, kan datgevaarlijke situaties opleveren; er ontstaatdruk en niet alle flessen kunnen daar tegen.Zorg er daarom voor dat eventuele overdrukkan ontwijken. Let bij het gebruiken vanchemische sterilisatiemiddelen opaanwijzingen van de fabrikant.

Vastzetten in calciumalginaat is een zeer algemeengebruikte techniek om cellen te immobiliseren. Hetis heel geschikt voor levende cellen omdat die nietgauw beschadigd worden door deze behandeling.Toepassingen van deze techniek zijn onder anderede immobilisatie van levende of dode cellen inbioreactors, het vasthouden van plantenprotoplastenen van plantenembryo’s (‘kunstmatig zaad’ of ‘artifi-cial seed’) voor het opkweken, immobilisatie vanhybridomacellen voor het bereiden van monoclonaleantilichamen en het invangen van enzymen en anderestoffen (zie de tabel verderop).De cellen of stoffen die moeten worden geïmmo-

biliseerd worden eerst gemengd met een oplossingvan natriumalginaat. Dit mengsel laat men dandruppelen in een oplossing met multivalente katio-nen, meestal Ca2+. De druppels worden vanzelfbolletjes als ze in de oplossing komen, waarbij de inhet alginaat opgeloste cellen en/of enzymen terechtkomen in een driedimensionaal netwerk van doorionen verbonden alginaatstrengen. (zie het schemahierboven).Meer informatie is te vinden in Smidsrød, O en Skjåk-Bræk, G. (1990), Alginate as an immobilization ma-trix for cells. Trends in Biotechnology 8(3), 71-78.

....

...


®

The University of Reading, United Kingdom

NATIONAL CENTRE FOR BIOTECHNOLOGY EDUCATIO

N

Enzymes for Schools and Colleges

Novo Nordisk Lactozymβ-galactosidase from Kluyveromyces lactis

100 ml

Store at 4°C. Do not freeze.

Saccharomyces cerevisiaeFermentation results

Gist, lactase en natriumalginaatin oplossing

Druppel voor druppeltoevoegen

Spoel met water

Enzym in de bolletjes breektlactose af tot glucose engalactose

Calciumchlorideoplossing

De gistcellen moeten het hebben van desuikers die zijn ontstaan dank zij hetenzym; ze maken daarbij kooldioxide enalcohol

Oplossing vanlactose, waaraantoegevoegd pepton engistextract

13%natriumchlorideoplossing

Zet het gasvolume uittegen de tijd

CO2

Voorbeelden van gebruik van met alginaat geïmmobiliseerde cellen (naar Smidsrød,O. en Skjåk-Bræk,G.1990)

Cellen Product/doel

BacteriënErwinia rhapontice IsomaltulosePseudomonas denitrificans DrinkwaterzuiveringZymomonas mobilis Ethanol

Blauwgroene AlgenAnabena sp. Ammonia

Gisten, schimmelsKluyveromyces bulgaricus Lactose-splitsingSaccharomyces cerevisiae EthanolSaccharomyce bajanus Champagne

AlgenBotryococcus braunii Koolwaterstoffen

Cellen Product/doel

PlantencellenChatharanthus roseus Alkaloïden voor

kankertherapieDiverse planten PlantenembryosProtoplasten Celbehandeling,

microscopieDierlijke cellen

Hybridomacellen Monoclonaleantilichamen

Eilandjes vanLangerhans Insuline/ImplantatieFibroblasten, lymfoomcellen Interferons ( α en β )

gedroogdeGIST


....

...

Het monteren van de gist-

brandstofcel(de precieze afmetingen doener niet veel toe; het prototypewas 55 mm x55 mm).

gat waardoor dekamer wordtgevuld

neopreenpakking

uiteinde van dekoolstofvezel-elektrode

kaasdoekvoorkomt datelektrode het

membraan raakt

kation-uitwisselmemebraan

kamer aan deeindplaat gelijmdmet aquariumlijm

Mic

ro-o

rganis

men in

act

ie Brandstofcelop gistH H H H H H H H H H H H H H H

Eencelligen (bacteriën, protozoën) dieelektriciteit produceren waren lange tijd eenbiologisch curiosum. Tegenwoordig zienonderzoekers mogelijkheden om ze tegebruiken in horloges en camera’s, alsenergiebron in de Derde Wereld en alsbioreactoren om afval uit de industrie om tezetten in elektriciteit. De brandstofcel die hierstaat beschreven genereert een kleinstroompje door elektronen af te tappen van deelektronentransportketen van gist. Daarmee isdit instrument geschikt om ademhaling tebestuderen op een geheel nieuwe enstimulerende manier. Meer informatiehierover is te vinden in BIOtechnologyEducation 1(4) pag. 163-168 (1989).

Doell Een stimulerende inleiding te geven bij het

bestuderen van ademhaling.l Gelegenheid te geven enkele factoren die

gistademhaling beïnvloeden teonderzoeken.

VoorbereidingenDe verschillende oplossingen moeten voorafklaar gemaakt worden. Laat de kation-uitwisselmembraan 24 uur van te vorenweken in gedistilleerd water. Gedroogde gistkan tijdens het monteren van de cel in watbuffer worden opgenomen.

TijdsduurMontage (tot en met het genereren vanelektriciteit) kost ongeveer 30 minuten.

Benodigdhedenper leerling of groepje leerlingenl Brandstofcel, gemaakt van 4 mm Perspex.l 2 neopreen pakkingen.l kation-uitwisselmembraan, op maat

geknipt en passend tussen de kamers vande cel. Deze membraan kan hergebruiktworden, maar smelt bij autoclaveren.

l 2 koolstofvezel-elektroden.l 2 stukken kaasdoek, of (stevige) tissue

passend in de cel.l 2 plastic injectiespuiten (10 ml), om

vloeistoffen in de cel te injecteren.l 1 Petrischaal om de cel in te zetten.l 2 elektrische draden met krokodillebekken.l 0-5 V voltmeter of motortje.l Schaar.

....

...


V

4 H+

4 4

Fe(CN)64-

3-Fe(CN)6

De werking Anode Kathode

elektronen

Glucose methyleenblauw(gereduceerd)

kaliumferri-cyanide

Kooldioxide

Kation-uitwisselmembraan

methyleenblauw(geoxydeerd)

De completebrandstofcel

gistcellenelektronentransportketen

Alle oplossingen moeten gemaakt worden in0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,0, niet in water.l Gedroogde gist, een dikke suspensie in

0,1 M fosfaatbuffer (geen glucosetoevoegen voordat de gist goed actiefgeworden is in de buffer.)

l 5 ml 10 mM methyleenblauwoplossing.l 5 ml 1 M glucose oplossing.l 10 ml 0,02 M K3Fe(CN)6, kaliumferri-

cyanide (rood bloedloogzout) oplossing.

Maken van 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,0:Los 4,08 g Na

2HPO4 en 3,29 NaH

2PO

4 op in

500 ml gedistilleerd water.

Werkwijze1 Knip twee koolstofvezel-elektroden, zoals

is aangegeven op het schema.2 Knip twee stukken kaasdoek, zodanig dat

ze in de brandstofcel passen.3 Zet de cel in elkaar zoals is aangegeven in

bijgaand schema.4 Zet de cel in een Petrischaal zodat bij

eventuele lekkage het vocht in die schaalkomt.

5 Meng de gistssuspensie, de glucose- en demethyleenblauwoplossingen. Injecteer ditmengsel in een van de kamers van de cel.

6 Injecteer de oplossing van bloedloogzout inde andere kamer van de cel.

7 Verbind de voltmeter, multimeter of motorvia de krokodillebekken aan de elektroden.Brandstofcellen van dit type genereren 0,4à 0,6 V. Er moet meteen stroom zijn.Controleer de draden en de verbindingenals de meter 0 aanwijst of de motor nietdraait. Let er goed op dat de elektrodenniet in aanraking komen met de kation-uitwisselmembraan.

Uitbreiding1 Er kunnen meer cellen gekoppeld worden;

dit levert een hogere spanning. Vergrotenvan de cel (of het oppervlak van deelektrode) leidt tot een sterkere stroom,maar niet tot een hoger voltage.

2 Er kunnen verschillende typen gist wordengebruikt. Uit veiligheidsoverwegingen ishet gebruik van andere micro-organismenaf te raden.

3 Onderzoek de invloed van temperatuur.Bedenk wel welke blanco’s nodig zijn omvergelijkingen te maken.

VeiligheidK3Fe(CN)6 (afvalcategorie 2) is giftig. Werkin een zuurkast en gebruik een veiligheidsbril.

Als de oplossing in contactkomt met de ogen, spoel danmet veel water en raadpleegeen arts. Als het wordtingeslikt, geef dan zeer veel

water te drinken en raadpleeg een arts. Zorgvoor een zorgvuldige verwerking van stoffenen materialen die met deze stof in contact zijngeweest.

DankDeze gist-brandstofcel is ontwikkeld door Dr.Peter Benetto van King’s College, Londen.


....

...

Ge

no

verd

rach

t

F-Plasmide

Figuur 1. Conjugatie en overdracht van F-plasmiden tussen bacteriecellen

1. F-plasmide ontwindt enverdubbelt zich

Plasmide bevatgenen vooreiwitten van depilus

2. Enkelstrengs DNA gaat naarde ontvangende cel door depilus

pilusbacteriechromosoom

3. Complementair DNA wordtgesynthetiseerd, nieuw F-plasmide isontstaan.

Receptor

Alledaagse genoverdracht doorconjugatie van bacteriënH H H H H H H H H H H H H H H

Bacteriën wisselen in de natuur opverschillende manieren genen uit. Dezemechanismen maken het voor organismenmogelijk zich aan snel veranderendeomgevingsfactoren aan te passen. De meestmobiele genen bevinden zich in het algemeenop plasmiden.

Plasmiden zijn DNA-ringen. Deze DNA-ringen vermenigvuldigen zich onafhankelijkvan het bacteriële genoom. Plasmidenbevatten een paar genen voor eigenschappendie gunstig zijn voor de gastheer, zoals hetkunnen afbreken van schadelijke stoffen inde omgeving, zoals zware metalen ofantibiotica.

We onderscheiden drie typen van natuurlijkegenoverdracht:

Transformatie is het opnemen van “naakt” DNAuit de directe omgeving van de cel;

Transductie is de verplaatsing van DNA van deene cel naar de andere met behulp van eenbacteriofaag;

Conjugatie is de overdracht van gespecialiseerde‘F-plasmiden’ door een nauw buisje (pilusgeheten) dat twee bacteriecellen verbindt (zieFiguur 1).

Al deze mechanismen (en met name de trans-formatie) worden in het laboratorium gebruikt omgeselecteerde genen in bacteriën te brengen.

Donor

....

...


Figuur 2. Het beeld van donor- enreceptorstammen op gewone MacConkey agar

ReceptorEscherichia coli(Lac- stam)

DonorEscherichia coli(Lac+ stam)

Figuur 3:Het onderscheiden van dedonor, receptor engeconjugeerde stammen opstreptomycine bevattendeMacConkey agar.

ReceptorEscherichia coli

K-12 L17

Kleine wittekolonies

DonorEscherichia coli

K-12 CSH36

Geenkolonies

Streptomycine resistentiegenop het chromosoom

Streptomycine resistentiegenop het chromosoom

Rodekolonies Lac+ gen op het

plasmide

Lac+ gen ophet

plasmide

Rodekolonies

Kleine wittekolonies

In het volgende experiment wordt de conjugatietussen twee in de natuur voorkomendebacteriestammen bestudeerd.Let wel: Deze proef wordt met gewone bacteriënen plasmiden, door middel van in de natuurvoorkomende mechanismen uitgevoerd en is dusgeen genetische modificatie.

F-plasmidenF-plasmidenF-plasmidenF-plasmidenF-plasmidenDe zogenaamde F-plasmiden (F van fertiliteit =vruchtbaarheid) bevatten genen die het mogelijkmaken om een kopie van het plasmide van eendonorbacterie naar een ontvangende bacterie tebrengen.

F-plasmiden kunnen ook nog andere genenbevatten. In het hier beschreven onderzoek bevatde donorstam een plasmide genaamd F Lac+ Ditplasmide heet zo omdat het genen bevat die debacterie-gastheer in staat stelt lactose af tebreken. De bacteriestam wordt een Lac+ stamgenoemd. De ontvangende (receptor)stamdaarentegen heeft geen plasmide, is niet in staatlactose om te zetten en is daarom een Lac– stam.Op platen met MacConkey agar zien dezestammen er verschillend uit; de donorstam vormtrode kolonies en de receptorstam vormt wittekolonies (zie Figuur 2).

Wanneer beide stammen door elkaar wordengemengd, worden F Lac+ plasmiden overgegevenvan de donor aan de ontvanger. Zo verkrijgt de

receptorstam de mogelijkheid om lactose af tebreken.Om de donor, receptor en geconjugeerde(receptorstam met verkregen plasmide) stammente kunnen onderscheiden, wordt gebruik gemaaktvan een genetisch foefje. Voor de receptor wordteen stam uitgezocht met een chromosomaal gendat de stam ongevoelig maakt voor hetantibioticum streptomycine. De donorstam heeftzo’n gen niet en wordt geremd doorstreptomycine. Nu kunnen de receptor engeconjugeerde stammen worden geïdentificeerd.

Conjugant


....

...

Donor

Receptor

Alleen zij kunnen op een streptomycinebevattend medium groeien met kleine witte,respectievelijk rode kolonies (Figuur 3).

DoelDoelDoelDoelDoell Het aanbieden van een stimulerende

kennismaking met de bacteriële genetical Leerlingen de mogelijkheid te geven om te

discussiëren over onderwerpen die te makenhebben met de overdracht van genen in denatuur, zoals de verspreiding van resistentietegen antibiotica en de risicobeoordeling bijgentechnologie.

VoorbereidingenVoorbereidingenVoorbereidingenVoorbereidingenVoorbereidingenDe volgende media dienen vooraf te wordengemaakt en gesteriliseerd:l 3 kleine (100 ml) met een wattenprop

afgesloten erlenmeyers, met daarin 10 mlvloeibaar voedingsoplossing (basismedium);

l Steriele MacConkey agar (1,5% agar) mettoegevoegde streptomycine-sulfaat(eindconcentratie 200 mg/l). Nadat de agar isafgekoeld tot 50 °C (handwarm) dient het teworden verdeeld over steriele Petrischalen(ongeveer 15-20 ml per plaat).

De gebruikte cultures zijn:Donorstam:

Escherichia coli K-12CSH36(DSM 6253)

Receptorstam:Escherichia coli K-12L17(DSM 6254)

Deze in de natuur voorkomende stammen komenvan de Duitse Verzameling van Micro-organismenen Celcultures (DSMZ). Het adres is: DSMZDeutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b,D-38124 Braunschweig, Duitsland, tel: 0049 5312616 336, fax: 0049 531 2616 418, Email:[email protected], Web: http://www.gbf-braunschweig.de/DSMZ/dsmzhome.htm.In Nederland kan men stammen kopen bij hetC.B.S. te Baarn, tel (035) 548 12 11, email:

[email protected].

Voor levering uit Duitsland moet men rekenen op10 (werk)dagen. Beide cultures worden gevries-droogd in ampullen aangeleverd.De ampullen moeten correct worden geopend omer zeker van te zijn dat de inhoud niet wordtbesmet en dat de gebruiker niet aan onnodiggevaar wordt blootgesteld (zie appendix hiernaasten de bijgeleverde instructies). De donorstamgaat snel in kwaliteit achteruit, daarom is eenvers gemaakte cultuur nodig.

Overnachtcultures van de donor- en dereceptorstam worden als volgt gemaakt:1. Inoculeer een van de drie erlenmeyers met de

donorstam (en label die Donor) en een anderemet de receptorstam (en label die Receptor);

2. Incubeer beide erlenmeyers overnacht bij37 °C, bij voorkeur in een schudwaterbad.

Conjugeren van deze twee cultures:1. Breng met een steriele pipet 0,8 ml (800 µl)

van de donorcultuur over naar de derdeerlenmeyer met 10 ml sterielevoedingsoplossing.

2. Voeg met een steriele pipet 0,2 ml van dereceptorcultuur toe aan dezelfde erlenmeyer.

3. Label deze erlenmeyer en incubeer 16-24 uurbij 37 °C. Let op: Zwenk de erlenmeyerVOORZICHTIG tijdens het incuberen; bij al tekrachtig schudden zullen de pili tussen deconjuganten breken.

Steriele watten strijkstokjes worden gemaaktdoor een kleine propje watten om de top van eencocktailprikker te winden. Autoclaveer deze ineen McCartney flesje of losjes gewikkeld inaluminiumfolie 15 minuten bij 121 °C (in eensnelkookpan).

TijdsduurTijdsduurTijdsduurTijdsduurTijdsduurmedia maken: 60 minutenincubatie 10 ml cultures: 48 uurbeënten van de platen: 15 minutenincubatie platen: 24-48 uurbestuderen van de resultaten: 20 minuten

BenodigdhedenBenodigdhedenBenodigdhedenBenodigdhedenBenodigdhedenPer student of groepje studenten (aangenomendat het gebruikelijk practicummateriaalbeschikbaar is).l Waterbad/incubator van 37 °Cl Een steriele Petrischaal met 15-20 ml

MacConkey agar en toegevoegdestreptomycine

l De volgende voorgekweekte cultures:- Donorstam- Receptorstam- Geconjugeerde mix van de donor- en

receptorstam

....

...


D

R

M

Mix metconjuganten

AFVAL(Desinfectans)

l 3 steriele zelfgemaakte watten strijkstokjesl Een kleine beker met daarin een

desinfecterend middel (bijv. Stafilexchloortablet) om na gebruik de strijkstokjes inte plaatsen

l Markeerstift voor de Petrischalen

WerkwijzeWerkwijzeWerkwijzeWerkwijzeWerkwijze1. Verdeel de streptomycine-MacConkey

agarplaten met de markeerstift (op deonderkant van de platen) in drie gelijkedelen.

2. Teken midden in elk segment een rondje meteen diameter van ongeveer 1 cm. Markeer derondjes met de letters D (voor dedonorstam), R (voor de receptor) en M (voorhet de mix van de twee stammen, waarin degeconjugeerde bacteriën zitten).

3. Gebruik een steriel strijkstokje om degemarkeerde gebieden op de plaat tebeënten. Denk eraan voor elke cultuur eennieuw stokje te gebruiken. Zet na gebruik destokjes in de beker met desinfectans.

4. Laat de platen even staan tot de vloeistofniet meer zichtbaar is. Keer de platen om enincubeer ze een tot twee dagen bij 37 °C.

UitbreidingenUitbreidingenUitbreidingenUitbreidingenUitbreidingenHet experiment kan met verschillendekwantitatieve proeven worden uitgebreid,bijvoorbeeld:1. Het bepalen van de optimale verhouding

tussen donor en receptor, door de donor enreceptorcultuur in steriele Ringer’s of 10–3

MgSO4-oplossing te verdunnen.2. Het bepalen van de optimale mengtijd voor de

conjugatie.

VeiligheidVeiligheidVeiligheidVeiligheidVeiligheidDit experiment moet in een geschiktpracticumlokaal worden uitgevoerd. Standaardmicrobiologische veiligheidsprocedures,waaronder het steriel werken, moeten wordengevolgd tijdens het uitvoeren van het experimenten bij het verwerken van het afval.

Met dank aanMet dank aanMet dank aanMet dank aanMet dank aanDit experiment is een vereenvoudigde versie vandat van professor Patricia Nevers van deUniversiteit van Hamburg. Professor Nevers’protocol was weer gebaseerd op dat van E. Härleen R. Hausmann van de Universiteit van Freiburg.


....

...

Ge

no

verd

rach

tGenoverdracht inde natuur doorAgrobacteriumtumefaciensH H H H H H H H H H H H H H H

Plantentumoren vormen een ernstig probleem inland- en tuinbouw. Tumoren ontwikkelen zich inkleine beschadigingen aan de plant, die kunnenontstaan bij grondbewerking, vorst of tijdens hetenten.

Rond de eeuwwisseling constateerde men datbepaalde tumoren altijd samen gingen metbacteriële infecties. De betrokken bacterie werdAgrobacterium tumefaciens genoemd (Grieks:agar = akker; Latijn: tumor = zwelling; facere =doen). Pas rond 1980 kreeg men uiteindelijkinzicht in de ingewikkelde relatie tussen deplanten en Agrobacterium.

De infecterende bacteriën brengen een kleinstukje van hun genetisch materiaal (een plasmide)in het genoom van de plantencellen. Dit zorgtervoor dat elke geïnfecteerde plantencel zich gaatdelen. Er ontstaat een tumor, die als habitatfungeert en zorgt voor de ongebruikelijkeaminozuur derivaten, die de ongenode bacteriëlegast nodig heeft.

De manier waarop Agrobacterium genenoverdraagt wordt ietwat gewijzigd doorveredelaars gebruikt om gewenste genen over tedragen zonder tijdrovende kruisingen. Daarmeezijn gemodificeerde vormen van Agrobacteriumeen belangrijk gereedschap in de gentechnologiegeworden.

Agrobacterium is staafvormig en ongeveer evengroot als E. coli; 1 tot 3 µm lang. De virulenteAgrobacterium tumefaciens kan aëroob in debovenste lagen van de grond leven. Het is eensaprofiet, hoewel het anorganische stikstof kanbenutten. Agrobacterium tast alleen dicotyleplanten aan en kan uitsluitend een plantbinnendringen en infecteren in bestaandewondjes. De bacterie kan namelijk geen intactecelwanden penetreren. Wondvocht van nabijebeschadigde cellen trekt de bacteriën aan enactiveert de genoverdracht. De bacteriënvermenigvuldigen zich rond de wond enpenetreren het intercellulaire gebied, door zichaan de celwanden van de planten te hechten. Hetplasmide van Agrobacterium wordt overgedragenaan en uiteindelijk geïntegreerd in het

chromosoom van de plant. Vanaf dit chromosoomdirigeert het de produktie van opines, dieAgrobacterium gebruikt als een koolstof- enstikstofbron.

DoelDoelDoelDoelDoelIn het volgende onderzoek wordtBryophyllum =Kalanchoë sp (gemakkelijk tekweken en te vermeerderen) onderverschillende omstandigheden geïnfecteerdmet een in de natuur voorkomende vorm vanAgrobacterium. Binnen vier weken kan degroei van de tumor worden waargenomen. Devolgende variaties binnen de proefopzetkunnen worden onderzocht:

A. De manier van infecteren:- verwond de plant en infecteer de wond

onmiddellijk met Agrobacterium- verwond de plant en infecteer de wond de

volgende dag met Agrobacterium- verwond de plant en infecteer de wond

met Agrobacterium. Dek de geïnfecteerdewond af met een vochtig papiertje.

- verwond de plant en infecteer deze nietmet de bacterie

- breng Agrobacterium aan op nietverwonde plantedelen.

B. Plaats van de infectie- stengel- bladoppervlak- spruittop

Voorbereidingen1. Het vermeerderen van de waardplant

(leerlingen kunnen dit doen - ook thuis)2. Het maken van voedingsmedium en

Agrobacterium tumefaciens cultures: erdienen tenminste twee weken voor gebruikverse cultures te worden gemaakt.

TijdsduurKweken van de waardplant (indien nodig)

4 maandenBereiden van de Agrobacterium cultuur

2 wekenInfecteren van de planten met Agrobacterium

20 minutenObserveren van de tumorgroei 3 tot 6 weken

....

...


Steriliseereen entnaald

PAS OP:ethanol isbrandbaar

Kras op de plantmet de sterielenaald

Gloei de entnaaldvoor en na gebruikgoed uit Agrobacterium

tumefacienscultuur

Breng de bacteriënaan op de krassen

BenodigdhedenPer leerling of groep leerlingen is het volgendenodig (hierbij wordt aangenomen dat normalepracticumuitrusting ook aanwezig is)l Steriel water (in een flesje of Erlenmeyer)l Entnaaldl Entoogl Binoculair microscoopl Schaarl Labelkaartjes met touwtjes en markeerstift (of

potlood)l Papieren handdoekjesl Plakbandl Ethanol, om de instrumenten in de vlam te

steriliserenl Agrobacterium tumefaciens cultuur (op

voedingsagar)l Kalanchoë (Bryophyllum) planten, circa 3 tot

4 maanden oud

WerkwijzeWerkwijzeWerkwijzeWerkwijzeWerkwijzeDe planten in dit experiment worden opdiverse manieren behandeld (zie de hierbovenbeschreven aanwijzingen in de introductie, ende instructies hieronder).

1. Markeer elke plant met datum enbehandelingsmethode. Maak indien nodigonderscheid tussen de verschillendgeïnfecteerde delen van de plant metbehulp van de labelkaartjes.

2. Plaats de planten na de behandeling ineen goed verlichte ruimte en houd zevochtig (maar geef niet teveel water).

3. Observeer en noteer de ontwikkeling vande tumoren gedurende 3 tot 6 weken.Bestudeer een stukje tumorweefsel onderhet binoculair en vergelijk dit met eenstukje normaal blad.

Infectie methodenInfectie methodenInfectie methodenInfectie methodenInfectie methoden

Methode 1 (wonden direct geïnfecteerd)1 Dip een entnaald in de alcohol, maak die

gloeiend heet en laat de alcoholverbranden (uitgloeien). Kras een ofmeerdere keren over het bladoppervlak.

2 Infecteer de wonden met deAgrobacterium cultuur. Gloei hiervooreen entoog uit en laat deze eventjesafkoelen. Neem een klein beetje van dewittige bacterie cultuur op met het entoogen verspreid dit over de wond. Gloei hetoog opnieuw uit.

Methode 2 (wonden na 24 uur geïnfecteerd)1 Verwond de plant (zoals in methode 1).2 Infecteer het verwonde gebied de

volgende dag met Agrobacterium (zoalsin methode 1).

Methode 3 (wonden na infectie afgedekt meteen vochtig papiertje)

1 Verwond en infecteer de plant (zoals inmethode 1).

2 Knip stukjes uit papieren handdoeken enbevochtig die met steriel kraanwater.Plaats de stroken op de wond en maak zemet plakband vast. Houd het papier tweedagen vochtig.

Methode 4 (wonden niet geïnfecteerd)1 Verwond de (nieuwe) plant op dezelfde

plaatsen als in methode 1 en op eennieuwe plaats- bedek de nieuwe plek met


....

...

Een gewenst gen wordtgeïsoleerd uit een donor

organisme

Restrictieenzym

Een restrictieenzym kniptDNA opspecificiekeplaatsen

DNA ligase verbindt de DNAfragmenten met elkaar

Ongewenste genenworden van het plasmide

verwijderd

Het nieuwe plasmide wordt inAgrobacterium tumefaciensgebracht

PlasmideBacteriechromosoom

Bladponsjes worden op deAgrobacterium

celsuspensie gelegd

Bacteriën infecteren opde snijvlakken enbrengen daarmee hetnieuwe plasmide binnen

De bladponsjes worden gekweekt opeen selectief medium - alleen degetransformeerde cellen gedijen

Hele planten, die nu eengeïntroduceerd gen bevatten,

worden voortgekweekt

Hoe gemodificeerde vormen van Agrobacterium tumefaciens in de gentechnologie worden gebruikt

vochtige papieren stroken. Infecteer dewonden niet met de bacterie.

Methode 5 (infectie zonder verwonding)1 Verwond de plant niet.2 Infecteer de plant op een of meer niet

verwonde plekken met Agrobacterium(zoals in methode 1).

VeiligheidsvoorzieningenVeiligheidsvoorzieningenVeiligheidsvoorzieningenVeiligheidsvoorzieningenVeiligheidsvoorzieningenDit experiment moet in een practicumlokaalworden uitgevoerd. Standaardmicrobiologische veiligheidsprocedures,waaronder het steriel werken, moeten wordengevolgd tijdens het uitvoeren van het experi-ment.

Met dank aanMet dank aanMet dank aanMet dank aanMet dank aanUta Nellen van het Centrum voor SchoolBiologie en Omgeving Voorlichting in Ham-burg heeft dit experiment opgezet. EIBE ishaar zeer dankbaar voor haar toestemming omdit materiaal te mogen gebruiken.

....

...


Appendix 1Microbiologische media


1MODULE

Voedingsmedia dienen te worden bereid met in de handel verkrijgbaar uitgangsmateriaal,waarbij de instructies van de leverancier moeten worden gevolgd. In de meest catalogistaan ze onder ‘Nutrient Broth’ of ‘Nährbouillon’ (voor vloeibare media), dan wel‘Nutrient Agar’, of voedingsagar (voor vaste media), men kan zelfs platen metvoedingsagar kant en klaar kopen. Het is ook mogelijk om, door 2 g/l agar toe te voegenaan ‘Broth’ zelf voedingsagar te maken. Doorgaans staan de benodigde hoeveelheden opde pot. De media moeten voor gebruik gedurende 15 minuten worden geautoclaveerd bij121 °C. In het algemeen kunnen klaargemaakte media enkele maanden worden bewaard bij4 °C.

Basismedium‘Nutrient Broth’ 13, 0 gram, toevoegen aanGedistilleerd water 1,0 liter

Voedingsagar Voedingsagar Voedingsagar Voedingsagar Voedingsagar of Basisagar Basisagar Basisagar Basisagar BasisagarBasismedium, waaraan toegevoegdAgar 2,0 gram

ZetmeelagarVoedingsagar waaraan toegevoegdZetmeel, oplosbaar 2,0 gram

Autoclaveer 15 minuten bij 121 °C.

MacConkey agar met streptomycineMacConkey agar 50,0 gramGedestilleerd water 990 ml

Laat dit na 15 minuten autoclaveren bij 121 °C afkoelen tot 50 °C en voeg10 ml streptomycine sulfaat oplossing 200 mg/10 ml toe(Eindconcentratie streptomycine 200 mg/l)

De platen moeten vers worden gemaakt. Ze kunnen slechts een paar dagen bij 4 °C in dekoelkast worden bewaard.


....

...

Appendix 2Microbiologische technieken


1MODULE

Microbiologische veiligheid, VMTBij verschillende experimenten worden micro-organismen gebruikt. Voor het werken met micro-organismen zijn speciale veiligheidsregels opgesteld.Deze regels, ook wel Veilige MicrobiologischeTechnieken (VMT) genoemd, moeten strikt wordennageleefd. De VMT zijn er op gericht dat er geenbesmetting vanuit het practicumlokaal naar debuitenwereld kan optreden. Dit is belangrijk ook alworden er geen ziekteverwekkende organismengebruikt.Micro-organismen zijn overal en je ziet ze niet. Dat ismeteen het grootste gevaar van het werken met micro-organismen op een school. Iedereen moet zich ervanbewust zijn dat slordig en onzorgvuldig werken gevaarkan opleveren voor hem of haar zelf of voor groeps-genoten. Het spreekt vanzelf dat bij de keuze van deexperimenten en de organismen gelet wordt opmogelijke gevaren voor de gezondheid. Niettemin ishet werken volgens de VMT noodzakelijk. Dit slaat ophet voorwerk, de handelingen tijdens het practicum enhet verwerken van het microbiologisch afval.Om voldoende grote aantallen bacteriën te krijgen,worden geschikte voedingsmedia beënt met eenmonster. In de meeste gevallen hebben we met voor demens onschuldige soorten te maken. In principe wordttijdens het practicum niet met pathogene micro-organismen gewerkt, maar alle cultures moetenbeschouwd worden als potentieel gevaarlijk. Omdathet kweken niet selectief gebeurt, heb je nooit degarantie dat er geen ziekteverwekkende bacteriënopgehoopt zijn. De cultuur -en alles wat daarmee incontact komt- is altijd de besmettingsbron. Infectieszijn alleen te vermijden door VMT.Daarom moeten de onderstaande veiligheidseisen inacht genomen worden.l Draag tijdens een microbiologisch practicum

een dichte labjas.l Maak aan het begin en aan het eind van het

practicum de tafel schoon met een

chlooroplossing. Deze oplossing wordtgemaakt door het oplossen van chloortabletten(bijv. Hospidex). Bewaar de oplossing bijvoorkeur in een spuitfles met gele band.

l Laat tijdens het practicum geen hand-leidingen en dergelijke op tafel liggen.

l Verzamel alles wat nodig is voor met hetexperiment begonnen wordt.

l Pipetteer nooit met de mond, ook geenwater. Gebruik een pipetteerballon, of eenautomatische pipet.

l Veeg pipetten niet met papier af.l Beschouw de voor kweken gebruikte media en

materialen als mogelijke besmettingsbron.l Open cultures alleen als het nodig is,

bijvoorbeeld bij doorenten.l Leg glaswerk dat in aanraking is geweest met

bacteriën eerst in de chlooroplossing. Denk eraandat pipetten nog nadruppelen en op die manier devloer kunnen besmetten.

l Werk op en boven de tafel.l Eet, drink noch rook in het lokaal.l Was na afloop van het practicum de handen.l Was ook de handen als deze besmet zijn geraakt.

AërosolenAërosolen zijn kleine druppels met in ons gevalmicroben die in de lucht kunnen komen, daar eenhalf uur of langer blijven hangen en ingeademdkunnen worden. Ze vormen de belangrijkstepotentiële infectiebron voor laboratorium infecties.Aërosolen van geknoeide cultures kunnenoog- en huidinfecties veroorzaken enwanneer met de mond wordtgepipetteerd, kunnen microbenworden ingeslikt.

....

...


Manier om dop ofwattenprop vast

te houden

Steriel werkenH H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H

Het doel van steriel werken is:

a) Reincultures van micro-organismen tekrijgen en te houden;

b) Veiliger met micro-organismen werken.

Een reincultuur bevat uitsluitend één soortmicro-organismen terwijl een gemengdecultuur er twee of meer bevat.

De besmetting van een kweek is altijd eenbedreiging omdat micro-organismen overalzijn; op de huid, in de lucht en op levenlozeobjecten. Om een reincultuur te krijgen,moeten steriele voedingsmedia en sterielevoorwerpen worden gebruikt en moetenbesmettingen worden uitgesloten. Dit zijn debasisprincipes van steriel werken.

Het is niet realistisch om te verwachten datjonge leerlingen volledig steriel kunnen wer-ken. Toch moeten de leerlingen in sommigeexperimenten in deze module steriel culturesover brengen. Dan moeten de volgende proce-dures worden gevolgd.

Voedingsmedia moeten voor gebruik zijngesteriliseerd met de autoclaaf. Sterielevoorwerpen (flessen, Petrischalen, enz.)moeten worden gebruikt. Deksel moeten oppotten blijven om besmetting te voorkomen.

Het werk dient vlak bij een bunsenbrander teworden uitgevoerd. De opstijgende lucht vande vlam zal microben die voedingsmedia enreincultures zouden kunnen besmetten,wegvoeren.

Als een dop van de fles is gehaald, dan moetdie in de hand worden gehouden tot dat dezeteruggeplaatst kan worden. Dit voorkomtbesmetting van tafel en cultuur. Na het weg-halen van de dop dient de nek van de fles 1-2seconden in de vlam te worden gehouden. Ditdoodt de aanwezige microben en de opstij-gende lucht voorkomt een eventuele besmet-ting van de cultuur vanuit de atmosfeer. Naenige oefening is het mogelijk om de fles inde ene hand te houden en het entoog in deandere, op zo’n manier dat de pink vrij is omde dop te pakken en tegen de onderkant vande hand aan te houden (Zie de figuur). Het is

erg belangrijk dat de dop een beetje los wordtgedraaid vlak voor het oppakken van hetentoog. Indien nodig kunnen twee leerlingendeze handeling samen uitvoeren.Entogen moeten worden verhit tot de heledraad rood gloeit. Dit moet zowel voor als nahet overbrengen van de kweek worden ge-daan. Om het sputteren en de kans op hetvormen van aërosolen te verminderen, wordthet oog langzaam in de vlam van debunsenbrander gebracht.

Als de bunsenbrander even niet nodig is, moetde vlam op geel worden gedraaid, zodat devlam goed zichtbaar is. Een blauwe vlam vanongeveer 5 centimeter wordt gebruikt om deentogen en naalden uit te gloeien en om deflessehalzen te ontsmetten.

Vermijd het besmetten van het werkgebied.Instrumenten moeten direct na gebruikworden gesteriliseerd en gebruikte pipettendienen direct na gebruik in pot met versedesinfectans te worden geplaatst.


....

...

Plak desgewenst deplaten hier en daarmet plakband vast

Schrijf op deonderkantvan de plaat

Cultures op een voedingsbodemH H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H

Label voor het inoculeren de onderkant vande voedingsbodem. Naam, datum en de naamof bron van het gebruikte organismen makenhet mogelijk dat de platen en hun inhoudlater kunnen worden geïdentificeerd.Indien gewenst kan plakband gebruiktworden om de platen op de juiste manierdicht te plakken (zie figuur hier onder).

Het plakband zal ervoor zorgen dat de platenniet per ongeluk open gaan of worden besmet.N.B. Sluit de platen niet helemaal rondom metplakband af, dit kan een anaërobe situatie in dePetrischalen creëren.

BacteriënBacterie cultures in Petrischalen moetennormaal gesproken op hun kop wordengeïncubeerd, zodat eventuele condensdruppelsop de deksel vallen en niet op de kolonies. (Alser voor de inoculatie sprake is van ernstigecondensatie, dan dienen de platen voor gebruikte worden gedroogd. Dat kan door de platen,geopend maar omgekeerd en dakpansgewijs, ca.een half uur in een broedstoof bij 50 à 60 °C ofwat langer bij 30 °C te leggen.)

Na twee tot drie dagen incuberen bij 25-30 °Czijn de bacteriekolonies zichtbaar.

SchimmelsSchimmel cultures in Petrischalen hoeven nietop hun kop te worden geïncubeerd; toch is hetraadzaam dit ALTIJD te doen. Schimmel-cul-tures moeten ongeveer 7 dagen incuberen. Deschimmels kunnen bij kamertemperatuur(±21 °C) groeien, maar een incubator geeft eengrotere mate van zekerheid.

Verwerken van microbiologisch afval.H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H

l Gooi de gebruikte voedingsbodemsmogen niet zonder meer weg. Steriliseerze in een autoclaaf of snelkookpan. Zezijn immers besmet met bacteriën.

l Verzamel wegwerpmateriaal voor hetsteriliseren in een speciale zak. Glaswerkmet inhoud wordt verzameld in specialerekjes en mandjes.

l Spoel nooit besmette reageerbuizen ofander glaswerk om bij de wasbakken.Het spoelen gebeurt pas na hetsteriliseren.

l Pipetten gaan na gebruik in een bak metchlooroplossing. De wattenprop moetwel verwijderd worden. Dit gaat het bestemet een pincet met scherpe punten of eenpaperclip.

l Maak de tafels worden na afloop schoonmet een chlooroplossing. Aangezien dieoplossing een tijdje moet inwerken, is hetniet nodig de tafel na behandeling tedrogen.

l Voer na steriliseren het afval in eenspeciale container af als chemisch afval(cat. 5).

....

...


130120110100

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Temperatuur Actietijd

100 °C 20 uur110 °C 2,5 uur115 °C 50 minuten121 °C 15 minuten125 °C 6,5 minuten130 °C 2,5 minuten

Temperatuur (ºC)S

teril

isat

ietij

d (m

inut

en)

Autoclaveren en SteriliserenH H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H

Steriliseren betekent het volledig vernietigenvan micro-organismen en hun sporen.

Alle gereedschap moet voor gebruik wordengesteriliseerd zodat er geen kans opcontaminatie is. Cultures en besmet materiaaldienen ook na afloop te worden gesteriliseerdom ze veilig weg te kunnen gooien.

Autoclaveren is de beste methode om voe-dingsmedia, vloeibare oplossingen en afge-dankte cultures te steriliseren. Het procesmaakt gebruikt van stoom onder hoge druk,meestal bij 121 °C. Microben worden invochtige warmte beter vernietigd dan indroge, omdat de stoom de eiwitten denatu-reert. Autoclaveren kan zowel met eengewone snelkookpan als met een specialeautoclaaf. In een practicumlokaal kunnensnelkookpannen worden gebruikt, maar hungeringe capaciteit kan een bezwaar zijn wan-neer het materiaal van een hele klas moetworden geautoclaveerd.

Principes van het autoclaverenTwee factoren zijn cruciaal voor het effectiefautoclaveren. Ten eerste moet alle lucht uit deautoclaaf zijn verwijderd. Dit waarborgt datde hete stoom in contact komt met het testeriliseren oppervlak; als er lucht aanwezigis, is bij dezelfde druk de temperatuur lager.De materialen die gesteriliseerd dienen teworden, moeten losjes worden verpakt zodatde lucht eruit kan worden verdreven.Schroefdoppen moeten losjes op de flessen enpotten worden geplaatst om de lucht te latenontsnappen en om te voorkomen dat erbinnenin een gevaarlijke druk wordtopgebouwd.

Ten tweede moet er voldoende tijd wordengenomen om de hitte naar het midden van hetmedium in Petrischalen en anderereactievaten te laten penetreren (doorgeleiding). De tijd die nodig is om media envoorwerpen bij verschillende temperaturen testeriliseren is weergegeven in nevenstaandegrafiek.

Merk op dat een klein verschil in detemperatuur een groot verschil in debenodigde sterilisatietijd kan geven. Het isook van belang dat de temperatuur binneninde materialen, die in de bepaalde tijd

gesteriliseerd moeten worden, wordt bereikt,bijvoorbeeld de voedingsoplossing in hetuiterste puntje van een fermentorvat.De drie factoren die de tijdsduur van hetautoclaveerproces bepalen, zijn dus:l de penetratie tijd

de tijd die nodig is voordat alles in deautoclaaf de vereiste temperatuur heeftbereikt;

l de actietijdde minimale tijd die, gegeven detemperatuur, nodig is om alle levendeorganismen te doden

l de veiligheidstijdeen veiligheidsmarge, meestal de helftvan de actietijd.

Gewone snelkookpannen werken bij 121 °C.De totale sterilisatietijd wordt dan, de pene-tratietijd, bijvoorbeeld 5 min, plus 15 minutenactietijd, plus een veiligheidsmarge vanongeveer 5 minuten, dus totaal 25 minuten

VatVatVatVatVat VolumeVolumeVolumeVolumeVolume ActietijdActietijdActietijdActietijdActietijd

Reageerbuis 20 ml 12-14 minuten

Fles 50 ml 12-14 minuten

Fles 200 ml 12-15 minuten

Fermentor 1 liter 20-25 minuten


....

...

KaramelliserenAutoclaven werken soms boven de 121 °C.Hoewel de hierdoor bespaarde tijd een voor-deel kan zijn, moet er rekening mee wordengehouden dat hoge temperaturen nadeligkunnen zijn voor sommige media. Glucoseoplossingen bijvoorbeeld, karamelliseren bijhoge temperaturen en vormen componentendie toxisch voor de microben kunnen zijn. Inhet geval van glucose kan deze reactie wordenvermeden door de pH op 4 te stellen. Na hetsteriliseren kan, indien gewenst, de pH weerworden terug gebracht.

Maillard reactiesBruinkleuring (de Maillard reactie) kan ookworden veroorzaakt door de interactie bijhoge temperatuur tussen stikstofrijke com-ponenten en koolhydraten in het medium.Ook hier worden componenten gevormd dievoor sommige micro-organismen toxischkunnen zijn, zodat het soms nodig kan zijnom de koolhydraten en de rest van het me-dium apart te autoclaveren, bijvoorbeeld bijhet bereiden van melkagar.

Gebruik en onderhoud van autoclavenDe gebruiksaanwijzing van de leverancierdient altijd te worden gevolgd bij het gebruikvan snelkookpan of autoclaaf. Speciale aan-dacht moet worden gegeven aan de minimalehoeveelheid water in de autoclaaf zodat dezetijdens het gebruik niet droog kan koken. Eensnelkookpan heeft tenminste 250 ml waternodig. De grotere autoclaven hebben aanzien-lijk meer nodig. Het gebruik van gedestilleerdof gedeïoniseerd water in de autoclaaf voor-komt de vorming van ketelsteen. Autoclavenmoeten droog worden opgeruimd. De bodemvan de autoclaaf kan vol putjes komen als ditniet wordt gedaan, daarbij verzwakt de bodemdie dan onder druk bol naar buiten gaat staan.

Wanneer de autoclaaf wordt gebruikt, moet destoom en lucht gedurende ongeveer 1 minuutuit de autoclaaf kunnen ontsnappen voordathet ventiel op de pan wordt gezet om zo alle

lucht te laten verdwijnen. Na de totale sterili-satietijd moet tijd worden gegeven om deinhoud af te laten koelen en op de normaleatmosferische druk terug te komen. Opengeen dop of ventiel terwijl de pan nog onderdruk staat. Dit veroorzaakt brandwonden. Hetvoortijdig openen van de deksel en de daarop-volgende vermindering van druk zal elkevloeistof in de autoclaaf laten koken. De agarof voedingsvloeistof zal gaan schuimen enoverkoken.

Droge hittesterilisatieGlaswerk is goed te steriliseren door het eenuur of twee bloot te stellen aan eentemperatuur van 200 °C in een hittestoof.Pipetten rolt men daarbij het best in papier;aan het mondstuk een kleine wattenprop.

FiltersterilisatieFiltersterilisatieFiltersterilisatieFiltersterilisatieFiltersterilisatieStoffen die niet tegen verhitting kunnen, kanmen steriliseren door ze door een speciaalfilter te zuigen in een (vooraf gesteriliseerde)afzuigerlenmeyer. De poriegrootte van zulkefilters is zo klein dat een bacterie er niet doorkan. Deze filters zijn gewoon in de handel.

Chemische sterilisatieVerschillende chemicaliën worden voor hetsteriliseren gebruikt, de meest gebruiktelaboratorium ontsmettingsmiddelen zijnheldere fenolen en hypochloriden.

Heldere fenolen zijn effectief tegen bacteriënen schimmels, maar onwerkzaam bij sporenen sommige virussen. Ze worden tot op zekerhoogte geïnactiveerd door contact met rubber,hout en plastic. In het laboratorium kunnen deheldere fenolen worden gebruikt in afvalvatenen om oppervlakten te ontsmetten.

Hypochloriden (zoals bleekmiddelen) zijnniet ideaal voor het steriliseren van gebruiktePetrischalen e.d. aangezien ze door eiwit enplastic materiaal geïnactiveerd kunnenworden. Maar, een 5% oplossing vanDomestos (Lever) of Chloraat I oplossing isgeschikt om in afvalvaten te gebruiken.

....

...


Openingan ampoule

Appendix 3Het openen van een ampul


1MODULE

Het openen vaneen ampul

Pas op!Draag een veiligheidsbril. Erkunnen glassplinters rond-vliegen bij het openen vande ampul.

1 Verhit de puntige kant van de ampulin een vlam. Draai hem rond tijdenshet verhitten (zie figuur)

2 Druppel met een pipet of ietsdergelijks enkele druppels koud waterop het hete stuk glas. Het glas moetnu versplinteren.

3 Geef op deze kant van de ampul eenstevige tik met een pincet, maar welvoorzichtig. Vang de glasbrokken opin een Petrischaal. Let er goed op dathet glas goed wordt verwijderd.

4 Haal met een pincet de prop glaswolweg, die de binnenbuis op z’n plaatshoudt.

5 Tik voorzichtig deze binnenbuis eruitin een steriele Petrischaal, en doe daaronmiddellijk weer de deksel op.


....

...

Het opkweken van een cultuur vanuiteen ampul met een gevriesdroogdecultuur

1. Verwijder met een pincet dewattenprop en houd de opening vande binnenste glazen buis kort in devlam (uitgloeien).

2. Voeg 1 ml steriele voedingsoplossingtoe aan de inhoud van de binnenstebuis.

3. Gloei de opening van de buis nog eenkeer uit en stop de wattenprop weerterug. Laat de buis 20 minuten staanom de gedroogde cultuur weer totleven te brengen.

4. Gebruik een uitgegloeid entoog omde inhoud van de buis te mengen engiet het geheel over in een steriele(reageer)buis waar al 5 mlvoedingsoplossing in zit. Gloei hetentoog opnieuw uit.

5. Laat de kweek overnacht bij 30 °Cgroeien.

De volgende dag6. Gebruik een uitgegloeid entoog om

een druppeltje van de bereidesuspensie op het oppervlak van eenvoedingsbodem uit te strijken. Dezestap is om de reinheid van de cultuurte controleren -er mag slechts éénsoort kolonies op de plaat groeien.

Het opkweken van een cultuur vanafeen voedingsbodem met lossekolonies

1. Gloei een entoog uit en laat dezetenminste 30 sec. afkoelen.

2. Pak met behulp van het entoog eenkolonie van de plaat en breng dezeover naar een buis met 5 ml sterielevoedingsoplossing en roervoorzichtig. Gloei het entoogopnieuw uit.

3. Laat de kweek overnacht bij 30 °Cgroeien, als het kan in eenwaterschudbad.

Het opkweken van een cultuur vanafeen ingevroren glycerolkweek

1. Gloei een entoog uit en laat dezeminstens 30 sec. afkoelen.

2. Schraap met het entoog langs debevroren cultuur en breng deonzichtbare cellen over naar een buismet 5 ml steriele voedingsoplossingen roer voorzichtig. Gloei het entoogopnieuw uit.

3. Laat de kweek overnacht bij 30 °Cgroeien, het mooiste is eenwaterschudbad.

De volgende dag4. Gebruik een uitgegloeid entoog om

een druppeltje van de bereidesuspensie op het oppervlak van eenvoedingsbodem uit te strijken. Dezestap is om de reinheid van de cultuurte controleren -er mag slechts éénsoort kolonies op de plaat groeien.

Documents

Inleiding Biotechnologie 1