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Inmunologiacutea de la Bartonelosis
iquestqueacute hay de nuevo
Palmira Ventosilla
Inst Med Trop ldquoAlexander von Humboldtrdquo-UPCH
Miraflores Lima-Peruacute 10 de Junio 2015
Bartonella bacilliformis
FAMILIA Bartonellaceae
GENERO Bartonella
B alsatica B bacilliformis B birtlesii B clarridgeiae B doshiae
B elizabethae B grahamii B henselae B koehlerae B peromysci
B schoenbuchensis B schoenbuchii B talpae B taylorii
B tribocorum B vinsonii B quintana
Bergey
http dxdoiorg 101007 bergeysoutline
ESPECIES
CLASE Alfa Proteobacteria
TAXONOMIA
-2 Proteobacteria SUBCLASE
1 DEFORMINA Proteiacutena extracelular de 67kDa
2 MOVILIDAD Posee de 1 a 10 flagelos polares de 3 a 10 microm
de largo
La flagelina es una proteiacutena de 42 kDa
Se expreso la flagelina de B bacilliformis
en E Coli Se amplificoacute por PCR el gen fla
A e insertoacute en el plaacutesmido pGEM-T
obtenieacutendose la construccioacuten pAEfla Esta
se transfirioacute a E coli BL21(DE3) dando
una buena expresioacuten de flagelina (PAGE-
SDS)
Se evaluaraacute su capacidad antigeacutenica de
la flagelina proteinas de invacioacutem IaIA
en IaIB en ratones BalBc
Clonamiento y expresioacuten del gen de flagelina de Bartonella
bacilliformis EN Escherichia coli Garciacutea-de-la-Guarda R Alvarado
D Lozano O Flores L Guerrero A M Ventosilla P Guerra H
Coha J M Ramiacuterez P y Romero C IC 2002-2003
En resumen las proteiacutenas como la flagelina ialAB
deformina RhoA y el antiacutegeno de 43 kDa han empezado a
ayudar a entender los mecanismos moleculares para la
invasioacuten de B bacilliformis a los eritrocitos Las funciones
de estas proteiacutenas todaviacutea no se conocen totalmente Yanji Xu and Yan Chai Bartonella bacilliformis Molecular Mechanisms of Invasion Einstein
Quart J Biol Med (2002) 1956-58
INVASION
IAIB IalB contiene una secuencia 22-amino-aacutecido Es posible que el cambio de
nichos ecoloacutegicos de las Lutzomyias al ser humano (cambios de temperatura la
disponibilidad de hierro pH etc) tenga un efecto sobre la expresioacuten de la
proteiacutena ialB (Coleman amp Minnick 2001)) En otra investigacioacuten se ha
demostrado que los niveles de proteiacutena ialB se correlacionaron con cambios en
ialB mRNA con los cambios de temperatura pH La mayor cantidad de ialB
estuvo presente en B bacilliformis que habiacutean sido cultivados a 20 deg C en
estado de shock de aacutecido al igual que con los niveles de ARNm ialB las
cantidades de proteiacutena ialB disminuyeron en respuesta a pH baacutesico (pH 80) o
cambio de temperatura a 37 deg C Cuando las bacterias pasan desde el vector
fleboacutetomo a hueacutesped humano hay un cambio ascendente raacutepido de la
temperatura a 37 deg C y un aumento en el pH a 74 Probablemente otros
factores bacterianos estaacuten implicados en la adhesioacuten de eritrocitos y la invasioacuten
IalB fue localizado en la membrana interna de B bacilliformis y es poco
probable que interactue directamente con los eritrocitos Por lo tanto auacuten no se
sabe como esta proteiacutena participa en la invasioacuten de eritrocitos humanos
La B bacilliformis posee tres genes que codifican las
proteiacutenas de BRP (Kaiseret al 2011) Estas proteiacutenas
pertenecen a la familia de TAA de sistemas de secrecioacuten tipo
V BRP de B bacilliformis comparte dominios comunes y
las caracteriacutesticas estructurales con TAA pero el rol de esta
proteiacutena auacuten no se ha investigado pero probablemente BRP
desempentildean papeles similares a las proteiacutenas del TAA en B
henselae y B quintana Esas proteiacutenas estaacuten involucradas en
autoaglutinacioacuten la adhesioacuten a las ceacutelulas hueacutesped la matriz
extracelular (fibronectina y colaacutegenos) la inhibicioacuten de la
fagocitosis y como tambieacuten en la induccioacuten de una
respuesta pro-angiogeacutenico en ceacutelulas hueacutesped (Minnick et
al 2014)
BRP
Modelo de ingreso de Bartonella bacilliformis al gloacutebulo rojo
Rolain JM Novelli S Ventosilla P Maguina C Guerra H Raoult D Immunofluorescence detection of B bacilliformis
flagella in vitro and in vivo in human red blood cells as viewed by laser confocal microscopy Ann N Y Acad Sci 2003
Jun990581-4
Formas Bacilares
Formas cocobacilares
Formas cocoides
IMMUNIDAD HUMORAL
IMMUNIDAD HUMORAL FASE AGUDA
Hipergamaglobulinemia en la fase aguda descrito entre los antildeos
30 y 60
IgG e IgA = Valores Normales
IgM = incrementados se normaliza en 4 semanas
Incremento de niveles de reactantes de fase aguda Activa
complemento
Consumo de complemento C3 disminuido en 64 C4
disminuido en 70 Despueacutes de 2 a 4 semanas se normaliza
Patrucco R Estudio de los patrones Inmunoloacutegicos en pacientes portadores de la enfermedad
de Carrioacuten Diag 198312 138-144
IMMUNIDAD HUMORAL FASE VERRUCOSA
Discreto incremento de IgG IgM IgA pero no
significativo
Complemento (C3 C4) en valores normales
Albumina alfa 1 alfa 2 y fraccioacuten beta dentro de
liacutemites normales
bull Maguintildea CP Estudio electroforeacutetico en suero de 16 pacientes portadores de bartonelosis
humana en fase eruptiva Diagnoacutestico 1986 17 88-90
IMMUNDAD CELULAR
INMUNIDAD CELULAR FASE AGUDA
Discreta linfopenia
Disminucioacuten en nuacutemero de los Linfocitos T
respuesta funcional pobre a los Ag
Nuacutemero de Linfocitos B normal
Disminucioacuten de Linfocitos CD4+
Elevacioacuten de Linfocitos CD8+
Disminucioacuten de la razoacuten CD4+CD8+
IMMUNIDAD CELULAR FASE VERRUCOSA
Leucocitos en valores normales tendencia a linfocitosis
Valores absolutos y relativos de linfocitos T
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
En 1942 Howe usoacute la teacutecnica de aglutinacioacuten
En 1972 ColichoacutenCantella usaron hemaglutinacioacuten
En 2000 un estudio en Cajamarca 63 fueron
reactivos usando ELISA ( S = 548) FAT (S =
337) e IHA (S= 278) IgM estuvo presente en
pacientes de fase aguda intercalar y eruptiva aun
en pacientes que tuvieron la fase aguda hasta dos
antildeos anteriores
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
Bartonella bacilliformis
FAMILIA Bartonellaceae
GENERO Bartonella
B alsatica B bacilliformis B birtlesii B clarridgeiae B doshiae
B elizabethae B grahamii B henselae B koehlerae B peromysci
B schoenbuchensis B schoenbuchii B talpae B taylorii
B tribocorum B vinsonii B quintana
Bergey
http dxdoiorg 101007 bergeysoutline
ESPECIES
CLASE Alfa Proteobacteria
TAXONOMIA
-2 Proteobacteria SUBCLASE
1 DEFORMINA Proteiacutena extracelular de 67kDa
2 MOVILIDAD Posee de 1 a 10 flagelos polares de 3 a 10 microm
de largo
La flagelina es una proteiacutena de 42 kDa
Se expreso la flagelina de B bacilliformis
en E Coli Se amplificoacute por PCR el gen fla
A e insertoacute en el plaacutesmido pGEM-T
obtenieacutendose la construccioacuten pAEfla Esta
se transfirioacute a E coli BL21(DE3) dando
una buena expresioacuten de flagelina (PAGE-
SDS)
Se evaluaraacute su capacidad antigeacutenica de
la flagelina proteinas de invacioacutem IaIA
en IaIB en ratones BalBc
Clonamiento y expresioacuten del gen de flagelina de Bartonella
bacilliformis EN Escherichia coli Garciacutea-de-la-Guarda R Alvarado
D Lozano O Flores L Guerrero A M Ventosilla P Guerra H
Coha J M Ramiacuterez P y Romero C IC 2002-2003
En resumen las proteiacutenas como la flagelina ialAB
deformina RhoA y el antiacutegeno de 43 kDa han empezado a
ayudar a entender los mecanismos moleculares para la
invasioacuten de B bacilliformis a los eritrocitos Las funciones
de estas proteiacutenas todaviacutea no se conocen totalmente Yanji Xu and Yan Chai Bartonella bacilliformis Molecular Mechanisms of Invasion Einstein
Quart J Biol Med (2002) 1956-58
INVASION
IAIB IalB contiene una secuencia 22-amino-aacutecido Es posible que el cambio de
nichos ecoloacutegicos de las Lutzomyias al ser humano (cambios de temperatura la
disponibilidad de hierro pH etc) tenga un efecto sobre la expresioacuten de la
proteiacutena ialB (Coleman amp Minnick 2001)) En otra investigacioacuten se ha
demostrado que los niveles de proteiacutena ialB se correlacionaron con cambios en
ialB mRNA con los cambios de temperatura pH La mayor cantidad de ialB
estuvo presente en B bacilliformis que habiacutean sido cultivados a 20 deg C en
estado de shock de aacutecido al igual que con los niveles de ARNm ialB las
cantidades de proteiacutena ialB disminuyeron en respuesta a pH baacutesico (pH 80) o
cambio de temperatura a 37 deg C Cuando las bacterias pasan desde el vector
fleboacutetomo a hueacutesped humano hay un cambio ascendente raacutepido de la
temperatura a 37 deg C y un aumento en el pH a 74 Probablemente otros
factores bacterianos estaacuten implicados en la adhesioacuten de eritrocitos y la invasioacuten
IalB fue localizado en la membrana interna de B bacilliformis y es poco
probable que interactue directamente con los eritrocitos Por lo tanto auacuten no se
sabe como esta proteiacutena participa en la invasioacuten de eritrocitos humanos
La B bacilliformis posee tres genes que codifican las
proteiacutenas de BRP (Kaiseret al 2011) Estas proteiacutenas
pertenecen a la familia de TAA de sistemas de secrecioacuten tipo
V BRP de B bacilliformis comparte dominios comunes y
las caracteriacutesticas estructurales con TAA pero el rol de esta
proteiacutena auacuten no se ha investigado pero probablemente BRP
desempentildean papeles similares a las proteiacutenas del TAA en B
henselae y B quintana Esas proteiacutenas estaacuten involucradas en
autoaglutinacioacuten la adhesioacuten a las ceacutelulas hueacutesped la matriz
extracelular (fibronectina y colaacutegenos) la inhibicioacuten de la
fagocitosis y como tambieacuten en la induccioacuten de una
respuesta pro-angiogeacutenico en ceacutelulas hueacutesped (Minnick et
al 2014)
BRP
Modelo de ingreso de Bartonella bacilliformis al gloacutebulo rojo
Rolain JM Novelli S Ventosilla P Maguina C Guerra H Raoult D Immunofluorescence detection of B bacilliformis
flagella in vitro and in vivo in human red blood cells as viewed by laser confocal microscopy Ann N Y Acad Sci 2003
Jun990581-4
Formas Bacilares
Formas cocobacilares
Formas cocoides
IMMUNIDAD HUMORAL
IMMUNIDAD HUMORAL FASE AGUDA
Hipergamaglobulinemia en la fase aguda descrito entre los antildeos
30 y 60
IgG e IgA = Valores Normales
IgM = incrementados se normaliza en 4 semanas
Incremento de niveles de reactantes de fase aguda Activa
complemento
Consumo de complemento C3 disminuido en 64 C4
disminuido en 70 Despueacutes de 2 a 4 semanas se normaliza
Patrucco R Estudio de los patrones Inmunoloacutegicos en pacientes portadores de la enfermedad
de Carrioacuten Diag 198312 138-144
IMMUNIDAD HUMORAL FASE VERRUCOSA
Discreto incremento de IgG IgM IgA pero no
significativo
Complemento (C3 C4) en valores normales
Albumina alfa 1 alfa 2 y fraccioacuten beta dentro de
liacutemites normales
bull Maguintildea CP Estudio electroforeacutetico en suero de 16 pacientes portadores de bartonelosis
humana en fase eruptiva Diagnoacutestico 1986 17 88-90
IMMUNDAD CELULAR
INMUNIDAD CELULAR FASE AGUDA
Discreta linfopenia
Disminucioacuten en nuacutemero de los Linfocitos T
respuesta funcional pobre a los Ag
Nuacutemero de Linfocitos B normal
Disminucioacuten de Linfocitos CD4+
Elevacioacuten de Linfocitos CD8+
Disminucioacuten de la razoacuten CD4+CD8+
IMMUNIDAD CELULAR FASE VERRUCOSA
Leucocitos en valores normales tendencia a linfocitosis
Valores absolutos y relativos de linfocitos T
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
En 1942 Howe usoacute la teacutecnica de aglutinacioacuten
En 1972 ColichoacutenCantella usaron hemaglutinacioacuten
En 2000 un estudio en Cajamarca 63 fueron
reactivos usando ELISA ( S = 548) FAT (S =
337) e IHA (S= 278) IgM estuvo presente en
pacientes de fase aguda intercalar y eruptiva aun
en pacientes que tuvieron la fase aguda hasta dos
antildeos anteriores
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
FAMILIA Bartonellaceae
GENERO Bartonella
B alsatica B bacilliformis B birtlesii B clarridgeiae B doshiae
B elizabethae B grahamii B henselae B koehlerae B peromysci
B schoenbuchensis B schoenbuchii B talpae B taylorii
B tribocorum B vinsonii B quintana
Bergey
http dxdoiorg 101007 bergeysoutline
ESPECIES
CLASE Alfa Proteobacteria
TAXONOMIA
-2 Proteobacteria SUBCLASE
1 DEFORMINA Proteiacutena extracelular de 67kDa
2 MOVILIDAD Posee de 1 a 10 flagelos polares de 3 a 10 microm
de largo
La flagelina es una proteiacutena de 42 kDa
Se expreso la flagelina de B bacilliformis
en E Coli Se amplificoacute por PCR el gen fla
A e insertoacute en el plaacutesmido pGEM-T
obtenieacutendose la construccioacuten pAEfla Esta
se transfirioacute a E coli BL21(DE3) dando
una buena expresioacuten de flagelina (PAGE-
SDS)
Se evaluaraacute su capacidad antigeacutenica de
la flagelina proteinas de invacioacutem IaIA
en IaIB en ratones BalBc
Clonamiento y expresioacuten del gen de flagelina de Bartonella
bacilliformis EN Escherichia coli Garciacutea-de-la-Guarda R Alvarado
D Lozano O Flores L Guerrero A M Ventosilla P Guerra H
Coha J M Ramiacuterez P y Romero C IC 2002-2003
En resumen las proteiacutenas como la flagelina ialAB
deformina RhoA y el antiacutegeno de 43 kDa han empezado a
ayudar a entender los mecanismos moleculares para la
invasioacuten de B bacilliformis a los eritrocitos Las funciones
de estas proteiacutenas todaviacutea no se conocen totalmente Yanji Xu and Yan Chai Bartonella bacilliformis Molecular Mechanisms of Invasion Einstein
Quart J Biol Med (2002) 1956-58
INVASION
IAIB IalB contiene una secuencia 22-amino-aacutecido Es posible que el cambio de
nichos ecoloacutegicos de las Lutzomyias al ser humano (cambios de temperatura la
disponibilidad de hierro pH etc) tenga un efecto sobre la expresioacuten de la
proteiacutena ialB (Coleman amp Minnick 2001)) En otra investigacioacuten se ha
demostrado que los niveles de proteiacutena ialB se correlacionaron con cambios en
ialB mRNA con los cambios de temperatura pH La mayor cantidad de ialB
estuvo presente en B bacilliformis que habiacutean sido cultivados a 20 deg C en
estado de shock de aacutecido al igual que con los niveles de ARNm ialB las
cantidades de proteiacutena ialB disminuyeron en respuesta a pH baacutesico (pH 80) o
cambio de temperatura a 37 deg C Cuando las bacterias pasan desde el vector
fleboacutetomo a hueacutesped humano hay un cambio ascendente raacutepido de la
temperatura a 37 deg C y un aumento en el pH a 74 Probablemente otros
factores bacterianos estaacuten implicados en la adhesioacuten de eritrocitos y la invasioacuten
IalB fue localizado en la membrana interna de B bacilliformis y es poco
probable que interactue directamente con los eritrocitos Por lo tanto auacuten no se
sabe como esta proteiacutena participa en la invasioacuten de eritrocitos humanos
La B bacilliformis posee tres genes que codifican las
proteiacutenas de BRP (Kaiseret al 2011) Estas proteiacutenas
pertenecen a la familia de TAA de sistemas de secrecioacuten tipo
V BRP de B bacilliformis comparte dominios comunes y
las caracteriacutesticas estructurales con TAA pero el rol de esta
proteiacutena auacuten no se ha investigado pero probablemente BRP
desempentildean papeles similares a las proteiacutenas del TAA en B
henselae y B quintana Esas proteiacutenas estaacuten involucradas en
autoaglutinacioacuten la adhesioacuten a las ceacutelulas hueacutesped la matriz
extracelular (fibronectina y colaacutegenos) la inhibicioacuten de la
fagocitosis y como tambieacuten en la induccioacuten de una
respuesta pro-angiogeacutenico en ceacutelulas hueacutesped (Minnick et
al 2014)
BRP
Modelo de ingreso de Bartonella bacilliformis al gloacutebulo rojo
Rolain JM Novelli S Ventosilla P Maguina C Guerra H Raoult D Immunofluorescence detection of B bacilliformis
flagella in vitro and in vivo in human red blood cells as viewed by laser confocal microscopy Ann N Y Acad Sci 2003
Jun990581-4
Formas Bacilares
Formas cocobacilares
Formas cocoides
IMMUNIDAD HUMORAL
IMMUNIDAD HUMORAL FASE AGUDA
Hipergamaglobulinemia en la fase aguda descrito entre los antildeos
30 y 60
IgG e IgA = Valores Normales
IgM = incrementados se normaliza en 4 semanas
Incremento de niveles de reactantes de fase aguda Activa
complemento
Consumo de complemento C3 disminuido en 64 C4
disminuido en 70 Despueacutes de 2 a 4 semanas se normaliza
Patrucco R Estudio de los patrones Inmunoloacutegicos en pacientes portadores de la enfermedad
de Carrioacuten Diag 198312 138-144
IMMUNIDAD HUMORAL FASE VERRUCOSA
Discreto incremento de IgG IgM IgA pero no
significativo
Complemento (C3 C4) en valores normales
Albumina alfa 1 alfa 2 y fraccioacuten beta dentro de
liacutemites normales
bull Maguintildea CP Estudio electroforeacutetico en suero de 16 pacientes portadores de bartonelosis
humana en fase eruptiva Diagnoacutestico 1986 17 88-90
IMMUNDAD CELULAR
INMUNIDAD CELULAR FASE AGUDA
Discreta linfopenia
Disminucioacuten en nuacutemero de los Linfocitos T
respuesta funcional pobre a los Ag
Nuacutemero de Linfocitos B normal
Disminucioacuten de Linfocitos CD4+
Elevacioacuten de Linfocitos CD8+
Disminucioacuten de la razoacuten CD4+CD8+
IMMUNIDAD CELULAR FASE VERRUCOSA
Leucocitos en valores normales tendencia a linfocitosis
Valores absolutos y relativos de linfocitos T
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
En 1942 Howe usoacute la teacutecnica de aglutinacioacuten
En 1972 ColichoacutenCantella usaron hemaglutinacioacuten
En 2000 un estudio en Cajamarca 63 fueron
reactivos usando ELISA ( S = 548) FAT (S =
337) e IHA (S= 278) IgM estuvo presente en
pacientes de fase aguda intercalar y eruptiva aun
en pacientes que tuvieron la fase aguda hasta dos
antildeos anteriores
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
1 DEFORMINA Proteiacutena extracelular de 67kDa
2 MOVILIDAD Posee de 1 a 10 flagelos polares de 3 a 10 microm
de largo
La flagelina es una proteiacutena de 42 kDa
Se expreso la flagelina de B bacilliformis
en E Coli Se amplificoacute por PCR el gen fla
A e insertoacute en el plaacutesmido pGEM-T
obtenieacutendose la construccioacuten pAEfla Esta
se transfirioacute a E coli BL21(DE3) dando
una buena expresioacuten de flagelina (PAGE-
SDS)
Se evaluaraacute su capacidad antigeacutenica de
la flagelina proteinas de invacioacutem IaIA
en IaIB en ratones BalBc
Clonamiento y expresioacuten del gen de flagelina de Bartonella
bacilliformis EN Escherichia coli Garciacutea-de-la-Guarda R Alvarado
D Lozano O Flores L Guerrero A M Ventosilla P Guerra H
Coha J M Ramiacuterez P y Romero C IC 2002-2003
En resumen las proteiacutenas como la flagelina ialAB
deformina RhoA y el antiacutegeno de 43 kDa han empezado a
ayudar a entender los mecanismos moleculares para la
invasioacuten de B bacilliformis a los eritrocitos Las funciones
de estas proteiacutenas todaviacutea no se conocen totalmente Yanji Xu and Yan Chai Bartonella bacilliformis Molecular Mechanisms of Invasion Einstein
Quart J Biol Med (2002) 1956-58
INVASION
IAIB IalB contiene una secuencia 22-amino-aacutecido Es posible que el cambio de
nichos ecoloacutegicos de las Lutzomyias al ser humano (cambios de temperatura la
disponibilidad de hierro pH etc) tenga un efecto sobre la expresioacuten de la
proteiacutena ialB (Coleman amp Minnick 2001)) En otra investigacioacuten se ha
demostrado que los niveles de proteiacutena ialB se correlacionaron con cambios en
ialB mRNA con los cambios de temperatura pH La mayor cantidad de ialB
estuvo presente en B bacilliformis que habiacutean sido cultivados a 20 deg C en
estado de shock de aacutecido al igual que con los niveles de ARNm ialB las
cantidades de proteiacutena ialB disminuyeron en respuesta a pH baacutesico (pH 80) o
cambio de temperatura a 37 deg C Cuando las bacterias pasan desde el vector
fleboacutetomo a hueacutesped humano hay un cambio ascendente raacutepido de la
temperatura a 37 deg C y un aumento en el pH a 74 Probablemente otros
factores bacterianos estaacuten implicados en la adhesioacuten de eritrocitos y la invasioacuten
IalB fue localizado en la membrana interna de B bacilliformis y es poco
probable que interactue directamente con los eritrocitos Por lo tanto auacuten no se
sabe como esta proteiacutena participa en la invasioacuten de eritrocitos humanos
La B bacilliformis posee tres genes que codifican las
proteiacutenas de BRP (Kaiseret al 2011) Estas proteiacutenas
pertenecen a la familia de TAA de sistemas de secrecioacuten tipo
V BRP de B bacilliformis comparte dominios comunes y
las caracteriacutesticas estructurales con TAA pero el rol de esta
proteiacutena auacuten no se ha investigado pero probablemente BRP
desempentildean papeles similares a las proteiacutenas del TAA en B
henselae y B quintana Esas proteiacutenas estaacuten involucradas en
autoaglutinacioacuten la adhesioacuten a las ceacutelulas hueacutesped la matriz
extracelular (fibronectina y colaacutegenos) la inhibicioacuten de la
fagocitosis y como tambieacuten en la induccioacuten de una
respuesta pro-angiogeacutenico en ceacutelulas hueacutesped (Minnick et
al 2014)
BRP
Modelo de ingreso de Bartonella bacilliformis al gloacutebulo rojo
Rolain JM Novelli S Ventosilla P Maguina C Guerra H Raoult D Immunofluorescence detection of B bacilliformis
flagella in vitro and in vivo in human red blood cells as viewed by laser confocal microscopy Ann N Y Acad Sci 2003
Jun990581-4
Formas Bacilares
Formas cocobacilares
Formas cocoides
IMMUNIDAD HUMORAL
IMMUNIDAD HUMORAL FASE AGUDA
Hipergamaglobulinemia en la fase aguda descrito entre los antildeos
30 y 60
IgG e IgA = Valores Normales
IgM = incrementados se normaliza en 4 semanas
Incremento de niveles de reactantes de fase aguda Activa
complemento
Consumo de complemento C3 disminuido en 64 C4
disminuido en 70 Despueacutes de 2 a 4 semanas se normaliza
Patrucco R Estudio de los patrones Inmunoloacutegicos en pacientes portadores de la enfermedad
de Carrioacuten Diag 198312 138-144
IMMUNIDAD HUMORAL FASE VERRUCOSA
Discreto incremento de IgG IgM IgA pero no
significativo
Complemento (C3 C4) en valores normales
Albumina alfa 1 alfa 2 y fraccioacuten beta dentro de
liacutemites normales
bull Maguintildea CP Estudio electroforeacutetico en suero de 16 pacientes portadores de bartonelosis
humana en fase eruptiva Diagnoacutestico 1986 17 88-90
IMMUNDAD CELULAR
INMUNIDAD CELULAR FASE AGUDA
Discreta linfopenia
Disminucioacuten en nuacutemero de los Linfocitos T
respuesta funcional pobre a los Ag
Nuacutemero de Linfocitos B normal
Disminucioacuten de Linfocitos CD4+
Elevacioacuten de Linfocitos CD8+
Disminucioacuten de la razoacuten CD4+CD8+
IMMUNIDAD CELULAR FASE VERRUCOSA
Leucocitos en valores normales tendencia a linfocitosis
Valores absolutos y relativos de linfocitos T
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
En 1942 Howe usoacute la teacutecnica de aglutinacioacuten
En 1972 ColichoacutenCantella usaron hemaglutinacioacuten
En 2000 un estudio en Cajamarca 63 fueron
reactivos usando ELISA ( S = 548) FAT (S =
337) e IHA (S= 278) IgM estuvo presente en
pacientes de fase aguda intercalar y eruptiva aun
en pacientes que tuvieron la fase aguda hasta dos
antildeos anteriores
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
2 MOVILIDAD Posee de 1 a 10 flagelos polares de 3 a 10 microm
de largo
La flagelina es una proteiacutena de 42 kDa
Se expreso la flagelina de B bacilliformis
en E Coli Se amplificoacute por PCR el gen fla
A e insertoacute en el plaacutesmido pGEM-T
obtenieacutendose la construccioacuten pAEfla Esta
se transfirioacute a E coli BL21(DE3) dando
una buena expresioacuten de flagelina (PAGE-
SDS)
Se evaluaraacute su capacidad antigeacutenica de
la flagelina proteinas de invacioacutem IaIA
en IaIB en ratones BalBc
Clonamiento y expresioacuten del gen de flagelina de Bartonella
bacilliformis EN Escherichia coli Garciacutea-de-la-Guarda R Alvarado
D Lozano O Flores L Guerrero A M Ventosilla P Guerra H
Coha J M Ramiacuterez P y Romero C IC 2002-2003
En resumen las proteiacutenas como la flagelina ialAB
deformina RhoA y el antiacutegeno de 43 kDa han empezado a
ayudar a entender los mecanismos moleculares para la
invasioacuten de B bacilliformis a los eritrocitos Las funciones
de estas proteiacutenas todaviacutea no se conocen totalmente Yanji Xu and Yan Chai Bartonella bacilliformis Molecular Mechanisms of Invasion Einstein
Quart J Biol Med (2002) 1956-58
INVASION
IAIB IalB contiene una secuencia 22-amino-aacutecido Es posible que el cambio de
nichos ecoloacutegicos de las Lutzomyias al ser humano (cambios de temperatura la
disponibilidad de hierro pH etc) tenga un efecto sobre la expresioacuten de la
proteiacutena ialB (Coleman amp Minnick 2001)) En otra investigacioacuten se ha
demostrado que los niveles de proteiacutena ialB se correlacionaron con cambios en
ialB mRNA con los cambios de temperatura pH La mayor cantidad de ialB
estuvo presente en B bacilliformis que habiacutean sido cultivados a 20 deg C en
estado de shock de aacutecido al igual que con los niveles de ARNm ialB las
cantidades de proteiacutena ialB disminuyeron en respuesta a pH baacutesico (pH 80) o
cambio de temperatura a 37 deg C Cuando las bacterias pasan desde el vector
fleboacutetomo a hueacutesped humano hay un cambio ascendente raacutepido de la
temperatura a 37 deg C y un aumento en el pH a 74 Probablemente otros
factores bacterianos estaacuten implicados en la adhesioacuten de eritrocitos y la invasioacuten
IalB fue localizado en la membrana interna de B bacilliformis y es poco
probable que interactue directamente con los eritrocitos Por lo tanto auacuten no se
sabe como esta proteiacutena participa en la invasioacuten de eritrocitos humanos
La B bacilliformis posee tres genes que codifican las
proteiacutenas de BRP (Kaiseret al 2011) Estas proteiacutenas
pertenecen a la familia de TAA de sistemas de secrecioacuten tipo
V BRP de B bacilliformis comparte dominios comunes y
las caracteriacutesticas estructurales con TAA pero el rol de esta
proteiacutena auacuten no se ha investigado pero probablemente BRP
desempentildean papeles similares a las proteiacutenas del TAA en B
henselae y B quintana Esas proteiacutenas estaacuten involucradas en
autoaglutinacioacuten la adhesioacuten a las ceacutelulas hueacutesped la matriz
extracelular (fibronectina y colaacutegenos) la inhibicioacuten de la
fagocitosis y como tambieacuten en la induccioacuten de una
respuesta pro-angiogeacutenico en ceacutelulas hueacutesped (Minnick et
al 2014)
BRP
Modelo de ingreso de Bartonella bacilliformis al gloacutebulo rojo
Rolain JM Novelli S Ventosilla P Maguina C Guerra H Raoult D Immunofluorescence detection of B bacilliformis
flagella in vitro and in vivo in human red blood cells as viewed by laser confocal microscopy Ann N Y Acad Sci 2003
Jun990581-4
Formas Bacilares
Formas cocobacilares
Formas cocoides
IMMUNIDAD HUMORAL
IMMUNIDAD HUMORAL FASE AGUDA
Hipergamaglobulinemia en la fase aguda descrito entre los antildeos
30 y 60
IgG e IgA = Valores Normales
IgM = incrementados se normaliza en 4 semanas
Incremento de niveles de reactantes de fase aguda Activa
complemento
Consumo de complemento C3 disminuido en 64 C4
disminuido en 70 Despueacutes de 2 a 4 semanas se normaliza
Patrucco R Estudio de los patrones Inmunoloacutegicos en pacientes portadores de la enfermedad
de Carrioacuten Diag 198312 138-144
IMMUNIDAD HUMORAL FASE VERRUCOSA
Discreto incremento de IgG IgM IgA pero no
significativo
Complemento (C3 C4) en valores normales
Albumina alfa 1 alfa 2 y fraccioacuten beta dentro de
liacutemites normales
bull Maguintildea CP Estudio electroforeacutetico en suero de 16 pacientes portadores de bartonelosis
humana en fase eruptiva Diagnoacutestico 1986 17 88-90
IMMUNDAD CELULAR
INMUNIDAD CELULAR FASE AGUDA
Discreta linfopenia
Disminucioacuten en nuacutemero de los Linfocitos T
respuesta funcional pobre a los Ag
Nuacutemero de Linfocitos B normal
Disminucioacuten de Linfocitos CD4+
Elevacioacuten de Linfocitos CD8+
Disminucioacuten de la razoacuten CD4+CD8+
IMMUNIDAD CELULAR FASE VERRUCOSA
Leucocitos en valores normales tendencia a linfocitosis
Valores absolutos y relativos de linfocitos T
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
En 1942 Howe usoacute la teacutecnica de aglutinacioacuten
En 1972 ColichoacutenCantella usaron hemaglutinacioacuten
En 2000 un estudio en Cajamarca 63 fueron
reactivos usando ELISA ( S = 548) FAT (S =
337) e IHA (S= 278) IgM estuvo presente en
pacientes de fase aguda intercalar y eruptiva aun
en pacientes que tuvieron la fase aguda hasta dos
antildeos anteriores
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
En resumen las proteiacutenas como la flagelina ialAB
deformina RhoA y el antiacutegeno de 43 kDa han empezado a
ayudar a entender los mecanismos moleculares para la
invasioacuten de B bacilliformis a los eritrocitos Las funciones
de estas proteiacutenas todaviacutea no se conocen totalmente Yanji Xu and Yan Chai Bartonella bacilliformis Molecular Mechanisms of Invasion Einstein
Quart J Biol Med (2002) 1956-58
INVASION
IAIB IalB contiene una secuencia 22-amino-aacutecido Es posible que el cambio de
nichos ecoloacutegicos de las Lutzomyias al ser humano (cambios de temperatura la
disponibilidad de hierro pH etc) tenga un efecto sobre la expresioacuten de la
proteiacutena ialB (Coleman amp Minnick 2001)) En otra investigacioacuten se ha
demostrado que los niveles de proteiacutena ialB se correlacionaron con cambios en
ialB mRNA con los cambios de temperatura pH La mayor cantidad de ialB
estuvo presente en B bacilliformis que habiacutean sido cultivados a 20 deg C en
estado de shock de aacutecido al igual que con los niveles de ARNm ialB las
cantidades de proteiacutena ialB disminuyeron en respuesta a pH baacutesico (pH 80) o
cambio de temperatura a 37 deg C Cuando las bacterias pasan desde el vector
fleboacutetomo a hueacutesped humano hay un cambio ascendente raacutepido de la
temperatura a 37 deg C y un aumento en el pH a 74 Probablemente otros
factores bacterianos estaacuten implicados en la adhesioacuten de eritrocitos y la invasioacuten
IalB fue localizado en la membrana interna de B bacilliformis y es poco
probable que interactue directamente con los eritrocitos Por lo tanto auacuten no se
sabe como esta proteiacutena participa en la invasioacuten de eritrocitos humanos
La B bacilliformis posee tres genes que codifican las
proteiacutenas de BRP (Kaiseret al 2011) Estas proteiacutenas
pertenecen a la familia de TAA de sistemas de secrecioacuten tipo
V BRP de B bacilliformis comparte dominios comunes y
las caracteriacutesticas estructurales con TAA pero el rol de esta
proteiacutena auacuten no se ha investigado pero probablemente BRP
desempentildean papeles similares a las proteiacutenas del TAA en B
henselae y B quintana Esas proteiacutenas estaacuten involucradas en
autoaglutinacioacuten la adhesioacuten a las ceacutelulas hueacutesped la matriz
extracelular (fibronectina y colaacutegenos) la inhibicioacuten de la
fagocitosis y como tambieacuten en la induccioacuten de una
respuesta pro-angiogeacutenico en ceacutelulas hueacutesped (Minnick et
al 2014)
BRP
Modelo de ingreso de Bartonella bacilliformis al gloacutebulo rojo
Rolain JM Novelli S Ventosilla P Maguina C Guerra H Raoult D Immunofluorescence detection of B bacilliformis
flagella in vitro and in vivo in human red blood cells as viewed by laser confocal microscopy Ann N Y Acad Sci 2003
Jun990581-4
Formas Bacilares
Formas cocobacilares
Formas cocoides
IMMUNIDAD HUMORAL
IMMUNIDAD HUMORAL FASE AGUDA
Hipergamaglobulinemia en la fase aguda descrito entre los antildeos
30 y 60
IgG e IgA = Valores Normales
IgM = incrementados se normaliza en 4 semanas
Incremento de niveles de reactantes de fase aguda Activa
complemento
Consumo de complemento C3 disminuido en 64 C4
disminuido en 70 Despueacutes de 2 a 4 semanas se normaliza
Patrucco R Estudio de los patrones Inmunoloacutegicos en pacientes portadores de la enfermedad
de Carrioacuten Diag 198312 138-144
IMMUNIDAD HUMORAL FASE VERRUCOSA
Discreto incremento de IgG IgM IgA pero no
significativo
Complemento (C3 C4) en valores normales
Albumina alfa 1 alfa 2 y fraccioacuten beta dentro de
liacutemites normales
bull Maguintildea CP Estudio electroforeacutetico en suero de 16 pacientes portadores de bartonelosis
humana en fase eruptiva Diagnoacutestico 1986 17 88-90
IMMUNDAD CELULAR
INMUNIDAD CELULAR FASE AGUDA
Discreta linfopenia
Disminucioacuten en nuacutemero de los Linfocitos T
respuesta funcional pobre a los Ag
Nuacutemero de Linfocitos B normal
Disminucioacuten de Linfocitos CD4+
Elevacioacuten de Linfocitos CD8+
Disminucioacuten de la razoacuten CD4+CD8+
IMMUNIDAD CELULAR FASE VERRUCOSA
Leucocitos en valores normales tendencia a linfocitosis
Valores absolutos y relativos de linfocitos T
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
En 1942 Howe usoacute la teacutecnica de aglutinacioacuten
En 1972 ColichoacutenCantella usaron hemaglutinacioacuten
En 2000 un estudio en Cajamarca 63 fueron
reactivos usando ELISA ( S = 548) FAT (S =
337) e IHA (S= 278) IgM estuvo presente en
pacientes de fase aguda intercalar y eruptiva aun
en pacientes que tuvieron la fase aguda hasta dos
antildeos anteriores
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
IAIB IalB contiene una secuencia 22-amino-aacutecido Es posible que el cambio de
nichos ecoloacutegicos de las Lutzomyias al ser humano (cambios de temperatura la
disponibilidad de hierro pH etc) tenga un efecto sobre la expresioacuten de la
proteiacutena ialB (Coleman amp Minnick 2001)) En otra investigacioacuten se ha
demostrado que los niveles de proteiacutena ialB se correlacionaron con cambios en
ialB mRNA con los cambios de temperatura pH La mayor cantidad de ialB
estuvo presente en B bacilliformis que habiacutean sido cultivados a 20 deg C en
estado de shock de aacutecido al igual que con los niveles de ARNm ialB las
cantidades de proteiacutena ialB disminuyeron en respuesta a pH baacutesico (pH 80) o
cambio de temperatura a 37 deg C Cuando las bacterias pasan desde el vector
fleboacutetomo a hueacutesped humano hay un cambio ascendente raacutepido de la
temperatura a 37 deg C y un aumento en el pH a 74 Probablemente otros
factores bacterianos estaacuten implicados en la adhesioacuten de eritrocitos y la invasioacuten
IalB fue localizado en la membrana interna de B bacilliformis y es poco
probable que interactue directamente con los eritrocitos Por lo tanto auacuten no se
sabe como esta proteiacutena participa en la invasioacuten de eritrocitos humanos
La B bacilliformis posee tres genes que codifican las
proteiacutenas de BRP (Kaiseret al 2011) Estas proteiacutenas
pertenecen a la familia de TAA de sistemas de secrecioacuten tipo
V BRP de B bacilliformis comparte dominios comunes y
las caracteriacutesticas estructurales con TAA pero el rol de esta
proteiacutena auacuten no se ha investigado pero probablemente BRP
desempentildean papeles similares a las proteiacutenas del TAA en B
henselae y B quintana Esas proteiacutenas estaacuten involucradas en
autoaglutinacioacuten la adhesioacuten a las ceacutelulas hueacutesped la matriz
extracelular (fibronectina y colaacutegenos) la inhibicioacuten de la
fagocitosis y como tambieacuten en la induccioacuten de una
respuesta pro-angiogeacutenico en ceacutelulas hueacutesped (Minnick et
al 2014)
BRP
Modelo de ingreso de Bartonella bacilliformis al gloacutebulo rojo
Rolain JM Novelli S Ventosilla P Maguina C Guerra H Raoult D Immunofluorescence detection of B bacilliformis
flagella in vitro and in vivo in human red blood cells as viewed by laser confocal microscopy Ann N Y Acad Sci 2003
Jun990581-4
Formas Bacilares
Formas cocobacilares
Formas cocoides
IMMUNIDAD HUMORAL
IMMUNIDAD HUMORAL FASE AGUDA
Hipergamaglobulinemia en la fase aguda descrito entre los antildeos
30 y 60
IgG e IgA = Valores Normales
IgM = incrementados se normaliza en 4 semanas
Incremento de niveles de reactantes de fase aguda Activa
complemento
Consumo de complemento C3 disminuido en 64 C4
disminuido en 70 Despueacutes de 2 a 4 semanas se normaliza
Patrucco R Estudio de los patrones Inmunoloacutegicos en pacientes portadores de la enfermedad
de Carrioacuten Diag 198312 138-144
IMMUNIDAD HUMORAL FASE VERRUCOSA
Discreto incremento de IgG IgM IgA pero no
significativo
Complemento (C3 C4) en valores normales
Albumina alfa 1 alfa 2 y fraccioacuten beta dentro de
liacutemites normales
bull Maguintildea CP Estudio electroforeacutetico en suero de 16 pacientes portadores de bartonelosis
humana en fase eruptiva Diagnoacutestico 1986 17 88-90
IMMUNDAD CELULAR
INMUNIDAD CELULAR FASE AGUDA
Discreta linfopenia
Disminucioacuten en nuacutemero de los Linfocitos T
respuesta funcional pobre a los Ag
Nuacutemero de Linfocitos B normal
Disminucioacuten de Linfocitos CD4+
Elevacioacuten de Linfocitos CD8+
Disminucioacuten de la razoacuten CD4+CD8+
IMMUNIDAD CELULAR FASE VERRUCOSA
Leucocitos en valores normales tendencia a linfocitosis
Valores absolutos y relativos de linfocitos T
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
En 1942 Howe usoacute la teacutecnica de aglutinacioacuten
En 1972 ColichoacutenCantella usaron hemaglutinacioacuten
En 2000 un estudio en Cajamarca 63 fueron
reactivos usando ELISA ( S = 548) FAT (S =
337) e IHA (S= 278) IgM estuvo presente en
pacientes de fase aguda intercalar y eruptiva aun
en pacientes que tuvieron la fase aguda hasta dos
antildeos anteriores
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
La B bacilliformis posee tres genes que codifican las
proteiacutenas de BRP (Kaiseret al 2011) Estas proteiacutenas
pertenecen a la familia de TAA de sistemas de secrecioacuten tipo
V BRP de B bacilliformis comparte dominios comunes y
las caracteriacutesticas estructurales con TAA pero el rol de esta
proteiacutena auacuten no se ha investigado pero probablemente BRP
desempentildean papeles similares a las proteiacutenas del TAA en B
henselae y B quintana Esas proteiacutenas estaacuten involucradas en
autoaglutinacioacuten la adhesioacuten a las ceacutelulas hueacutesped la matriz
extracelular (fibronectina y colaacutegenos) la inhibicioacuten de la
fagocitosis y como tambieacuten en la induccioacuten de una
respuesta pro-angiogeacutenico en ceacutelulas hueacutesped (Minnick et
al 2014)
BRP
Modelo de ingreso de Bartonella bacilliformis al gloacutebulo rojo
Rolain JM Novelli S Ventosilla P Maguina C Guerra H Raoult D Immunofluorescence detection of B bacilliformis
flagella in vitro and in vivo in human red blood cells as viewed by laser confocal microscopy Ann N Y Acad Sci 2003
Jun990581-4
Formas Bacilares
Formas cocobacilares
Formas cocoides
IMMUNIDAD HUMORAL
IMMUNIDAD HUMORAL FASE AGUDA
Hipergamaglobulinemia en la fase aguda descrito entre los antildeos
30 y 60
IgG e IgA = Valores Normales
IgM = incrementados se normaliza en 4 semanas
Incremento de niveles de reactantes de fase aguda Activa
complemento
Consumo de complemento C3 disminuido en 64 C4
disminuido en 70 Despueacutes de 2 a 4 semanas se normaliza
Patrucco R Estudio de los patrones Inmunoloacutegicos en pacientes portadores de la enfermedad
de Carrioacuten Diag 198312 138-144
IMMUNIDAD HUMORAL FASE VERRUCOSA
Discreto incremento de IgG IgM IgA pero no
significativo
Complemento (C3 C4) en valores normales
Albumina alfa 1 alfa 2 y fraccioacuten beta dentro de
liacutemites normales
bull Maguintildea CP Estudio electroforeacutetico en suero de 16 pacientes portadores de bartonelosis
humana en fase eruptiva Diagnoacutestico 1986 17 88-90
IMMUNDAD CELULAR
INMUNIDAD CELULAR FASE AGUDA
Discreta linfopenia
Disminucioacuten en nuacutemero de los Linfocitos T
respuesta funcional pobre a los Ag
Nuacutemero de Linfocitos B normal
Disminucioacuten de Linfocitos CD4+
Elevacioacuten de Linfocitos CD8+
Disminucioacuten de la razoacuten CD4+CD8+
IMMUNIDAD CELULAR FASE VERRUCOSA
Leucocitos en valores normales tendencia a linfocitosis
Valores absolutos y relativos de linfocitos T
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
En 1942 Howe usoacute la teacutecnica de aglutinacioacuten
En 1972 ColichoacutenCantella usaron hemaglutinacioacuten
En 2000 un estudio en Cajamarca 63 fueron
reactivos usando ELISA ( S = 548) FAT (S =
337) e IHA (S= 278) IgM estuvo presente en
pacientes de fase aguda intercalar y eruptiva aun
en pacientes que tuvieron la fase aguda hasta dos
antildeos anteriores
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
Modelo de ingreso de Bartonella bacilliformis al gloacutebulo rojo
Rolain JM Novelli S Ventosilla P Maguina C Guerra H Raoult D Immunofluorescence detection of B bacilliformis
flagella in vitro and in vivo in human red blood cells as viewed by laser confocal microscopy Ann N Y Acad Sci 2003
Jun990581-4
Formas Bacilares
Formas cocobacilares
Formas cocoides
IMMUNIDAD HUMORAL
IMMUNIDAD HUMORAL FASE AGUDA
Hipergamaglobulinemia en la fase aguda descrito entre los antildeos
30 y 60
IgG e IgA = Valores Normales
IgM = incrementados se normaliza en 4 semanas
Incremento de niveles de reactantes de fase aguda Activa
complemento
Consumo de complemento C3 disminuido en 64 C4
disminuido en 70 Despueacutes de 2 a 4 semanas se normaliza
Patrucco R Estudio de los patrones Inmunoloacutegicos en pacientes portadores de la enfermedad
de Carrioacuten Diag 198312 138-144
IMMUNIDAD HUMORAL FASE VERRUCOSA
Discreto incremento de IgG IgM IgA pero no
significativo
Complemento (C3 C4) en valores normales
Albumina alfa 1 alfa 2 y fraccioacuten beta dentro de
liacutemites normales
bull Maguintildea CP Estudio electroforeacutetico en suero de 16 pacientes portadores de bartonelosis
humana en fase eruptiva Diagnoacutestico 1986 17 88-90
IMMUNDAD CELULAR
INMUNIDAD CELULAR FASE AGUDA
Discreta linfopenia
Disminucioacuten en nuacutemero de los Linfocitos T
respuesta funcional pobre a los Ag
Nuacutemero de Linfocitos B normal
Disminucioacuten de Linfocitos CD4+
Elevacioacuten de Linfocitos CD8+
Disminucioacuten de la razoacuten CD4+CD8+
IMMUNIDAD CELULAR FASE VERRUCOSA
Leucocitos en valores normales tendencia a linfocitosis
Valores absolutos y relativos de linfocitos T
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
En 1942 Howe usoacute la teacutecnica de aglutinacioacuten
En 1972 ColichoacutenCantella usaron hemaglutinacioacuten
En 2000 un estudio en Cajamarca 63 fueron
reactivos usando ELISA ( S = 548) FAT (S =
337) e IHA (S= 278) IgM estuvo presente en
pacientes de fase aguda intercalar y eruptiva aun
en pacientes que tuvieron la fase aguda hasta dos
antildeos anteriores
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
Formas Bacilares
Formas cocobacilares
Formas cocoides
IMMUNIDAD HUMORAL
IMMUNIDAD HUMORAL FASE AGUDA
Hipergamaglobulinemia en la fase aguda descrito entre los antildeos
30 y 60
IgG e IgA = Valores Normales
IgM = incrementados se normaliza en 4 semanas
Incremento de niveles de reactantes de fase aguda Activa
complemento
Consumo de complemento C3 disminuido en 64 C4
disminuido en 70 Despueacutes de 2 a 4 semanas se normaliza
Patrucco R Estudio de los patrones Inmunoloacutegicos en pacientes portadores de la enfermedad
de Carrioacuten Diag 198312 138-144
IMMUNIDAD HUMORAL FASE VERRUCOSA
Discreto incremento de IgG IgM IgA pero no
significativo
Complemento (C3 C4) en valores normales
Albumina alfa 1 alfa 2 y fraccioacuten beta dentro de
liacutemites normales
bull Maguintildea CP Estudio electroforeacutetico en suero de 16 pacientes portadores de bartonelosis
humana en fase eruptiva Diagnoacutestico 1986 17 88-90
IMMUNDAD CELULAR
INMUNIDAD CELULAR FASE AGUDA
Discreta linfopenia
Disminucioacuten en nuacutemero de los Linfocitos T
respuesta funcional pobre a los Ag
Nuacutemero de Linfocitos B normal
Disminucioacuten de Linfocitos CD4+
Elevacioacuten de Linfocitos CD8+
Disminucioacuten de la razoacuten CD4+CD8+
IMMUNIDAD CELULAR FASE VERRUCOSA
Leucocitos en valores normales tendencia a linfocitosis
Valores absolutos y relativos de linfocitos T
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
En 1942 Howe usoacute la teacutecnica de aglutinacioacuten
En 1972 ColichoacutenCantella usaron hemaglutinacioacuten
En 2000 un estudio en Cajamarca 63 fueron
reactivos usando ELISA ( S = 548) FAT (S =
337) e IHA (S= 278) IgM estuvo presente en
pacientes de fase aguda intercalar y eruptiva aun
en pacientes que tuvieron la fase aguda hasta dos
antildeos anteriores
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
Formas cocobacilares
Formas cocoides
IMMUNIDAD HUMORAL
IMMUNIDAD HUMORAL FASE AGUDA
Hipergamaglobulinemia en la fase aguda descrito entre los antildeos
30 y 60
IgG e IgA = Valores Normales
IgM = incrementados se normaliza en 4 semanas
Incremento de niveles de reactantes de fase aguda Activa
complemento
Consumo de complemento C3 disminuido en 64 C4
disminuido en 70 Despueacutes de 2 a 4 semanas se normaliza
Patrucco R Estudio de los patrones Inmunoloacutegicos en pacientes portadores de la enfermedad
de Carrioacuten Diag 198312 138-144
IMMUNIDAD HUMORAL FASE VERRUCOSA
Discreto incremento de IgG IgM IgA pero no
significativo
Complemento (C3 C4) en valores normales
Albumina alfa 1 alfa 2 y fraccioacuten beta dentro de
liacutemites normales
bull Maguintildea CP Estudio electroforeacutetico en suero de 16 pacientes portadores de bartonelosis
humana en fase eruptiva Diagnoacutestico 1986 17 88-90
IMMUNDAD CELULAR
INMUNIDAD CELULAR FASE AGUDA
Discreta linfopenia
Disminucioacuten en nuacutemero de los Linfocitos T
respuesta funcional pobre a los Ag
Nuacutemero de Linfocitos B normal
Disminucioacuten de Linfocitos CD4+
Elevacioacuten de Linfocitos CD8+
Disminucioacuten de la razoacuten CD4+CD8+
IMMUNIDAD CELULAR FASE VERRUCOSA
Leucocitos en valores normales tendencia a linfocitosis
Valores absolutos y relativos de linfocitos T
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
En 1942 Howe usoacute la teacutecnica de aglutinacioacuten
En 1972 ColichoacutenCantella usaron hemaglutinacioacuten
En 2000 un estudio en Cajamarca 63 fueron
reactivos usando ELISA ( S = 548) FAT (S =
337) e IHA (S= 278) IgM estuvo presente en
pacientes de fase aguda intercalar y eruptiva aun
en pacientes que tuvieron la fase aguda hasta dos
antildeos anteriores
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
Formas cocoides
IMMUNIDAD HUMORAL
IMMUNIDAD HUMORAL FASE AGUDA
Hipergamaglobulinemia en la fase aguda descrito entre los antildeos
30 y 60
IgG e IgA = Valores Normales
IgM = incrementados se normaliza en 4 semanas
Incremento de niveles de reactantes de fase aguda Activa
complemento
Consumo de complemento C3 disminuido en 64 C4
disminuido en 70 Despueacutes de 2 a 4 semanas se normaliza
Patrucco R Estudio de los patrones Inmunoloacutegicos en pacientes portadores de la enfermedad
de Carrioacuten Diag 198312 138-144
IMMUNIDAD HUMORAL FASE VERRUCOSA
Discreto incremento de IgG IgM IgA pero no
significativo
Complemento (C3 C4) en valores normales
Albumina alfa 1 alfa 2 y fraccioacuten beta dentro de
liacutemites normales
bull Maguintildea CP Estudio electroforeacutetico en suero de 16 pacientes portadores de bartonelosis
humana en fase eruptiva Diagnoacutestico 1986 17 88-90
IMMUNDAD CELULAR
INMUNIDAD CELULAR FASE AGUDA
Discreta linfopenia
Disminucioacuten en nuacutemero de los Linfocitos T
respuesta funcional pobre a los Ag
Nuacutemero de Linfocitos B normal
Disminucioacuten de Linfocitos CD4+
Elevacioacuten de Linfocitos CD8+
Disminucioacuten de la razoacuten CD4+CD8+
IMMUNIDAD CELULAR FASE VERRUCOSA
Leucocitos en valores normales tendencia a linfocitosis
Valores absolutos y relativos de linfocitos T
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
En 1942 Howe usoacute la teacutecnica de aglutinacioacuten
En 1972 ColichoacutenCantella usaron hemaglutinacioacuten
En 2000 un estudio en Cajamarca 63 fueron
reactivos usando ELISA ( S = 548) FAT (S =
337) e IHA (S= 278) IgM estuvo presente en
pacientes de fase aguda intercalar y eruptiva aun
en pacientes que tuvieron la fase aguda hasta dos
antildeos anteriores
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
IMMUNIDAD HUMORAL
IMMUNIDAD HUMORAL FASE AGUDA
Hipergamaglobulinemia en la fase aguda descrito entre los antildeos
30 y 60
IgG e IgA = Valores Normales
IgM = incrementados se normaliza en 4 semanas
Incremento de niveles de reactantes de fase aguda Activa
complemento
Consumo de complemento C3 disminuido en 64 C4
disminuido en 70 Despueacutes de 2 a 4 semanas se normaliza
Patrucco R Estudio de los patrones Inmunoloacutegicos en pacientes portadores de la enfermedad
de Carrioacuten Diag 198312 138-144
IMMUNIDAD HUMORAL FASE VERRUCOSA
Discreto incremento de IgG IgM IgA pero no
significativo
Complemento (C3 C4) en valores normales
Albumina alfa 1 alfa 2 y fraccioacuten beta dentro de
liacutemites normales
bull Maguintildea CP Estudio electroforeacutetico en suero de 16 pacientes portadores de bartonelosis
humana en fase eruptiva Diagnoacutestico 1986 17 88-90
IMMUNDAD CELULAR
INMUNIDAD CELULAR FASE AGUDA
Discreta linfopenia
Disminucioacuten en nuacutemero de los Linfocitos T
respuesta funcional pobre a los Ag
Nuacutemero de Linfocitos B normal
Disminucioacuten de Linfocitos CD4+
Elevacioacuten de Linfocitos CD8+
Disminucioacuten de la razoacuten CD4+CD8+
IMMUNIDAD CELULAR FASE VERRUCOSA
Leucocitos en valores normales tendencia a linfocitosis
Valores absolutos y relativos de linfocitos T
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
En 1942 Howe usoacute la teacutecnica de aglutinacioacuten
En 1972 ColichoacutenCantella usaron hemaglutinacioacuten
En 2000 un estudio en Cajamarca 63 fueron
reactivos usando ELISA ( S = 548) FAT (S =
337) e IHA (S= 278) IgM estuvo presente en
pacientes de fase aguda intercalar y eruptiva aun
en pacientes que tuvieron la fase aguda hasta dos
antildeos anteriores
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
IMMUNIDAD HUMORAL FASE AGUDA
Hipergamaglobulinemia en la fase aguda descrito entre los antildeos
30 y 60
IgG e IgA = Valores Normales
IgM = incrementados se normaliza en 4 semanas
Incremento de niveles de reactantes de fase aguda Activa
complemento
Consumo de complemento C3 disminuido en 64 C4
disminuido en 70 Despueacutes de 2 a 4 semanas se normaliza
Patrucco R Estudio de los patrones Inmunoloacutegicos en pacientes portadores de la enfermedad
de Carrioacuten Diag 198312 138-144
IMMUNIDAD HUMORAL FASE VERRUCOSA
Discreto incremento de IgG IgM IgA pero no
significativo
Complemento (C3 C4) en valores normales
Albumina alfa 1 alfa 2 y fraccioacuten beta dentro de
liacutemites normales
bull Maguintildea CP Estudio electroforeacutetico en suero de 16 pacientes portadores de bartonelosis
humana en fase eruptiva Diagnoacutestico 1986 17 88-90
IMMUNDAD CELULAR
INMUNIDAD CELULAR FASE AGUDA
Discreta linfopenia
Disminucioacuten en nuacutemero de los Linfocitos T
respuesta funcional pobre a los Ag
Nuacutemero de Linfocitos B normal
Disminucioacuten de Linfocitos CD4+
Elevacioacuten de Linfocitos CD8+
Disminucioacuten de la razoacuten CD4+CD8+
IMMUNIDAD CELULAR FASE VERRUCOSA
Leucocitos en valores normales tendencia a linfocitosis
Valores absolutos y relativos de linfocitos T
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
En 1942 Howe usoacute la teacutecnica de aglutinacioacuten
En 1972 ColichoacutenCantella usaron hemaglutinacioacuten
En 2000 un estudio en Cajamarca 63 fueron
reactivos usando ELISA ( S = 548) FAT (S =
337) e IHA (S= 278) IgM estuvo presente en
pacientes de fase aguda intercalar y eruptiva aun
en pacientes que tuvieron la fase aguda hasta dos
antildeos anteriores
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
IMMUNIDAD HUMORAL FASE VERRUCOSA
Discreto incremento de IgG IgM IgA pero no
significativo
Complemento (C3 C4) en valores normales
Albumina alfa 1 alfa 2 y fraccioacuten beta dentro de
liacutemites normales
bull Maguintildea CP Estudio electroforeacutetico en suero de 16 pacientes portadores de bartonelosis
humana en fase eruptiva Diagnoacutestico 1986 17 88-90
IMMUNDAD CELULAR
INMUNIDAD CELULAR FASE AGUDA
Discreta linfopenia
Disminucioacuten en nuacutemero de los Linfocitos T
respuesta funcional pobre a los Ag
Nuacutemero de Linfocitos B normal
Disminucioacuten de Linfocitos CD4+
Elevacioacuten de Linfocitos CD8+
Disminucioacuten de la razoacuten CD4+CD8+
IMMUNIDAD CELULAR FASE VERRUCOSA
Leucocitos en valores normales tendencia a linfocitosis
Valores absolutos y relativos de linfocitos T
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
En 1942 Howe usoacute la teacutecnica de aglutinacioacuten
En 1972 ColichoacutenCantella usaron hemaglutinacioacuten
En 2000 un estudio en Cajamarca 63 fueron
reactivos usando ELISA ( S = 548) FAT (S =
337) e IHA (S= 278) IgM estuvo presente en
pacientes de fase aguda intercalar y eruptiva aun
en pacientes que tuvieron la fase aguda hasta dos
antildeos anteriores
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
IMMUNDAD CELULAR
INMUNIDAD CELULAR FASE AGUDA
Discreta linfopenia
Disminucioacuten en nuacutemero de los Linfocitos T
respuesta funcional pobre a los Ag
Nuacutemero de Linfocitos B normal
Disminucioacuten de Linfocitos CD4+
Elevacioacuten de Linfocitos CD8+
Disminucioacuten de la razoacuten CD4+CD8+
IMMUNIDAD CELULAR FASE VERRUCOSA
Leucocitos en valores normales tendencia a linfocitosis
Valores absolutos y relativos de linfocitos T
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
En 1942 Howe usoacute la teacutecnica de aglutinacioacuten
En 1972 ColichoacutenCantella usaron hemaglutinacioacuten
En 2000 un estudio en Cajamarca 63 fueron
reactivos usando ELISA ( S = 548) FAT (S =
337) e IHA (S= 278) IgM estuvo presente en
pacientes de fase aguda intercalar y eruptiva aun
en pacientes que tuvieron la fase aguda hasta dos
antildeos anteriores
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
INMUNIDAD CELULAR FASE AGUDA
Discreta linfopenia
Disminucioacuten en nuacutemero de los Linfocitos T
respuesta funcional pobre a los Ag
Nuacutemero de Linfocitos B normal
Disminucioacuten de Linfocitos CD4+
Elevacioacuten de Linfocitos CD8+
Disminucioacuten de la razoacuten CD4+CD8+
IMMUNIDAD CELULAR FASE VERRUCOSA
Leucocitos en valores normales tendencia a linfocitosis
Valores absolutos y relativos de linfocitos T
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
En 1942 Howe usoacute la teacutecnica de aglutinacioacuten
En 1972 ColichoacutenCantella usaron hemaglutinacioacuten
En 2000 un estudio en Cajamarca 63 fueron
reactivos usando ELISA ( S = 548) FAT (S =
337) e IHA (S= 278) IgM estuvo presente en
pacientes de fase aguda intercalar y eruptiva aun
en pacientes que tuvieron la fase aguda hasta dos
antildeos anteriores
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
IMMUNIDAD CELULAR FASE VERRUCOSA
Leucocitos en valores normales tendencia a linfocitosis
Valores absolutos y relativos de linfocitos T
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
En 1942 Howe usoacute la teacutecnica de aglutinacioacuten
En 1972 ColichoacutenCantella usaron hemaglutinacioacuten
En 2000 un estudio en Cajamarca 63 fueron
reactivos usando ELISA ( S = 548) FAT (S =
337) e IHA (S= 278) IgM estuvo presente en
pacientes de fase aguda intercalar y eruptiva aun
en pacientes que tuvieron la fase aguda hasta dos
antildeos anteriores
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
En 1942 Howe usoacute la teacutecnica de aglutinacioacuten
En 1972 ColichoacutenCantella usaron hemaglutinacioacuten
En 2000 un estudio en Cajamarca 63 fueron
reactivos usando ELISA ( S = 548) FAT (S =
337) e IHA (S= 278) IgM estuvo presente en
pacientes de fase aguda intercalar y eruptiva aun
en pacientes que tuvieron la fase aguda hasta dos
antildeos anteriores
P Pachas La Bartonelosis en el Peruacute Moacutedulos Teacuteenicos OGEINS 2000
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
Chamberlin y col 2000 demostraroacuten IFA 82 de S en pacientes
en fase aguda de Caraz (prevalencia de 45) 92 del control
negativo fueron sero negativos Chamberlin J Laughlin l Gordon S Romero S Solorzano N amp Regnery RR Reserved Serodiagnosis of
Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay Test Development and
Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology Nov
2000 p 4269ndash4271 Vol 38 No 11 American Society for Microbiology
V Mallqui E C Speelmon M Verastegui C Maguintildea-vargas P Pinell-sallesR Lavarello J Delgado M
Kosek S Romeroyamp R Gilman Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis clinical and diagnostic
laboratory immunologyjan 2000 p 1ndash5 vol 7 no 1
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
ELISA Indirecta como prueba de tamizaje
para la deteccioacuten de Inmunoglobulinas M y
G anti - Bartonella bacilliformis
Sandra Palma Albornoz
Palmira Ventosilla
Laboratorio de Microbiologiacutea Experimental
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH)
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
OBJETIVO GENERAL
Optimizar la prueba de ELISA indirecta para la
identificacioacuten raacutepida de inmunoglobulinas anti -
Bartonella bacilliformis
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
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bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
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J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
Bartonella bacilliformis ATCC 35685
Cultivo en agar Columbia con sangre de
carnero al 10 29 ordmC x 7 diacuteas
Coleccioacuten de las colonias
Se sonicoacute y centrifugoacute
Laurilsarcosina
Antiacutegeno
Sobrenadante Sedimento
PME
(Proteiacutenas de Membrana Externa) EXTRACTO CRUDO
Antiacutegeno
PREPARACION DE LOS ANTIGENOS
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
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10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
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bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
Evaluacioacuten de la prueba
bull Suero de pacientes con bartonelosis (hemocultivo positivo Prueba de Oro) Lima Caraz Huaraz Chimbote
Sueros en fase aguda 34
Sueros en fase eruptiva 34
bull Sueros negativos 34 donantes voluntarios con hemocultivo negativo
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
Antiacutegeno crudo (IgM)
Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 022 025
Sensibilidad 824 912
Especificidad 706 765
VPP 736 7894
VPN
80
8666
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
Proteiacutenas de Membrana Externa
(IgM) Fase Aguda Fase Eruptiva
Punto de corte 042 043
Sensibilidad 765 824
Especificidad 618 618
VPP 6857 6667
VPN
697
7692
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
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bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
CONCLUSIONES
bull Los resultados de sensibilidad con antiacutegeno
crudo fue superior que PME en la deteccioacuten
de IgM
bull Con ELISA se obtiene resultados alentadores
por su buena sensibilidad siendo uacutetil como
prueba de tamizaje en estudios
epidemioloacutegicos
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
OBJETIVOS
bull Estandarizar la teacutecnica de Western blot
para la deteccioacuten de inmunoglobulinas
G especificas para Bartonella
bacilliformis
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
Metodologiacutea
Obtencioacuten de proteiacutenas de membrana
externa
Determinacioacuten de proteiacutenas
Electroforesis en gel de
Poliacrilamida con SDS
Inmunoelectrotrasferencia
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
Deteccioacuten de la Reaccioacuten Antiacutegeno
Anticuerpo
Determinacioacuten de sensibilidad y
especificidad
-Sueros Positivos con hemocultivo positivos en
ambos fases que es nuestra ldquoPrueba de Orordquo
Lima Caraz Huaraz Chimbote etc Sueros en
fase aguda y eruptiva 31
- Sueros negativos 31
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
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Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
M A N V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M=Marcador de amplio rango (192775 ndash 7441 kDa) A= Pool Fase
aguda N= Pool control negativo V= Pool Fase Eruptiva 1-6= Pacientes
en Fase aguda 7-12= Pacientes en Fase Eruptiva 13- 17= controles
Negativos
13 kDa 15 kDa
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
10062015
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011 May-Jun53(3)149-54
Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
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Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
PA= Pooled acute phase sera
PV= Pooled chronic phase sera
PN= Pooled negative
control sera
Results Act 6511 Western Blot using individual
Protein Antigens (Bands)
M W
Band
Sensibilidad Especificidad
65 kDa 763
(2938)
875
(2832)
12 kDa 421
(3136)
100
(3232)
13 kDa 263
(1038)
100
(3232)
M W
Band
Sensitivity Especifidad
65 kDa 861
(3136)
875
(2832)
12 kDa 888
(3236)
100
(3232)
13 kDa 416
(1536)
100
(3232)
Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase aguda Table 1 Sensibilidad y
Especifidad en fase cronica
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Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
10062015
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
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LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
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J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
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Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
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Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
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bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
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Cytokines and T-Lymphocute count in patients in the acute
and chronic phases of Bartonella bacilliformis infection in an
endemic area in peru a pilot study
Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano
N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca J Ventosilla P
Source IMT- AvH UPCH
Abstract This cross-sectional pilot study evaluated the
immunology patterns using pre- and post-treatment samples in
patients with Human Bartonellosis Patients between 5 and 60
years of age from endemic areas in Peru in the acute or chronic
phases were included In patients in the acute phase of
Bartonellosis a state of immune peripheral tolerance should be
established for persistence of the infection Our findings were
that elevation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and
numeric abnormalities of CD4(+) and CD8(+) T-Lymphocyte
counts correlated significantly with an unfavorable immune
state
Niveles de IL-10 (plasma)
Control Fase verrucosa Fase aguda0
30
60
90
120
150
IL-1
0 (
pg
ml)
(n = 9) (n = 8)
(n = 11)
Niveles de IFN-
gamma (plasma)
Control Fase
verrucos
a
Fase aguda 0
100
200
300
IFN
-ga
mm
a (
pg
ml)
ANALIZANDO LA RESPUESTA INMUNE
CELULAR DE PACIENTES CON Bartonella
bacilliformis
OTRAS
INVESTIGACIONES
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iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
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globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
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LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
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bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
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Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
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J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
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Grupo de trabajo del Laboratorio de
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bull Andreacute Rodriacuteguez
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bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
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INVESTIGACIONES
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bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
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bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
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J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
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Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
10062015
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
bull Villar S Torres L Merello J Henriquez C Palma S Manguia C Ventosilla P Cok J Guerra H Valencia R
Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
10062015
iquest A DOacuteNDE VAMOS
Diagnostico Potencial de Fase aguda
10062015
bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
bull Huarcaya E Best I Rodriguez-Tafur J Maguintildea C Soloacuterzano N Menacho J Lopez De Guimaraes D Chauca
J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
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Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P Bartonellosis 2009 Clinic in Dermatology 27 (3) pp 271-280
10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
Diagnostico Potencial de Fase aguda
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bull Separacioacuten por densidades de
globulos rojos infectados in vitro
con B bacilliformis resulta muy
complicado (imagen derecha)
bull Una separacioacuten por Cell-sorting
(FACS) resultariacutea mas adecuada
para validacioacuten tincioacuten NA
bull Paneles de frotis de eritrocitos
infectados (diferentes diluciones)
como referencia para validacioacuten
de Tincioacuten NA
bull Validacioacuten a partir de
Muestras de pacientes
diagnosticados Fase Aguda
usando HFC y tincioacuten NA
NA Naranja de acridina
HFC Hydroethidine-
Citometria de flujo
Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
bull Chamberlin et al han mostrado que la teacutecnica de inmunofluorescencia indirecta usando bacterias co-cultivadas con ceacutelulas VERO tienen una MAYOR sensibilidad que otras pruebas seroloacutegicas
bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
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J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
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Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
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Microbiologiacutea Experimental- IMT
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bull C Henriquez Espantildea
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bull Joseacute Chauca
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UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
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Implementacioacuten de una prueba de
inmunofluorescencia indirecta
bull No hay un kit comercial para el diagnostico de B bacilliformis por inmunofluorescencia indirecta (solo para otras Bartonellas)
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bull No hay estudios posteriores a Chamberlin que confirme las ventajas de su meacutetodo Una simplificacioacuten de su meacutetodo evitando el uso de irradiacioacuten con material radioactivo podriacutea simplificar su implementacioacuten
10062015
LITERATURA
bull Chaloner GL Ventosilla P Birtles RJ 2011 Multi-Locus Sequence Analysis Reveals Profound Genetic
Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
nellabartonella-bacilliformis-2379html
bull Maguintildea C Guerra H Ventosilla P 2011 Aspectos Microbioloacutegicos y Fisioloacutegicos de las Bartonellas En
Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
bull Maguintildea C Huarcaya E Ventosilla P Best I Soloacuterzano N Menacho J Loacutepez de Guimaraes D Rodriguez-
Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
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J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
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Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
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Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
bull C Henriquez Espantildea
bull Eric Huarcaya USA
bull Joseacute Chauca
bull Juan Rodriguez Taffur
UMSN
bull Palmira Ventosilla
bull Sandra Villar
bull Sandra Palma
bull Solorsano H Huaraz
LITERATURA
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Diversity among Isolates of the Human Pathogen Bartonella bacilliformis PLoS Negl Trop Dis 5(7) e1248
doi101371journalpntd0001248httpwwwlabomeorgtopicsorganismsbacteriagrambartonellaceaebarto
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Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capiacutetulo XVIII Joseacute Benigno
Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935
Primera edicioacuten 2011 San Borja Lima peruacute Pgs 271-273
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Tafur J 2011 Nuevos Aspectos Inmunoloacutegicos En Daniel A Carrioacuten Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y
Otras Bartonelas Capitulo XIX Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro Maguintildea Vargas Deposito Legal en la
Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San Borja Lima Peruacute Pgs 274-280
bull Maguintildea C Ventosilla P Huarcaya E Cok J Enriacutequez C 2011 Diagnoacutestico En Daniel A Carrioacuten
Biografiacutea la enfermedad de Carrioacuten y Otras Bartonelas Capitulo XXI Joseacute Benigno Pentildealoza Jarriacuten y Ciro
Maguintildea Vargas Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Peruacute Ndeg 2010-13935 Primera edicioacuten San
Borja Lima Peruacute Pgs 289-291
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J amp Ventosilla P 2011 Cytokines and T-lymphocyte count in Patients in the Acute and Chronic Phases of
Bartonella bacilliformis Infection in an Endemic Area in Peru a Pilot Study Rev Inst Med Trop Sao Paulo
53(3)149-154 May-June
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Infante B 2010 BALBc Mice resist infection with B bacilliformis BMC Research Notes 2010 Nov 1(1)
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10062015
Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
bull Andreacute Rodriacuteguez
bull Benedicta Larotta
bull Ciro Maguintildea
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UMSN
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Grupo de trabajo del Laboratorio de
Microbiologiacutea Experimental- IMT
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bull Benedicta Larotta
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UMSN
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