INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

INFORME FINAL DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Y PROPUESTA DE ESTUDIO

PROYECTO No. 20070120.

“EEVVAALLUUAACCIIOONN DDEE LLAA TTOOXXIICCIIDDAADD DDEE CCEEPPAASS DDEE BBaacciilllluuss tthhuurriinnggiieennssiiss

SSOOMMEETTIIDDAASS AA UUNN PPRROOCCEESSOO DDEE MMUUTTAAGGEENNEESSIISS AALL AAZZAARR.” Reynosa, Tamaulipas, a 28 de Enero del 2007.

“EEVVAALLUUAACCIIOONN DDEE LLAA TTOOXXIICCIIDDAADD DDEE CCEEPPAASS DDEE BBaacciilllluuss tthhuurriinnggiieennssiiss

SSOOMMEETTIIDDAASS AA UUNN PPRROOCCEESSOO DDEE MMUUTTAAGGEENNEESSIISS AALL AAZZAARR.. ””

RESUMEN:

El objetivo principal del proyecto fue evaluar el efecto de la radiación ultravioleta sobre las

esporas de Bacillus thuringiensis con la finalidad de visualizar el efecto fenotípico de las células

bacterianas y la acción bioinsecticida de las inclusiones proteicas producidas bajo esta

condición. La bacteria Bacillus thuringiensis (Bth) es una alternativa ecológica para reducir el

daño de insectos plaga través de un metabolito producido al final de su ciclo de vida. El

complejo espora y cristal ó δ-endotoxina presenta un efecto toxico contra insectos plaga de

diversos ordenes. Estos productos bacterianos son aplicados en campo mediante aspersiones

foliares sobre las áreas a proteger, factor que hace que el complejo sea expuesto a la radiación

solar. Diversos trabajos establecen que los cristales proteicos son inactivados bajo esta

condición disminuyendo o cesando la actividad bioinsecticida. Existe muy poca información

publicada acerca del efecto biológico de la radiación UVC sobre las esporas de este

microorganismo. Esta información es gran importancia dentro del control de insectos plaga

mediante el uso de entomopatógenos microbianos, debido a que estos agentes deben de cumplir

ciertas características para que sean considerados efectivos, y una de ellas es que sea capaz de

causar epizootias entre la población de insectos plaga, por lo que deben ser ambientalmente

mas estables. Nosotros nos enfocamos a evaluar la toxicidad de la cepa 4L1 de B. thuringienis

sujeta a un proceso de mutagénesis por acción de la LUV, evaluándola contra una colonia de

insectos bajo condiciones de laboratorio tomando como referencia de comparación a la cepa

nativa. Dentro de los resultados obtenidos observamos un incremento en la biomasa celular

húmeda y el complejo espora cristal obtenido en los cultivos expuestos a la LUV,

incrementándose de en comparación con la cepa nativa un 21 a un 111% dependiendo del

tiempo de exposición a la fuente de luz. Los extractos espora cristal fueron incorporados a la

dieta artificial del insectos a dosis de 50g/ ml de dieta. La cepa nativa ocasiono un 85% de

mortalidad de la colonia de insectos, mientas que las cepas expuestas a una fuente de LUV en

intervalos de 10, 20, 30, 40, 50 y 60 minutos ocasionaron una mortalidad del 60, 63, 50, 35 65 y

38% respectivamente. Mediante este estudio se aprecia que la exposición de las esporas a una

fuente de LUV tiene un efecto positivo en el desarrollo celular de las células de Bacillus

thuringiensis reflejado en una mayor cantidad del complejo espora cristal obtenido, sin embargo

la toxicidad de las proteínas cristalinas de Bacillus thuringiensis se ve afectada disminuyendo la

mortalidad en un orden del 25 al 47% de mortalidad en relación a la cepa nativa

INTRODUCCIÓN:

Desde los inicios de la agricultura las civilizaciones sufrieron frecuentemente la devastación de

sus cosechas por los ataques de las plagas de insectos. Ante esta situación, el hombre fue

desarrollando algunas estrategias para su control y es así que desde hace algunos siglos los

chinos utilizaron hormigas para proteger sus huertas de cítricos contra gusanos, avispas y otros

insectos. Ya en el siglo XIX, científicos europeos y norteamericanos emplearon depredadores

naturales (catarinas y avispas) y patógenos (hongos) para proteger cultivos y bosques,

obteniendo resultados muy alentadores. Estas investigaciones perdieron importancia entre 1930

y 1940 al descubrirse los insecticidas químicos: compuestos que originalmente fueron

concebidos como armas químicas; como resultaron ser mucho más rápidos, baratos y con un

espectro de acción más amplio que los enemigos naturales de los insectos, su uso se extendió

rápidamente hasta llegar ha constituirse en una herramienta imprescindible de la agricultura

moderna. Si bien los insecticidas químicos han permitido un control eficaz de las plagas, se ha

establecido que estos compuestos son altamente perjudiciales para la salud humana y los

ecosistemas; además, por su persistencia en el medio ambiente, favorecen la selección de

insectos plaga resistentes a ellos, lo que ha motivado el uso de dosis cada vez mayores o de

productos cada vez más tóxicos. Esto ha generado mucha preocupación en el ámbito mundial y

actualmente se trabaja para limitar la aplicación de los insecticidas químicos y promover el

manejo integrado de plagas que incluye otras formas de control, efectivas y menos

contaminantes, tales como trampas, plásticos y el control biológico. Existen diferentes

alternativas a los métodos químicos, como por ejemplo el uso de biopesticidas, enmiendas

orgánicas, plantas resistentes a determinados patógenos, plantas micorrizadas, rotación de

cultivos, entre otras Dichas alternativas no son excluyentes, por el contrario, una combinación de

ellas de manera correcta podría llevar a un control económicamente aceptable para la mayoría

de los cultivos.

Los biopesticidas son productos que contienen un microorganismo como ingrediente activo o

bien se extraen de un ser vivo mediante procedimientos que no alteran su composición química.

Pueden estar constituidos por toda o una parte de la sustancia extraída, concentrada o no,

adicionada o no a sustancias coadyuvantes (DE LIÑAN, 2001). Esta estrategia de control

contempla la manipulación intencional de las poblaciones de los enemigos naturales de los

insectos plaga para limitar su población, así como el uso de algunos agentes microbianos

entomopatógenos.

La biotecnología ofrece varias alternativas para el control biológico, que van desde el uso de

reactores para la producción masiva de microorganismos silvestres y modificados

genéticamente, con un margen más amplio o mayor virulencia que los silvestres, hasta el uso de

plantas modificadas genéticamente y resistentes al ataque de algunos insectos. Dentro de los

productos biotecnológicos de este tipo, están las formulaciones comerciales de algunos

microorganismos conocidos como bioinsecticidas e incluyen a diferentes géneros y especies de

bacterias, hongos, nemátodos y virus. Estos microorganismos, denominados entomopatógenos,

son específicos: afectan sólo a determinados grupos de insectos y son inofensivos para insectos

benéficos, humanos y otros organismos superiores.

Un requisito importante para el uso de un microorganismo como agente de control es su

producción masiva a bajo costo, llevar a cabo la búsqueda de cepas nativas mas potentes y con

mayor estabilidad a las factores bióticos del campo una vez aplicadas las formulaciones del

biopesticida.

Los Agentes Microbianos de Control Plagas, como los productos de varias subespecies Bacillus

thuringiensis, cada vez más son usados en programas control de insectos plaga de importancia

agrícola, forestal y medica.

Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis (Bt) representa el mayor volumen de los

bioinsecticidas producidos en el ámbito mundial.

Bacillus thuringiensis produce una serie de proteínas cristalíferas la cuales presentan un efecto

toxico contra la mayoría de los ordenes de la clase Insecta en la etapa larval, tales como

lepidópteros, dípteros y coleópteros. Los cristales son protoxinas que al ser ingeridas por el

insecto son solubilizadas y procesadas por proteasas en el tracto digestivo. Las proteínas

procesadas son toxinas que se unen a receptores específicos en el epitelio del intestino y actúan

como otras enterotoxinas.

Las proteínas cristalíferas, llamadas Cry, están codificadas en plásmidos y se producen durante

el proceso de esporulación. Los plásmidos pueden perderse por el efecto de las condiciones del

proceso, en particular algunos genes Cry, lo que modificaría a su vez la proporción de las

diferentes proteínas que forman el cristal y por lo tanto su solubilidad y toxicidad. Las esporas de

Bacillus thuringiensis no están directamente involucradas en la toxicidad, pero contribuyen a la

mortandad del insecto, por lo que la mayoría de las preparaciones comerciales de Bacillus

thuringiensis incluyen proteínas Cry y esporas.

A escala industrial el método de producción de Bacillus thuringiensis involucra el cultivo por lote.

Experimentalmente, en cultivo por lote alimentado o en cultivo continuo, se ha logrado un

incremento considerable de biomasa y esporas; sin embargo, la actividad insecticida obtenida,

normalizada por la biomasa, es baja comparada con los cultivos en lote, lo que ha demostrado

que no existe una relación directa entre la cuenta total de esporas y la producción de Cry. Otro

de los problemas relacionados a este microorganismo y que disminuyen la efectividad de de esta

bacteria en campo son falta de adherencia de la bacteria sobre el cultivo a proteger debido a la

perdida por lavado (lluvia) y la inactivación de las toxinas por acción de la radiación ultravioleta

de la radiación solar. Se ha reportado la disminución o in inactivación de las proteínas cry por

acción de la luz solar. Sin embargo no se ha reportado el efecto que provoca la radiación solar

sobre las esporas de Bacillus thuringiensis. Esto es una información relevante que tendrá que

ser objeto de estudio debido a que para llevar a cabo la aplicaron de esta clase de productos en

campo para llevar a cabo su protección contra insectos plaga se lleva acabo la aplicación de

complejos espora cristal de B.t. Por lo que seria importante ver el efecto biológico que provoca la

radiación Ultravioleta sobre las esporas,, ya que se encontrar alguna variante de esta cepa con

esporas resistentes a este tipo de radiación, podremos llevar a cabo la protección del cultivo una

vez que estas esporas sean ingeridas y sean capaces de germinar en el interior del intestino el

insecto, por lo que una vez pasado del estadio de resistencia(espora) al estadio vegetativo, este

será capaz de llevar a cabo la síntesis de novo de proteínas cry para de esta manera poder

controlar a la colonia de insectos plaga.

Bajo este contexto, nos enfocamos a estudiar el efecto biológico de la radiación UV sobre las

esporas (cuerpos de resistencia) de esta bacteria y ver si es posible encontrar una variante

resistente a este tipo de radiación y ver si además presenta un efecto positivo con relación a su

entopatogencidad para de esta manera seleccionar alguna cepa con un elevado potencial para

llevar cabo el control de insectos plaga.

HIPOTESIS:

La exposición de esporas de Bacillus thuringiensis a una fuente de radiación Ultravioleta induce

un efecto biológico positivo sobre el microorganismo, incrementando la toxicidad contra una

colonia de insecto plaga

OBJETIVO GENERAL: . Evaluar la toxicidad de un cepa de Bacillus thuringiensis sometida a un proceso de mutagénesis

clásica sobre una colonia de insectos plaga criados bajo condiciones de laboratorio.

OBJETIVO ESPECIFICOS:

1. Evaluar la productividad de la biomasa y del complejo espora cristal obtenido a partir de

las células tratadas con respecto a la cepa nativa.

2. Evaluar la entotoxicidad de las células tratadas con una fuente de radiación ultravioleta

con respecto a la cepa nativa contra una colonia de insectos.

METODOLOGIA: Activación de las Cepas.- Las cepa 4L1 de B. thuringiensis fue reactivada sembrándola sobre placas de agar nutritivo

mediante el estriado cerrado en tamiz con la finalidad de cubrir toda la superficie del agar y

generar lo máximo de biomasa celular por unidad de superficie. Las placas fueron incubadas a

30ºc por espacio de 120 horas hasta obtener un cultivo cien porciento esporulado.

Inducción de la Mutagénesis.-

Una vez teniendo el material biológico (cepa 4L1 de B.th) en la fase esporulada, se inocularon 14

placas de agar nutritivo en cuatro cuadrantes. Los tratamientos a evaluar fueron 7 tiempos de

exposición (por duplicado) a la fuente de radiación UVC (0, 10, 20, 30, 40, 50 y 60 minutos). En

el interior de una campana de flujo laminar, las placas fueron expuestas de manera directa a la

fuente de UVC (265 nm) de manera directa a una distancia de 10 centímetros y dosificando cada

tratamiento con intervalos de 10 minutos entre un tratamiento y otro. Las placas fueron

incubadas a 30ºc durante 24 horas. Transcurrido el tiempo de incubación, las colonias

desarrolladas fueron resembradas de manera individual en placas con agar nutritivo y tres tubos

con agar nutritivo inclinado, para monitorear la formación de esporas y cristales, así como para

mantener un cepario de trabajo. De cada tratamiento se selecciono un ejemplar tomando como

parámetro de selección el tiempo de producción de las inclusiones cristalinas y de la espora. El

stock de cepas fue almacenado a 4ºc hasta el momento de la evaluación biológica.

Propagación de las variantes desarrolladas.

Posteriormente cada una de las cepas a evaluar fue activada en un tubo con agar inclinado e

incubado a 30ºc por 18 horas. Transcurrido el tiempo de incubación, el material biológico se

utilizo como semilla de inoculación de tubos con 10 ml de caldo triptosa fosfato, los cuales se

incubaron 30ºc por espacio de 18hr agitando el cultivo a 200 rpm (Lab-Line® Incubator-Shaker).

Finalmente el cultivo obtenido fue utilizado para inocular al 1%, un litro del caldo melaza- harina

de soya constituido de 20g de harina de soya, 10 ml de melaza, 10 ml de líquido de remojo de

maíz y 1gr de carbonato de calcio ajustado a un pH 7. Los cultivos fueron incubados a 30ºc

manteniendo una agitación de 200 rpm hasta obtener un cultivo en proceso de esporulación en

donde las células estén esporuladas en una proporción del 80%. Una vez que la cepa nativa (no

expuesta a la radiación UVC) alcanza esta condición, los cultivos son sacados del proceso de

incubación para finalmente ajustar el pH del medio a 7. La biomasa fue cosechada mediante centrifugación a 4ºc y 10000 rpm por espacio de 30

minutos. El paquete obtenido fue pesado y se registró la biomasa obtenida por litro de medio de

cultivo.

Obtención del complejo espora-cristal

Las cepas de cada uno de los tratamientos se activaron durante 18 horas en tubos con agar

inclinado a un pH 7.0. Transcurrido el proceso de incubación se tomo una carga abundante para

inocular 50 ml de caldo triptosa fosfato (CTP) en matraces Erlen Meyer de 250 ml. Los matraces

se mantuvieron en agitación a 200 rpm., a 30ºC por 18 horas. Del medio CTP se tomó 10 ml

para realizar la inoculación de 1 lt. de medio base de melaza (melaza 20g/l, harina de soya 20g/l,

líquido de remojo de maíz 10 g/l y carbonato de calcio 1 g/l) a pH de 7.0-7.2, en matraces Erlen

Meyer de 1 litro con agitación a 200 rpm a 30ºC.

Para la recuperación del complejo espora-cristal, el medio de cultivo se sometió a centrifugación

a 10,000 rpm durante 30 min y se determinó el peso del precipitado mediante la siguiente

ecuación: PP= P1-P2 donde; P1 (peso 1) corresponde al peso del bote más el medio de cultivo, P2

(peso 2) corresponde al peso del precipitado en el bote y PP (peso del precipitado) corresponde

al peso del precipitado obtenido de la diferencia de los pesos.

Para obtener el complejo espora- cristal se realizo una co- precipitación Lactosa- Acetona

(Dulmage, 1970). Para obtener el volumen de lactosa al 5% necesario para la co-precipitación,

se realizó mediante el uso de factores ya determinados de la siguiente manera: el PP se

multiplicó por un factor de 1.71 y al volumen obtenido de lactosa se le sumó el PP. De esta

manera, se obtuvo el volumen total, esta cantidad se multiplicó por un factor de 3.34 para

obtener el volumen de lactosa (Dulmage, 1970). El precipitado (PP) se colocó en un vaso de

precipitado con el volumen calculado de lactosa y se mantuvo en agitación durante 30 min.

Transcurrido el tiempo de adiciono lentamente el volumen de acetona calculado y se continuo el

proceso de agitación por 30 minutos mas. Posteriormente se dejó reposar por 10 min. Toda la

mezcla se filtró al vacío en un matraz Kitasato utilizando papel Whatman #1, el precipitado se

lavó con tres volúmenes de acetona. El filtrado se dejó secar y se trituró finamente con un

mortero y se guardó en frascos herméticos hasta su utilización.

Bioensayos de toxicidad contra larvas de Spodoptera frugiperda.

Una vez obtenido el complejo espora-cristal de cada una de las colonias de B. thuringiensis, se

realizaron bioensayos en el laboratorio para verificar si esta bacteria entomopatógena mostraba

algún efecto tóxico contra larvas neonatas de Spodoptera frugiperda, del pie de cría establecida

en el laboratorio de Biotecnología Ambiental, del CBG.

Para los ensayos se utilizó una concentración baja de 50 µg/ml y una concentración alta de 500

µg/ml del extracto de B. thuringiensis. Se preparó una solución stock utilizando 250 mg de

extracto y se aforo a un volumen de 50 ml con agua destilada para obtener una solución

concentrada de 5000 µg/ml. De la solución stock se tomaron 12.5 ml los cuales se incorporaron

a 112.5 ml de dieta para obtener una concentración de 500 µg/ml de dieta y 1.25 ml más 11.25

ml de agua destilada se incorporaron a 112.5 ml de dieta para obtener la concentración de 50

µg/ml de dieta. Se utilizaron copas del número cero con dieta artificial para cada una de las

concentraciones, en las cuales se colocó una larva neonata, las copas fueron cerradas con tapas

de plástico y colocadas en bolsas de papel y se incubaron a 28ºC y 65±5% de H. R. Se probaron

un total de 75 larvas para cada concentración y extracto de B. thuringiensis. Como testigo

negativo se utilizaron copas con dieta sin extracto de B. thuringiensis y se registró la mortalidad

al termino de 7 días.

RESULTADOS Y DISCUSIONES. Activación de las Cepas

La cepa 4L1 de Bacillus thuringiensis fue utilizada para evaluar el efecto de la radiación

ultravioleta sobre las esporas. El cultivo fue inoculado en placas de agar nutritivo sembradas en

forma de tamiz. Las cepas fueron incubadas en una atmósfera de 30ºc hasta obtener un cultivo

100% esporulado.

Inducción de la Mutagénesis.-

Obtenido el material de partida para realizar los bioensayos, se evaluaron 7 tratamientos

diferentes de exposición a la radiación ultravioleta del rango de 265nm por duplicado. Las

esporas del microorganismo fueron sembradas por estriado en 3 cuadrantes y fueron expuestas

a la fuente de radiación de manera directa a 30 centímetros de distancia a dosis de 0, 10, 20, 30,

40, 50 y 60 minutos. Los tratamientos fueron incubados a 30ºc durante 24 horas.

Selección de Cepas Sobreproductoras Quitinasas.-

Transcurrido el tiempo de incubación 3 clonas fueron seleccionadas y resembradas en una placa

y en un tubo con agar nutritivo como fuente de trabajo y de mantenimiento del cepario. Los

cultivos fueron nuevamente incubados bajo las misma condiciones hasta la obtención del cultivo

esporulado. Para ello fue monitoreado el proceso de esporulación y de la síntesis de las

inclusiones cristalinas de proteínas cry, observando que al cabo de las 48 horas la totalidad de

los tratamientos iniciaron el proceso de esporulación celular y síntesis de producción del se

presento a las 78 horas posterior a la incubación de las placas. Un total de dieciocho variantes y

3 cepas nativas conformo el stock biológico de estudio.

Obtención del complejo espora-cristal

Para llevar a cabo la obtención del complejo espora- cristal de la cepa nativa y de los diferentes

tratamientos las cepas fueron activadas en tubos con agar inclinado e incubadas a 30ºc por

espacio de 18 horas. Transcurrido el tiempo de incubación, se escalo el proceso mediante la

inoculación de medio de cultivo líquido (Caldo Triptosa Fosfato) atizando el cultivo anterior como

fuente de inoculo. Los caldos fueron incubados a 30ºc, y 200 r.p.m. por un periodo de 18 horas.

Posteriormente esta cultivo se utilizad con semilla para llevar a cabo la inoculación del cultivo de

obtención del complejo espora cristal. Un litro de medio de melaza fue utilizado para llevar a

cabo la obtención del complejo. Inoculados los medios, estos fueron incubados a 30ºc y 200 rpm

hasta la obtención del complejo espora cristal. El proceso de fermentación a nivel matraz fue

monitoreado cada 6 horas sobre el tratamiento de la cepa nativa (0 horas) con la finalidad de

observar el proceso de esporulación. Una vez iniciado el proceso de esporulación, los tiempos

de monitoreo fueron acortados a 3 horas. Una vez observado el 80% de las células en proceso

de esporulación y antes de que se de la lisis de estas. El proceso de incubación es detenido con

la finalidad de obtener la biomasa microbiana y obtener el extracto del complejo espora cristal.

EL pH del medio de cultivo es ajustado a 7.0 y el material es centrifugado a 10,000 rpm a 4ºC

por espacio de 30 minutos. La biomasa del paquete celular obtenido y la productividad se

encuentra registrada en la tabla No. 1.

Tabla No. 1.- Biomasa y Rendimiento celular obtenido por litro de cultivo.

BBiioommaassaa ((ggrr)) RReennddiimmiieennttoo ((%%))

0 29.43 100

10 58.87 200.03 20 56.02 190.35 30 59.69 202.82 40 62.23 211.45 50 35.76 121.51 60 54.36 184.71 70 55.42 188.31 80 52.61 178.76

Analizando los resultados concentrados en la tabla No. 1, se de manera general se pudo

observar que la exposición de las esporas a la fuente de radiación ultravioleta del rango de los

265 nm, indujo un efecto positivo en las células de Bacillus thuringiensis, incrementando el

volumen de biomasa celular obtenido en comparación con la cepa nativa (tiempo 0 min.) en un

rango que oscila del 21.51 al111.45 % mas.

Una vez obtenido la biomasa, se procedió a obtener los complejos espora cristal mediante el

protocolo descrito por Dulmage (1970). La cantidad del extracto espora- cristal obtenido se

concentra en la Tabla No. 2.

Tabla No. 2.- Cantidad y Rendimiento del extracto obtenido por litro de cultivo.

EExxttrraaccttoo ((ggrr)) RReennddiimmiieennttoo ((%%))

0 6.15 100

10 10.12 164.59 20 10.00 162.64 30 10.18 165.53 40 10.47 170.28 50 8.89 144.55 60 10.91 177.39 70 10.77 175.18 80 9.93 161.56

El efecto positivo que se observo en los datos concentrados en la tabla 1, se reproduce en los

datos concentrados en la tabla dos, incrementándose el rendimiento del extracto obtenido en

relación a la cepa nativa (tiempo de exposición de 0 min.) en un rango del 44.55% al 77.39%

Bioensayos de toxicidad contra larvas de Spodoptera frugiperda.

La evaluación biológica de cada uno de los 7 tratamientos fue evaluada mediante la

incorporación de cada extracto en la dieta merídica del Insecto. Los extractos fueron

incorporados a dos dosis diferentes, una dosis alta (500 g/ml) y una dosis baja (50g/ml) y la

mortalidad fue registrada a las 24 horas y 7 días después de iniciado el bioensayo.

La cepa nativa origino una mortalidad del 85% a los 7 días de exposición, la mortalidad generada

por las cepas irradiadas decreció en un orden del 22 al 50 porciento cuando fueron sometidas a

la dosis de 50g/ml.

Los datos de la mortalidad ocasionada para cada una de las cepas y para cada dosis se

concentran en la tabla No. 3.

Tabla No. 3.- Evaluación del efecto toxico de la cepa nativa y las variantes de Bacillus

thuringiensis contra Spodoptera frugiperda bajo condiciones de laboratorio.

50 g/ml 500 g/ml

MMoorrttaalliiddaadd aa llaass 2244

hhrrss ((%%))

MMoorrttaalliiddaadd aa llooss 77

ddííaass ((%%))

MMoorrttaalliiddaadd aa llaass 2244 hhrrss

((%%))

MMoorrttaalliiddaadd aa llooss 77

ddííaass ((%%))

00 53 85 100 100

1100 32 60 89 100

2200 28 63 93 100

3300 22 50 84 93

4400 13 35 75 89

5500 35 65 92 100

6600 37 38 90 100

De los datos concentrados en la tabla No.3, podemos apreciar que la mortalidad generada por

cada uno de los tratamientos que la mortalidad se incrementa generada por la dosis de 500g/ml

es elevada con relación a la mortalidad provocada a una dosis de 50g/ ml, además de que la

mortalidad generada a las 24 horas como a los 7 días es muy cercana al 100% excepto para la

variante sometida a una exposición a la fuente de luz ultravioleta de 40 minutos.

Con relación a la mortalidad generada a ua dosis del 50g/ml, se puede apreciar que la

mortalidad generada por la cepa nativa (0 min.) es mayormente mas elevada que la generada

por las variantes irradiadas, disminuyendo la mortalidad provocada por estas ultimas en un orden

del 15 al 47 porciento a los siete días de evaluación. Así también se pudo observar que la

mortalidad generada a las 24 horas es significativamente inferior a la obtenida a los 7 días de

evaluación. En relación a la toxicidad, de manera general podemos apreciar que la exposición

de las esporas a una fuente de radiación ultravioleta de 265 nm de longitud de onda tiene un

efecto ligeramente negativo sobre la toxicidad generada contra Spodoptera frugiperda a una

dosis baja.

CONCLUSIONES.

Al terminar la parte experimental del presente proyecto pudimos concluir:

1. La acción de la Luz ultravioleta presenta un efecto positivo sobre el rendimiento y

producción de biomasa húmeda y del extracto de la cepa 4L1 de Bacillus thuringiensis

incrementándose la cantidad de cada uno de los productos

2. Sin embargo tuvo un ligero efecto negativo en relación a la toxicidad generada sobre una

colonia de Spodoptera frugiperda a una dosis de 50g/ml y bajo condiciones de

laboratorio.

3. Aunque la mortalidad de la cepa nativa como de las variantes irradiadas es cercana al

100% a la dosis de 500 g/ml, esto no es indicador que las cepas de Bacillus

thuringiensis efectivas como agentes de biocontrol, ya que operacionalmente la

concentración es muy elevada y los costos de producción del ingrediente activo serian

elevados.

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