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Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Departamento de Ingeniería Bioquímica
“INFLUENCIA DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS
EN LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE HIDROLIZADO
PROTEICO OBTENIDO DE SEMILLA DE GARBANZO
(Cicer arietinum L.)”.
PROYECTO DE INVESTIGACION T E S I S
Que para obtener el Título de Ingeniero Bioquímico.
P R E S E N T A
Liliana Santiago Rico
Directores Dra. Cristian Jiménez Martínez
Dra. Xariss Miryam Sánchez Chino
CDMX, Mayo 2019
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Compuestos
Bioactivos del Departamento de Ingeniería Bioquímica de la Escuela
Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, bajo
la dirección de la Dra. Cristian Jiménez Martínez y la Dra. Xariss
Miryam Sánchez Chino y contó con el financiamiento del proyecto
SIP 20181003 “Efecto de la germinación de amaranto sobre la
capacidad hipogluceminate e hipolipidémica".
AGRADECIMIENTOS
“Buscar el logro de buena ley; no seaís un bufón que hace sonar sus cascabeles. La razón y
el verdadero sentimiento se expresan ellos mismos con escaso artificio; y si deseaís decir
alguna cosa de importancia, ¿Qué necesidad teneís de ir a la caza de palabras?”…
Fausto, J.W. Goethe.
Trato de encontrar qué artificios son los adecuados para expresar lo agradecida que estoy
de escribir esta dedicatoria, pero nada me satisface. Llegar a este punto significa que he
concluido una tarea que tenía asignada desde hace muchísimo tiempo (más del que jamás
admitiré), el cual no pude conseguir sin la ayuda de las siguientes personas:
Mis padres y hermana, por mantener todo el tiempo mis pies en la tierra, casi siempre con
palabras muy duras (como decía Oscar Wilde: “Un amigo es aquel que te apuñala de frente”),
pero con efectos saludables si se tiene el criterio de entender su trasfondo de bondad y
bienestar.
Ellos son los que se encargaban más que nadie de recordarme el camino y los objetivos que
tenemos como familia. Así que gracias, por tanto.
Mis abuelos por ser exactamente lo que se espera de estos seres: todo amor y paciencia.
Mis amigos Diana, Ulises, José y Cuauhtémoc por su valiosa compañía en los momentos de
alegría, aunque más importante, en las ocasiones más devastadoras de mis 25 años. Y por
tolerarme (porque esa es la palabra).
La Doctora Cristian por su paciencia conmigo. Y por confiar en mi promesa de entregarle un
trabajo terminado y bien hecho (eso último me gusta pensar). Me costó mucho esfuerzo y
también muchas veces pensé en renunciar, sólo su buen talante me daba ánimos.
La Doctora Xariss por sus amables comentarios y su disposición en revisar mi escrito, pues
el tiempo no es algo que se pueda devolver de ninguna manera; lo mismo para mis sinodales,
que han aceptado de buen grado ser testigos de este acontecimiento.
i
CONTENIDO
ÍNDICE DE CUADROS ........................................................................................................ iv
ÍNDICE DE FIGURAS ...........................................................................................................v
RESUMEN ........................................................................................................................... 1
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 3
ESTRÉS OXIDATIVO ....................................................................................................... 6
MOLÉCULAS ANTIOXIDANTES ...................................................................................... 6
COMPUESTOS FENÓLICOS ....................................................................................... 7
PRODUCCIÓN DE HIDROLIZADOS PROTEICOS CON FUNCIONALIDAD BIOLÓGICA
(PÉPTIDOS BIOACTIVOS) ............................................................................................ 10
HIDROLIZADOS PROTEICOS ................................................................................... 10
CLASIFICACIÓN Y FUNCIONALIDAD DE HIDROLIZADOS PROTEICOS ................ 11
PÉPTIDOS BIOACTIVOS ........................................................................................... 12
PÉPTIDOS ANTIOXIDANTES .................................................................................... 12
MECANISMO DE ACCIÓN DE PÉPTIDOS ANTIOXIDANTES ................................... 13
MÉTODOS DE OBTENCIÓN DE PÉPTIDOS ANTIOXIDANTES ................................ 14
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA ......................................................................................... 14
INTERACCIONES PROTEÍNA-FENÓLICOS ................................................................. 16
CONSECUENCIAS NUTRICIONALES ....................................................................... 20
EXTRACCIÓN, ANÁLISIS Y EFECTOS DE SEPARAR LOS COMPUESTOS
FENÓLICOS ............................................................................................................... 20
LEGUMINOSAS ............................................................................................................. 21
BENEFICIOS DEL CONSUMO DE LEGUMINOSAS ...................................................... 22
GARBANZO ................................................................................................................... 22
COMPOSICIÓN QUÍMICA .......................................................................................... 23
CARBOHIDRATOS ..................................................................................................... 23
LÍPIDOS...................................................................................................................... 24
ii
OTROS COMPONENTES .......................................................................................... 24
COMPUESTOS NO NUTRICIONALES....................................................................... 24
PROTEÍNAS ............................................................................................................... 25
ANTECEDENTES .............................................................................................................. 28
JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................ 30
OBJETIVOS ....................................................................................................................... 31
OBJETIVO GENERAL .................................................................................................... 31
OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................................... 31
MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................................. 31
OBTENCIÓN DEL CONCENTRADO PROTEICO DE SEMILLA DE GARBANZO (CPG) 32
ANÁLISIS QUÍMICO PROXIMAL DE LA HARINA Y CONCENTRADO PROTEICO DE LA
SEMILLA DE GARBANZO ............................................................................................. 32
EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS AL CPG ............................................. 33
DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS AL CPG Y CPGr ......................... 33
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL CPG Y CPGr ............................................................... 34
DETERMINACIÓN DE GRADO DE HIDRÓLISIS ........................................................... 34
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA SOLUBLE POR EL MÉTODO DEL ÁCIDO
BICINCONÍNICO (BCA) ................................................................................................. 34
DETERMINACIÓN DEL PERFIL ELECTROFORÉTICO ................................................ 35
EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE ............................................................ 36
ABTS·+ ........................................................................................................................ 36
DPPH .......................................................................................................................... 37
ANÁLISIS ESTADÍSTICO ............................................................................................... 37
DESARROLLO EXPERIMENTAL ...................................................................................... 38
RESULTADOS Y DISCUSIONES ...................................................................................... 40
OBTENCIÓN DEL CPG .................................................................................................. 40
ANÁLISIS QUÍMICO PROXIMAL ................................................................................... 41
DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS TOTALES ................................... 44
iii
DETERMINACIÓN DEL GRADO DE HIDRÓLISIS ......................................................... 45
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA SOLUBLE ............................................................... 48
DETERMINACIÓN DEL PERFIL ELECTROFORÉTICO ................................................ 50
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE ......................................................................................... 52
CONCLUSIONES .............................................................................................................. 57
REFERENCIAS ................................................................................................................. 58
iv
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Productos comerciales e ingredientes con función en la salud basada en
péptidos bioactivos............................................................................................................. 10
Cuadro 2. Calidad de la proteína de la semilla de garbanzo crudo ..................................... 26
Cuadro 3. Contenido de aminoácidos en la semilla de garbanzo. ...................................... 27
Cuadro 4. Rendimiento en la extracción de la proteína por lote ......................................... 40
Cuadro 5. Composición proximal de la harina y el concentrado proteico (g/100g) en base
seca ................................................................................................................................... 42
Cuadro 6. Concentración de compuestos fenólicos en CPG y CPGr ................................. 44
Cuadro 7. Curva de hidrólisis enzimática del concentrado proteico .................................... 47
Cuadro 8. Proteína Soluble en CPG y CPGr ...................................................................... 49
Cuadro 9. Actividad antirradical DPPH en el CPG y CPGr ................................................. 54
Cuadro 10. Actividad antioxidante empleando la técnica del radical ABTS en el CPG y
CPGr .................................................................................................................................. 55
v
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Modelo hipotético de la reacción en cadena de radicales libres. ........................... 3
Figura 2. Modelo hipotético de la generación de EROs. ....................................................... 5
Figura 3. Estructura básica de los flavonoides. .................................................................... 7
Figura 4. Subclases de flavonoides. ..................................................................................... 8
Figura 5. Interacción proteínas-polifenoles. .......................................................................... 9
Figura 6. Estructura de los principales aminoácidos relacionados con la actividad
antioxidante en péptidos. ................................................................................................... 14
Figura 7. Hidrólisis enzimática de proteínas ....................................................................... 15
Figura 8. Oxidación de catecol como prerrequisito para la formación de productos de
reacción. ............................................................................................................................ 18
Figura 9. Diferentes perfiles de reacción. ........................................................................... 19
Figura 10. Tipos de garbanzo ............................................................................................ 23
Figura 11. Flavonoides en el garbanzo. ............................................................................. 25
Figura 12. Complejo BCA-Cu. ............................................................................................ 35
Figura 13. Diagrama del desarrollo experimental ............................................................... 38
Figura 14. Curvas de hidrólisis del concentrado proteico de C. arietinum L........................ 46
Figura 15. Proteína soluble en CPG y CPGr ...................................................................... 49
Figura 16. Perfil electroforético de CPG. ........................................................................... 51
Figura 17. Perfil electroforético de CPGr. ........................................................................... 51
Figura 18. Determinación de la capacidad antioxidante por la técnica de DPPH ................ 53
Figura 19. Determinación de la capacidad antioxidante por la técnica del radical ABTS .... 53
Figura 20. Capacidad antioxidante para cada hidrolizado del CPG .................................... 56
Figura 21. Capacidad antioxidante para cada hidrolizado del CPGr ................................... 56
1
RESUMEN
El concepto de estrés oxidativo surgió en el año 1985, y se define como “una situación de
desbalance con un aumento o disminución de especies oxidantes”. En el organismo humano
se generan especies reactivas de oxígeno como resultado del metabolismo; sin embargo,
cuando la cantidad de estas especies reactivas sobrepasa los niveles normales pueden tener
un efecto dañino, causando la oxidación de macromoléculas como proteínas, ácidos
nucleicos y lípidos de membranas, lo cual provoca un funcionamiento celular anormal y cerca
de 100 enfermedades diferentes, incluyendo aterosclerosis, artritis, isquemia, repercusión en
tejidos, lesión del sistema nervioso central, gastritis, cáncer, así como envejecimiento
prematuro, niveles de glucosa y colesterol elevados. El cuerpo humano cuenta con diversas
líneas internas (enzimas como la glutatión peroxidasa, catalasa, superóxido dismutasa,
glutatión reductasa, entre otras) y externas de defensa contra los radicales libres. Finalmente
destacan diversos antioxidantes dietarios de bajo peso molecular como la vitamina E,
carotenoides, compuestos fenólicos, clorofilas, ácido ascórbico, entre otros, que tienen la
habilidad de reaccionar con los radicales libres mediante diversos mecanismos, dando lugar
a especies químicas menos reactivas y dañinas.
En términos de importancia económica, las Leguminosae son el segundo grupo de plantas
más importante después de los cereales en la dieta de los humanos, aunque en comparación
con éstos, las leguminosas son ricas en proteínas de alta calidad, resultando un alimento
nutritivo. De manera especial, el garbanzo es una de las semillas más cultivadas en México,
por lo que es un alimento disponible dentro del país. Aunado a esta ventaja económica, su
calidad nutritiva es bastante elevada, contando con un porcentaje de proteínas de alrededor
del 20% y menos del 10 % de grasas, así como un alto contenido en fibra dietaria, que lo
vuelve una buena opción como fuente de nutrientes. En las últimas décadas se ha evaluado
la posibilidad de obtener algún beneficio extra que le otorgue un valor añadido por medio
especialmente del aprovechamiento de sus proteínas.
De estas proteínas, se ha comprendido la importancia de cadenas de aminoácidos más
pequeñas, los péptidos, en diversas funciones relevantes para el campo de los alimentos.
Algunos son producidos originalmente como moléculas pequeñas y otros son productos
derivados del metabolismo o procesamiento enzimático de las proteínas. Se denomina
actividad biológica a la que ejercen las proteínas más allá de sus propiedades nutrimentales
o funcionales. En particular los péptidos bioactivos se generan por acción de proteasas sobre
2
diversas proteínas alimentarias, en las que parecen estar encriptados pero son resistentes a
la actividad de peptidasas y realizan diferentes funciones: antihipertensivos, con actividad
opioide, inmunomoduladores, antioxidantes, y secuestradores de metales, entre otros.
Los péptidos antioxidantes son pequeños fragmentos proteicos de bajo peso molecular
típicamente constituidos por cadenas de no más de 20 aminoácidos unidos entre sí por
enlaces peptídicos. Se cree que la capacidad antioxidante de estas moléculas se debe sobre
todo a la capacidad reductora de algunos de los residuos aminoacídicos contenidos en ellas,
aunque también propiedades de barrera y de secuestramiento de metales pro-oxidantes han
sido reportadas como posibles responsables de su actividad antioxidante.
3
INTRODUCCIÓN
Antes del surgimiento de la fotosíntesis, la atmósfera de la tierra era predominantemente
reductora y los organismos que la poblaban eran anaerobios, es decir, que obtenían su
energía en ausencia de oxígeno. Con el incremento del O2 en la atmósfera, la mayor parte
de estos organismos pereció y los que lograron adaptarse optimizaron la producción de
energía empleando al oxígeno como aceptor final de electrones, que en organismos
eucariotes se lleva a cabo en la cadena respiratoria mitocondrial (Konigsberg, 1992).
En química, la reducción es la ganancia de electrones y la oxidación es la pérdida de éstos.
Se tiene un agente oxidante que oxida a otra molécula con el fin de reducirse, es decir, que
recibe electrones. Una de las moléculas más oxidantes es precisamente el oxígeno (Elejalde-
Guerra, 2001).
El término radical libre (RL) se refiere a una molécula que tiene un par de electrones
desapareados, es decir, que en su último nivel de energía le falta un electrón, que tomará de
cualquier molécula adyacente para estabilizarse (Figura 1). Sin embargo, como han tomado
sólo un electrón, la otra molécula quedará a su vez desapareada y tendrá que tomar otro
electrón, iniciando una reacción en cadena (Halliwell y Gutterdige, 1999).
Figura 1. Modelo hipotético de la reacción en cadena de radicales libres. Fuente:
Elaboración propia
4
El oxígeno en su forma natural de molécula diatómica (O2), es en realidad un di-radical que
se puede representar de la siguiente forma: •O-O• la cual se conoce como oxígeno triplete
(3O2) y es muy poco reactiva, sin embargo, esta reactividad puede incrementarse con la
absorción de energía y de esta manera, el oxígeno triplete se convierte en el singulete (1O2),
que es muy reactivo (Halliwell y Gutterdige, 1999; Hansberg-Torres, 2008).
El 1O2 es capaz de reaccionar con diversas biomoléculas e inactivarlas. Pero lo más
significativo es que debido a su capacidad antioxidante, puede recibir un electrón que
provenga de alguna vía metabólica, iniciando así una cascada de radicales libres y generar
especies reactivas de oxígeno EROs. Cuando el 1O2 recibe un electrón, uno de los electrones
despareados queda estable en forma de anión, mientras que el otro lado, sigue siendo RL
(Figura 2a). A esta molécula se le conoce como anión o radical superóxido (O2•) y es una de
las ERO más importantes a nivel fisiológico (Davies, 1995).
El O2• es poco reactivo y únicamente reacciona de manera importante con otros radicales,
en especial con otros superóxidos, además de metales como cobre, hierro libre, o con los
centros Fe-S de las proteínas. También reacciona con el óxido nítrico y el ascorbato. El anión
superóxido no reacciona con el NADPH ni con las proteínas, lípidos o las bases nitrogenadas
de ADN (Hansberg-Torres, 2008). El O2• puede recibir otro electrón para estabilizar a su
segundo electrón desapareado, convirtiéndose en un anión peróxido, que cuando se protona
se convierte en el peróxido de hidrógeno (H2O2) (Figura 2b). Esta reacción se lleva a cabo
de manera fisiológica y es catalizada por la enzima superóxido dismutasa (SOD) (Liochev y
Fridovich, 2010).
El H2O2 no es un RL en sí mismo, pero se le considera una ERO ya que es un precursor
potencial de RL, en especial de OH-, uno de los más dañinos para las células. A diferencia
de los RL que no pueden atravesar las membranas biológicas porque reaccionan con los
lípidos que las forman, el H2O2 sí puede hacerlo, y es ahí donde radica una de sus
propiedades más importantes, ya que puede generarse en un compartimento celular y
difundir hacia otro (Rigoulet et al., 2011).
En el organismo existe una gran cantidad de enzimas que metabolizan al H2O2 para
convertirlo en agua. Entre ellas se encuentran las catalasas (Chelikani et al., 2004), las
5
peroxidasas como las glutatión peroxidasas (Arthur, 2000; Battin y Brumaghim, 2009) y las
tiorredoxinas (Biaglow y Miller, 2005; Carvahlo et al., 2006), entre otras.
Sin embargo, si el H2O2 encuentra a un electrón proveniente de un metal de transición como
hierro (Fe2+) o cobre (Cu1+), se induce lo que se conoce como la reacción de Fenton, en la
cual se rompe el enlace entre los átomos de oxígeno. Uno de ellos recibe el electrón
proveniente del metal y se convierte en el anión hidroxilo (OH-) mientras que el otro queda
con un electrón desapareado formando al radical hidroxilo (•OH) (Figura 2c). Esta reacción
no es enzimática sino química, por lo que la producción de •OH no es algo controlado o
regulado por las células; y por esta misma razón no existen enzimas que sean capaces de
metabolizar dicho radical (Halliwell y Gutteridge, 2000).
En cuanto a los productos de la reacción de Fenton, uno de los mas nocivos es el radical
•OH, de los más reactivos que existen (Halliwell y Gutteridge, 2000). No pueden difundirse a
través de las membranas porque rápidamente reacciona con los lípidos que la conforman,
iniciando la lipoperoxidación. También reacciona con los azúcares y las bases nitrogenadas
del ADN y con los aminoácidos de las proteínas.
Figura 2. Modelo hipotético de la generación de EROs. Fuente: Elaboración propia
Existen otras EROs importantes como el radical alcoxilo (LO•), peroxilo (LOO•) e incluso
especies reactivas que además del oxígeno incluyen al nitrógeno (RNS), como el óxido nítrico
(NO•) o el peroxinitrito (ONOO-) (Ferrer-Sueta y Radi, 2009).
6
ESTRÉS OXIDATIVO
El concepto de estrés oxidante u oxidativo (EO) surgió en el año 1985 propuesto por Helmut
Sies, y se define como una situación de desbalance con un aumento o disminución de
oxidantes (Sies y Cadenas, 1985). El concepto implica el reconocimiento de una producción
fisiológica de antioxidantes (RL y especies relacionadas) y de la existencia de una defensa
antioxidante. La condición de desbalance, a su vez, se refiere a la efectividad fisiológica de
la defensa antioxidante en mantener al mínimo el estrés. Sin embargo, si se analiza el
concepto con detenimiento, implica que en condiciones fisiológicas normales existe una
situación de equilibrio, en donde por cada oxidante existe un antioxidante que lo neutraliza,
casi en una relación uno a uno. Ahora se sabe que la situación en realidad no es así. El
concepto se ha modificado ya que hay momentos en los que la célula requiere ambientes
más reducidos o más oxidados para mantener su homeostasis, por lo que el estado redox es
un concepto dinámico (Forman et al., 2004).
No obstante, el estrés oxidante puede referirse a una condición anormal en el cual las células
ya no son capaces de regular dichos cambios y se mantienen mayormente en un estado
oxidado que no pueden controlar (Droge, 2002).
MOLÉCULAS ANTIOXIDANTES
En el organismo humano se generan EROs como resultado del metabolismo normal, que a
bajas concentraciones ejercen un papel benéfico, como en el proceso de relajación de las
células del músculo liso, y favoreciendo la actividad mitocondrial normal. Sin embargo,
cuando la cantidad de estas especies reactivas sobrepasa los niveles normales pueden tener
un efecto dañino, causando la oxidación de macromoléculas como proteínas, ácidos
nucleicos y lípidos de membranas, lo cual puede causar un funcionamiento celular anormal
y diversas patologías (Bramley, et al., 2000). Se ha considerado que los RL y EROs están
involucrados en la patogénesis de cerca de 100 enfermedades diferentes, incluyendo
aterosclerosis, artritis, isquemia, lesión del sistema nervioso central, gastritis, cáncer (Tepe
et al., 2007), así como envejecimiento prematuro, o niveles de glucosa y colesterol elevados
(Elejalde-Guerra, 2001). El organismo humano cuenta con sistemas de defensa endogenos
(enzimas como la glutatión peroxidasa, catalasa, superóxido dismutasa, glutatión reductasa,
entre otras) y externas de defensa contra los RL. Finalmente, destacan diversos
7
antioxidantes dietarios de bajo peso molecular como la vitamina E, carotenoides, compuestos
fenólicos, clorofilas, ácido ascórbico, entre otros, que tienen la habilidad de reaccionar con
los RL mediante diversos mecanismos, dando lugar a especies químicas menos reactivas y
dañinas (Bramley et al., 2000).
COMPUESTOS FENÓLICOS
Se conoce como fenólicos a un grupo de compuestos abundantes en la naturaleza que se
caracterizan por contener en su estructura química al menos un anillo bencénico hidroxilado.
Pueden ser moléculas simples, o complejas, formando polímeros (Álvarez-Parrilla et al.,
2012). Diversos estudios epidemiológicos han sugerido asociaciones entre la ingesta de
alimentos ricos en polifenoles y la prevención de enfermedades relacionadas con procesos
oxidativos y de inflamación (enfermedades degenerativas, cardiovasculares y algunos tipos
de cáncer) (Arts y Hollman, 2005; Kampa et al., 2007; Scalbert y Williamson, 2000). Existen
dos grupos principales de polifenoles: los denominados flavonoides y los no flavonoides. La
estructura básica de los flavonoides es la del 2-fenilbenzopirona (C3-C6-C3) (Figura 3) y se
clasifican en 8 subclases: flavanonas, flavonas, dihidroflavonoles, flavonoles, flavan-3-oles,
antocianidinas, isoflavonas, y protoantocianidinas (Figura 4).
Figura 3. Estructura básica de los flavonoides. Fuente: Andrés-Lacueva, et al., 2009
El grupo de los no flavonoides se clasifica de acuerdo con el número de carbonos que
contiene y comprende las siguientes subclases: fenoles simples, ácidos benzoicos, taninos
hidrolizables, acetofenonas, ácidos fenilacéticos, ácidos cinámicos, cumarinas,
benzofenonas, xantonas, estilbenos, chalconas, lignanos y secoiridoides (Andrés-Lacueva et
al., 2009). En las leguminosas se encuentran en su mayoría las isoflavonas (Manach et al.,
2004) como la genisteína en la soya (64.8 mg/100g), la leche de soya (6.1 mg/100g) y el tofu
(13.3 mg/100g). La dadzeina y la glicetina también se encuentran en la soya, leche de soya
y tofu, pero en menor concentración (Andrés-Lacueva et al., 2009).
9
Si bien estos compuestos son beneficiosos para la salud por su actividad antioxidante, en
términos de nutrición, su presencia reduce la digestibiliad de proteínas. En estudios de
calidad proteica realizados por Bejosano y Corke (1998) se determinó la composición de
aminoácidos y la digestibilidad in vitro de concentrados de proteína integral de cinco
genotipos de proteína de amaranto y se demostró que la presencia de compuestos fenólicos
influye en la digestibilidad de las proteínas, por lo cual deben ser eliminados. En presencia
de oxígeno estos compuestos fenólicos se oxidan en medio alcalino o próximo a la
neutralidad, por acción de la polifenoloxidasa, dando como producto ortoquinonas, que luego
generan pardeamiento enzimático (Cuq, 1996), o bien, reaccionan con los grupos amino
terminales, aminoácidos libres como lisina y cisteína (Cheftel et al., 1989). Los residuos de
metionina se pueden oxidar a metionina sulfóxido (Cuq, 1996). Esto se produce en la
purificación tecnológica de proteínas a partir de hojas o ciertos granos ricos en polifenoles y
las consecuencias nutricionales del contacto de las proteínas con los polifenoles oxidados se
deben fundamentalmente a la disminución de la disponibilidad de lisina y en menor grado de
otros aminoácidos como la metionina. El grupo amino de la lisina puede condensarse con las
quinonas en su forma desprotonada, es decir, que esta reacción se ve favorecida a pH
alcalino (Figura 5).
Figura 5. Interacción proteínas-polifenoles. Adaptado de Cuq, 1996
10
PRODUCCIÓN DE HIDROLIZADOS PROTEICOS CON FUNCIONALIDAD BIOLÓGICA (PÉPTIDOS BIOACTIVOS)
HIDROLIZADOS PROTEICOS
Los hidrolizados proteicos son fracciones de proteínas y cadenas peptídicas obtenidas por
hidrólisis enzimática, fermentación microbiana y fraccionamiento o enriquecimiento de
péptidos (Korhonen y Pihlanto, 2006; Mersich y Jungbauer, 2008). Los hidrolizados proteicos
tienen una amplia gama de aplicaciones que varían desde ingredientes en alimentos hasta
su empleo como fuente de nitrógeno en la preparación de dietas viables para administración
parenteral en hospitales, fórmulas hipoalergénicas infantiles, alimentos bajos en calorías y
bebidas para deportistas. En el Cuadro 1 se presentan productos comerciales e ingredientes
con función en la salud basada en péptidos bioactivos (Hong et al., 2008; Mersich y
Jungbauer, 2008).
Cuadro 1. Productos comerciales e ingredientes con función en la salud basada en péptidos bioactivos.
Marca Tipo de
producto Péptido bioactivo
Función en la salud que promociona
Productor/País
Calpis Leche ácida Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro, Derivado de β-caseina y κ-caseina
Reducción de la presión sanguínea
Calpis Co., Japón
Evolus
Bebida de leche fermentada
enriquecida en calcio
Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro, Derivado de β-caseina y κ-caseina
Reducción de la presión sanguínea
Valio Oy, Finlandia
BioZate
Hidrolizado del aislado de
proteínas del suero
Fragmentos de β-lactoglobulina
Reducción de la presión sanguínea
Davisco, EUA
BioPURE-GMP
Aislado de proteína del
suero
k-casein f(106–169) (Glicomacropeptido)
Prevención de caries dentales, influenciar la coagulación sanguínea, protección contra virus y bacterias
Davisco, EUA
PRODIET F200/Lactiu
m
Leche saborizada, confitería, capsulas
as1-casein f (91–100) (Tyr- Leu-Gly Tyr-Leu-Glu-Gln- Leu-Leu-Arg)
Reducción de efectos del estrés
Ingredia, Francia
Festivo Queso
fermentado bajo en grasa
as1-casein f (1–9), as1-casein f (1–7), as1-casein f (1–6)
Ningún beneficio obtenido aún
MTT Agrifood Research Finlandia
Cysteine Peptide
Hidrolizado/ingrediente
Péptidos derivados de caseína
Productos para incrementar la energía y el sueño
DMV International, Países Bajos
C12 Hidrolizado/ingr
ediente Péptidos derivados de caseína
Reducción de la presión sanguínea
DMV International, Países Bajos
11
Capolac Ingrediente Caseinofosfopeptido Ayuda a la absorción de minerales
Arla Foods Ingredients,
Suecia
PeptoPro Ingrediente/ Hidrolizado
Péptidos derivados de caseina
Mejora el desempeño atlético y la recuperación del músculo,
DSM Food Specialties, Países
Bajos
Vivinal Alpha
Ingrediente/ Hidrolizado
Péptidos derivados de las proteínas del suero
Productos para la relajación y el sueño
Borculo Domo Ingredients
(BDI), Holanda
Fuente: Korhonen y Pihlanto (2006)
La caseína, proteínas del suero y de diferentes leguminosas son las fuentes proteicas
comúnmente utilizadas para la producción de hidrolizados (Erdmann et al., 2008) y la
obtención y caracterización de péptidos.
CLASIFICACIÓN Y FUNCIONALIDAD DE HIDROLIZADOS PROTEICOS
Uno de los parámetros básicos empleados para describir a los hidrolizados proteicos es el
grado de hidrólisis (GH), el cual corresponde al porcentaje de enlaces peptídicos
hidrolizados. Según el GH, se clasifican en (Korhonen y Pihlanto, 2006):
I. Hidrolizados limitados: con GH menores del 10%, para la mejora de las
propiedades funcionales.
II. Hidrolizados extensivos: con GH mayores del 10%, para su uso en alimentación
especializada. Este último grupo puede a su vez dividirse en aquellos para ser usados
como suplemento proteico (tercera edad, deportistas, dietas), en dietas médicas y por
último enriquecidos en péptidos bioactivos.
La funcionalidad de un hidrolizado proteico se encuentra determinada por la estructura
molecular, tamaño y secuencia específica de aminoácidos en los péptidos generados durante
la hidrólisis, de manera que el entendimiento de la relación entre las características químicas
y la funcionalidad de los hidrolizados permite mejorar la calidad y estabilidad de fórmulas a
base de hidrolizados (Sarmadi e Ismail, 2010).
Las aplicaciones potenciales para los péptidos requieren que éstos puedan ser producidos
en forma definida y reproducible, por lo tanto, la factibilidad del proceso de hidrólisis de un
12
sistema enzima/sustrato específico depende del control cualitativo de los productos de la
hidrólisis.
PÉPTIDOS BIOACTIVOS
Recientemente se ha comprendido la importancia de cadenas de aminoácidos más
pequeñas, los péptidos, con diversas funciones relevantes para el campo de los alimentos.
Algunos son producidos originalmente como moléculas pequeñas y otros son productos
derivados del metabolismo o procesamiento enzimático de las proteínas (Badui, 2013). En
particular los péptidos bioactivos se generan por acción de proteasas sobre diversas
proteínas alimentarias, en las que parecen estar encriptados, pero son resistentes a la
actividad de peptidasas. Estos péptidos pueden presentar actividad biológica, denominada
así, debido a la acción que ejercen las proteínas más allá de sus propiedades nutrimentales
o tecnofuncionales y que, dependiendo de su composición y orden de aminoácidos,
presentan actividades como: antihipertensivos, con actividad opioide, inmunomoduladores,
antioxidantes, y secuestradores de metales, entre otros (Badui, 2013).
PÉPTIDOS ANTIOXIDANTES
En particular, los péptidos antioxidantes son pequeños fragmentos proteicos de bajo peso
molecular (≤ 1500 Da) típicamente constituidos por cadenas de no más de 20 aminoácidos
unidos entre sí por enlaces peptídicos. Se cree que la capacidad antioxidante de estas
moléculas se debe sobre todo a la capacidad reductora de algunos de los residuos
aminoacídicos contenidos en ellas, aunque también propiedades de barrera y de
secuestramiento de metales pro-oxidantes han sido reportadas como posibles responsables
de su actividad antioxidante (Sarmadi e Ismail, 2010). Aunque la secuencia de aminoácidos
encontrada en los péptidos antioxidantes es la misma que originalmente se encuentra en la
proteína de origen, las propiedades no se manifiestan sino hasta que el fragmento en
cuestión es “liberado” de la estructura madre, con lo que puede deducirse la interferencia de
otros grupos funcionales presentes en la proteína, capaces de bloquear la actividad
antioxidante de los fragmentos peptídicos. Por este motivo, es necesario llevar a cabo la
fragmentación de las proteínas, ya sea por métodos enzimáticos o fermentación (Sarmadi e
Ismail, 2010).
13
En las últimas décadas se han realizado importantes avances en el estudio y producción
comercial de péptidos antioxidantes. Su aplicación como antioxidantes “naturales”, tanto en
el área de tecnología de alimentos como en el área de salud, ha sido discutida en numerosas
publicaciones científicas.
MECANISMO DE ACCIÓN DE PÉPTIDOS ANTIOXIDANTES
Los estudios realizados hasta la fecha coinciden en que su actividad antioxidante está
determinada por:
a) La capacidad de las cadenas laterales de los aminoácidos constituyentes para
eliminar RL
b) La capacidad de las cadenas laterales de los aminoácidos constituyentes para quelar
metales de transición; y
c) La posición relativa de los aminoácidos dentro de la cadena peptídica (Chen et al.,
1996; Xiong, 2010).
Típicamente, la presencia de aminoácidos como Cys, Met, Tyr, Phe, Trp en péptidos
antioxidantes es asociada con su capacidad para eliminar RL; mientras que Lis, Arg, Glu,
Asp, Thr y Ser fosforilada, son asociados con capacidad para quelar metales de transición
(Figura 6) (Rajapakse et al., 2005; Xiong, 2010). Las cadenas laterales azufradas
nucleofílicas y aromáticas actúan como eliminadores de radicales debido a la fácil sustracción
de hidrógenos de su estructura. Los aminoácidos aromáticos estabilizan al radical y
simultáneamente mantienen su propia estabilidad vía resonancia a través de la estructura
cíclica. Por otro lado, los péptidos constituidos por aminoácidos básicos y ácidos pueden
interactuar con metales de transición a través de sus residuos cargados evitando procesos
oxidativos (Saiga et al, 2003).
Se ha demostrado que residuos de His, Glu y Asp dentro de la secuencia aminoacídica
pueden actuar como eliminadores de RL y como compuestos quelantes de metales de
transición (Chen et al., 1996; Liu et al., 2010; Liu et al., 2010; Qian, et al., 2008). Por último,
algunos aminoácidos hidrófobos, como Leu y Val, han sido reportados como relevantes
promotores de actividad antioxidante de los péptidos cuando se encuentran localizados en
el carbono o nitrógeno terminales, debido a su naturaleza lipofílica, proveen un mejor punto
de contacto entre el péptido y los ácidos grasos, promoviendo la eliminación de radicales
14
libres (Chen et al., 1996; Mendis et al., 2005; Suetsuna y Chen, 2002; Park et al., 2001;
Suetsuna et al., 2000).
Figura 6. Estructura de los principales aminoácidos relacionados con la actividad
antioxidante en péptidos. Fuente: Elaboración propia.
MÉTODOS DE OBTENCIÓN DE PÉPTIDOS ANTIOXIDANTES
Según el método de obtención, existen diversos factores que pueden influir en la capacidad
del péptido generado, sin embargo, es la secuencia y tipos de aminoácidos presentes los
que la definen (Rajapakse et al., 2005).
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA
Es el proceso más común y eficiente, donde se utilizan enzimas proteolíticas. Las enzimas
proteolíticas abarcan un grupo de hidrolasas referidas como peptidasas o comúnmente
llamadas proteasas, las cuales comparten las características de atacar enlaces peptídicos
(Illanes, 2008). Las proteasas pueden ser clasificadas por su origen (animal, vegetal o
microbiano), modo de acción catalítica (endo- o exo- actividad) o con base en su sitio
15
catalítico (serinproteasa, cisteinproteasa, aspartatoproteasa, metaloproteasa) (Nielsen,
2010).
En la hidrólisis enzimática, la capacidad antioxidante de los péptidos generados depende de
la naturaleza y pre-tratamiento de la proteína, tipo de proteasa utilizada y de las condiciones
en las cuales se lleva a cabo la hidrólisis (Xiong, 2010).
Este proceso se desarrolla en tres fases (Figura 7):
a) La formación de un complejo enzima-sustrato,
b) La ruptura del enlace peptídico dando como resultado la liberación de péptidos, y
c) Los péptidos resultantes se separan de la enzima después de un ataque nucleofílico
de una molécula de agua
Figura 7. Hidrólisis enzimática de proteínas. Fuente: Elaboración propia
La estructura compacta de las proteínas globulares en su estado nativo dificulta la proteólisis.
Un tratamiento térmico de la proteína previo causa cambios en su estructura y permite una
mayor accesibilidad del sustrato a la acción enzimática debido a un mayor número de enlaces
peptídicos expuestos. Asimismo, el calor inactiva ciertos inhibidores de proteasas que
contienen proteínas nativas de fuentes vegetales (Nielsen, 1997). La aplicación de
temperaturas entre 50 y 90°C por 2 a 30 min son utilizadas de manera regular como pre-
tratamientos para hidrolizar enzimáticamente proteínas de diversos orígenes (Li, et al., 2007;
Peña-Ramos y Xiong, 2003; Xie et al., 2008; You et al., 2010).
16
La especificidad de las enzimas empleadas en la liberación de péptidos antioxidantes afecta
el tamaño, composición y secuencia de aminoácidos del péptido generado, lo cual influye
sobre su capacidad antioxidante (Samardi e Ismail, 2010). La producción de péptidos
antioxidantes se puede llevar a cabo con más de una enzima actuando sobre un mismo
sustrato (Li et al., 2007). El orden en que se añaden las enzimas puede afectar la capacidad
antioxidante de los péptidos resultantes debido a la especificidad de estas (Vercruysse et al.,
2009).
El grado de hidrólisis enzimática es influenciado por las condiciones de reacción, lo que
afecta las propiedades funcionales de los hidrolizados obtenidos (Nielsen, 1997). Por lo
general, a un mayor grado de hidrólisis, corresponde una mayor capacidad antioxidante del
péptido liberado debido a su menor tamaño y mayor exposición de aminoácidos hidrófobos
(Foh et al., 2010; Jamdar et al., 2010; Klompong et al., 2007; Li et al., 2007; Liu et al., 2010;
Liu et al., 2010; Qian et al., 2010; You et al., 2009). Los valores de temperatura, pH, así como
la relación enzima-sustrato determinan la velocidad de reacción; mientras que el tiempo
afecta el grado de hidrólisis (Benítez et al., 2008). Éstas son variables que han mostrado ser
influyentes en la actividad antioxidante de péptidos liberados (Guerard et al., 2007; Ren et
al., 2008; You et al., 2010; Zhuang et al., 2009).
INTERACCIONES PROTEÍNA-FENÓLICOS
Las proteínas en los alimentos pueden formar complejos con otros componentes, incluyendo
a los polifenoles, que conducen a cambios vitales en sus propiedades estructurales,
funcionales y nutricionales (Shahidi, 2000; Ozdal et al., 2013; Bordenave et al., 2014; Shahidi
y Ambigaipalan, 2015).
Se han reportado cuatro tipos de interacciones para los polifenoles y las proteínas, que son
puentes de hidrógeno, interacción electrostática, enlaces covalentes e interacciones
hidrofóbicas (Bordenave et al., 2014; Ozdal et al., 2013; García-Estévez et al., 2017;
Fernandes et al., 2017).
Entre ellos, las uniones hidrófobas y de hidrógeno representan la principal fuerza impulsora
de todas estas interacciones (Jia et al., 2016). De acuerdo con Shahidi y Naczk (2003), los
compuestos fenólicos forman complejos tanto en concentraciones bajas como altas de
17
proteínas debido a interacciones hidrofóbicas. Esto se explica con más detalle por los
puentes de hidrógeno a través de los grupos hidróxilo en los compuestos fenólicos y los
grupos carbonil en los enlaces peptídicos de las proteínas (Loomis y Battaile, 1966).
Las interacciones hidrofóbicas pueden ocurrir entre dos anillos aromáticos donde uno podría
ser un aminoácido hidrofóbico (Le Bourvellec y Renard, 2012). Esto también se conoce como
interacción de apilamiento. Las concentraciones de proteínas tienen una influencia directa en
este tipo de interacción como una monocapa hidrofóbica en una concentración proteica baja,
mientras que a altas concentraciones más capas de superficies hidrofóbicas son formadas
debido a la formación de complejos de polifenoles y proteínas. Este proceso también incluye
el entrecruzamiento de moléculas proteicas, que generan complejos coloreados de alto peso
molecular (Sabir et al.,1974). La agregación y precipitación ocurre como una consecuencia
de todas estas interacciones (Martínez-González et al., 2017).
Este tipo de interacciones son no-covalentes, y son más débiles ya que no involucran
compartir un par de electrones (Nagy et al., 2012; Jakobek, 2015), y la mayoría son
estabilizadas por puentes de hidrógeno (Yuksel et al., 2010; Jia et al., 2016). En contraste,
los enlaces covalentes forman interacciones irreversibles.
La complejación reversible tiene lugar en un proceso de dos etapas, donde en la primera el
polifenol y el co-sustrato se encuentran en equilibrio con complejos solubles vía fuerzas no
covalentes (Luck et al., 1994). En un segundo paso, estos complejos solubles pueden
agregarse y precipitar cuando las condiciones de equilibrio cambian. El precipitado puede
volver a disolverse bajo condiciones favorables como ausencia de oxígeno, iones metálicos,
ácidos o álcalis (Shahidi y Senadheera, 2018). La máxima interacción proteína-polifenol
ocurre en el punto isoeléctrico de la proteína (Trigueros et al., 2014).
Para las uniones covalentes, un paso clave en la reacción de compuestos fenólicos con las
proteínas es la facilidad de los primeros en ser oxidados enzimática o no enzimáticamente
(Cilliers y Singleton, 1991; Friedman, 1996) y seguir siendo altamente reactivos (Figura 8).
Primero, la orto- o para-quinona reacciona con otras quinonas para producir pigmentos
oscuros (Nicolas et al., 1994). Lo anterior es válido para la mayoría de los compuestos
fenólicos. La reacción previamente mencionada es un prerrequisito para generar especies
electrofílicas capaces de subyacer una adición nucleofílica (Figura 8). En este caso, las
18
cadenas de proteínas aportan el lado nucleófilo de la reacción, especialmente la lisina, los
grupos tiol o el grupo indol del triptófano son los residuos más reactivos. También los grupos
imidazol y disulfuro han sido reportados como compañeros de reacción (Vithayatil y Murthy,
1972; Loomis, 1974; Matheis y Whitaker, 1984, Kroll et al., 2003).
Figura 8. Oxidación de catecol como prerrequisito para la formación de productos de reacción. Fuente: Rohn, 2014.
En presencia de un grupo aminoacídico nucleófilo y de acuerdo al mecanismo propuesto por
Namiki et al. (2001), una dimerización de los compuestos fenólicos previa a su interacción
con las proteínas durante el calentamiento y valores de pH alcalinos parecen ser un
precedente de la reacción. Consecuentemente, tres tipos de productos de reacción deben
ser considerados, tales como muestra la Figura 9 (A-C): En el primer caso, hay un producto
simple, donde un solo compuesto fenólico está enlazado a una sola cadena lateral de
aminoácido (Figura 9A). Se puede presentar el caso de que los compuestos fenólicos formen
oligomeros con peso molecular variable antes de unirse a los residuos aminoacídicos (Figura
9B). Y finalmente, un entrecruzamiento proteico entre estructuras monoméricas o incluso
oligoméricas. Además, puede verse favorecida la formación de puentes disulfuro debido a
las reacciones redox en los compuestos fenólicos y el cambio en la conformación de la
proteína. (Figura 9C).
19
Figura 9. Diferentes perfiles de reacción. Fuente: Rohn, 2014
Estas interacciones ocurren de forma inespecífica y depende de la estructura inicial de la
proteína, así como su conformación. Las cadenas más accesibles reaccionarán primero,
antes de que la proteína se repliegue o descubra para generar nuevos sitios de reacción.
Esto significa que cada proteína va a ser afectada específicamente dependiendo de las
condiciones, tales como pH, temperatura, secuencia de aminoácidos, punto isoeléctrico,
tipos de fenólicos (Rohn, 2018). Estos cambios tienen el potencial de influenciar en algunas
propiedades tecnofuncionales (Pringent et al., 2003).
20
CONSECUENCIAS NUTRICIONALES
Resultado de su reacción con las proteínas, las propiedades de los compuetos fenólicos
también pueden verse afectadas, por ejemplo, la actividad antioxidante se ve dismunuida
como consecuencia de enlaces covalentes formados con las proteínas (Rohn et al., 2004,
2005).
En el caso de las proteínas, el efecto está en la actividad biológica de proteína-enzima
(Alberghina, 1964; Rohn et al., 2001, 2002, 2004, 2005). Aminoácidos esenciales como la
lisina y triptófano son preferidos como compañeros de reacción, lo cual implica una pérdida
en la calidad nutricional de las proteínas (Davies et al., 1978). Los compuestos fenólicos
vegetales tienen afinidad por las enzimas digestivas del sistema gastroinstestinal humano,
causando la reducción de la digestibilidad de las proteínas, carbohidratos y lípidos (Quesada
et al., 1996; Jakobek, 2015; Alu’datt, 2006; Alu’datt et al., 2013, 2014, 2016a, b, 2017b).
EXTRACCIÓN, ANÁLISIS Y EFECTOS DE SEPARAR LOS COMPUESTOS FENÓLICOS
Muchos disolventes orgánicos y agua han sido reportados para extraer fenólicos libres y
ligados de plantas (Shahidi y Naczk, 2004; Alu’datt, 2006, Alu’datt et al., 2017a, 2017b).
Shahidi y Naczk (2004) reportaron que el mejor disolvente para extraer fenólicos libres a
partir de plantas es el metanol, mientras que los fenólicos ligados pueden ser extraídos por
tratamientos ácidos o básicos seguidos de un tratamiento con metanol a temperatura
ambiente (Alu’datt, 2006, Alu’datt et al., 2013, 2016b). Las técnicas de análisis van desde
HPLC, cromatografía de gases, resonancia magnética nuclear, electroforesis capilar y
electroforesis de zona capilar (Montedoro et al., 1992a, b; Pirisi et al., 2000; Alu’datt, 2006;
Alhakmani et al., 2013; Wong-Paz et al., 2015; Liu et al., 2016; Alu’datt et al., 2013, 2016b).
Alu’datt en el 2006 y 2014 demostró que la extracción de fenólicos libres y ligados de aislados
de proteína de soya desengrasada disminuía la estabilidad térmica de la glicinina. Sin
embargo, la sola separación de los fenólicos libres del aislado proteico de soya permitió una
estabilidad térmica más elevada comparada con la extracción de ambos tipos de fenólicos.
La capacidad de retención de agua aumentó, mejoró la viscosidad y la estabilidad térmica de
la glicinina. De igual forma, se encontró que la capacidad antioxidante era más alta cuando
sólo se extraían los compuestos fenólicos libres, pero no los ligados en aislados proteicos de
soya y semilla de lino.
21
LEGUMINOSAS
En términos de importancia económica, las Leguminosae son la familia más importante de
las dicotiledóneas (Harbone, 1994) y constituyen el segundo grupo de plantas más
importante después de los cereales en la dieta de los humanos, pero en comparación con
éstos, las semillas de las leguminosas son ricas en proteínas de alta calidad, por lo que
resultan una fuente de alimento altamente nutritivo (Zhao, et al., 2014).
Sus semillas acumulan grandes cantidades de proteína durante su desarrollo. La mayoría de
estas proteínas están desprovistas de actividad catalítica y no desempeñan algún papel
estructural en el tejido del cotiledón. Se almacenan en las vacuolas o cuerpos de proteínas,
en las células del parénquima cotiledóneo, sobreviven a la desecación en la semilla. Estas
proteínas maduran y se someten a proteólisis en la germinación, proporcionando
aminoácidos libres, así como amoniaco y esqueletos de carbono a las plántulas en desarrollo.
Estas proteínas de semilla se denominan proteínas de almacenamiento (Casey et al., 1986).
Las proteínas representan alrededor del 20% (peso seco) en semillas como chícharo y
frijoles, aumentando hasta 38-40% en la soya o lupino (Derbyshire, 1976; Guéguen y Cerletti,
1994). La clase más abundante de proteínas en los granos de leguminosas son las globulinas
(proteínas solubles en soluciones salinas) y a su vez están clasificadas como 7S y 11S de
acuerdo con su coeficiente de sedimentación. Desde el punto de vista nutricional, todas las
proteínas de almacenamiento de las leguminosas son bajas en aminoácidos azufrados (Met,
Cys y Trp), cabe destacar que la concentración de lisina es mayor que en los cereales
(Rockland y Radke, 1981; Ampe et al., 1986).
Además, las leguminosas contienen un número de compuestos no-nutricionales que pueden
ser de naturaleza proteica y no proteica. Su presencia es a menudo el resultado de una
adaptación evolutiva que permite a la planta sobrevivir y completar su ciclo de vida bajo
condiciones naturales. Los efectos anti-nutricionales consisten en la inhibición de varias
enzimas digestivas, incluyendo la tripsina, quimotripsina y amilasa (Leterme et al., 1992). Sin
embargo, sus efectos usualmente se manifiestan sólo si la semilla o la harina son consumidas
sin cocinarse, ya que el calor de la cocción normalmente desactiva estas proteínas (Vidal-
Valverde et al., 1994).
22
BENEFICIOS DEL CONSUMO DE LEGUMINOSAS
A pesar de su contenido de lípidos, almidón y proteínas, se afirma que las leguminosas
ayudan a regular el peso corporal gracias a su efecto de saciedad, que limita la ingesta diaria
de alimentos, por lo que su consumo frecuente en paralelo con una dieta baja en grasas
saturadas puede ayudar a controlar la homeostasis de lípidos, y en consecuencia, reducir el
riesgo de enfermedades cardiovasculares. El alto contenido de fibra, su bajo índice glucémico
(IG) y la presencia de componentes menores tales como fitoesteroles, saponinas,
oligosacáridos, etc., son considerados los principales agentes responsables de esta
propiedad (Duranti, 2006).
Su bajo IG y alto contenido de fibras no digeribles, también ayudan al control glucémico en
individuos diabéticos. Además, pueden contribuir a prevenir la resistencia a la insulina, que
representa el pródromo a la diabetes tipo II (Duranti, 2006).
El tránsito acelerado de los alimentos digeridos en el tracto intestinal (Probert et al., 1995) y
su excreción final juegan una serie de efectos positivos, como la disminución de la
reabsorción del colesterol, digestión incompleta del almidón, disminución de los procesos de
fermentación. Estos factores se han considerado beneficiosos en la prevención del cáncer,
especialmente de colon (Duranti, 2006).
GARBANZO
A nivel mundial, el garbanzo (Cicer arietinum) se consume principalmente como grano y el
modo de prepararlo está determinado por factores étnicos y regionales. Su cultivo ha sido
desde el comienzo de la agricultura hace más de 9 500 años, desde Turquía hasta Irán
(Redden y Berger, 2007). De acuerdo con estudios realizados mediante polimorfismo de
longitud de fragmentos de restricción, se ha llegado a la conclusión de que existen cuatro
centros de biodiversidad de garbanzo: Pakistán-Afganistán, Iraq, Turquía y Líbano (Talebi et
al., 2008).
Existen dos variedades de garbanzo: Kabuli y Desi, y morfológicamente son distintos como
se muestra en la Figura 10. El tipo Kabuli se destina al consumo humano y el tipo Desi al
forrajero:
23
Figura 10. Tipos de garbanzo: a) Desi; b) Kabuli
Los tipos de garbanzo que se producen en México provienen inicialmente de la región
mediterránea (Francia, España e Italia) y asiática (India y Afganistán). El Servicio de
Información Agroalimentaria y Pesquera (SIAP) publicó los estados con mayor producción
nacional de garbanzo de grano, destacando: Sinaloa (53,658.01 ton), Sonora (35,824.09 ton)
y Michoacán (16,801.44 ton) aportaron el 87.4% de la producción nacional (121,567.48 ton)
(SIAP, 2016).
COMPOSICIÓN QUÍMICA
CARBOHIDRATOS
La concentración de carbohidratos presentes en el garbanzo representa entre el 60-70% del
peso seco total del grano. En mayor cantidad se encuentra el almidón (50%), molécula
formada principalmente por amilosa y amilopectina. A diferencia del almidón en los cereales,
el de las leguminosas se caracteriza por el predominio de la fracción de amilosa (30-40%)
responsable de su baja digestibilidad debido a que, tras la cocción, esta actúa como almidón
resistente (Guillon y Champa, 2002).
También, contienen monosacáridos (usualmente 1% o menos) y en cantidades ligeramente
mayores disacáridos, como sacarosa (1-3%). Se han caracterizado diversos oligosacáridos
en semillas de leguminosas, incluyendo rafinosa (sacarosa+galactosa), estaquiosa
(sacarosa+2 galactosas) y verbascosa (sacarosa +3 galactosas), que son galactósidos de la
sacarosa (formado por una molécula de sacarosa y de una a tres moléculas de galactosa),
los cuales no son digeridos ni absorbidos por el sistema digestivo humano, lo que lleva a su
24
acumulación en el intestino grueso, donde son fermentados por las bacterias del colon. Estos
compuestos representan alrededor del 22% de los azúcares totales, de los cuales el 25%
está como rafinosa, estaquiosa y verbascosa; así como los galactosil ciclitoles incluyendo el
ciceritol, que constituye del 36 al 43% (Frimpong, 2010; Jukanti, et al., 2012).
LÍPIDOS
La concentración total de lípidos de los garbanzos tipo Desi y Kabuli oscila entre 2.9–7.4% y
3.4- 8.8%, respectivamente, y comprenden principalmente ácidos grasos poliinsaturados (62
– 67%), monoinsaturados (19–26%) y grasas saturadas (12–24%) (Wood y Grusak, 2007).
El principal ácido graso presente en las fracciones lipídicas es el ácido palmítico (Ravi, 2005).
El ácido linoleico se encuentra en el tipo Desi (46 - 62%) y Kabuli (16 – 56%) (Muhammad et
al., 2007; Wood y Grusak, 2007).
OTROS COMPONENTES
El garbanzo contiene vitaminas hidrosolubles y liposolubles. Del complejo B destacan la
riboflavina (B2), la niacina (B3), la vitamina B6 se encuentra presente en forma de piridoxina
(Wood y Grusak, 2007). El contenido de folato varía de 150 – 557 µg/g, y de vitamina C, 4
mg/100 g (Wood y Grusak, 2007). Abbo et al., (2005) señalan que el garbanzo contiene alta
concentración de carotenoides, hasta 49 mg/100 g de β-caroteno, así como luteína y
zeaxantina. Por otra parte, el garbanzo contiene 13.7 mg/100 g de vitamina E (Wood y
Grusak, 2007; Jukanti et al., 2012).
La variación en los micronutrientes del garbanzo depende directamente de las condiciones
del cultivo (Wood y Grusak, 2007; Muhammad et al., 2007).
COMPUESTOS NO NUTRICIONALES
Los factores o compuestos no nutricionales del garbanzo pueden dividirse en tipo proteico y
no proteico (Domoney, 1999). El no proteico engloba alcaloides, taninos, fitatos, saponinas y
compuestos fenólicos; mientras que los factores no nutricionales de tipo proteico incluyen
inhibidores de tripsina, quimotripsina, lectinas y péptidos antifúngicos. Son de interés
comercial ya que afectan de forma negativa ciertas modificaciones enzimáticas necesarias
25
durante el procesamiento de los alimentos, como la capacidad de retención de agua,
capacidad de formación de geles y la formación de espuma en diferentes productos (García-
Cerreno, 1996), reducen la digestibilidad, o bien, otorgan un sabor amargo que lo hace
menos apetecible para el consumo en humanos y animales (Birk y Peri, 1980).
En cuanto a los compuestos fenólicos, en el garbanzo han sido identificados principalmente
altos niveles de biochanina A (Mazur et al., 1998) y en menor cantidad, la biochanina B, mejor
conocida como formononetina (Aguilera, et al., 2011; Mazur et al., 1998), y que
estructuralmente son similares a la genisteína y daizeína de la soya, excepto por un grupo
hidroxilo metilado (Stevenson y Aslam, 2006) (Figura 11) y cuyos efectos benéficos a la salud
han sido reportados (Cassady et al., 1988; Kole et al., 2011; Rathel et al., 2005).
Figura 11. Flavonoides en el garbanzo. En la parte izquierda se ven sus análogos de
la soya, respectivamente. Fuente: Girón-Calle, et al., 2016
PROTEÍNAS
El contenido de proteína en el garbanzo varía significativamente cuando se considera la
masa total del grano seco (17 – 22%) y cuando es descascarado incrementa (25–28.9%). En
varios estudios se han reportado diferencias en la concentración de proteína cruda de Kabuli
y Desi. En el Cuadro 2 se observa la calidad de la proteína del garbanzo.
26
Cuadro 2. Calidad de la proteína de la semilla de garbanzo crudo
Parámetro %
IVPDa 83.61 ± 0.40
EAAIc 67.10
PERb 2.32
Aminoácidos limitantes
Primero Valina
Segundo Metionina + Cistina
± Significa desviación estándar de tres determinaciones
a Digestibilidad in vitro de la proteina
b Relación de eficiencia proteica
c Indice de aminoácidos esenciales
Adaptado de El-Adawy y Alajaji (2006)
Las proteínas de reserva del garbanzo han sido fraccionadas en globulinas (solubles en
soluciones salinas; 56%), albúminas (solubles en agua; 12%), prolaminas (solubles en
alcohol; 2.8%), glutelinas (solubles en ácidos/álcalis; 18.1%), así como proteínas residuales
(Chavan, et al., 1989).
Las globulinas, que representan alrededor del 50% de las proteínas del garbanzo, están
compuestas a su vez por dos grandes grupos, la 11S (legumina) y la 7S (vicilina) (Casey, et
al., 1993), la legumina es la que constituyen la mayor concentración. Estructuralmente la
legumina es una proteína oligomérica con seis subunidades monoméricas cuaternarias de
54 - 60 kDa, siendo su peso molecular de alrededor 320 - 400 kDa (Casey et al., 1993);
mientras para la vicilina, Guéguen (1991) reportó los pesos moleculares de sus subunidades
como 50, 35, 33, 19, 15 y 13 kDa, caracterizados por electroforesis SDS-PAGE.
El garbanzo es una de las pocas leguminosas que contienen glutelinas, que también
pertenecen a la familia de globulinas 11–12S, y estructuralmente son similares (Shotwell et
al., 1988; Takaiwa et al., 1999).
27
Las proteínas del garbanzo son relativamente bajas en aminoácidos azufrados, tales como
metionina, cisteína y triptófano (Cuadro 3). Sin embargo, el contenido de lisina y arginina es
alto en comparación con los cereales (Duranti, 2006). Otros tipos de proteínas que se
encuentran en las leguminosas son algunas enzimas, inhibidores de tripsina y las lectinas, y
se destaca que la mayoría de estos compuestos son solubles en agua.
Cuadro 3. Contenido de aminoácidos en la semilla de garbanzo.
Aminoácido Wang y Daun (2004)* El-Adawy y Alajaji
(2006)*† Kabuli Desi
Lys 5.80 5.90 7.70
Met 1.50 1.50 1.60
Cys 1.40 1.30 1.30
Phe 5.20 5.30 5.90
Tyr 2.80 2.30 3.70
Ile 3.10 3.60 4.10
Leu 6.40 7.00 7.00
Thr 4.20 4.30 3.60
Val 3.70 4.00 3.60
Arg 10.50 9.80 10.30
His 2.10 2.20 3.40
Ala 3.90 4.10 4.40
Asp 12.10 12.80 11.40
Glu 15.2 16.00 17.30
Gly 3.80 3.90 4.10
Pro 4.90 4.80 4.60
Ser 5.90 6.00 1.10
Trp 1.0 0.90 4.90
* Expresado como g/16g N
† El tipo de garbanzo no es especificado
28
ANTECEDENTES
Se han realizado diferentes trabajos con proteínas de garbanzo, que incluyen desde
hidrolizados, hasta la obtención y caracterización de péptidos. Entre estos se encuentran:
Zhang et al., (2011) reportan la purificación de un péptido con actividad antioxidante obtenido
a partir del hidrolizado de proteína de garbanzo digerido con AlcalasaMR, el péptido se obtuvo
por separación del hidrolizado mediante SephadexMR G-25, siendo la fracción de menor peso
molecular la que presentó mayor capacidad antioxidante. Asimismo, la secuencia de
aminoácidos se identificó como Asn-Arg-Tyr-His-Glu, con peso molecular de 717.37 Da y
relación molar de 1:1:1:1:1 para los cinco aminoácidos en la secuencia. Este péptido presentó
actividad de captación de radicales libres DPPH, hidroxilo y superóxido, además de actividad
quelante de hierro y cobre con valores de 76.9 y 63% respectivamente, evaluando una
concentración del péptido de 50 µg/mL. Además, la inhibición de la peroxidación lipídica
resultó ser el mayor al estándar de α-tocoferol. La relación de inhibición de la autooxidación
del ácido linoléico fue de 88.8% a los ocho días del análisis.
Kou et al., (2013) identificaron un péptido con capacidad antioxidante en la albúmina del
garbanzo usando HLPC en fase reversa, acoplado a un espectrómetro de masa. La
secuencia fue identificada como Arg-Gln-Ser-His-Phe-Ala-Asn-Ala-Gln-Pro y un peso
molecular de 1155 Da; conteniendo los siguientes aminoácidos que tienen un papel
importante en su actividad antioxidante: residuos hidrófobos (Pro e His), residuos de
aminoácidos aromáticos (Phe) y aminoácidos no polares alifáticos (Ala). Asimismo,
encontraron que este péptido es mejor estabilizando radicales hidroxilo.
Torres-Fuentes et al., (2011) fraccionaron un hidrolizado de proteína de garbanzo obtenido
por un tratamiento pepsina/pancreatina, empleando una columna de afinidad con cobre
inmovilizado. Estos investigadores reportan un valor de quelación de 28, 36.7 y 45%
evaluando 60 μg de cada fracción (F1, F2, F3). La fracción F1 presentó alto contenido de Lis
(11.5 g/100 g de proteína) y Arg (24.9 g/100 g) mientras que las fracciones F2 y F3
presentaron un alto contenido de His (17.4 y 22.9 g/100 g respectivamente) existiendo una
correlación positiva entre el contenido de este aminoácido y la capacidad quelante de cobre.
Estas fracciones fueron separadas por cromatografía de filtración en gel, y las sub-fracciones
obtenidas se analizaron, obteniendo los valores más altos de quelación para F2B, F2D, F3D
29
y F3E por arriba del 80% evaluando 30 µg de muestra; el peso molecular de estas sub-
fracciones fue de 1205, 105, 308 y 162 Da respectivamente. Estos resultados muestran que
los péptidos quelantes generados durante la digestión de la proteína del garbanzo pueden
prevenir la generación de EROs y favorecer la absorción de minerales.
En otro estudio, Torres-Fuentes et al., (2015) lograron obtener 4 péptidos con una presencia
de aminoácidos con propiedades antioxidantes, (hidrofóbicos, ácidos y básicos), así como la
posición específica de los aminoácidos en la secuencia peptídica que puede también
contribuir a su bioactividad, tales como los aminoácidos hidrofóbos en el N- terminal y C-
terminal (Li y Li, 2013); además los aminoácidos polares, como histidina o arginina en la
posición C- terminal, contribuyen a la actividad antioxidante (Li y Li, 2013). Las secuencias
de los péptidos se citan a continuación: Ala-Leu-Glu-Pro-Asp-His-Arg (ALEPDHR), 836.4 Da;
Thr-Glu-Thr-Trp-Asn-Pro-Asn-His-Pro-Glu-Leu (TETWNPNHPEL), 1336.6 Da; Phe-Val-Pro-
His (FVPH), 498.2 Da; Ser-Ala-Glu-His-Gly-Ser-Leu-His (SAEHGSLH), 836.4 Da.
30
JUSTIFICACIÓN
El estilo de vida de la actualidad, aunado a la contaminación ambiental, radiación, químicos,
la popularidad de comida hipercalórica, así como el estrés, causan una sobreproducción de
RL y EROs que contribuyen a varios desórdenes de salud en humanos. Sobre este
escenario, en las últimas décadas ha crecido el interés y demanda del consumidor por
alimentos funcionales que además de nutrir, contengan propiedades biológicamente activas,
como la antioxidante. Esto ha provocado una búsqueda constante de nuevas fuentes para la
elaboración de estos productos.
Entre las opciones como materia prima destacan las leguminosas, y en especial el garbanzo,
cuya alta disponibilidad en el país, así como su contenido de proteína, lo vuelve una fuente
atractiva para la obtención de hidrolizados proteicos. Sin embargo, el garbanzo también
contiene distintos compuestos no nutricionales que limitan su óptimo aprovechamiento,
destacando los compuestos fenólicos, que por sí mismos poseen capacidad antioxidante,
pero a su vez se relacionan de forma negativa con los carbohidratos y más importante, con
las proteínas.
Por lo que el presente estudio pretende ofrecer un punto de vista en la investigación sobre el
garbanzo como una fuente de hidrolizados proteicos, así como su interacción con los
compuestos fenólicos, y si éstos ejercen un efecto sinérgico o antagónico en la capacidad
antioxidante.
31
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Determinar la influencia de los compuestos fenólicos en la actividad antioxidante de
hidrolizado proteico obtenido de semilla de garbanzo (Cicer arietinum L.)
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Determinar la composición química proximal de la semilla de garbanzo (C. arietinum
L.).
2. Obtener el concentrado proteico de la harina de semilla de garbanzo por precipitación
isoeléctrica.
3. Obtener un concentrado de proteínas reducido en compuestos fenólicos del
concentrado proteico.
4. Hidrolizar enzimáticamente los concentrados proteicos obtenidos, por medio de un
sistema secuencial de pepsina-pancreatina.
5. Caracterizar los hidrolizados de proteína de garbanzo por medio del perfil
electroforético y grado de hidrolisis
6. Evaluar la actividad antioxidante de los hidrolizados proteicos.
32
MATERIALES Y MÉTODOS
Fueron empleadas semillas de garbanzo de la variedad Kabuli adquiridas en el mercado local
de la delegación Miguel Hidalgo, en la Ciudad de México; y llevadas al Laboratorio de
Compuestos Bioactivos de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas para su
procesamiento.
Primero, se eliminó manualmente la materia extraña a las semillas de garbanzo, luego se
trituraron en un molino de discos para granos hasta obtener una granulometría más fina.
Posteriormente fue desengrasada usando hexano en una relación 1:5 (harina:hexano, p/v).
OBTENCIÓN DEL CONCENTRADO PROTEICO DE SEMILLA DE GARBANZO (CPG)
La extracción del concentrado de proteínas de garbanzo (CPG) se realizó utilizando el
método de Zhang et al., (2007) con modificaciones. La harina obtenida fue suspendida en
agua destilada usando una relación 1:10 p/v (harina/agua), se ajustó el pH a 9.0 con una
solución de NaOH 1 N, agitando por 1 h. Posteriormente la suspensión fue centrifugada a 10
000 rpm por 30 min a 4°C, y se desecho el precipitado. Después se ajustó el pH del
sobrenadante con HCl 1 N hasta 4.3, agitando durante 1 h. Nuevamente fue centrifugado
bajo las mismas condiciones anteriores y se recuperó el precipitado, para secarlo por
liofilización en condiciones de 0.12 mbar a -50°C.
ANÁLISIS QUÍMICO PROXIMAL DE LA HARINA Y CONCENTRADO PROTEICO DE LA
SEMILLA DE GARBANZO
Los valores de este análisis se determinaron de acuerdo con los procedimientos oficiales
descritos por la AOAC (2012):
Humedad (925.10). Se evaluó por la pérdida de peso después de secar la muestra
hasta peso constante.
Cenizas (930.05). Calculado como el peso remanente posterior al calcinamiento de
la muestra.
Extracto etéreo (930.09). Determinación realizada en un sistema Soxhlet luego de
dos extracciones con éter de petróleo, cuantificando los componentes solubles.
33
Fibra cruda (930.10). Evaluada en base a una digestión in vitro mediante tratamientos
ácidos y alcalinos, separando los constituyentes solubles de los insolubles.
Proteína total (N x 6.25) (Método 978.04). Se calcula indirectamente mediante un
sistema Kjeldahl que cuantifica el nitrógeno contenido en la muestra.
Extracto no nitrogenado (ENN). Se obtiene por diferencia al 100% de la muestra, la
sumatoria de los componentes anteriormente mencionados.
EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS AL CPG
El CPG se dividio en dos lotes a uno de ellos se le realizo un tratamiento para extraer los
compuestos fenólicos, conforme a la metodología de Nithiyanantham et al., (2012) con
modificaciones. El concentrado proteico fue sometido a dos lavados con una solución de
acetona-agua (70:30 v/v) en una relación 1:5 (concentrado/acetona, p/v), posteriormente se
decantó el líquido sobrenadante, dejando evaporar el disolvente restante a temperatura
ambiente durante 20 h. A partir de este momento se tendrán dos tipos de muestra: el
concentrado proteico conteniendo compuestos fenólicos (CPG) y el concentrado proteico
reducido en compuestos fenólicos (CPGr).
DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS AL CPG Y CPGr
Se realizó como describe Aguilera et al., (2011) con modificaciones. Los CPG y CPGr fueron
suspendidos en una solución de metanol acidificado con 1 % de HCl (v/v), en una relación
1:5 (concentrado: solución, p/v) durante 30 min. Luego, cada suspensión fue centrifugada a
5 000 rpm por 10 min. Los sobrenadantes se utilizaron directamente para la estimación de
fenólicos totales empleando el reactivo de Folin-Ciocalteu, con ácido gálico como estándar
(Singleton et al., 1999). El ensayo por triplicado se realizó de acuerdo con Nithiyanantham et
al., (2012), alícuotas (100 µL) de los extractos fueron colocados en tubos de ensayo y se
completó el volumen a 1 mL con agua destilada. 0.5 mL de reactivo de Folin- Ciocalteu (1:1
con agua) y 2.5 mL de solución al 20% de carbonato de sodio (Na2CO3) fueron adicionados
secuencialmente en cada tubo y se agitan en un vórtex. Hecho esto, los tubos se colocan en
la oscuridad por 40 min, y finalmente se midió la absorbancia a 725 nm. Los valores de las
absorbancias obtenidas para cada muestra fueron interpolados en la curva tipo de ácido
gálico (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mg/mL). La concentración de fenólicos totales fue obtenida en
mg equivalente de ácido gálico/ g (mg EAG/g).
34
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL CPG Y CPGr
La hidrólisis enzimática de las muestras de CPG y CPGr se efectúo secuencialmente con
pepsina de mucosa gástrica porcina P-7125 (Sigma Aldrich) y pancreatina de páncreas
porcino P-1750 4xUSP (Sigma Aldrich), usando un digestor de 100 mL con agitación,
termómetro y un electrodo de pH. La reacción se llevó a cabo por 120 min, tomando alícuotas
cada 15, 30, 60, 90 y 120 min y se mantuvo el pH constante durante el tratamiento enzimático.
Las condiciones de hidrólisis fueron: concentración de aislado de proteína al 5%; proporción
enzima/sustrato, 1:20 (p/p); pH, 2 para pepsina y 7.5 para pancreatina; a 37°C. Las enzimas
en las alícuotas fueron inactivadas por calor a 93°C por 5 min. Cada hidrolizado fue
centrifugado a 10,000 rpm por 15 min para separar material insoluble, y congelado para su
almacenamiento.
DETERMINACIÓN DE GRADO DE HIDRÓLISIS
Se evaluó utilizando el método reportado por Kim et al., (1990), mediante el cual se estimó
la cantidad de nitrógeno soluble en ácido tricloroacético (TCA) al 10%, con respecto a su
proporción de nitrógeno sin hidrolizar en el concentrado proteico, según la ecuación:
%𝐺𝐻 = 𝑁𝑠𝑜𝑙𝑢𝑏𝑙𝑒 𝑒𝑛 𝑇𝐶𝐴 𝑎𝑙 10%
𝑁𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 (100)
Para determinar el nitrógeno soluble en TCA se tomó una alícuota de 5 mL de cada
hidrolizado y se mezclaron con 5 mL de TCA al 10%. Esta mezcla fue centrifugada a 10 000
rpm por 15 min y el nitrógeno del sobrenadante se analizó con el método Kjeldahl (método
978.04; AOAC, 2012).
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA SOLUBLE POR EL MÉTODO DEL ÁCIDO
BICINCONÍNICO (BCA)
La concentración de proteína soluble en los hidrolizados se determinó por el método del ácido
bicinconínico (4,4’-dicarboxi-2,2’-biquinolina), que es un ensayo colorimétrico comúnmente
empleado para estimar la concentración de proteína en una muestra. Se basa en la reducción
de cobre (II) con las proteínas en medio alcalino, produciendo cobre (I) y formando un
35
complejo purpúreo con el BCA (cromóforo Cu+1(BCA)2) (Figura 12), que absorbe en la región
de los 560 nm (Zaia et al., 1998).
Figura 12. Complejo BCA-Cu. Fuente: Bainor et al. (2011)
El ensayo fue realizado por triplicado en una microplaca de 96 pozos, para lo cual se tomaron
14 µL de hidrolizado y 286 µL del reactivo BCA (preparado en una relación 1:50 de
CuSO4•5H2O-BCA), se incuba en baño maría a 60°C por 15 min para el desarrollo de color.
Después se enfría hasta temperatura ambiente y se lee la absorbancia a 562 nm. Los
resultados se interpolan en una curva tipo de 0.4 hasta 1.0 mg/mL de una solución estándar
de albúmina sérica bovina (BSA).
DETERMINACIÓN DEL PERFIL ELECTROFORÉTICO
La caracterización electroforética de los concentrados e hidrolizados se realizó en un gel de
poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, donde se anula el efecto de forma y carga
de la proteína, sólo separándose por el peso molecular. Para lograrlo se utilizan tiol-
reductores fuertes como mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT) y un detergente desnaturalizante
fuerte: el dodecil sulfato de sodio (SDS) (Badui, 2013). Se empleó la metodología de Laemmli
(1970) modificada, usando un gel separador Mini-Protean® TGX marca Bio-Rad, con un
gradiente del 8-16% de poliacrilamida en un equipo Mini-Protean 3 de BioRad®. 250 µL de
las muestras de hidrolizados fueron solubilizadas en 250 µL de regulador de Laemmli y
agitadas en un vortex para después ser calentadas a ebullición por 5 min.
Se aplicaron 15 µL tanto para la muestra como para el marcador (Kaleidoscope® marca Bio-
Rad 10-250 kD) en cada pozo del gel. La separación electroforética se realizó a 100 V por
90 min. Posteriormente el gel se colocó en una solución de TCA al 12.5% agitando a 30 rpm
durante 30 min. El gel se tiñó con una solución conteniendo 40% de metanol, 7% de ácido
36
acético y Azul de Coomassie R-250 (0.125%) durante toda la noche. El proceso de desteñido
consistió en lavar tres veces el gel en una solución de etanol al 50% por 15 min, aplicándose
después una solución de etanol - ácido acético – agua (30 – 7 – 63 % v/v) por 30 min, y
finalmente se lavó con una solución de metanol – ácido acético – agua (30 – 7 – 63 % v/v)
por 30 min.
EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
ABTS·+
La solución con el radical ABTS·+ [2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina)-6 sulfonato de amonio]
se preparó con 38 mg de ABTS y la adición de 6.62 mg de persulfato de potasio, aforados a
10 mL con agua destilada. La solución resultante reposó en la oscuridad a temperatura
ambiente durante 16 h para la estabilización del radical. Transcurrido el tiempo, es necesario
ajustar la absorbancia de la solución hasta 0.800 ± 0.05 a una longitud de onda de 734 nm.
Para el análisis de las muestras, se tomaron 3.5 µL de cada hidrolizado y se añaden 296.5
µL del reactivo de ABTS en una microplaca de 96 pozos. La absorbancia fue medida a 734
nm a los 0 y 6 min con un espectrofotómetro (ThermoScientific Multiskan Go, Software SkanIt
4.1), cuyos resultados se interpolaron en una curva tipo de Trolox de 0.6, 1.2, 1.5, 2.1, 2.7 y
3 mM, se tomaron 3.5 µL de cada una de estas soluciones por triplicado, añadiendo 296.5
µL del reactivo de ABTS·+ ajustado. Las absorbancias fueron leídas para cada concentración
de Trolox después de 6 min.
Cálculo de inhibición:
%𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 = (𝐴𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 − 𝐴𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙
𝐴𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙) 100
Con los resultados obtenidos, se construye una gráfica que presenta el porcentaje de
inhibición en función de la concentración de Trolox, a partir de la cual se interpolan los valores
de lecturas de absorbancia de las muestras, y se reporta en mmol equilaventes de Trolox/g
de muestra.
37
DPPH
Este método se basa en la reducción del radical DPPH· (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) que es
un cromógeno púrpura) a su hidrazina correspondiente (DPPH-H, color amarillo) al
reaccionar con los antioxidantes (donadores de hidrógeno) (Sánchez-Moreno, 2002).
Se preparó una solución de 125 µM del reactivo DPPH en metanol al 80%. En una microplaca
de 96 pozos, se añadieron por triplicado 28 µL de muestra con 272 µL de solución de DPPH,
protegidos de la luz, fueron homogeneizados y dejaron reposar por 1 h. Al cabo de este
tiempo, se leyó a 520 nm en un espectrofotómetro (ThermoScientific Multiskan Go, Software
SkanIt 4.1).
La actividad antirradical se calculó como el porcentaje de decoloración de DPPH, usando la
siguiente ecuación:
% 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑟𝑟𝑎𝑑𝑖𝑐𝑎𝑙 = 𝐴𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 − 𝐴𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
𝐴𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 (100)
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Todos los resultados fueron procesados mediante estadística descriptiva utilizando medidas
de tendencia central (media) y dispersión (desviación estándar).
39
La Figura 13 ilustra grosso modo todo el proceso realizado desde la recepción de los granos
de garbanzo al laboratorio donde fue molido y tamizado con el fin de aumentar la superficie
de contacto. Fue determinado el análisis químico proximal a la harina tamizada.
Posteriormente se preparó para la extracción y precipitación de las proteínas valiéndonos del
punto isoeléctrico. Una vez hecho esto el concentrado obtenido fue liofilizado para facilitar la
manipulación y como forma de extender su vida útil. También fue determinado el análisis
químico proximal con el objetivo de saber cuánto se logró concentrar el contenido original de
proteína.
Después el 50% de la cantidad total obtenida fue sometida a una extracción de los
compuestos fenólicos presentes utilizando dos tipos de disolventes y así se obtuvieron dos
tipos de concentrado proteico, uno sin tratamiento y otro reducido en fenólicos. Luego cada
uno fue hidrolizado por 45 min con una solución enzimática de pepsina, y posteriormente fue
digerido con solución enzimática de pancreatina por 75 min más, tomando alícuotas al tiempo
0, 15, 30, 60 y 120 min totales. Los hidrolizados obtenidos una vez que se detenía la reacción
fueron centrifugados para eliminar remanentes de la digestión y fueron congelados para su
almacenamiento. Posteriormente se realizaron los ensayos para grado de hidrólisis, proteína
soluble, electroforesis en gel de poliacrilamida bajo condiciones desnaturalizantes para saber
el peso molecular de los hidrolizados, así como la evaluación final de la capacidad
antioxidante con las técnicas del radical ABTS y el reactivo DPPH.
40
RESULTADOS Y DISCUSIONES
OBTENCIÓN DEL CPG
La manera más fácil y económica de preparar un aislado proteico es aprovechando la
diferencia de solubilidad y el punto isoeléctrico de las fracciones proteicas de interés. Para la
obtención de estos aislados por lo general se utiliza agua y álcalis ajustados a un valor de
pH que depende de cada caso. En el presente estudio fue empleado un total de 3 200 g de
harina previamente desengrasada, cuyo contenido de proteína era de 13.32 % b.s. y
concluido el proceso de precipitación de las proteínas y su liofilización, el peso final del
concentrado fue de 371.7 g generando un rendimiento promedio final de 11.61 % (Cuadro
4); con un porcentaje de proteína de 87.27 % b.s. (Cuadro 5), que es un valor superior al que
obtuvieron Sánchez-Vioque et al., (1999) de 78.0%, y similar al que determinó Paredes-
López (1991) de 87.8% ± 0.6 b.s. en condiciones análogas.
Cuadro 4. Rendimiento en la extracción de la proteína por lote
Harina desengrasada
(g)
Concentrado liofilizado
(g)
Rendimiento
(%)
400.00 38.60 9.65
800.00 102.41 12.80
800.00 99.62 12.45
400.00 42.75 10.69
800.00 88.39 11.05
3,200.00 371.77 Promedio =
11.32%
Aunque la solubilidad de las proteínas del garbanzo es mínima al pH 4.3, existe pérdida de
aquellas moléculas que son solubles a este pH, especialmente las albúminas (Berot y Davin,
1996), fracción que representa el 12% del total de la concentración de proteínas en el
garbanzo (Chavan et al., 1989). Por lo tanto, de acuerdo con la concentración final de
proteínas que se lograron extraer (87.27% b.s.), se obtuvo un concentrado (55–89%
proteína), a diferencia de un aislado cuyo contenido debe ser mayor al 92% (Harrison Sport
Nutrition, 2017).
Las atracciones intermoleculares débiles se conservan en el pH natural del medio donde
encuentran las proteínas. Un cambio en éste acarrea modificaciones en la estructura terciaria
41
por los cambios en la ionización de las cadenas laterales cargadas (Badui, 2013). En los
procesos tecnológicos cuyo fin es la obtención de aislados proteicos vegetales, el tratamiento
alcalino se aplica con mayor frecuencia a valores de pH cercanos a 10 mediante
solubilización alcalina (Badui, 2013). Posteriormente, se lleva el pH a valores ácidos que
implique una protonación de cargas principalmente de los aminoácidos Asp y Glu, y que al
ser los aminoácidos que se encuentran en mayor cantidad en la proteína del garbanzo
(Cuadro 3), su solubilidad va disminuyendo hasta llegar al pH óptimo reportado por Sánchez-
Vioque et al., (1999) que es de 4.3.
El no haber realizado un tratamiento adicional al precipitado con disolventes polares y no
polares, con el fin de extraer compuestos que pudieran ser solubles en ellos, como fibra,
lípidos, azúcares solubles, así como otros carbohidratos, provoca que el contenido de
proteína disminuya con respecto a un concentrado proteico que sí lo tiene (Sánchez-Vioque
et al., 1999).
ANÁLISIS QUÍMICO PROXIMAL
El análisis químico proximal se realizó a la harina y al CPG (Cuadro 5). Las leguminosas son
consideradas una buena fuente de proteína, observando que el contenido de proteínas, a
pesar de ser baja con respecto a lo reportado en otras investigaciones como la de Sánchez-
Vioque, (1999), con un valor de 24.7% para la harina, esté continúa siendo considerable, en
comparación con otras fuentes proteicas como los cereales, lacteos, cárnicos, cuyo valor no
es mayor del 10%, (Badui, 2013).
El contenido de proteína varía significativamente cuando se considera la masa total del grano
seco (17-22%) y cuando es descascarado, pudiendo incrementarse hasta 25.3 - 28.9%. En
el procedimiento que se realizó dentro de esta investigación no se consideró la eliminación
de la cáscara previo a la molienda, por lo que esa podría ser una de las razones por las
cuales, el rendimiento de proteína es menor comparado con otros estudios. La calidad de la
proteína del garbanzo es equivalente al que ofrece el grano de frijol de soya (Friedman,
1996), pero como ya se ha mencionado, el garbanzo tiene factores no nutricionales que
disminuyen la disponibilidad de la proteína. De acuerdo con Singh (1988), los inhibidores de
proteasas y amilasas, lectinas, polifenoles y algunos carbohidratos son los principales
42
factores no nutricionales. Otros factores son el ácido fítico y carbohidratos no digeribles como
la rafinosa y estaquiosa.
Cuadro 5. Composición proximal de la harina y el concentrado proteico (g/100g) en base seca
Determinación Harina Concentrado Proteico
Cenizas 4.35 ± 0.15 3.05 ± 0.05
Extracto etéreo 11.39 ± 0.71 3.37 ± 0.85
Proteína 13.32 ± 0.19 87.27 ± 0.84
Fibra Cruda 19.62 ± 0.06 2.93 ± 0.19
Carbohidratos* 51.32 3.38
*Obtenido por diferencia
± Desviación estándar de tres determinaciones
En el presente trabajo se determinó que la cantidad de proteína era de 13.32%, aunque se
han reportado diferencias, debidas principalmente a la variedad y región de cultivo, por
ejemplo: Williams y Singh (1987) reportaron de 17 a 24%, Newman et al., (1987) entre 12.6
y 30.5%, De Haro y Moreno (1992), entre 15.5 y 28.2%. El-Adaway y Alajaji (2006)
determinaron que la digestibilidad in vitro de la proteína es de 83.61%, por lo que su calidad
proteica es de las mejores entre las leguminosas. El contenido en proteína es un carácter
muy influenciado por el ambiente y, por lo tanto, poco heredable (Kharrat et al., 1990). Al
igual que para el resto de las leguminosas, son los aminoácidos azufrados (cisteína y
metionina) los aminoácidos limitantes (De Haro y Moreno, 1992; Jambunathan y Singh, 1980;
Gil et al., 1996).
Las leguminosas exhiben altos valores de minerales que dependen de la especie, las
condiciones de cultivo y las características con las que crece la planta. En valor reportado en
el presente estudio concuerda con lo reportado por Sánchez-Vioque et al., 1999 y Mondor et
al., 2009.
El garbanzo es una buena fuente de carbohidratos, que en el presente estudio es de 51.32
% del contenido total en base seca, pudiendo llegar a tener hasta 80% del peso seco total
del grano (Aguilar-Raymundo et al., 2013). Principalmente la concentración de
monosacáridos en el garbanzo son galactosa (0.05%), ribosa (0.1%), fructosa (0.25%) y
43
glucosa (0.7%), mientras que, en los disacáridos libres, los más abundantes son la maltosa
y la sacarosa (0.6 y 1-2% respectivamente). El garbanzo contiene oligosacáridos que no son
digeridos ni absorbidos por el sistema digestivo humano, pero son fermentados por las
bacterias del colon. Los α- galactósidos son los más abundantes en la semilla de garbanzo,
representando alrededor del 62% de los azúcares totales (Frimpong, 2010; Jukanti et al,
2012). Cabe resaltar el contenido de almidón, que llega a representar del 37.5 al 50.8% del
contenido de carbohidratos totales en el garbanzo, siendo mayor en la variedad Kabuli
(Frimpong, 2010). El garbanzo también contiene polisacáridos que no forman parte del
almidón, y se dividen en dos grupos: solubles e insolubles. La parte soluble está integrada
por hemicelulosa (3.5-9%) y sustancias pécticas (1.5-4%).
Los azúcares pueden producir una pérdida de la calidad de la proteína ya que reaccionan
con éstas mediante la reacción de Maillard (Davies et al., 1998; Friedman, 1996a) dando
lugar a la formación de una base de Schiff y produciéndose una disminución en el contenido
de lisina, metionina y triptófano asimilable (Hurrel et al., 1983; Hurrel et al., 1985; Finot, 1982;
Finot et al., 1982).
Aunque la harina fue sometida a extracciones de lípidos con hexano, los remanentes son
mayoritariamente de naturaleza polar (Sánchez-Vioque, et al. 1999). El porcentaje
cuantificado de 3.37% para el CPG puede llegar a ser de importancia por la posible
interacción de éstos, primero, con el oxígeno en la formación de radicales libres; y segundo,
en la interacción de éstos con la proteína misma, (Kikugawa et al., 1981). En parte son
responsables de otorgar sabor a los concentrados proteicos. Los lípidos pueden formar
complejos con la amilosa y alterar la biodisponibilidad, mayormente del almidón (Cai et al,
2001; Candela et al, 1997).
Una vez que se ha obtenido el concentrado se puede observar la modificación de los
diferentes componentes. En el caso de la proteína, de 13.32% que se tenía inicialmente,
pudo concentrarse hasta el 87%, con la consecuente disminución de los demás
componentes. Aunque el concentrado proteico tiene una mayor riqueza proteica con respecto
a la harina, aún presenta contenidos elevados de otros componentes no deseados en el
producto final. Entre estos compuestos se destaca la fibra, los azúcares, lípidos y como se
describirá más adelante, los compuestos fenólicos.
44
DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS TOTALES
La determinación de los compuestos fenólicos totales (CFT) se realizó por el método de Folin-
Ciocalteu para el CPG y CPGr. Como se puede observar en el Cuadro 6, la concentración
de CFT en la muestra sin el tratamiento de acetona-agua fue de 3.381 ± 0.409 mg eq. de
ácido gálico/g de muestra seca, resultado similar al reportado por Singh (1988) de 3.03 mg/g
y por Segev et al., (2010) de 0.5 a 6.8 mg eq. (+)-catequina/g; aunque difiere de lo reportado
por Nithiyanantham et al. (2012), que reportó 19.42 ± 2.72 mg eq. ácido tánico/g, y por
Sreerama et al., (2012) de 10.84 ± 0.12 mg eq. ácido gálico/g para las harinas
desengrasadas. Xu y Chang (2008), reportaron un contenido de polifenoles en el frijol negro
Turtle Eclipse de 9.70 ± 0.35 mg EAG/g
Cuadro 6. Concentración de compuestos fenólicos en CPG y CPGr
CPG A765 mg/mL mg/g Promedio (mg/g)
CPG
0.3038 0.1620 3.2407
3.381 ± 0.409 0.3508 0.1920 3.8410
0.2897 0.1530 3.0606
CPGr
0.1093 0.0378 0.7567
0.754 ± 0.007 0.1095 0.0379 0.7592
0.1085 0.0373 0.7464
± Desviación estándar de tres determinaciones
La variación en la concentración de estos compuestos se puede atribuir a factores genéticos,
oscilación entre cada cultivo, así como el procedimiento de extracción utilizado (Amarowicz
y Pegg, 2008). Los polifenoles se encuentran de forma más abundante en el pericarpio del
grano, el cual fue separado en su mayoría durante el proceso de molienda y posterior
tamizado, lo que podría explicar los valores por debajo de los reportados en estudios
anteriores. Sin embargo, la presencia de estos, aún en baja concentración podría causar
interferencia al momento de realizar la hidrólisis. Durante el proceso de purificación de las
proteínas, en presencia de oxígeno, los compuestos fenólicos se oxidan en medio alcalino,
dando como producto ortoquinonas que se polimerizan y forman un color pardo. También es
posible que reaccionen con grupos amino terminales, con lo cual disminuye la disponibilidad
45
tanto de estos compuestos, como de algunos aminoácidos, especialmente lisina y metionina
(Cuq, 1996).
En cuanto al CPGr, se observa una disminución en la concentración de CFT teniendo
solamente 0.754 ± 0.007 mg eq. ácido gálico/g, que nos indica la eficiencia en la extracción
usando este sistema (88%).
Se ha reportado que los polifenoles presentes en el pericarpio de la semilla de frijol presentan
actividad antioxidante y pueden disminuir la digestibilidad de proteínas (Boateng et al., 2008;
Cardador-Martínez et al., 2002; Oomah et al., 2005; Xu y Chang, 2008). Para disminuir la
interferencia de éstos en las pruebas de actividad antioxidante de los posibles péptidos
contenidos en la muestra de estudio, se ha realizado la misma extracción con acetona al 75%
(Carrasco-Castilla et al., 2012), logrando la reducción de estos compuestos en 94.7 %.
Boateng et al., (2008) reportó menor contenido de compuestos fenólicos (6.21 mg EAG/g)
extraídos con etanol.
La disminución de compuestos fenólicos es posible porque están involucrados mecanismos
reversibles en la interacción de estos compuestos con las proteínas, siendo los enlaces
iónicos los que han sido reportados como predominantes, pero hay otras interacciones, tales
como puentes de hidrógeno, enlaces hidrofóbicos y fuerzas de van der Waals (Hernández-
Jabalera et al., 2015).
Los compuestos fenólicos pueden dividirse en dos clases: tipo flavonoides y no flavonoides.
Las isoflavonas son una clase importante de flavonoides en la familia Leguminosae, y en el
garbanzo se han encontrado dos clases principales: biochanina A y formononetina (Figura
9). Para la extracción de compuestos flavonoides que poseen un gran número de grupos
hidroxilo insustituidos o azúcares (son considerados polares), se emplean disolventes
polares como el metanol, etanol, acetona, DMSO o agua (Pérez-Nájera et al., 2013).
DETERMINACIÓN DEL GRADO DE HIDRÓLISIS
El uso de técnicas in vitro que simulen una digestión in vivo ha sido extensamente usada en
animales y humanos (Ribeiro et al., 2016). Para ello fue realizada una hidrólisis secuencial
con pepsina a pH 2 durante 45 min, emulando una digestión en el estómago; seguido del uso
de pancreatina a pH 8 para recrear las condiciones del intestino delgado. La Figura 14 ilustra
la curva de hidrólisis obtenida para los dos tipos de muestras probadas.
46
Figura 14. Curvas de hidrólisis del concentrado proteico de C. arietinum L.
La pepsina es una proteasa aspártica cuyo pH óptimo es 2.0, aunque puede estar activa en
un intervalo de 1.0-4.0, y una temperatura óptima de 37°C. En contraste con otras peptidasas,
solamente hidroliza enlaces peptídicos, no enlaces amidas ni ésteres. Es específica para la
configuración óptica de los aminoácidos, siendo los de tipo aromático buenos sustratos,
especialmente si el otro residuo es aromático o un ácido dicarboxílico. Esta especificidad
puede ser un limitante al momento de realizar cualquier hidrólisis con esta enzima, ya que
influye la composición de la proteína. Así es como se forman productos intermediarios, cuyo
carácter físico es opuesto a los de las proteínas más complejas de las que se derivan,
resaltando el aumento de su solubilidad en agua. Esta solubilización de las proteínas parece
ser la función principal de la pepsina, pues las sustancias proteicas formadas son demasiado
complejas para ser absorbidas por las paredes digestivas (Malewiak y Péquignot, 1997).
Como se observa en el Cuadro 7, hasta el minuto 30, el porcentaje de hidrólisis no fue mayor
al 20% para ambas muestras, el cual aumentó cuando fue adicionada la pancreatina, ya que
al ser una mezcla de endo- y exopeptidasas, contribuye a una mayor fragmentación de los
enlaces peptídicos. A nivel metabólico, lo que ocurre es que el quimo ácido llega al duodeno,
0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
80.00
0 20 40 60 80 100 120 140
% G
rad
o d
e H
idró
lisis
Tiempo (min)
CPG CPGr
47
donde las secreciones pancreáticas, biliares e intestinales se desencadenan en seguida por
mediación de dos hormonas duodenales: la secretina y la hormona duodenal colescitocinina-
pancreozimina (CCK-PZ) que condiciona la secreción simultánea de bicarbonatos (que
elevan el pH) y de enzimas, que son activas en medio alcalino (alrededor de 7- 8). Las dos
enzimas principales de la digestión proteica son la tripsina y quimotripsina, que se encargan
de continuar con la acción de la pepsina. Este conjunto de proteasas pancreáticas degrada
las proteínas hasta la fase de oligopéptidos de 2, 3 o 4 aminoácidos (Malewiak y Péquignot,
1997).
Cuadro 7. Curva de hidrólisis enzimática del concentrado proteico
Tiempo (min) % Grado de Hidrólisis
CPG CPGr
15 10.55 ± 1.53 13.27 ± 1.47
30 17.33 ± 1.75 20.39 ± 2.96
60 26.37 ± 2.08 39.80 ± 1.48
90 39.18 ± 3.65 57.12 ± 1.52
120 45.92 ± 2.17 68.30 ± 2.04
± Desviación estándar de tres determinaciones
En la Figura 12 es posible apreciar un incremento en el grado de hidrólisis cuando el
concentrado proteico fue sometido a lavados con acetona para disminuir la concentración de
fenólicos totales. Dichos resultados ofrecen una pauta para mostrar la interacción de estos
compuestos con las proteínas del garbanzo, y su posible interferencia en la acción de las
enzimas, ya que al estar en menor cantidad el grado de hidrólisis aumentó hasta un 68.30 %
con lo cual podemos inferir que se están liberando más péptidos en el CPG reducido en
fenólicos. Sin embargo, una proteólisis extensiva puede afectar las potenciales propiedades
antioxidantes (Elías et al., 2008) ya que los aminoácidos libres no tienen buenas propiedades
antioxidantes, que podría verse reflejado posteriormente.
Hernández-Jabalera et al., (2015) reportaron un grado de hidrólisis máximo de 24.01% en
concentrados proteicos de semilla de colza reducidos en compuestos fenólicos, utilizando un
sistema pepsina-pancreatina durante 240 min de hidrólisis, que es un valor menor al
encontrado en el presente estudio. La diferencia puede radicar en la concentración de enzima
48
utilizada, ya que los investigadores emplearon las enzimas al 1% mientras en este trabajo la
concentración fue de 5%.
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA SOLUBLE
Para que se puedan obtener efectos benéficos, los péptidos resultantes de la digestión deben
alcanzar el intestino delgado en una forma activa, o bien, ser activados dentro de él (Ribeiro
et al., 2016). La absorción de los nutrientes depende de su carácter hidrosoluble y son
transportados hacia los capilares sanguíneos que desembocan en la vena porta (Malewiak y
Péquignot, 1997) que en el caso de aminoácidos y oligopéptidos son absorbidos por
mecanismos activos por medio de transportadores dependientes de ATP. Se debe asegurar
que la proteína cuantificada fuera solamente la soluble, por lo que se procedió a realizar una
precipitación previa con ácido tricloroacético (TCA) al 12% para separar los remanentes de
la hidrólisis, como son las enzimas o la proteína que no logró ser hidrolizada. No se sabe
mucho acerca del mecanismo de precipitación del TCA, pero se sugiere una agregación
hidrofóbica como mecanismo dominante (Novák y Havlíček, 2016).
El contenido de proteína soluble en los hidrolizados fue cuantificado por el método del ácido
bicinconínico (BCA), el cual fue elegido ya que la proteína del garbanzo es rica en residuos
de arginina (Cuadro 3), lo que produciría un resultado artificialmente alto en la técnica de
Bradford. Además, las técnicas de Lowry y BCA ofrecen mejores resultados cuando las
muestras son mezclas complejas de proteínas (Olson y Markwell, 2007).
Similarmente, como ocurre en el grado de hidrólisis, se puede observar un aumento en la
concentración de proteína soluble cuando el concentrado de proteina es sometido a una
extracción de fenólicos (Figura 13). Pringent et al., (2003) sugirieron que la disminución en
la solubilidad de las proteínas se debe a interacciones no covalentes entre compuestos
fenólicos y proteínas, que las precipitan mediante mecanismos multidentados (por
interacciones simultaneas con más proteínas) o bien, por recubrimientos con una monocapa
menos hidrofílica. Como consecuencia, se tiene un cambio en la carga neta de las proteínas.
Sin embargo, en ambas muestras, se observa la máxima solubilidad en el minuto 30,
manteniéndose constante el resto de la hidrólisis (Cuadro 8). En la técnica de BCA, la primera
reacción ocurre como resultado de la interacción entre el complejo de cobre-BCA con los
residuos de cisteína, cistina, triptófano, y tirosina. A elevadas temperaturas (60°C fue la
empleada en esta técnica), el enlace peptídico también es responsable en el desarrollo de
49
color. Arcan y Yemenicioğlu (2010) encontraron que la concentración de proteína soluble
disminuía conforme aumentaban la concentración de enzima -que en este caso coincide con
la adición de pancreatina al sistema-, el cual indicaba una hidrólisis extensiva y pérdida de
enlaces peptídicos que puedan favorecer el desarrollo de color en el ensayo, lo que puede
explicar los valores constantes en los hidrolizados posteriores a 30 min.
Cuadro 8. Proteína Soluble en CPG y CPGr
Tiempo (min) Proteína Soluble (mg/mL)
CPG CPGr
0 6.424 ± 0.59 14.771 ± 0.15
15 9.372 ± 0.72 23.337 ± 0.33
30 10.447 ± 0.69 24.729 ± 0.54
60 9.362 ± 0.58 23.267 ± 1.00
90 7.739 ± 2.46 23.093 ± 1.28
120 9.338 ± 1.28 23.240 ± 1.43
± Desviación estándar de tres determinaciones
Figura 15. Proteína soluble en CPG y CPGr
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
0 15 30 60 90 120
mg
BSA
/mL
Tiempo (min)
CPG CPGr
50
DETERMINACIÓN DEL PERFIL ELECTROFORÉTICO
Como se mencionó anteriormente, una vez que la digestión en el intestino se ha llevado a
cabo, los oligopéptidos resultantes deben tener el tamaño adecuado para ser transportados
al interior del torrente sanguíneo y así puedan ejercer su actividad. Por ello es necesario
determinar el peso molecular para saber si éstos pueden llegar a las células donde son
requeridos. Cuando se llevan a cabo experimentos de electroforésis en geles granulados que
contienen cantidades crecientes de bisacrilamida, se debe tener en cuenta que las moléculas
de poliacrilamida formadas se encuentran como un sistema de filamentos distribuidos al azar,
cada uno de ellos formado por dos a cinco cadenas paralelas. Al aumentar los enlaces
cruzados, el diámetro del poro en estos geles puede llegar a ser tan pequeño como 60 Å,
aportando una matriz no cargada, en la que la separación se puede llevar a cabo con base
en el tamiz molecular y a las diferencias de movilidad (Gordon, 1975).
El dodecil sulfato sódico (SDS) es un detergente de acción desnaturalizante que se une a las
cadenas polipeptídicas desnaturalizadas (una molécula de SDS a cada dos aminoácidos de
la cadena). Esta unión masiva de moléculas de SDS bloquea la carga propia de la proteína
o hidrolizado, y le confiere al complejo una carga neta negativa proporcional a su masa,
haciendo que todas las proteínas acomplejadas con SDS viajen hacia la parte inferior del gel
de poliacrilamida. Por lo tanto, las moléculas de mayor tamaño quedarán rezagadas en la
parte superior del gel y las de menor tamaño pueden atravesar y pasar a través de los poros
(Clemente et al., 1999).
Las Figuras 16 y 17 ilustran los perfiles moleculares para los concentrados proteicos y los
hidrolizados En primera instancia, los geles muestran el efecto de la solubilidad para cada
una de las muestras, sobre todo en la banda del concentrado sin hidrolizar con extracción de
compuestos fenólicos (Figura 17 – C), el cual logró una separación más definida, y en
concordancia con Félix et al., (2018) la mayoría de estas bandas corresponden a las
proteínas globulares, legumina y vicilina. Específicamente, la banda que está cerca de los 50
kDa puede estar relacionada a la presencia de α, β, γ-vicilina. También aparece una banda
intensa a la altura de los 37 kDa, que puede ser atribuida específicamente a la subunidad
básica (β) de la legumina. Asimismo, podemos ver una banda a la altura de los 20 kDa, y
51
puede corresponder a la proteína 11S del garbanzo. Por último, podemos apreciar una ligera
banda a la altura de los 10 kDa, que es posible atribuirla a la subunidad α-legumina.
Figura 16. Perfil electroforético de CPG. M= marcador. C=Concentrado proteico
Figura 17. Perfil electroforético de CPGr. M= marcador, C= concentrado
Al contrario, en la Figura 16, en el carril C, no se logró una separación de los componentes
de la proteína del garbanzo, excepto por dos que se encuentran entre 25-37kDa, y como ya
se mencionó anteriormente, corresponden a la proteína 11S del garbanzo. La aglutinación
52
del resto de las proteínas se atribuye a la existencia de interacciones no covalentes entre
éstas y los compuestos fenólicos, comportamiento que continúa hasta el minuto 30 de la
hidrólisis, cuyo resultado concuerda con lo reportado en la proteína soluble para esta
muestra, donde la concentración no era mayor de los 10 mg/mL. Conforme se hidrolizan las
proteínas, se observa una acumulación de intensas bandas a la altura de los 10 a 15 kDa,
indicando que efectivamente se están obteniendo péptidos de bajo peso molecular.
Al mismo tiempo, con el aumento en el tiempo de hidrólisis van apareciendo líneas más
definidas, como es el caso de las bandas correspondientes a los 90 y 120 min en ambos
tipos de muestras, en el rango de 20 a 25 kDa, cuya naturaleza corresponde a proteínas
resistentes a la digestión enzimática. La digestión de semillas de garbanzo conduce a la
eliminación de la mayoría de sus proteínas de almacenamiento, cuya excepción son las
vicilinas y, en menor medida, las leguminas. Vicilinas y leguminas, de garbanzo y chicharo,
ya se ha demostrado que resisten tanto la digestión in vivo como in vitro (Ribeiro et al. 2016).
Estas proteínas, de la superfamilia de Cupin, se caracterizan por tener tanto efectos
benéficos en la salud y como propiedades alergénicas.
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
El potencial antioxidante de los hidrolizados proteicos depende del número de fragmentos,
su longitud, composición de aminoácidos, así como los complejos que formen con otros
compuestos tales como polifenoles y su estructura secundaria y terciaria (Elías et al. 2008).
La prueba con DPPH (Figura 18) ha sido considerada como una de las más rápidas y
precisas para evaluar las propiedades antioxidantes de frutas y vegetales. La capacidad
antioxidante se mide determinando el DPPH• remanente por medio de espectrofotometría
donde se cuantifica la decoloración de la reacción, la cual se produce al adicionar el
antioxidante a la solución metanólica o etanólica de DPPH (Brandwilliams et al., 1995).
53
Figura 18. Determinación de la capacidad antioxidante por la técnica de DPPH
Otro de los ensayos más comunes para determinar la capacidad antioxidante es el ABTS
(Figura 19), en el cual se mide la disminución de la absorbancia de este radical por acción
de los antioxidantes después de un periodo de incubación. La concentración remanente de
ABTS•+ se determina espectrofotométricamente a 734 nm. Cuando se emplea Trolox (un
análogo hidrosoluble de la vitamina E) como estándar de referencia, el método se llama
TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) (Álvarez-Parrilla et al., 2012).
Figura 19. Determinación de la capacidad antioxidante por la técnica del radical ABTS
De acuerdo con el Cuadro 9, se puede observar que el porcentaje de actividad antirradical
va aumentando conforme las proteínas son sometidas a un mayor tiempo de hidrólisis.
Aunque no se observa una diferencia entre ambos tipos de muestra, puesto que el máximo
valor obtenido en el CPG fue de 25.403 ± 5.940 % y para la muestra reducida en fenólicos,
54
el valor fue ligeramente mayor con 29.258 ± 4.510 % a los 120 min para ambos. Estos
resultados son similares a los que Torres-Fuentes et al., (2015) reportaron con DPPH, y que
inician en aproximadamente 10% hasta un máximo de 44.6% en hidrolizados proteicos de
garbanzo en concentraciones de hasta 100 mg/mL. De forma similar, Zhang et al., (2011)
obtuvieron valores similares de inhibición, siendo el máximo de 45.33% para un péptido con
peso molecular de 717.37 Da. Esto da una pauta para plantear una posible liberación de
péptidos con una naturaleza similar en los hidrolizados obtenidos en el presente estudio.
Por otro lado, Hernández-Jabalera et al., (2015) reportó un valor de 23.34 ±0.40% para
hidrolizados de concentrado proteico de semilla de colza.
Cuadro 9. Actividad antirradical DPPH en el CPG y CPGr
Tiempo (min) % Actividad Antirradical DPPH
CPG† CPGr ‡
0 18.654 ± 0.88 12.197 ± 5.71
15 19.542 ± 2.18 18.920 ± 4.16
30 17.077 ± 3.42 13.230 ± 3.95
60 19.176 ± 4.84 26.730 ± 7.77
90 23.937 ± 2.23 24.526 ± 2.74
120 25.403 ± 5.94 29.258 ± 4.51
± Desviación estándar de tres determinaciones
†El rango de concentración de proteína fue de 6.424 – 10.447 mg/mL
‡El rango de concentración de proteína fue de 14.771 – 24.729 mg/mL
Asimismo, puede observarse también que conforme avanza la hidrólisis, los valores de
actividad antirradical aumentan proporcionalmente. Este fenómeno se observa tanto en CPG
como en reducido en polifenoles, aunque entre ambos tipos de muestra no se muestra una
diferencia tan grande para afirmar que los fenólicos están ejerciciendo una acción favorable
en la actividad antioxidante.
Con respecto al ensayo de actividad antioxidante realizado con ABTS (Cuadro 10) los valores
obtenidos pueden considerarse altos si son comparamos con lo que reportó Kou et al.,
(2013), en el cual determinó una TEAC entre 0.453 y 1.918 mmol/L para hidrolizados de
albúminas del garbanzo con un rango de concentración desde 0.1 – 5 mg/mL.
55
Por el contrario, Carrasco-Castilla et al., (2012) reportó un valor de 1.82 mM TEAC/mg
proteína en hidrolizados de proteína de frijol usando un sistema pepsina-pancreatina.
Esta tendencia puede relacionarse incluso con la concentración de polifenoles que tiene cada
concentrado de la siguiente manera: La caída de absorbancia en la que se basan los cálculos
TEAC proporciona sólo estequiometría de reacción (moles totales ABTS•+ reducido por mol
antioxidante después de la reacción completa). Generalmente se pueden donar dos
electrones por grupo de fenol -OH, por lo que la capacidad antioxidante medida en TEAC
debería ser muy predecible a partir de la estructura antioxidante. De hecho, en estas
condiciones, los polifenoles son altamente favorecidos y otros efectos estructurales sobre la
reactividad antioxidante están ocultos (Schaich et al., 2015). En ese sentido, los compuestos
fenólicos estarían ejerciendo un efecto sinérgico en la evaluación de la capacidad
antioxidante de los hidrolizados, lo cual es evidente en la diferencia hallada para los dos tipos
de muestra, en el que la capacidad antioxidante con los fenólicos llega a ser hasta tres veces
mayor.
Cuadro 10. Actividad antioxidante empleando la técnica del radical ABTS en el CPG y CPGr
Tiempo (min) mM TEAC/mg proteína
CPG† CPGr‡
0 0.151 ± 0.013 0.046 ± 0.052
15 0.211 ± 0.071 0.052 ± 0.009
30 0.077 ± 0.090 0.102 ± 0.052
60 0.203 ± 0.074 0.103 ± 0.020
90 0.375 ± 0.031 0.110 ± 0.023
120 0.322 ± 0.055 0.185 ± 0.057
± Desviación estándar de tres determinaciones
†El rango de concentración de proteína fue de 6.424 – 10.447 mg/mL
‡El rango de concentración de proteína fue de 14.771 – 24.729 mg/mL
La relación que existe entre el grado de hidrólisis y la capacidad antioxidante se muestra en
las Figuras 18 y 19 para cada muestra (CPG y CPGr, respectivamente). Comparando ambas
gráficas se puede notar que existe un aumento general en la capacidad antioxidante a partir
del minuto 30, o bien, después de la adición de la pancreatina al sistema, con lo que se
56
confirma que hay posibilidad de que estos péptidos sean generados durante la digestión en
un organismo. Por otro lado, se debe tener en cuenta que una hidrólisis extensiva de las
proteínas puede llevar a la liberación de aminoácidos, que pueden afectar la capacidad
antioxidante de los hidrolizados, incluso disminuirla. Con todo lo anterior, es importante
mencionar que los hidrolizados con actividad antioxidante derivados de un concentrado
proteico del garbanzo son una fuente de péptidos bioactivos.
Figura 20. Capacidad antioxidante para cada hidrolizado del CPG
Figura 21. Capacidad antioxidante para cada hidrolizado del CPGr
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0
5
10
15
20
25
30
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mm
ol T
EAC
/mg
pro
teín
a
%In
hib
ició
n (D
PP
H)
%Grado de hidrólisis% Inhibición (DPPH) mM TEAC/mg proteína
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
10
15
20
25
30
35
0 10 20 30 40 50 60 70 80
mM
TEA
C/
mg
pro
teín
a
% In
hib
ició
n (D
PP
H)
% Grado de hidrólisis
% Inhibición (DPPH) mM TEAC/mg proteína
57
CONCLUSIONES
La semilla de garbanzo utilizada contenía 13.32% de proteínas, 51.32% de
carbohidratos, 19.62% de fibra, 11.39% de lípidos y 4.35% de cenizas.
Con el método de precipitación isoelectria a pH de solubilización de 4.3 y de
precipitación de 9.0 se logró obtener un concentrado de proteína con 87.27%, con un
rendimiento de 11.61%
Por medio de la extracción acetona-agua se logró reducir la concentración de
compuestos fenólicos en un 77.7%.
Se logró un mayor grado de hidrolisis utilizando el sistema secuencial en todos los
tiempos probados para el CPGr, el mayor GH fue de 68.3%, mientras que para el
CPG fue de 46%, a los 120 min. Sin embargo, en ambos casos la mayor
concentración de proteína soluble fue a los 15 min, sin mostrar diferencias
significativas en los demás tiempos, de manera similar fue mayor la concentración en
los CPGr (40%). Con la reducción de compuestos fenólicos se evidencian mayor
número de bandas en la electroforesis.
Por el método de DPPH la reducción de compuestos fenólicos favoreció el tiempo de
reacción ya que a los 60 min de logra obtener la mayor actividad, lo que podría reducir
los costos de operación, mientras que en hidrolizado proveniente del CPG la mayor
actividad se observó a los 90 min.
Con el método de ABTS se observó que la presencia de los compuestos fenólicos
favorece la actividad antioxidante, ya que cuando se redujo la concentración de estos
compuestos la actividad se ve afectada es 57% menor en el hidrolizado de CPG.
Dependiendo de la naturaleza de las especies oxidantes la presencia de compuestos
fenólicos incrementa la actividad antioxidante, sin embargo, reduce el grado de
hidrolisis al estar ligado a las proteinas, y por lo tanto podría incrementar los tiempos
de reacción.
Los hidrolizados proteícos de garbanzo son una buena alternativa en la elaboración
de alimentos funcionales. El impacto funcional es mejor si estas proteínas van
acompañadas de compuestos fenólicos
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