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Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Departamento de Ingeniería Bioquímica INFLUENCIA DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS EN LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE HIDROLIZADO PROTEICO OBTENIDO DE SEMILLA DE GARBANZO (Cicer arietinum L.)”. PROYECTO DE INVESTIGACION T E S I S Que para obtener el Título de Ingeniero Bioquímico. P R E S E N T A Liliana Santiago Rico Directores Dra. Cristian Jiménez Martínez Dra. Xariss Miryam Sánchez Chino CDMX, Mayo 2019

Instituto Politécnico Nacional - Ecosursii.ecosur.mx/Content/ProductosActividades/archivos/... · 2019-06-03 · Bioactivos del Departamento de Ingeniería Bioquímica de la Escuela

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Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Departamento de Ingeniería Bioquímica

“INFLUENCIA DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS

EN LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE HIDROLIZADO

PROTEICO OBTENIDO DE SEMILLA DE GARBANZO

(Cicer arietinum L.)”.

PROYECTO DE INVESTIGACION T E S I S

Que para obtener el Título de Ingeniero Bioquímico.

P R E S E N T A

Liliana Santiago Rico

Directores Dra. Cristian Jiménez Martínez

Dra. Xariss Miryam Sánchez Chino

CDMX, Mayo 2019

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Compuestos

Bioactivos del Departamento de Ingeniería Bioquímica de la Escuela

Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, bajo

la dirección de la Dra. Cristian Jiménez Martínez y la Dra. Xariss

Miryam Sánchez Chino y contó con el financiamiento del proyecto

SIP 20181003 “Efecto de la germinación de amaranto sobre la

capacidad hipogluceminate e hipolipidémica".

AGRADECIMIENTOS

“Buscar el logro de buena ley; no seaís un bufón que hace sonar sus cascabeles. La razón y

el verdadero sentimiento se expresan ellos mismos con escaso artificio; y si deseaís decir

alguna cosa de importancia, ¿Qué necesidad teneís de ir a la caza de palabras?”…

Fausto, J.W. Goethe.

Trato de encontrar qué artificios son los adecuados para expresar lo agradecida que estoy

de escribir esta dedicatoria, pero nada me satisface. Llegar a este punto significa que he

concluido una tarea que tenía asignada desde hace muchísimo tiempo (más del que jamás

admitiré), el cual no pude conseguir sin la ayuda de las siguientes personas:

Mis padres y hermana, por mantener todo el tiempo mis pies en la tierra, casi siempre con

palabras muy duras (como decía Oscar Wilde: “Un amigo es aquel que te apuñala de frente”),

pero con efectos saludables si se tiene el criterio de entender su trasfondo de bondad y

bienestar.

Ellos son los que se encargaban más que nadie de recordarme el camino y los objetivos que

tenemos como familia. Así que gracias, por tanto.

Mis abuelos por ser exactamente lo que se espera de estos seres: todo amor y paciencia.

Mis amigos Diana, Ulises, José y Cuauhtémoc por su valiosa compañía en los momentos de

alegría, aunque más importante, en las ocasiones más devastadoras de mis 25 años. Y por

tolerarme (porque esa es la palabra).

La Doctora Cristian por su paciencia conmigo. Y por confiar en mi promesa de entregarle un

trabajo terminado y bien hecho (eso último me gusta pensar). Me costó mucho esfuerzo y

también muchas veces pensé en renunciar, sólo su buen talante me daba ánimos.

La Doctora Xariss por sus amables comentarios y su disposición en revisar mi escrito, pues

el tiempo no es algo que se pueda devolver de ninguna manera; lo mismo para mis sinodales,

que han aceptado de buen grado ser testigos de este acontecimiento.

i

CONTENIDO

ÍNDICE DE CUADROS ........................................................................................................ iv

ÍNDICE DE FIGURAS ...........................................................................................................v

RESUMEN ........................................................................................................................... 1

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 3

ESTRÉS OXIDATIVO ....................................................................................................... 6

MOLÉCULAS ANTIOXIDANTES ...................................................................................... 6

COMPUESTOS FENÓLICOS ....................................................................................... 7

PRODUCCIÓN DE HIDROLIZADOS PROTEICOS CON FUNCIONALIDAD BIOLÓGICA

(PÉPTIDOS BIOACTIVOS) ............................................................................................ 10

HIDROLIZADOS PROTEICOS ................................................................................... 10

CLASIFICACIÓN Y FUNCIONALIDAD DE HIDROLIZADOS PROTEICOS ................ 11

PÉPTIDOS BIOACTIVOS ........................................................................................... 12

PÉPTIDOS ANTIOXIDANTES .................................................................................... 12

MECANISMO DE ACCIÓN DE PÉPTIDOS ANTIOXIDANTES ................................... 13

MÉTODOS DE OBTENCIÓN DE PÉPTIDOS ANTIOXIDANTES ................................ 14

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA ......................................................................................... 14

INTERACCIONES PROTEÍNA-FENÓLICOS ................................................................. 16

CONSECUENCIAS NUTRICIONALES ....................................................................... 20

EXTRACCIÓN, ANÁLISIS Y EFECTOS DE SEPARAR LOS COMPUESTOS

FENÓLICOS ............................................................................................................... 20

LEGUMINOSAS ............................................................................................................. 21

BENEFICIOS DEL CONSUMO DE LEGUMINOSAS ...................................................... 22

GARBANZO ................................................................................................................... 22

COMPOSICIÓN QUÍMICA .......................................................................................... 23

CARBOHIDRATOS ..................................................................................................... 23

LÍPIDOS...................................................................................................................... 24

ii

OTROS COMPONENTES .......................................................................................... 24

COMPUESTOS NO NUTRICIONALES....................................................................... 24

PROTEÍNAS ............................................................................................................... 25

ANTECEDENTES .............................................................................................................. 28

JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................ 30

OBJETIVOS ....................................................................................................................... 31

OBJETIVO GENERAL .................................................................................................... 31

OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................................... 31

MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................................. 31

OBTENCIÓN DEL CONCENTRADO PROTEICO DE SEMILLA DE GARBANZO (CPG) 32

ANÁLISIS QUÍMICO PROXIMAL DE LA HARINA Y CONCENTRADO PROTEICO DE LA

SEMILLA DE GARBANZO ............................................................................................. 32

EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS AL CPG ............................................. 33

DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS AL CPG Y CPGr ......................... 33

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL CPG Y CPGr ............................................................... 34

DETERMINACIÓN DE GRADO DE HIDRÓLISIS ........................................................... 34

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA SOLUBLE POR EL MÉTODO DEL ÁCIDO

BICINCONÍNICO (BCA) ................................................................................................. 34

DETERMINACIÓN DEL PERFIL ELECTROFORÉTICO ................................................ 35

EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE ............................................................ 36

ABTS·+ ........................................................................................................................ 36

DPPH .......................................................................................................................... 37

ANÁLISIS ESTADÍSTICO ............................................................................................... 37

DESARROLLO EXPERIMENTAL ...................................................................................... 38

RESULTADOS Y DISCUSIONES ...................................................................................... 40

OBTENCIÓN DEL CPG .................................................................................................. 40

ANÁLISIS QUÍMICO PROXIMAL ................................................................................... 41

DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS TOTALES ................................... 44

iii

DETERMINACIÓN DEL GRADO DE HIDRÓLISIS ......................................................... 45

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA SOLUBLE ............................................................... 48

DETERMINACIÓN DEL PERFIL ELECTROFORÉTICO ................................................ 50

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE ......................................................................................... 52

CONCLUSIONES .............................................................................................................. 57

REFERENCIAS ................................................................................................................. 58

iv

ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Productos comerciales e ingredientes con función en la salud basada en

péptidos bioactivos............................................................................................................. 10

Cuadro 2. Calidad de la proteína de la semilla de garbanzo crudo ..................................... 26

Cuadro 3. Contenido de aminoácidos en la semilla de garbanzo. ...................................... 27

Cuadro 4. Rendimiento en la extracción de la proteína por lote ......................................... 40

Cuadro 5. Composición proximal de la harina y el concentrado proteico (g/100g) en base

seca ................................................................................................................................... 42

Cuadro 6. Concentración de compuestos fenólicos en CPG y CPGr ................................. 44

Cuadro 7. Curva de hidrólisis enzimática del concentrado proteico .................................... 47

Cuadro 8. Proteína Soluble en CPG y CPGr ...................................................................... 49

Cuadro 9. Actividad antirradical DPPH en el CPG y CPGr ................................................. 54

Cuadro 10. Actividad antioxidante empleando la técnica del radical ABTS en el CPG y

CPGr .................................................................................................................................. 55

v

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Modelo hipotético de la reacción en cadena de radicales libres. ........................... 3

Figura 2. Modelo hipotético de la generación de EROs. ....................................................... 5

Figura 3. Estructura básica de los flavonoides. .................................................................... 7

Figura 4. Subclases de flavonoides. ..................................................................................... 8

Figura 5. Interacción proteínas-polifenoles. .......................................................................... 9

Figura 6. Estructura de los principales aminoácidos relacionados con la actividad

antioxidante en péptidos. ................................................................................................... 14

Figura 7. Hidrólisis enzimática de proteínas ....................................................................... 15

Figura 8. Oxidación de catecol como prerrequisito para la formación de productos de

reacción. ............................................................................................................................ 18

Figura 9. Diferentes perfiles de reacción. ........................................................................... 19

Figura 10. Tipos de garbanzo ............................................................................................ 23

Figura 11. Flavonoides en el garbanzo. ............................................................................. 25

Figura 12. Complejo BCA-Cu. ............................................................................................ 35

Figura 13. Diagrama del desarrollo experimental ............................................................... 38

Figura 14. Curvas de hidrólisis del concentrado proteico de C. arietinum L........................ 46

Figura 15. Proteína soluble en CPG y CPGr ...................................................................... 49

Figura 16. Perfil electroforético de CPG. ........................................................................... 51

Figura 17. Perfil electroforético de CPGr. ........................................................................... 51

Figura 18. Determinación de la capacidad antioxidante por la técnica de DPPH ................ 53

Figura 19. Determinación de la capacidad antioxidante por la técnica del radical ABTS .... 53

Figura 20. Capacidad antioxidante para cada hidrolizado del CPG .................................... 56

Figura 21. Capacidad antioxidante para cada hidrolizado del CPGr ................................... 56

1

RESUMEN

El concepto de estrés oxidativo surgió en el año 1985, y se define como “una situación de

desbalance con un aumento o disminución de especies oxidantes”. En el organismo humano

se generan especies reactivas de oxígeno como resultado del metabolismo; sin embargo,

cuando la cantidad de estas especies reactivas sobrepasa los niveles normales pueden tener

un efecto dañino, causando la oxidación de macromoléculas como proteínas, ácidos

nucleicos y lípidos de membranas, lo cual provoca un funcionamiento celular anormal y cerca

de 100 enfermedades diferentes, incluyendo aterosclerosis, artritis, isquemia, repercusión en

tejidos, lesión del sistema nervioso central, gastritis, cáncer, así como envejecimiento

prematuro, niveles de glucosa y colesterol elevados. El cuerpo humano cuenta con diversas

líneas internas (enzimas como la glutatión peroxidasa, catalasa, superóxido dismutasa,

glutatión reductasa, entre otras) y externas de defensa contra los radicales libres. Finalmente

destacan diversos antioxidantes dietarios de bajo peso molecular como la vitamina E,

carotenoides, compuestos fenólicos, clorofilas, ácido ascórbico, entre otros, que tienen la

habilidad de reaccionar con los radicales libres mediante diversos mecanismos, dando lugar

a especies químicas menos reactivas y dañinas.

En términos de importancia económica, las Leguminosae son el segundo grupo de plantas

más importante después de los cereales en la dieta de los humanos, aunque en comparación

con éstos, las leguminosas son ricas en proteínas de alta calidad, resultando un alimento

nutritivo. De manera especial, el garbanzo es una de las semillas más cultivadas en México,

por lo que es un alimento disponible dentro del país. Aunado a esta ventaja económica, su

calidad nutritiva es bastante elevada, contando con un porcentaje de proteínas de alrededor

del 20% y menos del 10 % de grasas, así como un alto contenido en fibra dietaria, que lo

vuelve una buena opción como fuente de nutrientes. En las últimas décadas se ha evaluado

la posibilidad de obtener algún beneficio extra que le otorgue un valor añadido por medio

especialmente del aprovechamiento de sus proteínas.

De estas proteínas, se ha comprendido la importancia de cadenas de aminoácidos más

pequeñas, los péptidos, en diversas funciones relevantes para el campo de los alimentos.

Algunos son producidos originalmente como moléculas pequeñas y otros son productos

derivados del metabolismo o procesamiento enzimático de las proteínas. Se denomina

actividad biológica a la que ejercen las proteínas más allá de sus propiedades nutrimentales

o funcionales. En particular los péptidos bioactivos se generan por acción de proteasas sobre

2

diversas proteínas alimentarias, en las que parecen estar encriptados pero son resistentes a

la actividad de peptidasas y realizan diferentes funciones: antihipertensivos, con actividad

opioide, inmunomoduladores, antioxidantes, y secuestradores de metales, entre otros.

Los péptidos antioxidantes son pequeños fragmentos proteicos de bajo peso molecular

típicamente constituidos por cadenas de no más de 20 aminoácidos unidos entre sí por

enlaces peptídicos. Se cree que la capacidad antioxidante de estas moléculas se debe sobre

todo a la capacidad reductora de algunos de los residuos aminoacídicos contenidos en ellas,

aunque también propiedades de barrera y de secuestramiento de metales pro-oxidantes han

sido reportadas como posibles responsables de su actividad antioxidante.

3

INTRODUCCIÓN

Antes del surgimiento de la fotosíntesis, la atmósfera de la tierra era predominantemente

reductora y los organismos que la poblaban eran anaerobios, es decir, que obtenían su

energía en ausencia de oxígeno. Con el incremento del O2 en la atmósfera, la mayor parte

de estos organismos pereció y los que lograron adaptarse optimizaron la producción de

energía empleando al oxígeno como aceptor final de electrones, que en organismos

eucariotes se lleva a cabo en la cadena respiratoria mitocondrial (Konigsberg, 1992).

En química, la reducción es la ganancia de electrones y la oxidación es la pérdida de éstos.

Se tiene un agente oxidante que oxida a otra molécula con el fin de reducirse, es decir, que

recibe electrones. Una de las moléculas más oxidantes es precisamente el oxígeno (Elejalde-

Guerra, 2001).

El término radical libre (RL) se refiere a una molécula que tiene un par de electrones

desapareados, es decir, que en su último nivel de energía le falta un electrón, que tomará de

cualquier molécula adyacente para estabilizarse (Figura 1). Sin embargo, como han tomado

sólo un electrón, la otra molécula quedará a su vez desapareada y tendrá que tomar otro

electrón, iniciando una reacción en cadena (Halliwell y Gutterdige, 1999).

Figura 1. Modelo hipotético de la reacción en cadena de radicales libres. Fuente:

Elaboración propia

4

El oxígeno en su forma natural de molécula diatómica (O2), es en realidad un di-radical que

se puede representar de la siguiente forma: •O-O• la cual se conoce como oxígeno triplete

(3O2) y es muy poco reactiva, sin embargo, esta reactividad puede incrementarse con la

absorción de energía y de esta manera, el oxígeno triplete se convierte en el singulete (1O2),

que es muy reactivo (Halliwell y Gutterdige, 1999; Hansberg-Torres, 2008).

El 1O2 es capaz de reaccionar con diversas biomoléculas e inactivarlas. Pero lo más

significativo es que debido a su capacidad antioxidante, puede recibir un electrón que

provenga de alguna vía metabólica, iniciando así una cascada de radicales libres y generar

especies reactivas de oxígeno EROs. Cuando el 1O2 recibe un electrón, uno de los electrones

despareados queda estable en forma de anión, mientras que el otro lado, sigue siendo RL

(Figura 2a). A esta molécula se le conoce como anión o radical superóxido (O2•) y es una de

las ERO más importantes a nivel fisiológico (Davies, 1995).

El O2• es poco reactivo y únicamente reacciona de manera importante con otros radicales,

en especial con otros superóxidos, además de metales como cobre, hierro libre, o con los

centros Fe-S de las proteínas. También reacciona con el óxido nítrico y el ascorbato. El anión

superóxido no reacciona con el NADPH ni con las proteínas, lípidos o las bases nitrogenadas

de ADN (Hansberg-Torres, 2008). El O2• puede recibir otro electrón para estabilizar a su

segundo electrón desapareado, convirtiéndose en un anión peróxido, que cuando se protona

se convierte en el peróxido de hidrógeno (H2O2) (Figura 2b). Esta reacción se lleva a cabo

de manera fisiológica y es catalizada por la enzima superóxido dismutasa (SOD) (Liochev y

Fridovich, 2010).

El H2O2 no es un RL en sí mismo, pero se le considera una ERO ya que es un precursor

potencial de RL, en especial de OH-, uno de los más dañinos para las células. A diferencia

de los RL que no pueden atravesar las membranas biológicas porque reaccionan con los

lípidos que las forman, el H2O2 sí puede hacerlo, y es ahí donde radica una de sus

propiedades más importantes, ya que puede generarse en un compartimento celular y

difundir hacia otro (Rigoulet et al., 2011).

En el organismo existe una gran cantidad de enzimas que metabolizan al H2O2 para

convertirlo en agua. Entre ellas se encuentran las catalasas (Chelikani et al., 2004), las

5

peroxidasas como las glutatión peroxidasas (Arthur, 2000; Battin y Brumaghim, 2009) y las

tiorredoxinas (Biaglow y Miller, 2005; Carvahlo et al., 2006), entre otras.

Sin embargo, si el H2O2 encuentra a un electrón proveniente de un metal de transición como

hierro (Fe2+) o cobre (Cu1+), se induce lo que se conoce como la reacción de Fenton, en la

cual se rompe el enlace entre los átomos de oxígeno. Uno de ellos recibe el electrón

proveniente del metal y se convierte en el anión hidroxilo (OH-) mientras que el otro queda

con un electrón desapareado formando al radical hidroxilo (•OH) (Figura 2c). Esta reacción

no es enzimática sino química, por lo que la producción de •OH no es algo controlado o

regulado por las células; y por esta misma razón no existen enzimas que sean capaces de

metabolizar dicho radical (Halliwell y Gutteridge, 2000).

En cuanto a los productos de la reacción de Fenton, uno de los mas nocivos es el radical

•OH, de los más reactivos que existen (Halliwell y Gutteridge, 2000). No pueden difundirse a

través de las membranas porque rápidamente reacciona con los lípidos que la conforman,

iniciando la lipoperoxidación. También reacciona con los azúcares y las bases nitrogenadas

del ADN y con los aminoácidos de las proteínas.

Figura 2. Modelo hipotético de la generación de EROs. Fuente: Elaboración propia

Existen otras EROs importantes como el radical alcoxilo (LO•), peroxilo (LOO•) e incluso

especies reactivas que además del oxígeno incluyen al nitrógeno (RNS), como el óxido nítrico

(NO•) o el peroxinitrito (ONOO-) (Ferrer-Sueta y Radi, 2009).

6

ESTRÉS OXIDATIVO

El concepto de estrés oxidante u oxidativo (EO) surgió en el año 1985 propuesto por Helmut

Sies, y se define como una situación de desbalance con un aumento o disminución de

oxidantes (Sies y Cadenas, 1985). El concepto implica el reconocimiento de una producción

fisiológica de antioxidantes (RL y especies relacionadas) y de la existencia de una defensa

antioxidante. La condición de desbalance, a su vez, se refiere a la efectividad fisiológica de

la defensa antioxidante en mantener al mínimo el estrés. Sin embargo, si se analiza el

concepto con detenimiento, implica que en condiciones fisiológicas normales existe una

situación de equilibrio, en donde por cada oxidante existe un antioxidante que lo neutraliza,

casi en una relación uno a uno. Ahora se sabe que la situación en realidad no es así. El

concepto se ha modificado ya que hay momentos en los que la célula requiere ambientes

más reducidos o más oxidados para mantener su homeostasis, por lo que el estado redox es

un concepto dinámico (Forman et al., 2004).

No obstante, el estrés oxidante puede referirse a una condición anormal en el cual las células

ya no son capaces de regular dichos cambios y se mantienen mayormente en un estado

oxidado que no pueden controlar (Droge, 2002).

MOLÉCULAS ANTIOXIDANTES

En el organismo humano se generan EROs como resultado del metabolismo normal, que a

bajas concentraciones ejercen un papel benéfico, como en el proceso de relajación de las

células del músculo liso, y favoreciendo la actividad mitocondrial normal. Sin embargo,

cuando la cantidad de estas especies reactivas sobrepasa los niveles normales pueden tener

un efecto dañino, causando la oxidación de macromoléculas como proteínas, ácidos

nucleicos y lípidos de membranas, lo cual puede causar un funcionamiento celular anormal

y diversas patologías (Bramley, et al., 2000). Se ha considerado que los RL y EROs están

involucrados en la patogénesis de cerca de 100 enfermedades diferentes, incluyendo

aterosclerosis, artritis, isquemia, lesión del sistema nervioso central, gastritis, cáncer (Tepe

et al., 2007), así como envejecimiento prematuro, o niveles de glucosa y colesterol elevados

(Elejalde-Guerra, 2001). El organismo humano cuenta con sistemas de defensa endogenos

(enzimas como la glutatión peroxidasa, catalasa, superóxido dismutasa, glutatión reductasa,

entre otras) y externas de defensa contra los RL. Finalmente, destacan diversos

7

antioxidantes dietarios de bajo peso molecular como la vitamina E, carotenoides, compuestos

fenólicos, clorofilas, ácido ascórbico, entre otros, que tienen la habilidad de reaccionar con

los RL mediante diversos mecanismos, dando lugar a especies químicas menos reactivas y

dañinas (Bramley et al., 2000).

COMPUESTOS FENÓLICOS

Se conoce como fenólicos a un grupo de compuestos abundantes en la naturaleza que se

caracterizan por contener en su estructura química al menos un anillo bencénico hidroxilado.

Pueden ser moléculas simples, o complejas, formando polímeros (Álvarez-Parrilla et al.,

2012). Diversos estudios epidemiológicos han sugerido asociaciones entre la ingesta de

alimentos ricos en polifenoles y la prevención de enfermedades relacionadas con procesos

oxidativos y de inflamación (enfermedades degenerativas, cardiovasculares y algunos tipos

de cáncer) (Arts y Hollman, 2005; Kampa et al., 2007; Scalbert y Williamson, 2000). Existen

dos grupos principales de polifenoles: los denominados flavonoides y los no flavonoides. La

estructura básica de los flavonoides es la del 2-fenilbenzopirona (C3-C6-C3) (Figura 3) y se

clasifican en 8 subclases: flavanonas, flavonas, dihidroflavonoles, flavonoles, flavan-3-oles,

antocianidinas, isoflavonas, y protoantocianidinas (Figura 4).

Figura 3. Estructura básica de los flavonoides. Fuente: Andrés-Lacueva, et al., 2009

El grupo de los no flavonoides se clasifica de acuerdo con el número de carbonos que

contiene y comprende las siguientes subclases: fenoles simples, ácidos benzoicos, taninos

hidrolizables, acetofenonas, ácidos fenilacéticos, ácidos cinámicos, cumarinas,

benzofenonas, xantonas, estilbenos, chalconas, lignanos y secoiridoides (Andrés-Lacueva et

al., 2009). En las leguminosas se encuentran en su mayoría las isoflavonas (Manach et al.,

2004) como la genisteína en la soya (64.8 mg/100g), la leche de soya (6.1 mg/100g) y el tofu

(13.3 mg/100g). La dadzeina y la glicetina también se encuentran en la soya, leche de soya

y tofu, pero en menor concentración (Andrés-Lacueva et al., 2009).

8

Figura 4. Subclases de flavonoides. Fuente: Andrés-Lacueva et al., 2009

9

Si bien estos compuestos son beneficiosos para la salud por su actividad antioxidante, en

términos de nutrición, su presencia reduce la digestibiliad de proteínas. En estudios de

calidad proteica realizados por Bejosano y Corke (1998) se determinó la composición de

aminoácidos y la digestibilidad in vitro de concentrados de proteína integral de cinco

genotipos de proteína de amaranto y se demostró que la presencia de compuestos fenólicos

influye en la digestibilidad de las proteínas, por lo cual deben ser eliminados. En presencia

de oxígeno estos compuestos fenólicos se oxidan en medio alcalino o próximo a la

neutralidad, por acción de la polifenoloxidasa, dando como producto ortoquinonas, que luego

generan pardeamiento enzimático (Cuq, 1996), o bien, reaccionan con los grupos amino

terminales, aminoácidos libres como lisina y cisteína (Cheftel et al., 1989). Los residuos de

metionina se pueden oxidar a metionina sulfóxido (Cuq, 1996). Esto se produce en la

purificación tecnológica de proteínas a partir de hojas o ciertos granos ricos en polifenoles y

las consecuencias nutricionales del contacto de las proteínas con los polifenoles oxidados se

deben fundamentalmente a la disminución de la disponibilidad de lisina y en menor grado de

otros aminoácidos como la metionina. El grupo amino de la lisina puede condensarse con las

quinonas en su forma desprotonada, es decir, que esta reacción se ve favorecida a pH

alcalino (Figura 5).

Figura 5. Interacción proteínas-polifenoles. Adaptado de Cuq, 1996

10

PRODUCCIÓN DE HIDROLIZADOS PROTEICOS CON FUNCIONALIDAD BIOLÓGICA (PÉPTIDOS BIOACTIVOS)

HIDROLIZADOS PROTEICOS

Los hidrolizados proteicos son fracciones de proteínas y cadenas peptídicas obtenidas por

hidrólisis enzimática, fermentación microbiana y fraccionamiento o enriquecimiento de

péptidos (Korhonen y Pihlanto, 2006; Mersich y Jungbauer, 2008). Los hidrolizados proteicos

tienen una amplia gama de aplicaciones que varían desde ingredientes en alimentos hasta

su empleo como fuente de nitrógeno en la preparación de dietas viables para administración

parenteral en hospitales, fórmulas hipoalergénicas infantiles, alimentos bajos en calorías y

bebidas para deportistas. En el Cuadro 1 se presentan productos comerciales e ingredientes

con función en la salud basada en péptidos bioactivos (Hong et al., 2008; Mersich y

Jungbauer, 2008).

Cuadro 1. Productos comerciales e ingredientes con función en la salud basada en péptidos bioactivos.

Marca Tipo de

producto Péptido bioactivo

Función en la salud que promociona

Productor/País

Calpis Leche ácida Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro, Derivado de β-caseina y κ-caseina

Reducción de la presión sanguínea

Calpis Co., Japón

Evolus

Bebida de leche fermentada

enriquecida en calcio

Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro, Derivado de β-caseina y κ-caseina

Reducción de la presión sanguínea

Valio Oy, Finlandia

BioZate

Hidrolizado del aislado de

proteínas del suero

Fragmentos de β-lactoglobulina

Reducción de la presión sanguínea

Davisco, EUA

BioPURE-GMP

Aislado de proteína del

suero

k-casein f(106–169) (Glicomacropeptido)

Prevención de caries dentales, influenciar la coagulación sanguínea, protección contra virus y bacterias

Davisco, EUA

PRODIET F200/Lactiu

m

Leche saborizada, confitería, capsulas

as1-casein f (91–100) (Tyr- Leu-Gly Tyr-Leu-Glu-Gln- Leu-Leu-Arg)

Reducción de efectos del estrés

Ingredia, Francia

Festivo Queso

fermentado bajo en grasa

as1-casein f (1–9), as1-casein f (1–7), as1-casein f (1–6)

Ningún beneficio obtenido aún

MTT Agrifood Research Finlandia

Cysteine Peptide

Hidrolizado/ingrediente

Péptidos derivados de caseína

Productos para incrementar la energía y el sueño

DMV International, Países Bajos

C12 Hidrolizado/ingr

ediente Péptidos derivados de caseína

Reducción de la presión sanguínea

DMV International, Países Bajos

11

Capolac Ingrediente Caseinofosfopeptido Ayuda a la absorción de minerales

Arla Foods Ingredients,

Suecia

PeptoPro Ingrediente/ Hidrolizado

Péptidos derivados de caseina

Mejora el desempeño atlético y la recuperación del músculo,

DSM Food Specialties, Países

Bajos

Vivinal Alpha

Ingrediente/ Hidrolizado

Péptidos derivados de las proteínas del suero

Productos para la relajación y el sueño

Borculo Domo Ingredients

(BDI), Holanda

Fuente: Korhonen y Pihlanto (2006)

La caseína, proteínas del suero y de diferentes leguminosas son las fuentes proteicas

comúnmente utilizadas para la producción de hidrolizados (Erdmann et al., 2008) y la

obtención y caracterización de péptidos.

CLASIFICACIÓN Y FUNCIONALIDAD DE HIDROLIZADOS PROTEICOS

Uno de los parámetros básicos empleados para describir a los hidrolizados proteicos es el

grado de hidrólisis (GH), el cual corresponde al porcentaje de enlaces peptídicos

hidrolizados. Según el GH, se clasifican en (Korhonen y Pihlanto, 2006):

I. Hidrolizados limitados: con GH menores del 10%, para la mejora de las

propiedades funcionales.

II. Hidrolizados extensivos: con GH mayores del 10%, para su uso en alimentación

especializada. Este último grupo puede a su vez dividirse en aquellos para ser usados

como suplemento proteico (tercera edad, deportistas, dietas), en dietas médicas y por

último enriquecidos en péptidos bioactivos.

La funcionalidad de un hidrolizado proteico se encuentra determinada por la estructura

molecular, tamaño y secuencia específica de aminoácidos en los péptidos generados durante

la hidrólisis, de manera que el entendimiento de la relación entre las características químicas

y la funcionalidad de los hidrolizados permite mejorar la calidad y estabilidad de fórmulas a

base de hidrolizados (Sarmadi e Ismail, 2010).

Las aplicaciones potenciales para los péptidos requieren que éstos puedan ser producidos

en forma definida y reproducible, por lo tanto, la factibilidad del proceso de hidrólisis de un

12

sistema enzima/sustrato específico depende del control cualitativo de los productos de la

hidrólisis.

PÉPTIDOS BIOACTIVOS

Recientemente se ha comprendido la importancia de cadenas de aminoácidos más

pequeñas, los péptidos, con diversas funciones relevantes para el campo de los alimentos.

Algunos son producidos originalmente como moléculas pequeñas y otros son productos

derivados del metabolismo o procesamiento enzimático de las proteínas (Badui, 2013). En

particular los péptidos bioactivos se generan por acción de proteasas sobre diversas

proteínas alimentarias, en las que parecen estar encriptados, pero son resistentes a la

actividad de peptidasas. Estos péptidos pueden presentar actividad biológica, denominada

así, debido a la acción que ejercen las proteínas más allá de sus propiedades nutrimentales

o tecnofuncionales y que, dependiendo de su composición y orden de aminoácidos,

presentan actividades como: antihipertensivos, con actividad opioide, inmunomoduladores,

antioxidantes, y secuestradores de metales, entre otros (Badui, 2013).

PÉPTIDOS ANTIOXIDANTES

En particular, los péptidos antioxidantes son pequeños fragmentos proteicos de bajo peso

molecular (≤ 1500 Da) típicamente constituidos por cadenas de no más de 20 aminoácidos

unidos entre sí por enlaces peptídicos. Se cree que la capacidad antioxidante de estas

moléculas se debe sobre todo a la capacidad reductora de algunos de los residuos

aminoacídicos contenidos en ellas, aunque también propiedades de barrera y de

secuestramiento de metales pro-oxidantes han sido reportadas como posibles responsables

de su actividad antioxidante (Sarmadi e Ismail, 2010). Aunque la secuencia de aminoácidos

encontrada en los péptidos antioxidantes es la misma que originalmente se encuentra en la

proteína de origen, las propiedades no se manifiestan sino hasta que el fragmento en

cuestión es “liberado” de la estructura madre, con lo que puede deducirse la interferencia de

otros grupos funcionales presentes en la proteína, capaces de bloquear la actividad

antioxidante de los fragmentos peptídicos. Por este motivo, es necesario llevar a cabo la

fragmentación de las proteínas, ya sea por métodos enzimáticos o fermentación (Sarmadi e

Ismail, 2010).

13

En las últimas décadas se han realizado importantes avances en el estudio y producción

comercial de péptidos antioxidantes. Su aplicación como antioxidantes “naturales”, tanto en

el área de tecnología de alimentos como en el área de salud, ha sido discutida en numerosas

publicaciones científicas.

MECANISMO DE ACCIÓN DE PÉPTIDOS ANTIOXIDANTES

Los estudios realizados hasta la fecha coinciden en que su actividad antioxidante está

determinada por:

a) La capacidad de las cadenas laterales de los aminoácidos constituyentes para

eliminar RL

b) La capacidad de las cadenas laterales de los aminoácidos constituyentes para quelar

metales de transición; y

c) La posición relativa de los aminoácidos dentro de la cadena peptídica (Chen et al.,

1996; Xiong, 2010).

Típicamente, la presencia de aminoácidos como Cys, Met, Tyr, Phe, Trp en péptidos

antioxidantes es asociada con su capacidad para eliminar RL; mientras que Lis, Arg, Glu,

Asp, Thr y Ser fosforilada, son asociados con capacidad para quelar metales de transición

(Figura 6) (Rajapakse et al., 2005; Xiong, 2010). Las cadenas laterales azufradas

nucleofílicas y aromáticas actúan como eliminadores de radicales debido a la fácil sustracción

de hidrógenos de su estructura. Los aminoácidos aromáticos estabilizan al radical y

simultáneamente mantienen su propia estabilidad vía resonancia a través de la estructura

cíclica. Por otro lado, los péptidos constituidos por aminoácidos básicos y ácidos pueden

interactuar con metales de transición a través de sus residuos cargados evitando procesos

oxidativos (Saiga et al, 2003).

Se ha demostrado que residuos de His, Glu y Asp dentro de la secuencia aminoacídica

pueden actuar como eliminadores de RL y como compuestos quelantes de metales de

transición (Chen et al., 1996; Liu et al., 2010; Liu et al., 2010; Qian, et al., 2008). Por último,

algunos aminoácidos hidrófobos, como Leu y Val, han sido reportados como relevantes

promotores de actividad antioxidante de los péptidos cuando se encuentran localizados en

el carbono o nitrógeno terminales, debido a su naturaleza lipofílica, proveen un mejor punto

de contacto entre el péptido y los ácidos grasos, promoviendo la eliminación de radicales

14

libres (Chen et al., 1996; Mendis et al., 2005; Suetsuna y Chen, 2002; Park et al., 2001;

Suetsuna et al., 2000).

Figura 6. Estructura de los principales aminoácidos relacionados con la actividad

antioxidante en péptidos. Fuente: Elaboración propia.

MÉTODOS DE OBTENCIÓN DE PÉPTIDOS ANTIOXIDANTES

Según el método de obtención, existen diversos factores que pueden influir en la capacidad

del péptido generado, sin embargo, es la secuencia y tipos de aminoácidos presentes los

que la definen (Rajapakse et al., 2005).

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA

Es el proceso más común y eficiente, donde se utilizan enzimas proteolíticas. Las enzimas

proteolíticas abarcan un grupo de hidrolasas referidas como peptidasas o comúnmente

llamadas proteasas, las cuales comparten las características de atacar enlaces peptídicos

(Illanes, 2008). Las proteasas pueden ser clasificadas por su origen (animal, vegetal o

microbiano), modo de acción catalítica (endo- o exo- actividad) o con base en su sitio

15

catalítico (serinproteasa, cisteinproteasa, aspartatoproteasa, metaloproteasa) (Nielsen,

2010).

En la hidrólisis enzimática, la capacidad antioxidante de los péptidos generados depende de

la naturaleza y pre-tratamiento de la proteína, tipo de proteasa utilizada y de las condiciones

en las cuales se lleva a cabo la hidrólisis (Xiong, 2010).

Este proceso se desarrolla en tres fases (Figura 7):

a) La formación de un complejo enzima-sustrato,

b) La ruptura del enlace peptídico dando como resultado la liberación de péptidos, y

c) Los péptidos resultantes se separan de la enzima después de un ataque nucleofílico

de una molécula de agua

Figura 7. Hidrólisis enzimática de proteínas. Fuente: Elaboración propia

La estructura compacta de las proteínas globulares en su estado nativo dificulta la proteólisis.

Un tratamiento térmico de la proteína previo causa cambios en su estructura y permite una

mayor accesibilidad del sustrato a la acción enzimática debido a un mayor número de enlaces

peptídicos expuestos. Asimismo, el calor inactiva ciertos inhibidores de proteasas que

contienen proteínas nativas de fuentes vegetales (Nielsen, 1997). La aplicación de

temperaturas entre 50 y 90°C por 2 a 30 min son utilizadas de manera regular como pre-

tratamientos para hidrolizar enzimáticamente proteínas de diversos orígenes (Li, et al., 2007;

Peña-Ramos y Xiong, 2003; Xie et al., 2008; You et al., 2010).

16

La especificidad de las enzimas empleadas en la liberación de péptidos antioxidantes afecta

el tamaño, composición y secuencia de aminoácidos del péptido generado, lo cual influye

sobre su capacidad antioxidante (Samardi e Ismail, 2010). La producción de péptidos

antioxidantes se puede llevar a cabo con más de una enzima actuando sobre un mismo

sustrato (Li et al., 2007). El orden en que se añaden las enzimas puede afectar la capacidad

antioxidante de los péptidos resultantes debido a la especificidad de estas (Vercruysse et al.,

2009).

El grado de hidrólisis enzimática es influenciado por las condiciones de reacción, lo que

afecta las propiedades funcionales de los hidrolizados obtenidos (Nielsen, 1997). Por lo

general, a un mayor grado de hidrólisis, corresponde una mayor capacidad antioxidante del

péptido liberado debido a su menor tamaño y mayor exposición de aminoácidos hidrófobos

(Foh et al., 2010; Jamdar et al., 2010; Klompong et al., 2007; Li et al., 2007; Liu et al., 2010;

Liu et al., 2010; Qian et al., 2010; You et al., 2009). Los valores de temperatura, pH, así como

la relación enzima-sustrato determinan la velocidad de reacción; mientras que el tiempo

afecta el grado de hidrólisis (Benítez et al., 2008). Éstas son variables que han mostrado ser

influyentes en la actividad antioxidante de péptidos liberados (Guerard et al., 2007; Ren et

al., 2008; You et al., 2010; Zhuang et al., 2009).

INTERACCIONES PROTEÍNA-FENÓLICOS

Las proteínas en los alimentos pueden formar complejos con otros componentes, incluyendo

a los polifenoles, que conducen a cambios vitales en sus propiedades estructurales,

funcionales y nutricionales (Shahidi, 2000; Ozdal et al., 2013; Bordenave et al., 2014; Shahidi

y Ambigaipalan, 2015).

Se han reportado cuatro tipos de interacciones para los polifenoles y las proteínas, que son

puentes de hidrógeno, interacción electrostática, enlaces covalentes e interacciones

hidrofóbicas (Bordenave et al., 2014; Ozdal et al., 2013; García-Estévez et al., 2017;

Fernandes et al., 2017).

Entre ellos, las uniones hidrófobas y de hidrógeno representan la principal fuerza impulsora

de todas estas interacciones (Jia et al., 2016). De acuerdo con Shahidi y Naczk (2003), los

compuestos fenólicos forman complejos tanto en concentraciones bajas como altas de

17

proteínas debido a interacciones hidrofóbicas. Esto se explica con más detalle por los

puentes de hidrógeno a través de los grupos hidróxilo en los compuestos fenólicos y los

grupos carbonil en los enlaces peptídicos de las proteínas (Loomis y Battaile, 1966).

Las interacciones hidrofóbicas pueden ocurrir entre dos anillos aromáticos donde uno podría

ser un aminoácido hidrofóbico (Le Bourvellec y Renard, 2012). Esto también se conoce como

interacción de apilamiento. Las concentraciones de proteínas tienen una influencia directa en

este tipo de interacción como una monocapa hidrofóbica en una concentración proteica baja,

mientras que a altas concentraciones más capas de superficies hidrofóbicas son formadas

debido a la formación de complejos de polifenoles y proteínas. Este proceso también incluye

el entrecruzamiento de moléculas proteicas, que generan complejos coloreados de alto peso

molecular (Sabir et al.,1974). La agregación y precipitación ocurre como una consecuencia

de todas estas interacciones (Martínez-González et al., 2017).

Este tipo de interacciones son no-covalentes, y son más débiles ya que no involucran

compartir un par de electrones (Nagy et al., 2012; Jakobek, 2015), y la mayoría son

estabilizadas por puentes de hidrógeno (Yuksel et al., 2010; Jia et al., 2016). En contraste,

los enlaces covalentes forman interacciones irreversibles.

La complejación reversible tiene lugar en un proceso de dos etapas, donde en la primera el

polifenol y el co-sustrato se encuentran en equilibrio con complejos solubles vía fuerzas no

covalentes (Luck et al., 1994). En un segundo paso, estos complejos solubles pueden

agregarse y precipitar cuando las condiciones de equilibrio cambian. El precipitado puede

volver a disolverse bajo condiciones favorables como ausencia de oxígeno, iones metálicos,

ácidos o álcalis (Shahidi y Senadheera, 2018). La máxima interacción proteína-polifenol

ocurre en el punto isoeléctrico de la proteína (Trigueros et al., 2014).

Para las uniones covalentes, un paso clave en la reacción de compuestos fenólicos con las

proteínas es la facilidad de los primeros en ser oxidados enzimática o no enzimáticamente

(Cilliers y Singleton, 1991; Friedman, 1996) y seguir siendo altamente reactivos (Figura 8).

Primero, la orto- o para-quinona reacciona con otras quinonas para producir pigmentos

oscuros (Nicolas et al., 1994). Lo anterior es válido para la mayoría de los compuestos

fenólicos. La reacción previamente mencionada es un prerrequisito para generar especies

electrofílicas capaces de subyacer una adición nucleofílica (Figura 8). En este caso, las

18

cadenas de proteínas aportan el lado nucleófilo de la reacción, especialmente la lisina, los

grupos tiol o el grupo indol del triptófano son los residuos más reactivos. También los grupos

imidazol y disulfuro han sido reportados como compañeros de reacción (Vithayatil y Murthy,

1972; Loomis, 1974; Matheis y Whitaker, 1984, Kroll et al., 2003).

Figura 8. Oxidación de catecol como prerrequisito para la formación de productos de reacción. Fuente: Rohn, 2014.

En presencia de un grupo aminoacídico nucleófilo y de acuerdo al mecanismo propuesto por

Namiki et al. (2001), una dimerización de los compuestos fenólicos previa a su interacción

con las proteínas durante el calentamiento y valores de pH alcalinos parecen ser un

precedente de la reacción. Consecuentemente, tres tipos de productos de reacción deben

ser considerados, tales como muestra la Figura 9 (A-C): En el primer caso, hay un producto

simple, donde un solo compuesto fenólico está enlazado a una sola cadena lateral de

aminoácido (Figura 9A). Se puede presentar el caso de que los compuestos fenólicos formen

oligomeros con peso molecular variable antes de unirse a los residuos aminoacídicos (Figura

9B). Y finalmente, un entrecruzamiento proteico entre estructuras monoméricas o incluso

oligoméricas. Además, puede verse favorecida la formación de puentes disulfuro debido a

las reacciones redox en los compuestos fenólicos y el cambio en la conformación de la

proteína. (Figura 9C).

19

Figura 9. Diferentes perfiles de reacción. Fuente: Rohn, 2014

Estas interacciones ocurren de forma inespecífica y depende de la estructura inicial de la

proteína, así como su conformación. Las cadenas más accesibles reaccionarán primero,

antes de que la proteína se repliegue o descubra para generar nuevos sitios de reacción.

Esto significa que cada proteína va a ser afectada específicamente dependiendo de las

condiciones, tales como pH, temperatura, secuencia de aminoácidos, punto isoeléctrico,

tipos de fenólicos (Rohn, 2018). Estos cambios tienen el potencial de influenciar en algunas

propiedades tecnofuncionales (Pringent et al., 2003).

20

CONSECUENCIAS NUTRICIONALES

Resultado de su reacción con las proteínas, las propiedades de los compuetos fenólicos

también pueden verse afectadas, por ejemplo, la actividad antioxidante se ve dismunuida

como consecuencia de enlaces covalentes formados con las proteínas (Rohn et al., 2004,

2005).

En el caso de las proteínas, el efecto está en la actividad biológica de proteína-enzima

(Alberghina, 1964; Rohn et al., 2001, 2002, 2004, 2005). Aminoácidos esenciales como la

lisina y triptófano son preferidos como compañeros de reacción, lo cual implica una pérdida

en la calidad nutricional de las proteínas (Davies et al., 1978). Los compuestos fenólicos

vegetales tienen afinidad por las enzimas digestivas del sistema gastroinstestinal humano,

causando la reducción de la digestibilidad de las proteínas, carbohidratos y lípidos (Quesada

et al., 1996; Jakobek, 2015; Alu’datt, 2006; Alu’datt et al., 2013, 2014, 2016a, b, 2017b).

EXTRACCIÓN, ANÁLISIS Y EFECTOS DE SEPARAR LOS COMPUESTOS FENÓLICOS

Muchos disolventes orgánicos y agua han sido reportados para extraer fenólicos libres y

ligados de plantas (Shahidi y Naczk, 2004; Alu’datt, 2006, Alu’datt et al., 2017a, 2017b).

Shahidi y Naczk (2004) reportaron que el mejor disolvente para extraer fenólicos libres a

partir de plantas es el metanol, mientras que los fenólicos ligados pueden ser extraídos por

tratamientos ácidos o básicos seguidos de un tratamiento con metanol a temperatura

ambiente (Alu’datt, 2006, Alu’datt et al., 2013, 2016b). Las técnicas de análisis van desde

HPLC, cromatografía de gases, resonancia magnética nuclear, electroforesis capilar y

electroforesis de zona capilar (Montedoro et al., 1992a, b; Pirisi et al., 2000; Alu’datt, 2006;

Alhakmani et al., 2013; Wong-Paz et al., 2015; Liu et al., 2016; Alu’datt et al., 2013, 2016b).

Alu’datt en el 2006 y 2014 demostró que la extracción de fenólicos libres y ligados de aislados

de proteína de soya desengrasada disminuía la estabilidad térmica de la glicinina. Sin

embargo, la sola separación de los fenólicos libres del aislado proteico de soya permitió una

estabilidad térmica más elevada comparada con la extracción de ambos tipos de fenólicos.

La capacidad de retención de agua aumentó, mejoró la viscosidad y la estabilidad térmica de

la glicinina. De igual forma, se encontró que la capacidad antioxidante era más alta cuando

sólo se extraían los compuestos fenólicos libres, pero no los ligados en aislados proteicos de

soya y semilla de lino.

21

LEGUMINOSAS

En términos de importancia económica, las Leguminosae son la familia más importante de

las dicotiledóneas (Harbone, 1994) y constituyen el segundo grupo de plantas más

importante después de los cereales en la dieta de los humanos, pero en comparación con

éstos, las semillas de las leguminosas son ricas en proteínas de alta calidad, por lo que

resultan una fuente de alimento altamente nutritivo (Zhao, et al., 2014).

Sus semillas acumulan grandes cantidades de proteína durante su desarrollo. La mayoría de

estas proteínas están desprovistas de actividad catalítica y no desempeñan algún papel

estructural en el tejido del cotiledón. Se almacenan en las vacuolas o cuerpos de proteínas,

en las células del parénquima cotiledóneo, sobreviven a la desecación en la semilla. Estas

proteínas maduran y se someten a proteólisis en la germinación, proporcionando

aminoácidos libres, así como amoniaco y esqueletos de carbono a las plántulas en desarrollo.

Estas proteínas de semilla se denominan proteínas de almacenamiento (Casey et al., 1986).

Las proteínas representan alrededor del 20% (peso seco) en semillas como chícharo y

frijoles, aumentando hasta 38-40% en la soya o lupino (Derbyshire, 1976; Guéguen y Cerletti,

1994). La clase más abundante de proteínas en los granos de leguminosas son las globulinas

(proteínas solubles en soluciones salinas) y a su vez están clasificadas como 7S y 11S de

acuerdo con su coeficiente de sedimentación. Desde el punto de vista nutricional, todas las

proteínas de almacenamiento de las leguminosas son bajas en aminoácidos azufrados (Met,

Cys y Trp), cabe destacar que la concentración de lisina es mayor que en los cereales

(Rockland y Radke, 1981; Ampe et al., 1986).

Además, las leguminosas contienen un número de compuestos no-nutricionales que pueden

ser de naturaleza proteica y no proteica. Su presencia es a menudo el resultado de una

adaptación evolutiva que permite a la planta sobrevivir y completar su ciclo de vida bajo

condiciones naturales. Los efectos anti-nutricionales consisten en la inhibición de varias

enzimas digestivas, incluyendo la tripsina, quimotripsina y amilasa (Leterme et al., 1992). Sin

embargo, sus efectos usualmente se manifiestan sólo si la semilla o la harina son consumidas

sin cocinarse, ya que el calor de la cocción normalmente desactiva estas proteínas (Vidal-

Valverde et al., 1994).

22

BENEFICIOS DEL CONSUMO DE LEGUMINOSAS

A pesar de su contenido de lípidos, almidón y proteínas, se afirma que las leguminosas

ayudan a regular el peso corporal gracias a su efecto de saciedad, que limita la ingesta diaria

de alimentos, por lo que su consumo frecuente en paralelo con una dieta baja en grasas

saturadas puede ayudar a controlar la homeostasis de lípidos, y en consecuencia, reducir el

riesgo de enfermedades cardiovasculares. El alto contenido de fibra, su bajo índice glucémico

(IG) y la presencia de componentes menores tales como fitoesteroles, saponinas,

oligosacáridos, etc., son considerados los principales agentes responsables de esta

propiedad (Duranti, 2006).

Su bajo IG y alto contenido de fibras no digeribles, también ayudan al control glucémico en

individuos diabéticos. Además, pueden contribuir a prevenir la resistencia a la insulina, que

representa el pródromo a la diabetes tipo II (Duranti, 2006).

El tránsito acelerado de los alimentos digeridos en el tracto intestinal (Probert et al., 1995) y

su excreción final juegan una serie de efectos positivos, como la disminución de la

reabsorción del colesterol, digestión incompleta del almidón, disminución de los procesos de

fermentación. Estos factores se han considerado beneficiosos en la prevención del cáncer,

especialmente de colon (Duranti, 2006).

GARBANZO

A nivel mundial, el garbanzo (Cicer arietinum) se consume principalmente como grano y el

modo de prepararlo está determinado por factores étnicos y regionales. Su cultivo ha sido

desde el comienzo de la agricultura hace más de 9 500 años, desde Turquía hasta Irán

(Redden y Berger, 2007). De acuerdo con estudios realizados mediante polimorfismo de

longitud de fragmentos de restricción, se ha llegado a la conclusión de que existen cuatro

centros de biodiversidad de garbanzo: Pakistán-Afganistán, Iraq, Turquía y Líbano (Talebi et

al., 2008).

Existen dos variedades de garbanzo: Kabuli y Desi, y morfológicamente son distintos como

se muestra en la Figura 10. El tipo Kabuli se destina al consumo humano y el tipo Desi al

forrajero:

23

Figura 10. Tipos de garbanzo: a) Desi; b) Kabuli

Los tipos de garbanzo que se producen en México provienen inicialmente de la región

mediterránea (Francia, España e Italia) y asiática (India y Afganistán). El Servicio de

Información Agroalimentaria y Pesquera (SIAP) publicó los estados con mayor producción

nacional de garbanzo de grano, destacando: Sinaloa (53,658.01 ton), Sonora (35,824.09 ton)

y Michoacán (16,801.44 ton) aportaron el 87.4% de la producción nacional (121,567.48 ton)

(SIAP, 2016).

COMPOSICIÓN QUÍMICA

CARBOHIDRATOS

La concentración de carbohidratos presentes en el garbanzo representa entre el 60-70% del

peso seco total del grano. En mayor cantidad se encuentra el almidón (50%), molécula

formada principalmente por amilosa y amilopectina. A diferencia del almidón en los cereales,

el de las leguminosas se caracteriza por el predominio de la fracción de amilosa (30-40%)

responsable de su baja digestibilidad debido a que, tras la cocción, esta actúa como almidón

resistente (Guillon y Champa, 2002).

También, contienen monosacáridos (usualmente 1% o menos) y en cantidades ligeramente

mayores disacáridos, como sacarosa (1-3%). Se han caracterizado diversos oligosacáridos

en semillas de leguminosas, incluyendo rafinosa (sacarosa+galactosa), estaquiosa

(sacarosa+2 galactosas) y verbascosa (sacarosa +3 galactosas), que son galactósidos de la

sacarosa (formado por una molécula de sacarosa y de una a tres moléculas de galactosa),

los cuales no son digeridos ni absorbidos por el sistema digestivo humano, lo que lleva a su

24

acumulación en el intestino grueso, donde son fermentados por las bacterias del colon. Estos

compuestos representan alrededor del 22% de los azúcares totales, de los cuales el 25%

está como rafinosa, estaquiosa y verbascosa; así como los galactosil ciclitoles incluyendo el

ciceritol, que constituye del 36 al 43% (Frimpong, 2010; Jukanti, et al., 2012).

LÍPIDOS

La concentración total de lípidos de los garbanzos tipo Desi y Kabuli oscila entre 2.9–7.4% y

3.4- 8.8%, respectivamente, y comprenden principalmente ácidos grasos poliinsaturados (62

– 67%), monoinsaturados (19–26%) y grasas saturadas (12–24%) (Wood y Grusak, 2007).

El principal ácido graso presente en las fracciones lipídicas es el ácido palmítico (Ravi, 2005).

El ácido linoleico se encuentra en el tipo Desi (46 - 62%) y Kabuli (16 – 56%) (Muhammad et

al., 2007; Wood y Grusak, 2007).

OTROS COMPONENTES

El garbanzo contiene vitaminas hidrosolubles y liposolubles. Del complejo B destacan la

riboflavina (B2), la niacina (B3), la vitamina B6 se encuentra presente en forma de piridoxina

(Wood y Grusak, 2007). El contenido de folato varía de 150 – 557 µg/g, y de vitamina C, 4

mg/100 g (Wood y Grusak, 2007). Abbo et al., (2005) señalan que el garbanzo contiene alta

concentración de carotenoides, hasta 49 mg/100 g de β-caroteno, así como luteína y

zeaxantina. Por otra parte, el garbanzo contiene 13.7 mg/100 g de vitamina E (Wood y

Grusak, 2007; Jukanti et al., 2012).

La variación en los micronutrientes del garbanzo depende directamente de las condiciones

del cultivo (Wood y Grusak, 2007; Muhammad et al., 2007).

COMPUESTOS NO NUTRICIONALES

Los factores o compuestos no nutricionales del garbanzo pueden dividirse en tipo proteico y

no proteico (Domoney, 1999). El no proteico engloba alcaloides, taninos, fitatos, saponinas y

compuestos fenólicos; mientras que los factores no nutricionales de tipo proteico incluyen

inhibidores de tripsina, quimotripsina, lectinas y péptidos antifúngicos. Son de interés

comercial ya que afectan de forma negativa ciertas modificaciones enzimáticas necesarias

25

durante el procesamiento de los alimentos, como la capacidad de retención de agua,

capacidad de formación de geles y la formación de espuma en diferentes productos (García-

Cerreno, 1996), reducen la digestibilidad, o bien, otorgan un sabor amargo que lo hace

menos apetecible para el consumo en humanos y animales (Birk y Peri, 1980).

En cuanto a los compuestos fenólicos, en el garbanzo han sido identificados principalmente

altos niveles de biochanina A (Mazur et al., 1998) y en menor cantidad, la biochanina B, mejor

conocida como formononetina (Aguilera, et al., 2011; Mazur et al., 1998), y que

estructuralmente son similares a la genisteína y daizeína de la soya, excepto por un grupo

hidroxilo metilado (Stevenson y Aslam, 2006) (Figura 11) y cuyos efectos benéficos a la salud

han sido reportados (Cassady et al., 1988; Kole et al., 2011; Rathel et al., 2005).

Figura 11. Flavonoides en el garbanzo. En la parte izquierda se ven sus análogos de

la soya, respectivamente. Fuente: Girón-Calle, et al., 2016

PROTEÍNAS

El contenido de proteína en el garbanzo varía significativamente cuando se considera la

masa total del grano seco (17 – 22%) y cuando es descascarado incrementa (25–28.9%). En

varios estudios se han reportado diferencias en la concentración de proteína cruda de Kabuli

y Desi. En el Cuadro 2 se observa la calidad de la proteína del garbanzo.

26

Cuadro 2. Calidad de la proteína de la semilla de garbanzo crudo

Parámetro %

IVPDa 83.61 ± 0.40

EAAIc 67.10

PERb 2.32

Aminoácidos limitantes

Primero Valina

Segundo Metionina + Cistina

± Significa desviación estándar de tres determinaciones

a Digestibilidad in vitro de la proteina

b Relación de eficiencia proteica

c Indice de aminoácidos esenciales

Adaptado de El-Adawy y Alajaji (2006)

Las proteínas de reserva del garbanzo han sido fraccionadas en globulinas (solubles en

soluciones salinas; 56%), albúminas (solubles en agua; 12%), prolaminas (solubles en

alcohol; 2.8%), glutelinas (solubles en ácidos/álcalis; 18.1%), así como proteínas residuales

(Chavan, et al., 1989).

Las globulinas, que representan alrededor del 50% de las proteínas del garbanzo, están

compuestas a su vez por dos grandes grupos, la 11S (legumina) y la 7S (vicilina) (Casey, et

al., 1993), la legumina es la que constituyen la mayor concentración. Estructuralmente la

legumina es una proteína oligomérica con seis subunidades monoméricas cuaternarias de

54 - 60 kDa, siendo su peso molecular de alrededor 320 - 400 kDa (Casey et al., 1993);

mientras para la vicilina, Guéguen (1991) reportó los pesos moleculares de sus subunidades

como 50, 35, 33, 19, 15 y 13 kDa, caracterizados por electroforesis SDS-PAGE.

El garbanzo es una de las pocas leguminosas que contienen glutelinas, que también

pertenecen a la familia de globulinas 11–12S, y estructuralmente son similares (Shotwell et

al., 1988; Takaiwa et al., 1999).

27

Las proteínas del garbanzo son relativamente bajas en aminoácidos azufrados, tales como

metionina, cisteína y triptófano (Cuadro 3). Sin embargo, el contenido de lisina y arginina es

alto en comparación con los cereales (Duranti, 2006). Otros tipos de proteínas que se

encuentran en las leguminosas son algunas enzimas, inhibidores de tripsina y las lectinas, y

se destaca que la mayoría de estos compuestos son solubles en agua.

Cuadro 3. Contenido de aminoácidos en la semilla de garbanzo.

Aminoácido Wang y Daun (2004)* El-Adawy y Alajaji

(2006)*† Kabuli Desi

Lys 5.80 5.90 7.70

Met 1.50 1.50 1.60

Cys 1.40 1.30 1.30

Phe 5.20 5.30 5.90

Tyr 2.80 2.30 3.70

Ile 3.10 3.60 4.10

Leu 6.40 7.00 7.00

Thr 4.20 4.30 3.60

Val 3.70 4.00 3.60

Arg 10.50 9.80 10.30

His 2.10 2.20 3.40

Ala 3.90 4.10 4.40

Asp 12.10 12.80 11.40

Glu 15.2 16.00 17.30

Gly 3.80 3.90 4.10

Pro 4.90 4.80 4.60

Ser 5.90 6.00 1.10

Trp 1.0 0.90 4.90

* Expresado como g/16g N

† El tipo de garbanzo no es especificado

28

ANTECEDENTES

Se han realizado diferentes trabajos con proteínas de garbanzo, que incluyen desde

hidrolizados, hasta la obtención y caracterización de péptidos. Entre estos se encuentran:

Zhang et al., (2011) reportan la purificación de un péptido con actividad antioxidante obtenido

a partir del hidrolizado de proteína de garbanzo digerido con AlcalasaMR, el péptido se obtuvo

por separación del hidrolizado mediante SephadexMR G-25, siendo la fracción de menor peso

molecular la que presentó mayor capacidad antioxidante. Asimismo, la secuencia de

aminoácidos se identificó como Asn-Arg-Tyr-His-Glu, con peso molecular de 717.37 Da y

relación molar de 1:1:1:1:1 para los cinco aminoácidos en la secuencia. Este péptido presentó

actividad de captación de radicales libres DPPH, hidroxilo y superóxido, además de actividad

quelante de hierro y cobre con valores de 76.9 y 63% respectivamente, evaluando una

concentración del péptido de 50 µg/mL. Además, la inhibición de la peroxidación lipídica

resultó ser el mayor al estándar de α-tocoferol. La relación de inhibición de la autooxidación

del ácido linoléico fue de 88.8% a los ocho días del análisis.

Kou et al., (2013) identificaron un péptido con capacidad antioxidante en la albúmina del

garbanzo usando HLPC en fase reversa, acoplado a un espectrómetro de masa. La

secuencia fue identificada como Arg-Gln-Ser-His-Phe-Ala-Asn-Ala-Gln-Pro y un peso

molecular de 1155 Da; conteniendo los siguientes aminoácidos que tienen un papel

importante en su actividad antioxidante: residuos hidrófobos (Pro e His), residuos de

aminoácidos aromáticos (Phe) y aminoácidos no polares alifáticos (Ala). Asimismo,

encontraron que este péptido es mejor estabilizando radicales hidroxilo.

Torres-Fuentes et al., (2011) fraccionaron un hidrolizado de proteína de garbanzo obtenido

por un tratamiento pepsina/pancreatina, empleando una columna de afinidad con cobre

inmovilizado. Estos investigadores reportan un valor de quelación de 28, 36.7 y 45%

evaluando 60 μg de cada fracción (F1, F2, F3). La fracción F1 presentó alto contenido de Lis

(11.5 g/100 g de proteína) y Arg (24.9 g/100 g) mientras que las fracciones F2 y F3

presentaron un alto contenido de His (17.4 y 22.9 g/100 g respectivamente) existiendo una

correlación positiva entre el contenido de este aminoácido y la capacidad quelante de cobre.

Estas fracciones fueron separadas por cromatografía de filtración en gel, y las sub-fracciones

obtenidas se analizaron, obteniendo los valores más altos de quelación para F2B, F2D, F3D

29

y F3E por arriba del 80% evaluando 30 µg de muestra; el peso molecular de estas sub-

fracciones fue de 1205, 105, 308 y 162 Da respectivamente. Estos resultados muestran que

los péptidos quelantes generados durante la digestión de la proteína del garbanzo pueden

prevenir la generación de EROs y favorecer la absorción de minerales.

En otro estudio, Torres-Fuentes et al., (2015) lograron obtener 4 péptidos con una presencia

de aminoácidos con propiedades antioxidantes, (hidrofóbicos, ácidos y básicos), así como la

posición específica de los aminoácidos en la secuencia peptídica que puede también

contribuir a su bioactividad, tales como los aminoácidos hidrofóbos en el N- terminal y C-

terminal (Li y Li, 2013); además los aminoácidos polares, como histidina o arginina en la

posición C- terminal, contribuyen a la actividad antioxidante (Li y Li, 2013). Las secuencias

de los péptidos se citan a continuación: Ala-Leu-Glu-Pro-Asp-His-Arg (ALEPDHR), 836.4 Da;

Thr-Glu-Thr-Trp-Asn-Pro-Asn-His-Pro-Glu-Leu (TETWNPNHPEL), 1336.6 Da; Phe-Val-Pro-

His (FVPH), 498.2 Da; Ser-Ala-Glu-His-Gly-Ser-Leu-His (SAEHGSLH), 836.4 Da.

30

JUSTIFICACIÓN

El estilo de vida de la actualidad, aunado a la contaminación ambiental, radiación, químicos,

la popularidad de comida hipercalórica, así como el estrés, causan una sobreproducción de

RL y EROs que contribuyen a varios desórdenes de salud en humanos. Sobre este

escenario, en las últimas décadas ha crecido el interés y demanda del consumidor por

alimentos funcionales que además de nutrir, contengan propiedades biológicamente activas,

como la antioxidante. Esto ha provocado una búsqueda constante de nuevas fuentes para la

elaboración de estos productos.

Entre las opciones como materia prima destacan las leguminosas, y en especial el garbanzo,

cuya alta disponibilidad en el país, así como su contenido de proteína, lo vuelve una fuente

atractiva para la obtención de hidrolizados proteicos. Sin embargo, el garbanzo también

contiene distintos compuestos no nutricionales que limitan su óptimo aprovechamiento,

destacando los compuestos fenólicos, que por sí mismos poseen capacidad antioxidante,

pero a su vez se relacionan de forma negativa con los carbohidratos y más importante, con

las proteínas.

Por lo que el presente estudio pretende ofrecer un punto de vista en la investigación sobre el

garbanzo como una fuente de hidrolizados proteicos, así como su interacción con los

compuestos fenólicos, y si éstos ejercen un efecto sinérgico o antagónico en la capacidad

antioxidante.

31

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Determinar la influencia de los compuestos fenólicos en la actividad antioxidante de

hidrolizado proteico obtenido de semilla de garbanzo (Cicer arietinum L.)

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Determinar la composición química proximal de la semilla de garbanzo (C. arietinum

L.).

2. Obtener el concentrado proteico de la harina de semilla de garbanzo por precipitación

isoeléctrica.

3. Obtener un concentrado de proteínas reducido en compuestos fenólicos del

concentrado proteico.

4. Hidrolizar enzimáticamente los concentrados proteicos obtenidos, por medio de un

sistema secuencial de pepsina-pancreatina.

5. Caracterizar los hidrolizados de proteína de garbanzo por medio del perfil

electroforético y grado de hidrolisis

6. Evaluar la actividad antioxidante de los hidrolizados proteicos.

32

MATERIALES Y MÉTODOS

Fueron empleadas semillas de garbanzo de la variedad Kabuli adquiridas en el mercado local

de la delegación Miguel Hidalgo, en la Ciudad de México; y llevadas al Laboratorio de

Compuestos Bioactivos de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas para su

procesamiento.

Primero, se eliminó manualmente la materia extraña a las semillas de garbanzo, luego se

trituraron en un molino de discos para granos hasta obtener una granulometría más fina.

Posteriormente fue desengrasada usando hexano en una relación 1:5 (harina:hexano, p/v).

OBTENCIÓN DEL CONCENTRADO PROTEICO DE SEMILLA DE GARBANZO (CPG)

La extracción del concentrado de proteínas de garbanzo (CPG) se realizó utilizando el

método de Zhang et al., (2007) con modificaciones. La harina obtenida fue suspendida en

agua destilada usando una relación 1:10 p/v (harina/agua), se ajustó el pH a 9.0 con una

solución de NaOH 1 N, agitando por 1 h. Posteriormente la suspensión fue centrifugada a 10

000 rpm por 30 min a 4°C, y se desecho el precipitado. Después se ajustó el pH del

sobrenadante con HCl 1 N hasta 4.3, agitando durante 1 h. Nuevamente fue centrifugado

bajo las mismas condiciones anteriores y se recuperó el precipitado, para secarlo por

liofilización en condiciones de 0.12 mbar a -50°C.

ANÁLISIS QUÍMICO PROXIMAL DE LA HARINA Y CONCENTRADO PROTEICO DE LA

SEMILLA DE GARBANZO

Los valores de este análisis se determinaron de acuerdo con los procedimientos oficiales

descritos por la AOAC (2012):

Humedad (925.10). Se evaluó por la pérdida de peso después de secar la muestra

hasta peso constante.

Cenizas (930.05). Calculado como el peso remanente posterior al calcinamiento de

la muestra.

Extracto etéreo (930.09). Determinación realizada en un sistema Soxhlet luego de

dos extracciones con éter de petróleo, cuantificando los componentes solubles.

33

Fibra cruda (930.10). Evaluada en base a una digestión in vitro mediante tratamientos

ácidos y alcalinos, separando los constituyentes solubles de los insolubles.

Proteína total (N x 6.25) (Método 978.04). Se calcula indirectamente mediante un

sistema Kjeldahl que cuantifica el nitrógeno contenido en la muestra.

Extracto no nitrogenado (ENN). Se obtiene por diferencia al 100% de la muestra, la

sumatoria de los componentes anteriormente mencionados.

EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS AL CPG

El CPG se dividio en dos lotes a uno de ellos se le realizo un tratamiento para extraer los

compuestos fenólicos, conforme a la metodología de Nithiyanantham et al., (2012) con

modificaciones. El concentrado proteico fue sometido a dos lavados con una solución de

acetona-agua (70:30 v/v) en una relación 1:5 (concentrado/acetona, p/v), posteriormente se

decantó el líquido sobrenadante, dejando evaporar el disolvente restante a temperatura

ambiente durante 20 h. A partir de este momento se tendrán dos tipos de muestra: el

concentrado proteico conteniendo compuestos fenólicos (CPG) y el concentrado proteico

reducido en compuestos fenólicos (CPGr).

DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS AL CPG Y CPGr

Se realizó como describe Aguilera et al., (2011) con modificaciones. Los CPG y CPGr fueron

suspendidos en una solución de metanol acidificado con 1 % de HCl (v/v), en una relación

1:5 (concentrado: solución, p/v) durante 30 min. Luego, cada suspensión fue centrifugada a

5 000 rpm por 10 min. Los sobrenadantes se utilizaron directamente para la estimación de

fenólicos totales empleando el reactivo de Folin-Ciocalteu, con ácido gálico como estándar

(Singleton et al., 1999). El ensayo por triplicado se realizó de acuerdo con Nithiyanantham et

al., (2012), alícuotas (100 µL) de los extractos fueron colocados en tubos de ensayo y se

completó el volumen a 1 mL con agua destilada. 0.5 mL de reactivo de Folin- Ciocalteu (1:1

con agua) y 2.5 mL de solución al 20% de carbonato de sodio (Na2CO3) fueron adicionados

secuencialmente en cada tubo y se agitan en un vórtex. Hecho esto, los tubos se colocan en

la oscuridad por 40 min, y finalmente se midió la absorbancia a 725 nm. Los valores de las

absorbancias obtenidas para cada muestra fueron interpolados en la curva tipo de ácido

gálico (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mg/mL). La concentración de fenólicos totales fue obtenida en

mg equivalente de ácido gálico/ g (mg EAG/g).

34

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL CPG Y CPGr

La hidrólisis enzimática de las muestras de CPG y CPGr se efectúo secuencialmente con

pepsina de mucosa gástrica porcina P-7125 (Sigma Aldrich) y pancreatina de páncreas

porcino P-1750 4xUSP (Sigma Aldrich), usando un digestor de 100 mL con agitación,

termómetro y un electrodo de pH. La reacción se llevó a cabo por 120 min, tomando alícuotas

cada 15, 30, 60, 90 y 120 min y se mantuvo el pH constante durante el tratamiento enzimático.

Las condiciones de hidrólisis fueron: concentración de aislado de proteína al 5%; proporción

enzima/sustrato, 1:20 (p/p); pH, 2 para pepsina y 7.5 para pancreatina; a 37°C. Las enzimas

en las alícuotas fueron inactivadas por calor a 93°C por 5 min. Cada hidrolizado fue

centrifugado a 10,000 rpm por 15 min para separar material insoluble, y congelado para su

almacenamiento.

DETERMINACIÓN DE GRADO DE HIDRÓLISIS

Se evaluó utilizando el método reportado por Kim et al., (1990), mediante el cual se estimó

la cantidad de nitrógeno soluble en ácido tricloroacético (TCA) al 10%, con respecto a su

proporción de nitrógeno sin hidrolizar en el concentrado proteico, según la ecuación:

%𝐺𝐻 = 𝑁𝑠𝑜𝑙𝑢𝑏𝑙𝑒 𝑒𝑛 𝑇𝐶𝐴 𝑎𝑙 10%

𝑁𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 (100)

Para determinar el nitrógeno soluble en TCA se tomó una alícuota de 5 mL de cada

hidrolizado y se mezclaron con 5 mL de TCA al 10%. Esta mezcla fue centrifugada a 10 000

rpm por 15 min y el nitrógeno del sobrenadante se analizó con el método Kjeldahl (método

978.04; AOAC, 2012).

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA SOLUBLE POR EL MÉTODO DEL ÁCIDO

BICINCONÍNICO (BCA)

La concentración de proteína soluble en los hidrolizados se determinó por el método del ácido

bicinconínico (4,4’-dicarboxi-2,2’-biquinolina), que es un ensayo colorimétrico comúnmente

empleado para estimar la concentración de proteína en una muestra. Se basa en la reducción

de cobre (II) con las proteínas en medio alcalino, produciendo cobre (I) y formando un

35

complejo purpúreo con el BCA (cromóforo Cu+1(BCA)2) (Figura 12), que absorbe en la región

de los 560 nm (Zaia et al., 1998).

Figura 12. Complejo BCA-Cu. Fuente: Bainor et al. (2011)

El ensayo fue realizado por triplicado en una microplaca de 96 pozos, para lo cual se tomaron

14 µL de hidrolizado y 286 µL del reactivo BCA (preparado en una relación 1:50 de

CuSO4•5H2O-BCA), se incuba en baño maría a 60°C por 15 min para el desarrollo de color.

Después se enfría hasta temperatura ambiente y se lee la absorbancia a 562 nm. Los

resultados se interpolan en una curva tipo de 0.4 hasta 1.0 mg/mL de una solución estándar

de albúmina sérica bovina (BSA).

DETERMINACIÓN DEL PERFIL ELECTROFORÉTICO

La caracterización electroforética de los concentrados e hidrolizados se realizó en un gel de

poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, donde se anula el efecto de forma y carga

de la proteína, sólo separándose por el peso molecular. Para lograrlo se utilizan tiol-

reductores fuertes como mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT) y un detergente desnaturalizante

fuerte: el dodecil sulfato de sodio (SDS) (Badui, 2013). Se empleó la metodología de Laemmli

(1970) modificada, usando un gel separador Mini-Protean® TGX marca Bio-Rad, con un

gradiente del 8-16% de poliacrilamida en un equipo Mini-Protean 3 de BioRad®. 250 µL de

las muestras de hidrolizados fueron solubilizadas en 250 µL de regulador de Laemmli y

agitadas en un vortex para después ser calentadas a ebullición por 5 min.

Se aplicaron 15 µL tanto para la muestra como para el marcador (Kaleidoscope® marca Bio-

Rad 10-250 kD) en cada pozo del gel. La separación electroforética se realizó a 100 V por

90 min. Posteriormente el gel se colocó en una solución de TCA al 12.5% agitando a 30 rpm

durante 30 min. El gel se tiñó con una solución conteniendo 40% de metanol, 7% de ácido

36

acético y Azul de Coomassie R-250 (0.125%) durante toda la noche. El proceso de desteñido

consistió en lavar tres veces el gel en una solución de etanol al 50% por 15 min, aplicándose

después una solución de etanol - ácido acético – agua (30 – 7 – 63 % v/v) por 30 min, y

finalmente se lavó con una solución de metanol – ácido acético – agua (30 – 7 – 63 % v/v)

por 30 min.

EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

ABTS·+

La solución con el radical ABTS·+ [2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina)-6 sulfonato de amonio]

se preparó con 38 mg de ABTS y la adición de 6.62 mg de persulfato de potasio, aforados a

10 mL con agua destilada. La solución resultante reposó en la oscuridad a temperatura

ambiente durante 16 h para la estabilización del radical. Transcurrido el tiempo, es necesario

ajustar la absorbancia de la solución hasta 0.800 ± 0.05 a una longitud de onda de 734 nm.

Para el análisis de las muestras, se tomaron 3.5 µL de cada hidrolizado y se añaden 296.5

µL del reactivo de ABTS en una microplaca de 96 pozos. La absorbancia fue medida a 734

nm a los 0 y 6 min con un espectrofotómetro (ThermoScientific Multiskan Go, Software SkanIt

4.1), cuyos resultados se interpolaron en una curva tipo de Trolox de 0.6, 1.2, 1.5, 2.1, 2.7 y

3 mM, se tomaron 3.5 µL de cada una de estas soluciones por triplicado, añadiendo 296.5

µL del reactivo de ABTS·+ ajustado. Las absorbancias fueron leídas para cada concentración

de Trolox después de 6 min.

Cálculo de inhibición:

%𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 = (𝐴𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 − 𝐴𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙

𝐴𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙) 100

Con los resultados obtenidos, se construye una gráfica que presenta el porcentaje de

inhibición en función de la concentración de Trolox, a partir de la cual se interpolan los valores

de lecturas de absorbancia de las muestras, y se reporta en mmol equilaventes de Trolox/g

de muestra.

37

DPPH

Este método se basa en la reducción del radical DPPH· (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) que es

un cromógeno púrpura) a su hidrazina correspondiente (DPPH-H, color amarillo) al

reaccionar con los antioxidantes (donadores de hidrógeno) (Sánchez-Moreno, 2002).

Se preparó una solución de 125 µM del reactivo DPPH en metanol al 80%. En una microplaca

de 96 pozos, se añadieron por triplicado 28 µL de muestra con 272 µL de solución de DPPH,

protegidos de la luz, fueron homogeneizados y dejaron reposar por 1 h. Al cabo de este

tiempo, se leyó a 520 nm en un espectrofotómetro (ThermoScientific Multiskan Go, Software

SkanIt 4.1).

La actividad antirradical se calculó como el porcentaje de decoloración de DPPH, usando la

siguiente ecuación:

% 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑟𝑟𝑎𝑑𝑖𝑐𝑎𝑙 = 𝐴𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 − 𝐴𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

𝐴𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 (100)

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Todos los resultados fueron procesados mediante estadística descriptiva utilizando medidas

de tendencia central (media) y dispersión (desviación estándar).

38

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Figura 13. Diagrama del desarrollo experimental

39

La Figura 13 ilustra grosso modo todo el proceso realizado desde la recepción de los granos

de garbanzo al laboratorio donde fue molido y tamizado con el fin de aumentar la superficie

de contacto. Fue determinado el análisis químico proximal a la harina tamizada.

Posteriormente se preparó para la extracción y precipitación de las proteínas valiéndonos del

punto isoeléctrico. Una vez hecho esto el concentrado obtenido fue liofilizado para facilitar la

manipulación y como forma de extender su vida útil. También fue determinado el análisis

químico proximal con el objetivo de saber cuánto se logró concentrar el contenido original de

proteína.

Después el 50% de la cantidad total obtenida fue sometida a una extracción de los

compuestos fenólicos presentes utilizando dos tipos de disolventes y así se obtuvieron dos

tipos de concentrado proteico, uno sin tratamiento y otro reducido en fenólicos. Luego cada

uno fue hidrolizado por 45 min con una solución enzimática de pepsina, y posteriormente fue

digerido con solución enzimática de pancreatina por 75 min más, tomando alícuotas al tiempo

0, 15, 30, 60 y 120 min totales. Los hidrolizados obtenidos una vez que se detenía la reacción

fueron centrifugados para eliminar remanentes de la digestión y fueron congelados para su

almacenamiento. Posteriormente se realizaron los ensayos para grado de hidrólisis, proteína

soluble, electroforesis en gel de poliacrilamida bajo condiciones desnaturalizantes para saber

el peso molecular de los hidrolizados, así como la evaluación final de la capacidad

antioxidante con las técnicas del radical ABTS y el reactivo DPPH.

40

RESULTADOS Y DISCUSIONES

OBTENCIÓN DEL CPG

La manera más fácil y económica de preparar un aislado proteico es aprovechando la

diferencia de solubilidad y el punto isoeléctrico de las fracciones proteicas de interés. Para la

obtención de estos aislados por lo general se utiliza agua y álcalis ajustados a un valor de

pH que depende de cada caso. En el presente estudio fue empleado un total de 3 200 g de

harina previamente desengrasada, cuyo contenido de proteína era de 13.32 % b.s. y

concluido el proceso de precipitación de las proteínas y su liofilización, el peso final del

concentrado fue de 371.7 g generando un rendimiento promedio final de 11.61 % (Cuadro

4); con un porcentaje de proteína de 87.27 % b.s. (Cuadro 5), que es un valor superior al que

obtuvieron Sánchez-Vioque et al., (1999) de 78.0%, y similar al que determinó Paredes-

López (1991) de 87.8% ± 0.6 b.s. en condiciones análogas.

Cuadro 4. Rendimiento en la extracción de la proteína por lote

Harina desengrasada

(g)

Concentrado liofilizado

(g)

Rendimiento

(%)

400.00 38.60 9.65

800.00 102.41 12.80

800.00 99.62 12.45

400.00 42.75 10.69

800.00 88.39 11.05

3,200.00 371.77 Promedio =

11.32%

Aunque la solubilidad de las proteínas del garbanzo es mínima al pH 4.3, existe pérdida de

aquellas moléculas que son solubles a este pH, especialmente las albúminas (Berot y Davin,

1996), fracción que representa el 12% del total de la concentración de proteínas en el

garbanzo (Chavan et al., 1989). Por lo tanto, de acuerdo con la concentración final de

proteínas que se lograron extraer (87.27% b.s.), se obtuvo un concentrado (55–89%

proteína), a diferencia de un aislado cuyo contenido debe ser mayor al 92% (Harrison Sport

Nutrition, 2017).

Las atracciones intermoleculares débiles se conservan en el pH natural del medio donde

encuentran las proteínas. Un cambio en éste acarrea modificaciones en la estructura terciaria

41

por los cambios en la ionización de las cadenas laterales cargadas (Badui, 2013). En los

procesos tecnológicos cuyo fin es la obtención de aislados proteicos vegetales, el tratamiento

alcalino se aplica con mayor frecuencia a valores de pH cercanos a 10 mediante

solubilización alcalina (Badui, 2013). Posteriormente, se lleva el pH a valores ácidos que

implique una protonación de cargas principalmente de los aminoácidos Asp y Glu, y que al

ser los aminoácidos que se encuentran en mayor cantidad en la proteína del garbanzo

(Cuadro 3), su solubilidad va disminuyendo hasta llegar al pH óptimo reportado por Sánchez-

Vioque et al., (1999) que es de 4.3.

El no haber realizado un tratamiento adicional al precipitado con disolventes polares y no

polares, con el fin de extraer compuestos que pudieran ser solubles en ellos, como fibra,

lípidos, azúcares solubles, así como otros carbohidratos, provoca que el contenido de

proteína disminuya con respecto a un concentrado proteico que sí lo tiene (Sánchez-Vioque

et al., 1999).

ANÁLISIS QUÍMICO PROXIMAL

El análisis químico proximal se realizó a la harina y al CPG (Cuadro 5). Las leguminosas son

consideradas una buena fuente de proteína, observando que el contenido de proteínas, a

pesar de ser baja con respecto a lo reportado en otras investigaciones como la de Sánchez-

Vioque, (1999), con un valor de 24.7% para la harina, esté continúa siendo considerable, en

comparación con otras fuentes proteicas como los cereales, lacteos, cárnicos, cuyo valor no

es mayor del 10%, (Badui, 2013).

El contenido de proteína varía significativamente cuando se considera la masa total del grano

seco (17-22%) y cuando es descascarado, pudiendo incrementarse hasta 25.3 - 28.9%. En

el procedimiento que se realizó dentro de esta investigación no se consideró la eliminación

de la cáscara previo a la molienda, por lo que esa podría ser una de las razones por las

cuales, el rendimiento de proteína es menor comparado con otros estudios. La calidad de la

proteína del garbanzo es equivalente al que ofrece el grano de frijol de soya (Friedman,

1996), pero como ya se ha mencionado, el garbanzo tiene factores no nutricionales que

disminuyen la disponibilidad de la proteína. De acuerdo con Singh (1988), los inhibidores de

proteasas y amilasas, lectinas, polifenoles y algunos carbohidratos son los principales

42

factores no nutricionales. Otros factores son el ácido fítico y carbohidratos no digeribles como

la rafinosa y estaquiosa.

Cuadro 5. Composición proximal de la harina y el concentrado proteico (g/100g) en base seca

Determinación Harina Concentrado Proteico

Cenizas 4.35 ± 0.15 3.05 ± 0.05

Extracto etéreo 11.39 ± 0.71 3.37 ± 0.85

Proteína 13.32 ± 0.19 87.27 ± 0.84

Fibra Cruda 19.62 ± 0.06 2.93 ± 0.19

Carbohidratos* 51.32 3.38

*Obtenido por diferencia

± Desviación estándar de tres determinaciones

En el presente trabajo se determinó que la cantidad de proteína era de 13.32%, aunque se

han reportado diferencias, debidas principalmente a la variedad y región de cultivo, por

ejemplo: Williams y Singh (1987) reportaron de 17 a 24%, Newman et al., (1987) entre 12.6

y 30.5%, De Haro y Moreno (1992), entre 15.5 y 28.2%. El-Adaway y Alajaji (2006)

determinaron que la digestibilidad in vitro de la proteína es de 83.61%, por lo que su calidad

proteica es de las mejores entre las leguminosas. El contenido en proteína es un carácter

muy influenciado por el ambiente y, por lo tanto, poco heredable (Kharrat et al., 1990). Al

igual que para el resto de las leguminosas, son los aminoácidos azufrados (cisteína y

metionina) los aminoácidos limitantes (De Haro y Moreno, 1992; Jambunathan y Singh, 1980;

Gil et al., 1996).

Las leguminosas exhiben altos valores de minerales que dependen de la especie, las

condiciones de cultivo y las características con las que crece la planta. En valor reportado en

el presente estudio concuerda con lo reportado por Sánchez-Vioque et al., 1999 y Mondor et

al., 2009.

El garbanzo es una buena fuente de carbohidratos, que en el presente estudio es de 51.32

% del contenido total en base seca, pudiendo llegar a tener hasta 80% del peso seco total

del grano (Aguilar-Raymundo et al., 2013). Principalmente la concentración de

monosacáridos en el garbanzo son galactosa (0.05%), ribosa (0.1%), fructosa (0.25%) y

43

glucosa (0.7%), mientras que, en los disacáridos libres, los más abundantes son la maltosa

y la sacarosa (0.6 y 1-2% respectivamente). El garbanzo contiene oligosacáridos que no son

digeridos ni absorbidos por el sistema digestivo humano, pero son fermentados por las

bacterias del colon. Los α- galactósidos son los más abundantes en la semilla de garbanzo,

representando alrededor del 62% de los azúcares totales (Frimpong, 2010; Jukanti et al,

2012). Cabe resaltar el contenido de almidón, que llega a representar del 37.5 al 50.8% del

contenido de carbohidratos totales en el garbanzo, siendo mayor en la variedad Kabuli

(Frimpong, 2010). El garbanzo también contiene polisacáridos que no forman parte del

almidón, y se dividen en dos grupos: solubles e insolubles. La parte soluble está integrada

por hemicelulosa (3.5-9%) y sustancias pécticas (1.5-4%).

Los azúcares pueden producir una pérdida de la calidad de la proteína ya que reaccionan

con éstas mediante la reacción de Maillard (Davies et al., 1998; Friedman, 1996a) dando

lugar a la formación de una base de Schiff y produciéndose una disminución en el contenido

de lisina, metionina y triptófano asimilable (Hurrel et al., 1983; Hurrel et al., 1985; Finot, 1982;

Finot et al., 1982).

Aunque la harina fue sometida a extracciones de lípidos con hexano, los remanentes son

mayoritariamente de naturaleza polar (Sánchez-Vioque, et al. 1999). El porcentaje

cuantificado de 3.37% para el CPG puede llegar a ser de importancia por la posible

interacción de éstos, primero, con el oxígeno en la formación de radicales libres; y segundo,

en la interacción de éstos con la proteína misma, (Kikugawa et al., 1981). En parte son

responsables de otorgar sabor a los concentrados proteicos. Los lípidos pueden formar

complejos con la amilosa y alterar la biodisponibilidad, mayormente del almidón (Cai et al,

2001; Candela et al, 1997).

Una vez que se ha obtenido el concentrado se puede observar la modificación de los

diferentes componentes. En el caso de la proteína, de 13.32% que se tenía inicialmente,

pudo concentrarse hasta el 87%, con la consecuente disminución de los demás

componentes. Aunque el concentrado proteico tiene una mayor riqueza proteica con respecto

a la harina, aún presenta contenidos elevados de otros componentes no deseados en el

producto final. Entre estos compuestos se destaca la fibra, los azúcares, lípidos y como se

describirá más adelante, los compuestos fenólicos.

44

DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS TOTALES

La determinación de los compuestos fenólicos totales (CFT) se realizó por el método de Folin-

Ciocalteu para el CPG y CPGr. Como se puede observar en el Cuadro 6, la concentración

de CFT en la muestra sin el tratamiento de acetona-agua fue de 3.381 ± 0.409 mg eq. de

ácido gálico/g de muestra seca, resultado similar al reportado por Singh (1988) de 3.03 mg/g

y por Segev et al., (2010) de 0.5 a 6.8 mg eq. (+)-catequina/g; aunque difiere de lo reportado

por Nithiyanantham et al. (2012), que reportó 19.42 ± 2.72 mg eq. ácido tánico/g, y por

Sreerama et al., (2012) de 10.84 ± 0.12 mg eq. ácido gálico/g para las harinas

desengrasadas. Xu y Chang (2008), reportaron un contenido de polifenoles en el frijol negro

Turtle Eclipse de 9.70 ± 0.35 mg EAG/g

Cuadro 6. Concentración de compuestos fenólicos en CPG y CPGr

CPG A765 mg/mL mg/g Promedio (mg/g)

CPG

0.3038 0.1620 3.2407

3.381 ± 0.409 0.3508 0.1920 3.8410

0.2897 0.1530 3.0606

CPGr

0.1093 0.0378 0.7567

0.754 ± 0.007 0.1095 0.0379 0.7592

0.1085 0.0373 0.7464

± Desviación estándar de tres determinaciones

La variación en la concentración de estos compuestos se puede atribuir a factores genéticos,

oscilación entre cada cultivo, así como el procedimiento de extracción utilizado (Amarowicz

y Pegg, 2008). Los polifenoles se encuentran de forma más abundante en el pericarpio del

grano, el cual fue separado en su mayoría durante el proceso de molienda y posterior

tamizado, lo que podría explicar los valores por debajo de los reportados en estudios

anteriores. Sin embargo, la presencia de estos, aún en baja concentración podría causar

interferencia al momento de realizar la hidrólisis. Durante el proceso de purificación de las

proteínas, en presencia de oxígeno, los compuestos fenólicos se oxidan en medio alcalino,

dando como producto ortoquinonas que se polimerizan y forman un color pardo. También es

posible que reaccionen con grupos amino terminales, con lo cual disminuye la disponibilidad

45

tanto de estos compuestos, como de algunos aminoácidos, especialmente lisina y metionina

(Cuq, 1996).

En cuanto al CPGr, se observa una disminución en la concentración de CFT teniendo

solamente 0.754 ± 0.007 mg eq. ácido gálico/g, que nos indica la eficiencia en la extracción

usando este sistema (88%).

Se ha reportado que los polifenoles presentes en el pericarpio de la semilla de frijol presentan

actividad antioxidante y pueden disminuir la digestibilidad de proteínas (Boateng et al., 2008;

Cardador-Martínez et al., 2002; Oomah et al., 2005; Xu y Chang, 2008). Para disminuir la

interferencia de éstos en las pruebas de actividad antioxidante de los posibles péptidos

contenidos en la muestra de estudio, se ha realizado la misma extracción con acetona al 75%

(Carrasco-Castilla et al., 2012), logrando la reducción de estos compuestos en 94.7 %.

Boateng et al., (2008) reportó menor contenido de compuestos fenólicos (6.21 mg EAG/g)

extraídos con etanol.

La disminución de compuestos fenólicos es posible porque están involucrados mecanismos

reversibles en la interacción de estos compuestos con las proteínas, siendo los enlaces

iónicos los que han sido reportados como predominantes, pero hay otras interacciones, tales

como puentes de hidrógeno, enlaces hidrofóbicos y fuerzas de van der Waals (Hernández-

Jabalera et al., 2015).

Los compuestos fenólicos pueden dividirse en dos clases: tipo flavonoides y no flavonoides.

Las isoflavonas son una clase importante de flavonoides en la familia Leguminosae, y en el

garbanzo se han encontrado dos clases principales: biochanina A y formononetina (Figura

9). Para la extracción de compuestos flavonoides que poseen un gran número de grupos

hidroxilo insustituidos o azúcares (son considerados polares), se emplean disolventes

polares como el metanol, etanol, acetona, DMSO o agua (Pérez-Nájera et al., 2013).

DETERMINACIÓN DEL GRADO DE HIDRÓLISIS

El uso de técnicas in vitro que simulen una digestión in vivo ha sido extensamente usada en

animales y humanos (Ribeiro et al., 2016). Para ello fue realizada una hidrólisis secuencial

con pepsina a pH 2 durante 45 min, emulando una digestión en el estómago; seguido del uso

de pancreatina a pH 8 para recrear las condiciones del intestino delgado. La Figura 14 ilustra

la curva de hidrólisis obtenida para los dos tipos de muestras probadas.

46

Figura 14. Curvas de hidrólisis del concentrado proteico de C. arietinum L.

La pepsina es una proteasa aspártica cuyo pH óptimo es 2.0, aunque puede estar activa en

un intervalo de 1.0-4.0, y una temperatura óptima de 37°C. En contraste con otras peptidasas,

solamente hidroliza enlaces peptídicos, no enlaces amidas ni ésteres. Es específica para la

configuración óptica de los aminoácidos, siendo los de tipo aromático buenos sustratos,

especialmente si el otro residuo es aromático o un ácido dicarboxílico. Esta especificidad

puede ser un limitante al momento de realizar cualquier hidrólisis con esta enzima, ya que

influye la composición de la proteína. Así es como se forman productos intermediarios, cuyo

carácter físico es opuesto a los de las proteínas más complejas de las que se derivan,

resaltando el aumento de su solubilidad en agua. Esta solubilización de las proteínas parece

ser la función principal de la pepsina, pues las sustancias proteicas formadas son demasiado

complejas para ser absorbidas por las paredes digestivas (Malewiak y Péquignot, 1997).

Como se observa en el Cuadro 7, hasta el minuto 30, el porcentaje de hidrólisis no fue mayor

al 20% para ambas muestras, el cual aumentó cuando fue adicionada la pancreatina, ya que

al ser una mezcla de endo- y exopeptidasas, contribuye a una mayor fragmentación de los

enlaces peptídicos. A nivel metabólico, lo que ocurre es que el quimo ácido llega al duodeno,

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

80.00

0 20 40 60 80 100 120 140

% G

rad

o d

e H

idró

lisis

Tiempo (min)

CPG CPGr

47

donde las secreciones pancreáticas, biliares e intestinales se desencadenan en seguida por

mediación de dos hormonas duodenales: la secretina y la hormona duodenal colescitocinina-

pancreozimina (CCK-PZ) que condiciona la secreción simultánea de bicarbonatos (que

elevan el pH) y de enzimas, que son activas en medio alcalino (alrededor de 7- 8). Las dos

enzimas principales de la digestión proteica son la tripsina y quimotripsina, que se encargan

de continuar con la acción de la pepsina. Este conjunto de proteasas pancreáticas degrada

las proteínas hasta la fase de oligopéptidos de 2, 3 o 4 aminoácidos (Malewiak y Péquignot,

1997).

Cuadro 7. Curva de hidrólisis enzimática del concentrado proteico

Tiempo (min) % Grado de Hidrólisis

CPG CPGr

15 10.55 ± 1.53 13.27 ± 1.47

30 17.33 ± 1.75 20.39 ± 2.96

60 26.37 ± 2.08 39.80 ± 1.48

90 39.18 ± 3.65 57.12 ± 1.52

120 45.92 ± 2.17 68.30 ± 2.04

± Desviación estándar de tres determinaciones

En la Figura 12 es posible apreciar un incremento en el grado de hidrólisis cuando el

concentrado proteico fue sometido a lavados con acetona para disminuir la concentración de

fenólicos totales. Dichos resultados ofrecen una pauta para mostrar la interacción de estos

compuestos con las proteínas del garbanzo, y su posible interferencia en la acción de las

enzimas, ya que al estar en menor cantidad el grado de hidrólisis aumentó hasta un 68.30 %

con lo cual podemos inferir que se están liberando más péptidos en el CPG reducido en

fenólicos. Sin embargo, una proteólisis extensiva puede afectar las potenciales propiedades

antioxidantes (Elías et al., 2008) ya que los aminoácidos libres no tienen buenas propiedades

antioxidantes, que podría verse reflejado posteriormente.

Hernández-Jabalera et al., (2015) reportaron un grado de hidrólisis máximo de 24.01% en

concentrados proteicos de semilla de colza reducidos en compuestos fenólicos, utilizando un

sistema pepsina-pancreatina durante 240 min de hidrólisis, que es un valor menor al

encontrado en el presente estudio. La diferencia puede radicar en la concentración de enzima

48

utilizada, ya que los investigadores emplearon las enzimas al 1% mientras en este trabajo la

concentración fue de 5%.

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA SOLUBLE

Para que se puedan obtener efectos benéficos, los péptidos resultantes de la digestión deben

alcanzar el intestino delgado en una forma activa, o bien, ser activados dentro de él (Ribeiro

et al., 2016). La absorción de los nutrientes depende de su carácter hidrosoluble y son

transportados hacia los capilares sanguíneos que desembocan en la vena porta (Malewiak y

Péquignot, 1997) que en el caso de aminoácidos y oligopéptidos son absorbidos por

mecanismos activos por medio de transportadores dependientes de ATP. Se debe asegurar

que la proteína cuantificada fuera solamente la soluble, por lo que se procedió a realizar una

precipitación previa con ácido tricloroacético (TCA) al 12% para separar los remanentes de

la hidrólisis, como son las enzimas o la proteína que no logró ser hidrolizada. No se sabe

mucho acerca del mecanismo de precipitación del TCA, pero se sugiere una agregación

hidrofóbica como mecanismo dominante (Novák y Havlíček, 2016).

El contenido de proteína soluble en los hidrolizados fue cuantificado por el método del ácido

bicinconínico (BCA), el cual fue elegido ya que la proteína del garbanzo es rica en residuos

de arginina (Cuadro 3), lo que produciría un resultado artificialmente alto en la técnica de

Bradford. Además, las técnicas de Lowry y BCA ofrecen mejores resultados cuando las

muestras son mezclas complejas de proteínas (Olson y Markwell, 2007).

Similarmente, como ocurre en el grado de hidrólisis, se puede observar un aumento en la

concentración de proteína soluble cuando el concentrado de proteina es sometido a una

extracción de fenólicos (Figura 13). Pringent et al., (2003) sugirieron que la disminución en

la solubilidad de las proteínas se debe a interacciones no covalentes entre compuestos

fenólicos y proteínas, que las precipitan mediante mecanismos multidentados (por

interacciones simultaneas con más proteínas) o bien, por recubrimientos con una monocapa

menos hidrofílica. Como consecuencia, se tiene un cambio en la carga neta de las proteínas.

Sin embargo, en ambas muestras, se observa la máxima solubilidad en el minuto 30,

manteniéndose constante el resto de la hidrólisis (Cuadro 8). En la técnica de BCA, la primera

reacción ocurre como resultado de la interacción entre el complejo de cobre-BCA con los

residuos de cisteína, cistina, triptófano, y tirosina. A elevadas temperaturas (60°C fue la

empleada en esta técnica), el enlace peptídico también es responsable en el desarrollo de

49

color. Arcan y Yemenicioğlu (2010) encontraron que la concentración de proteína soluble

disminuía conforme aumentaban la concentración de enzima -que en este caso coincide con

la adición de pancreatina al sistema-, el cual indicaba una hidrólisis extensiva y pérdida de

enlaces peptídicos que puedan favorecer el desarrollo de color en el ensayo, lo que puede

explicar los valores constantes en los hidrolizados posteriores a 30 min.

Cuadro 8. Proteína Soluble en CPG y CPGr

Tiempo (min) Proteína Soluble (mg/mL)

CPG CPGr

0 6.424 ± 0.59 14.771 ± 0.15

15 9.372 ± 0.72 23.337 ± 0.33

30 10.447 ± 0.69 24.729 ± 0.54

60 9.362 ± 0.58 23.267 ± 1.00

90 7.739 ± 2.46 23.093 ± 1.28

120 9.338 ± 1.28 23.240 ± 1.43

± Desviación estándar de tres determinaciones

Figura 15. Proteína soluble en CPG y CPGr

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

0 15 30 60 90 120

mg

BSA

/mL

Tiempo (min)

CPG CPGr

50

DETERMINACIÓN DEL PERFIL ELECTROFORÉTICO

Como se mencionó anteriormente, una vez que la digestión en el intestino se ha llevado a

cabo, los oligopéptidos resultantes deben tener el tamaño adecuado para ser transportados

al interior del torrente sanguíneo y así puedan ejercer su actividad. Por ello es necesario

determinar el peso molecular para saber si éstos pueden llegar a las células donde son

requeridos. Cuando se llevan a cabo experimentos de electroforésis en geles granulados que

contienen cantidades crecientes de bisacrilamida, se debe tener en cuenta que las moléculas

de poliacrilamida formadas se encuentran como un sistema de filamentos distribuidos al azar,

cada uno de ellos formado por dos a cinco cadenas paralelas. Al aumentar los enlaces

cruzados, el diámetro del poro en estos geles puede llegar a ser tan pequeño como 60 Å,

aportando una matriz no cargada, en la que la separación se puede llevar a cabo con base

en el tamiz molecular y a las diferencias de movilidad (Gordon, 1975).

El dodecil sulfato sódico (SDS) es un detergente de acción desnaturalizante que se une a las

cadenas polipeptídicas desnaturalizadas (una molécula de SDS a cada dos aminoácidos de

la cadena). Esta unión masiva de moléculas de SDS bloquea la carga propia de la proteína

o hidrolizado, y le confiere al complejo una carga neta negativa proporcional a su masa,

haciendo que todas las proteínas acomplejadas con SDS viajen hacia la parte inferior del gel

de poliacrilamida. Por lo tanto, las moléculas de mayor tamaño quedarán rezagadas en la

parte superior del gel y las de menor tamaño pueden atravesar y pasar a través de los poros

(Clemente et al., 1999).

Las Figuras 16 y 17 ilustran los perfiles moleculares para los concentrados proteicos y los

hidrolizados En primera instancia, los geles muestran el efecto de la solubilidad para cada

una de las muestras, sobre todo en la banda del concentrado sin hidrolizar con extracción de

compuestos fenólicos (Figura 17 – C), el cual logró una separación más definida, y en

concordancia con Félix et al., (2018) la mayoría de estas bandas corresponden a las

proteínas globulares, legumina y vicilina. Específicamente, la banda que está cerca de los 50

kDa puede estar relacionada a la presencia de α, β, γ-vicilina. También aparece una banda

intensa a la altura de los 37 kDa, que puede ser atribuida específicamente a la subunidad

básica (β) de la legumina. Asimismo, podemos ver una banda a la altura de los 20 kDa, y

51

puede corresponder a la proteína 11S del garbanzo. Por último, podemos apreciar una ligera

banda a la altura de los 10 kDa, que es posible atribuirla a la subunidad α-legumina.

Figura 16. Perfil electroforético de CPG. M= marcador. C=Concentrado proteico

Figura 17. Perfil electroforético de CPGr. M= marcador, C= concentrado

Al contrario, en la Figura 16, en el carril C, no se logró una separación de los componentes

de la proteína del garbanzo, excepto por dos que se encuentran entre 25-37kDa, y como ya

se mencionó anteriormente, corresponden a la proteína 11S del garbanzo. La aglutinación

52

del resto de las proteínas se atribuye a la existencia de interacciones no covalentes entre

éstas y los compuestos fenólicos, comportamiento que continúa hasta el minuto 30 de la

hidrólisis, cuyo resultado concuerda con lo reportado en la proteína soluble para esta

muestra, donde la concentración no era mayor de los 10 mg/mL. Conforme se hidrolizan las

proteínas, se observa una acumulación de intensas bandas a la altura de los 10 a 15 kDa,

indicando que efectivamente se están obteniendo péptidos de bajo peso molecular.

Al mismo tiempo, con el aumento en el tiempo de hidrólisis van apareciendo líneas más

definidas, como es el caso de las bandas correspondientes a los 90 y 120 min en ambos

tipos de muestras, en el rango de 20 a 25 kDa, cuya naturaleza corresponde a proteínas

resistentes a la digestión enzimática. La digestión de semillas de garbanzo conduce a la

eliminación de la mayoría de sus proteínas de almacenamiento, cuya excepción son las

vicilinas y, en menor medida, las leguminas. Vicilinas y leguminas, de garbanzo y chicharo,

ya se ha demostrado que resisten tanto la digestión in vivo como in vitro (Ribeiro et al. 2016).

Estas proteínas, de la superfamilia de Cupin, se caracterizan por tener tanto efectos

benéficos en la salud y como propiedades alergénicas.

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

El potencial antioxidante de los hidrolizados proteicos depende del número de fragmentos,

su longitud, composición de aminoácidos, así como los complejos que formen con otros

compuestos tales como polifenoles y su estructura secundaria y terciaria (Elías et al. 2008).

La prueba con DPPH (Figura 18) ha sido considerada como una de las más rápidas y

precisas para evaluar las propiedades antioxidantes de frutas y vegetales. La capacidad

antioxidante se mide determinando el DPPH• remanente por medio de espectrofotometría

donde se cuantifica la decoloración de la reacción, la cual se produce al adicionar el

antioxidante a la solución metanólica o etanólica de DPPH (Brandwilliams et al., 1995).

53

Figura 18. Determinación de la capacidad antioxidante por la técnica de DPPH

Otro de los ensayos más comunes para determinar la capacidad antioxidante es el ABTS

(Figura 19), en el cual se mide la disminución de la absorbancia de este radical por acción

de los antioxidantes después de un periodo de incubación. La concentración remanente de

ABTS•+ se determina espectrofotométricamente a 734 nm. Cuando se emplea Trolox (un

análogo hidrosoluble de la vitamina E) como estándar de referencia, el método se llama

TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) (Álvarez-Parrilla et al., 2012).

Figura 19. Determinación de la capacidad antioxidante por la técnica del radical ABTS

De acuerdo con el Cuadro 9, se puede observar que el porcentaje de actividad antirradical

va aumentando conforme las proteínas son sometidas a un mayor tiempo de hidrólisis.

Aunque no se observa una diferencia entre ambos tipos de muestra, puesto que el máximo

valor obtenido en el CPG fue de 25.403 ± 5.940 % y para la muestra reducida en fenólicos,

54

el valor fue ligeramente mayor con 29.258 ± 4.510 % a los 120 min para ambos. Estos

resultados son similares a los que Torres-Fuentes et al., (2015) reportaron con DPPH, y que

inician en aproximadamente 10% hasta un máximo de 44.6% en hidrolizados proteicos de

garbanzo en concentraciones de hasta 100 mg/mL. De forma similar, Zhang et al., (2011)

obtuvieron valores similares de inhibición, siendo el máximo de 45.33% para un péptido con

peso molecular de 717.37 Da. Esto da una pauta para plantear una posible liberación de

péptidos con una naturaleza similar en los hidrolizados obtenidos en el presente estudio.

Por otro lado, Hernández-Jabalera et al., (2015) reportó un valor de 23.34 ±0.40% para

hidrolizados de concentrado proteico de semilla de colza.

Cuadro 9. Actividad antirradical DPPH en el CPG y CPGr

Tiempo (min) % Actividad Antirradical DPPH

CPG† CPGr ‡

0 18.654 ± 0.88 12.197 ± 5.71

15 19.542 ± 2.18 18.920 ± 4.16

30 17.077 ± 3.42 13.230 ± 3.95

60 19.176 ± 4.84 26.730 ± 7.77

90 23.937 ± 2.23 24.526 ± 2.74

120 25.403 ± 5.94 29.258 ± 4.51

± Desviación estándar de tres determinaciones

†El rango de concentración de proteína fue de 6.424 – 10.447 mg/mL

‡El rango de concentración de proteína fue de 14.771 – 24.729 mg/mL

Asimismo, puede observarse también que conforme avanza la hidrólisis, los valores de

actividad antirradical aumentan proporcionalmente. Este fenómeno se observa tanto en CPG

como en reducido en polifenoles, aunque entre ambos tipos de muestra no se muestra una

diferencia tan grande para afirmar que los fenólicos están ejerciciendo una acción favorable

en la actividad antioxidante.

Con respecto al ensayo de actividad antioxidante realizado con ABTS (Cuadro 10) los valores

obtenidos pueden considerarse altos si son comparamos con lo que reportó Kou et al.,

(2013), en el cual determinó una TEAC entre 0.453 y 1.918 mmol/L para hidrolizados de

albúminas del garbanzo con un rango de concentración desde 0.1 – 5 mg/mL.

55

Por el contrario, Carrasco-Castilla et al., (2012) reportó un valor de 1.82 mM TEAC/mg

proteína en hidrolizados de proteína de frijol usando un sistema pepsina-pancreatina.

Esta tendencia puede relacionarse incluso con la concentración de polifenoles que tiene cada

concentrado de la siguiente manera: La caída de absorbancia en la que se basan los cálculos

TEAC proporciona sólo estequiometría de reacción (moles totales ABTS•+ reducido por mol

antioxidante después de la reacción completa). Generalmente se pueden donar dos

electrones por grupo de fenol -OH, por lo que la capacidad antioxidante medida en TEAC

debería ser muy predecible a partir de la estructura antioxidante. De hecho, en estas

condiciones, los polifenoles son altamente favorecidos y otros efectos estructurales sobre la

reactividad antioxidante están ocultos (Schaich et al., 2015). En ese sentido, los compuestos

fenólicos estarían ejerciendo un efecto sinérgico en la evaluación de la capacidad

antioxidante de los hidrolizados, lo cual es evidente en la diferencia hallada para los dos tipos

de muestra, en el que la capacidad antioxidante con los fenólicos llega a ser hasta tres veces

mayor.

Cuadro 10. Actividad antioxidante empleando la técnica del radical ABTS en el CPG y CPGr

Tiempo (min) mM TEAC/mg proteína

CPG† CPGr‡

0 0.151 ± 0.013 0.046 ± 0.052

15 0.211 ± 0.071 0.052 ± 0.009

30 0.077 ± 0.090 0.102 ± 0.052

60 0.203 ± 0.074 0.103 ± 0.020

90 0.375 ± 0.031 0.110 ± 0.023

120 0.322 ± 0.055 0.185 ± 0.057

± Desviación estándar de tres determinaciones

†El rango de concentración de proteína fue de 6.424 – 10.447 mg/mL

‡El rango de concentración de proteína fue de 14.771 – 24.729 mg/mL

La relación que existe entre el grado de hidrólisis y la capacidad antioxidante se muestra en

las Figuras 18 y 19 para cada muestra (CPG y CPGr, respectivamente). Comparando ambas

gráficas se puede notar que existe un aumento general en la capacidad antioxidante a partir

del minuto 30, o bien, después de la adición de la pancreatina al sistema, con lo que se

56

confirma que hay posibilidad de que estos péptidos sean generados durante la digestión en

un organismo. Por otro lado, se debe tener en cuenta que una hidrólisis extensiva de las

proteínas puede llevar a la liberación de aminoácidos, que pueden afectar la capacidad

antioxidante de los hidrolizados, incluso disminuirla. Con todo lo anterior, es importante

mencionar que los hidrolizados con actividad antioxidante derivados de un concentrado

proteico del garbanzo son una fuente de péptidos bioactivos.

Figura 20. Capacidad antioxidante para cada hidrolizado del CPG

Figura 21. Capacidad antioxidante para cada hidrolizado del CPGr

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0

5

10

15

20

25

30

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

mm

ol T

EAC

/mg

pro

teín

a

%In

hib

ició

n (D

PP

H)

%Grado de hidrólisis% Inhibición (DPPH) mM TEAC/mg proteína

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

10

15

20

25

30

35

0 10 20 30 40 50 60 70 80

mM

TEA

C/

mg

pro

teín

a

% In

hib

ició

n (D

PP

H)

% Grado de hidrólisis

% Inhibición (DPPH) mM TEAC/mg proteína

57

CONCLUSIONES

La semilla de garbanzo utilizada contenía 13.32% de proteínas, 51.32% de

carbohidratos, 19.62% de fibra, 11.39% de lípidos y 4.35% de cenizas.

Con el método de precipitación isoelectria a pH de solubilización de 4.3 y de

precipitación de 9.0 se logró obtener un concentrado de proteína con 87.27%, con un

rendimiento de 11.61%

Por medio de la extracción acetona-agua se logró reducir la concentración de

compuestos fenólicos en un 77.7%.

Se logró un mayor grado de hidrolisis utilizando el sistema secuencial en todos los

tiempos probados para el CPGr, el mayor GH fue de 68.3%, mientras que para el

CPG fue de 46%, a los 120 min. Sin embargo, en ambos casos la mayor

concentración de proteína soluble fue a los 15 min, sin mostrar diferencias

significativas en los demás tiempos, de manera similar fue mayor la concentración en

los CPGr (40%). Con la reducción de compuestos fenólicos se evidencian mayor

número de bandas en la electroforesis.

Por el método de DPPH la reducción de compuestos fenólicos favoreció el tiempo de

reacción ya que a los 60 min de logra obtener la mayor actividad, lo que podría reducir

los costos de operación, mientras que en hidrolizado proveniente del CPG la mayor

actividad se observó a los 90 min.

Con el método de ABTS se observó que la presencia de los compuestos fenólicos

favorece la actividad antioxidante, ya que cuando se redujo la concentración de estos

compuestos la actividad se ve afectada es 57% menor en el hidrolizado de CPG.

Dependiendo de la naturaleza de las especies oxidantes la presencia de compuestos

fenólicos incrementa la actividad antioxidante, sin embargo, reduce el grado de

hidrolisis al estar ligado a las proteinas, y por lo tanto podría incrementar los tiempos

de reacción.

Los hidrolizados proteícos de garbanzo son una buena alternativa en la elaboración

de alimentos funcionales. El impacto funcional es mejor si estas proteínas van

acompañadas de compuestos fenólicos

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