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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN
DE LA CAPACIDAD DE CORROSIÓN
DE UNA BACTERIA ESPORULADA
AISLADA DE UN GASODUCTO
T E S I S PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS Q U I M I C O B I O L O G I C A S P R E S E N T A: OSWALDO ARTURO RAMOS MONROY
DIRECTORES DE TESIS:
Dra. NORA RUIZ ORDAZ
Dra. MÓNICA JAZMÍN HERNÁNDEZ GAYOSSO
2008
IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN
DE LA CAPACIDAD DE CORROSIÓN
DE UNA BACTERIA ESPORULADA
AISLADA DE UN GASODUCTO
El presente trabajo fue realizado en los siguientes laboratorios:
Laboratorio de Bioingeniería del Departamento de Ingeniería Bioquímica de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.
Laboratorio de Microbiología y Electroquímica del Área de Corrosión del Instituto Mexicano del Petróleo.
CONTENIDO
Índice General
i
Índice de Tablas
v
Índice de Figuras
vi
Resumen
xi
Abstract
xii
Capítulo 1 Introducción
1
Capítulo 2 Antecedentes
16
Capítulo 3 Justificación
20
Capítulo 4 Objetivos
22
Capítulo 5 Metodología
24
Capítulo 6 Material y Métodos
26
Capítulo 7 Resultados y Discusión
75
Capítulo 8 Conclusiones
146
Capítulo 9 Bibliografía
148
Capítulo 10 Anexo Pruebas Electroquímicas
160
i
Índice General
1. Introducción
1.1. Generalidades 1.2. Corrosión 1.3. Tipos de corrosión 1.4. Corrosión inducida por microorganismos o biocorrosión 1.5. Biocorrosión de manera activa 1.5.1. Bacterias reductoras de sulfato 1.5.2. Bacterias productoras de ácido 1.5.3. Bacterias depositadoras de metales 1.5.4. Bacterias formadoras de babaza 1.5.5. Otras bacterias 1.6. Biocorrosión de manera pasiva 1.7. Identificación 1.8. Corrosión en la industria petrolera 1.9. Principales microorganismos en la industria petrolera 1.10. Indicios de la biocorrosión 1.11. Control del crecimiento bacteriano 1.12. Métodos para evaluar velocidades de corrosión 1.13. Métodos gravimétricos 1.14. Métodos electroquímicos
2 2 2 2 3 4 5 7 7 7 8 8 9 10 10 11 12 13 14 14
2. Antecedentes
17
3. Justificación
21
4. Objetivos
4.1. Objetivo general 4.2. Objetivos específicos
23 23 23
5. Metodología
25
ii
6. Material y Métodos
6.1. Recolección de la muestra 6.2. Microorganismos 6.3. Medios de cultivo
6.3.1. Medio de conservación de cepas 6.3.2. Medios de cultivo empleados en la selección del medio para el estudio de biocorrosión 6.3.3. Preparación de la celda electroquímica para la selección del medio de cultivo
6.4. Cupones de acero 6.4.1. Acondicionamiento de los cupones de acero al carbón API XL 52
6.5. Determinación de crecimiento por el número más probable (NMP) 6.6. Cuantificación de sulfuros 6.7. Cuantificación de sulfatos 6.8. Cuantificación de fierro total 6.9. Determinación de acidez 6.10. Determinación del pH 6.11. Identificación de los microorganismos
6.11.1. Pruebas bioquímicas de identificación tradicionales 6.11.2. Aislamiento de DNA 6.11.3. Amplificación del DNA por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 6.11.4. Electroforesis en gel con gradiente de temperatura 6.11.5. Electroforesis en gel de agarosa 6.11.6. Purificación del DNA amplificado 6.11.7. Secuenciación de un fragmento del gen 16S rDNA 6.11.8. Análisis de restricción del 16S rDNA amplificado (ARDRA) 6.11.9. Análisis del DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) 6.11.10. Extracción de plásmidos
6.12. Medición de la velocidad de corrosión 6.12.1. Técnica gravimétrica 6.12.2. Resistencia a la polarización (Rp) 6.12.3. Espectroscopía de Impedancia Electroquímica (EIE)
6.13. Análisis de las superficies metálicas 6.14. Determinación del crecimiento de las bacterias planctónicas y sésiles
6.14.1. Bacterias planctónicas 6.14.2. Bacterias sésiles
6.15. Determinación de la concentración celular 6.15.1. Por peso seco 6.15.2. Por turbiedad
6.16. Determinación de ácidos orgánicos por cromatografía de gases (GC) 6.17. Cupón de referencia adicionado de ácidos orgánicos
27 27 29 29 29 29 31 32 32 33 35 36 37 38 39 40 40 42 44 47 51 52 52 53 55 56 59 60 62 63 64 67 68 68 69 69 69 70 73
iii
7. Resultados y Discusión
7.1. Identificación de los microorganismos aislados de un gasoducto 7.1.2. Observación microscópica de las cepas G1-2006 y G1-2007 7.1.3. Identificación de las cepas mediante ensayos bioquímicos 7.1.4. Identificación de las cepas empleando técnicas moleculares 7.1.4.1. Aislamiento de DNA 7.1.4.2. Amplificación de un fragmento del 16S rDNA y TGGE 7.1.4.3. Análisis de restricción del 16S rDNA amplificado (ARDRA) 7.1.4.4. Análisis del DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) 7.1.4.5. Secuenciación del gen 16S rDNA 7.1.4.6. Perfil de plásmidos
7.2. Cinética de crecimiento, consumo de sulfatos, producción de H2S y de fierro total
7.2.1. Selección del medio de cultivo para los estudios de corrosión 7.2.2. Consumo de sulfatos 7.2.3. Producción de sulfuros 7.2.4. Formación de fierro total en el medio de cultivo
7.3. Producción de ácidos orgánicos 7.4. Determinación del crecimiento de las bacterias planctónicas y sésiles 7.5. Evaluación gravimétrica de la biocorrosión y de la corrosión abiótica con adición de ácidos orgánicos 7.6. Observaciones al microscopio electrónico de barrido de los cupones sometidos a corrosión 7.7. Determinación de la velocidad de corrosión inducida por C. celerecrescens
7.7.1. Técnica gravimétrica 7.8. Determinación de la velocidad de corrosión por técnicas electroquímicas, Rp y EIE
7.8.1. Resistencia a la polarización (Rp) 7.8.2. Espectroscopía de Impedancia Electroquímica (EIE) 7.8.2.1. Prueba de EIE para el sistema de referencia 7.8.2.2. Prueba de EIE para el sistema con C. celerecrescens (problema)
7.9. Microscopía electrónica de barrido ambiental (MEBA)
76 76 76 77 79 79 80 82 84 85 87 89 89 92 93 93 94 97 100 101 104 104 105 105 108 108 123 140
8. Conclusiones
145
9. Bibliografía
147
iv
10. Anexo 10. Pruebas Electroquímicas 10.1. Medición de potencial-tiempo 10.2. Resistencia a la polarización (Rp) 10.2.1. Ecuación de Butler-Volmer 10.2.2. La ecuación de Tafel 10.2.3. Ecuación de Stern y Geary 10.3. Espectroscopía de Impedancia Electroquímica (EIE)
159 159 159 159 160 161 162 165
v
Índice de Tablas
Tabla 1. Composición del medio de cultivo API RP 38
29
Tabla 2. Composición del medio Bold basal modificado
30
Tabla 3. Composición del medio Postgate C
30
Tabla 4. Iniciadores utilizados para la evaluación de la riqueza de especies
46
Tabla 5. Iniciadores utilizados para la identificación de las cepas aisladas
46
Tabla 6. Iniciadores empleados para el RAPD
46
Tabla 7. Pruebas bioquímicas para identificación de bacterias. Fermentación de carbohidratos
77
Tabla 8. Pruebas enzimáticas para identificación de bacterias
78
Tabla 9. Microorganismos identificados por secuenciación de un fragmento del 16S rDNA
86
Tabla 10. Velocidades de corrosión obtenidas por gravimetría para el cupón de acero al carbón API XL 52 expuesto a tres diferentes medios de cultivo (API RP 38, Bold basal modificado y Postgate C) en presencia de C. celerecrescens
104
Tabla 11. Valores de los elementos eléctricos que componen el circuito equivalente durante el ensayo electroquímico con el sistema de referencia
121
Tabla 12. Valores de los elementos eléctricos que componen el circuito equivalente durante el ensayo electroquímico en el sistema que incluye al microorganismo
136
vi
Índice de Figuras
Figura 1. Esquema de la corrosión inducida por microorganismos
3
Figura 2. Celda electroquímica de volumen nominal de 1000 mL empleada para la selección del medio de cultivo
31
Figura 3. Cilindros de acero al carbón API XL 52 referidos como electrodos de trabajo o cupones corrosimétricos
32
Figura 4. Bosquejo de las diluciones realizadas para la estimación del número más probable (NMP)
34
Figura 5. Programa utilizado para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
45
Figura 6. Equipo para llevar a cabo una electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TGGE)
49
Figura 7. Esquema de la celda utilizada en las técnicas electroquímicas
59
Figura 8. Dibujo emblemático de la elaboración de los ampoviales
67
Figura 9. Sistema de anaerobiosis para incubar los cupones de referencia y los cupones de referencia adicionados de ácido acético y ácido butírico
74
Figura 10. Morfología microscópica de las bacterias aisladas (A) de la cepa G1-2006 y (B) de la cepa G1-2007
76
Figura 11. Fotografía del electroferograma en gel de agarosa al 1% del DNA extraído de las cepas
79
Figura 12. Electroferograma en agarosa de los amplicones de 470 pb del 16S rDNA de los cultivos G1-2006 y G1-2007
80
Figura 13. Resultados de la electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TGGE) de un fragmento del 16S rDNA de los cultivos
81
Figura 14. Patrón electroforético del análisis de restricción del 16S rDNA de las cepas G1-2006 y G1-2007
82
Figura 15. Patrón electroforético del RAPD
84
vii
Figura 16. Electroferograma en gel de agarosa de los amplificados del 16S rDNA de las cepas
85
Figura 17. Perfil electroforético de la cuantificación de plásmidos mediante la prueba de lisis alcalina de las cepas G1-2006 y G1-2007
87
Figura 18. Electroferograma correspondiente a las cepas G1-2006 y G1-2007 con ayuda del kit para extracción de plásmidos
88
Figura 19. Cinética de crecimiento de C. celerecrescens en diferentes medios de cultivo
89
Figura 20. Consumo de SO42- y producción de S= y fierro total por C. celerecrescens
en medio de cultivo API RP 38
91
Figura 21. Consumo de SO42- y producción de S= y fierro total por C. celerecrescens
en medio de cultivo Bold basal modificado
91
Figura 22. Consumo de SO42- y producción de S= y fierro total por C. celerecrescens
en medio de cultivo Postgate C
92
Figura 23. Cromatogramas de productos metabólicos de C. celerecrescens junto con los perfiles de los estándares de ácido acético y ácido butírico. Las muestras se tomaron a diferentes tiempos (504, 672, 840 y 1008 h) de cultivo
94
Figura 24. Determinación cromatográfica de la concentración de ácido acético (Tr = 11.85) y ácido butírico (Tr = 16.2) de las muestras del cultivo de C. celerecrescens
95
Figura 25. Producción de acidez total y pH en función del tiempo del cultivo de C. celerecrescens en el medio Postgate C
96
Figura 26. Cinética de crecimiento de las bacterias planctónicas y sésiles en el cultivo de C. celerecrescens durante la evaluación de la corrosión inducida por microorganismos
97
Figura 27. Imagen obtenida por microscopía electrónica de barrido de la biopelícula formada por C. celerecrescens durante la evaluación de la corrosión por microorganismos Figura 28. Velocidades de corrosión de los cupones metálicos en el sistema biótico, en el sistema abiótico adicionado de ácidos orgánicos y en el sistema de referencia (testigo)
99 101
viii
Figura 29. Observación microscópica de la biopelícula (P) y de la biocorrosión (B), así como de los testigos (referencias) (R) de los cupones de acero al carbón API XL 52 para el sistema que explica la corrosión inducida por microorganismos
102
Figura 30. Observación microscópica de la corrosión de los cupones de acero al carbón API XL 52, tanto para el sistema abiótico adicionado de ácido acético y de ácido butírico, como para sus respectivos testigos (referencias) en función de las seis semanas de incubación
103
Figura 31. Resistencia de polarización para el sistema de referencia y para el de C. celerecrescens en función del tiempo
105
Figura 32. Evaluación en función del tiempo de la velocidad de corrosión del acero al carbón API XL 52 para ambos sistemas, tanto para el de referencia, como para el de C. celerecrescens, estimada por medida de la resistencia a la polarización
106
Figura 33. Diagramas de Nyquist para el sistema de referencia, expuesto el cupón de acero al carbón API XL 52 al medio de cultivo
109
Figura 34. Diagramas de Bode para el sistema de referencia, expuesto el metal de acero al carbón API XL 52 al medio de cultivo. A) modulo; B) ángulo de fase
110
Figura 35. Circuito equivalente empleado en el ajuste de los datos experimentales del sistema de referencia
111
Figura 36. Diagrama de Nyquist para el sistema de referencia ajustado al inicio de la prueba electroquímica con el programa ZView™
112
Figura 37. Diagramas de Bode para el sistema de referencia ajustados al inicio de la prueba electroquímica con el programa ZView™ Figura 38. Circuito equivalente y valores de cada elemento que forman el circuito al tiempo de inicio de la prueba, estimados mediante el programa ZView™
113 114
Figura 39. Diagrama de Nyquist para el sistema de referencia empleando el programa ZView™ a la mitad de la prueba electroquímica.
114
Figura 40. Diagramas de Bode para el sistema de referencia utilizando el programa ZView™ a la mitad de la técnica electroquímica
115
Figura 41. Circuito equivalente y valores de cada elemento que forman el circuito al tiempo intermedio de la técnica electroquímica
116
ix
Figura 42. Diagrama de Nyquist para el sistema de referencia al final de la determinación electroquímica correspondiente al ajuste con el programa ZView™
117
Figura 43. Diagramas de Bode para el sistema de referencia al final de la determinación electroquímica ajustados mediante el programa ZView™
118
Figura 44. Circuito equivalente y valores de cada elemento que forman el circuito al tiempo final de la determinación electroquímica
119
Figura 45. Velocidad de corrosión para el sistema de referencia calculada mediante EIE
122
Figura 46. Diagramas de Nyquist para el metal expuesto al microorganismo y al medio de cultivo
124
Figura 47. Diagramas de Bode para el metal expuesto al microorganismo y al medio de cultivo
125
Figura 48. Circuito equivalente empleado en el ajuste de los datos experimentales del sistema con el microorganismo en su primera etapa
126
Figura 49. Circuito equivalente empleado en el ajuste de los datos experimentales del sistema con el microorganismo en su segunda etapa Figura 50. Diagrama de Nyquist para el sistema con el microorganismo ajustado con el programa Zview™ para la primera etapa de la prueba electroquímica
126 127
Figura 51. Diagramas de Bode para el sistema con el microorganismo ajustados por medio del programa ZView™ al inicio de la prueba electroquímica
128
Figura 52. Circuito equivalente y valores de cada elemento que forman el circuito en los primeros tiempos de la determinación generados por el programa ZView™
129
Figura 53. Diagrama de Nyquist para el sistema con el microorganismo empleando el programa Zview™ a la mitad de la prueba electroquímica
130
Figura 54. Diagramas de Bode para el sistema con el microorganismo con el programa ZView™ a la mitad de la prueba electroquímica
131
Figura 55. Circuito equivalente y valores de cada elemento que forman el circuito a la mitad de la técnica aplicando el programa ZView™
132
x
Figura 56. Diagrama de Nyquist para el sistema con el microorganismo correspondientes al ajusta de con el programa ZView™ al final de la prueba electroquímica
133
Figura 57. Diagramas de Bode para el sistema con el microorganismo usando el programa ZView™ al final de la prueba electroquímica
134
Figura 58. Circuito equivalente y valores de cada elemento que forman el circuito al final de la determinación valorados con el programa ZView™
134
Figura 59. Velocidad de corrosión para el sistema con C. celerecrescens expuesto al medio de cultivo Postgate C y a acero a l carbón API XL 52 determinada mediante EIE
138
Figura 60. Velocidad de corrosión para los sistemas de referencia y con el microorganismo, expuestos a acero al carbón API XL 52 y al medio de cultivo Postgate C
139
Figura 61. Observación microscópica del sistema de referencia (R), de la biopelícula (P) y de la corrosión (C) (una vez eliminada la biopelícula) de los cupones metálicos obtenidos al finalizar los ensayos electroquímicos
141
Figura 62. Microanálisis de la superficie metálica del cupón retirado de la celda electroquímica al término del ensayo espectroscópico del sistema de referencia
142
Figura 63. Microanálisis de la superficie metálica del cupón retirado de la celda electroquímica al término de la determinación espectroscópica para el sistema con C. celerecrescens
143
Figura 64. Relación lineal entre la densidad de corriente, ί, y el sobrepotencial η, que se obtiene cuando se polariza un sistema de corrosión (± 10 a ±20 mV) desde el Ecorr
164
Figura 65. Circuito equivalente para un proceso de corrosión simple 165
Figura 66. Diagrama de Nyquist para un metal en proceso de corrosión con sus componentes real e imaginario
166
Figura 67. Diagrama de Nyquist para un proceso gobernado por control de difusión
167
Figura 68. Circuito equivalente que modela la impedancia de Warburg
168
xi
Resumen
La corrosión del acero inducida por microorganismos es uno de los problemas que se
presentan en los ductos de la industria del petróleo. En el presente trabajo se aisló una
bacteria esporulada de un gasoducto y un año después nuevamente se aisló del mismo
sitio otra bacteria esporulada. Ambas bacterias se identificaron y se evaluó su influencia
en la corrosión de acero al carbón API XL 52.
La identificación de las bacterias se realizó utilizando técnicas bioquímicas y mediante la
amplificación (PCR) del 16S rDNA, su secuenciación y comparación con la base de datos
del NCBI. También se compararon las cepas entre sí empleando técnicas moleculares
como los patrones de restricción únicos del 16S rDNA (ARDRA) y el perfil de fragmentos
amplificados del DNA genómico empleando un iniciador inespecífico (RAPD). Los
resultados obtenidos mostraron que las dos cepas corresponden a Clostridium
celerecrescens con una homología del 99% con la secuencia reportada en el NCBI, y los
perfiles electroforéticos del ARDRA y RAPD de ambas cepas fueron idénticos; por lo que se
puede concluir que se trata de la misma cepa y que ésta fue persistente. En ninguna de
las cepas se observó la presencia de plásmidos. Cuando se midió la velocidad de corrosión
del metal, mediante la técnica gravimétrica, con ambas cepas se obtuvieron resultados
similares (5.5 mpy). La evaluación de la velocidad de corrosión empleando técnicas
electroquímicas se realizó únicamente con la última cepa aislada, siendo ésta próxima a 5
mpy que es semejante a la obtenida con la técnica gravimétrica. Estos valores de
velocidad de corrosión se consideran moderados de acuerdo con la NACE y,
efectivamente, son inferiores a los obtenidos con bacterias reductoras de sulfato como
Desulfovibrio vietnamensis o Desulfovibrio alaskensis que habitualmente son responsables
de la corrosión de ductos. Sin embargo, la importancia de C. celerecrescens radica en su
permanencia en el ducto y su contribución al proceso de corrosión. Dada la naturaleza de
la cepa se podría atribuir su participación en la corrosión, por lo menos en parte, a la
producción de ácidos orgánicos; por lo que también se evaluó la generación de algunos de
ellos durante el proceso de corrosión. Los resultados claramente mostraron la producción
de ácido acético y ácido butírico que alcanzaron una concentración de 18 ppm y 24 ppm
en el seno del líquido, concentración que debe ser mayor en el interior de la biopelícula
adherida a la pared del metal puesto que ahí se generan.
La microscopia electrónica de barrido sirvió como herramienta de apoyo para observar el
daño causado por las bacterias en la superficie e integridad del metal. En estas
observaciones se apreció que el tipo de corrosión fue puntual.
De acuerdo con todos los resultados obtenidos, se concluye que C. celerecrescens es un
agente agresor a las líneas de distribución de los hidrocarburos.
xii
Abstract
The microbial steel corrosion is one of the problems that occur in the oil-industry pipes. In
this research a sporulated bacteria was isolated from a gas pipe and a year later, another
sporulated bacteria was isolated from the same place. Both bacteria were identified and
the influence they had on the API XL 52 carbon- steel corrosion was evaluated.
The identification was carried out by biochemical techniques and by 16S rDNA
amplification, sequencing, and comparison with the NCBI database. The strains were also
compared between them using molecular techniques as the restriction patterns, unique
for 16S rDNA (ARDRA), and the amplified bits profile from the genomic DNA, by using an
unspecific primer (RAPD). The results obtained showed that both strains corresponded to
Clostridium celerecrescens with a 99% homology according to the sequence reported on
the NCBI database. Also, the electrophoresis profiles of the ARDRA and RAPD of both
strains were identical; so it can be concluded these bacteria belong to the same strain and
that this was persistent. No plasmids were found in any of the strains. When the steel
corrosion rate was gravimetrically measured, similar results were appreciated (5.5 mpy).
The steel corrosion evaluation was carried out employing electrochemical techniques only
for the last isolated strain, resulting on 5 mpy, close to the result obtained using
gravimetric techniques.
These values of steel-corrosion rate can be considered as moderated according to the
NACE, and are effectively lower than those resulting from the sulfate reducing bacteria,
such as Desulfovibrio vietnamensis or Desulfovibrio alaskensis which are usually
responsible of the pipes corrosion. However, C. celerecrescens is important because of its
permanence on the internal pipe surface, and its contribution to the corrosion process.
Because of the strain nature, its contribution to the corrosion process could be due to the
organic acid production; thus, the production of some of them was evaluated during the
corrosion process. The results clearly showed the production of acetic and butyric acid
which reached 18 and 24 mg per liter concentration in the liquid sinus, which must best be
lower than in the biological film or biofilm added to the pipe surface.
The scanning electron microscopy analysis supported that the bacteria caused damage on
the surface and the steel integrity. In these images it was appreciated that the corrosion
process was localized.
Taken together the results obtained, it can be concluded that C. celerecrescens is an
aggressive agent which cause corrosion on the pipe lines that distribute hydrocarbons.
1
CAPÍTULO 1
INTRODUCCIÓN
2
1. Introducción
1.1. Generalidades
No cabe duda de que la industria petrolera mexicana es un motor de crecimiento
económico, por lo tanto, clave del progreso social; sin embargo, uno de los principales
problemas que enfrenta en la actualidad es la corrosión en los ductos, por tal motivo
PEMEX hace énfasis en programas que maximicen el rendimiento, la seguridad y
confiabilidad de la red de ductos. Dichos programas, se dirigen a solucionar los principales
problemas por los que los ductos sufren fallas, ya que el 60% de las irregularidades
presentadas en las líneas de transporte se deben a la corrosión del acero (PEMEX, 2006).
De manera significativa la corrosión, tanto química, como microbiológica presentan
severas consecuencias reflejadas en los siguientes sectores:
económico
salud
seguridad
tecnológico
cultural
1.2. Corrosión
En su principio más básico, la corrosión no es sino el proceso inverso de la metalurgia, por
el cual las estructuras metálicas enterradas o sumergidas tienden a retornar a su estado
mineral; es decir, se trata del deterioro de metales y aleaciones por acción química del
medio ambiente (agua o suelo). La característica fundamental de este fenómeno, es que
sólo ocurre en presencia de un electrólito, ocasionando regiones plenamente
identificadas, llamadas estas anódicas y catódicas: una reacción de oxidación es una
reacción anódica, en la cual los electrones son liberados dirigiéndose a otras regiones
catódicas. En la región anódica se producirá la disolución del metal (corrosión) y,
consecuentemente en la región catódica el metal permanecerá intacto (Shreir, 1994).
1.3. Tipos de corrosión
Se pueden distinguir dos tipos básicos de corrosión: la corrosión uniforme y la corrosión
localizada. La corrosión uniforme afecta más o menos por igual a todos los puntos de la
pieza y la corrosión localizada supone pérdidas pequeñas de material, pero sus
consecuencias son peores. La corrosión uniforme permite un mayor seguimiento y
3
previsión, ya que la corrosión localizada es menos previsible y su evolución es mucho
menos regular (Lee y col., 2006). Sin embargo, se ha dado una clasificación más detallada,
la cual está en función del tipo de daño causado a la estructura metálica, y es la siguiente:
uniforme, galvánica, por picadura, por fisuras, erosión intergranular, exfoliación, bajo
tensión, por fatiga, por rozamiento, por hidrógeno o por pérdida selectiva (NACE, 2004).
Cabe mencionar que se ha estimado que, para los países industrializados, el 20% de los
casos de corrosión son atribuidos a los microorganismos (Iverson, 1987), por tal motivo es
importante evaluar su efecto en el proceso de corrosión.
1.4. Corrosión inducida por microorganismos o biocorrosión
Se entiende por biocorrosión, al deterioro acelerado de un metal debido a la actividad
microbiana, en la cual se confluyen tres importantes componentes para llevar a cabo el
proceso: metal, productos de corrosión química y biopelícula (Figura 1). En esta última se
considera que en la matriz polimérica (biopelícula) se encuentran embebidos los
microorganismos y los productos secretados por ellos (Beech y Sonner, 2004; Miranda y
col., 2006).
Figura 1. Esquema de la corrosión inducida por microorganismos.
4
En el proceso de la corrosión inducida por microorganismos (CIM) se han presenciado dos
tipos de comportamiento. Se ha establecido que los microorganismos pueden actuar en
forma benéfica al inhibir las velocidades de corrosión y proteger de esta forma las
instalaciones (Potekhina y col., 1999; Dubiel y col., 2002) o bien acelerar el proceso de
corrosión y causar daños en la integridad de los sistemas (Sanders y Hamilton, 1984;
Feugeas y col., 1997).
Con base en lo reportado, la CIM se divide en (SIU, 2004):
Ataque biológicamente activo.
Ataque biológicamente pasivo.
En el ataque biológico pasivo el desgaste del metal es una consecuencia indirecta de la
formación de biomasa y productos, lo cual origina una biocorrosión lenta en el metal y
abarca grandes áreas con una mayor cantidad de pérdida de metal. Mientras que en el
ataque biológico activo se presenta una biocorrosión intensa y localizada con una mayor
incidencia de irregularidades en la superficie metálica, debida a los productos generados
por los microorganismos (Boopathy y Daniels., 1991; Marchal y col., 2001).
1.5. Biocorrosión de manera activa
En la corrosión biológica activa participan, tanto microorganismos aerobios, como
anaerobios, que al crecer cambian las características químicas y la dinámica de la
biopelícula, por lo que ésta se modifica a través del tiempo. Entre los factores que afectan
la agresividad de las bacterias corrosivas están: temperatura, concentraciones de carbono
orgánico total y de nitrógeno, el flujo, las concentraciones de oxígeno, el tratamiento
químico, pH y otras (Boopathy y Daniels, 1991; Marchal y col., 2001; Else y col., 2003).
Existen cinco clases principales de bacterias implicadas en la corrosión.
Bacterias reductoras de sulfatos.
Bacterias productoras de ácido.
Bacterias depositadoras de metales
Bacterias formadoras de babaza.
Otras bacterias.
5
1.5.1. Bacterias reductoras de sulfato
Las bacterias reductoras de sulfato presentan una amplia diversidad de características
morfológicas y bioquímicas: crecen anaeróbicamente y reducen sulfatos, SO42- , a sulfuros,
S2- (Boopathy y Daniels, 1991; Marchal y col., 2001).
Las bacterias reductoras de sulfato son las más representativas en cuanto se refiere a la
corrosión metálica. Tres géneros anaerobios causan la mayor parte de la corrosión,
Desulfovibrio, Desulfuromonas y Desulfotomaculum, las bacterias reductoras de sulfato
sobreviven en hábitats muy extremos. Forzosamente deben estar presentes los sulfatos o
azufre para su crecimiento, toleran temperaturas altas hasta 80 °C y un pH entre 8 y 9
(Boopathy y Daniels, 1991; Marchal y col., 2001; Else y col., 2003).
El mecanismo de la corrosión incluye la despolarización catódica, en donde se remueve al
hidrógeno de los sitios catódicos mediante enzimas capaces de utilizar el hidrógeno
(Boopathy y Daniels, 1991; Wagner y col., 1998; Tributsch y Rojas-Chapana, 2000; Marchal
y col., 2001).
H+
Sulfatos inorgánicos Sulfuros
reducen
El ataque ocurre con mayor facilidad en las superficies metálicas. Las principales
reacciones en la corrosión de acero son:
Ánodo
4Fe0 4Fe ++ + 8 e-
Disociación del agua
8H2O 8H+ + 8OH-
Cátodo
8H+ + 8e- 8H
En el cátodo el H, se adsorbe en la superficie del metal para ser transformado por las
bacterias.
6
Conversión de sulfato por las bacterias
8H (adsorbido) + SO42- S2- + 4H2O
La reacción es llevada a cabo por las bacterias como una función directa.
Productos finales de corrosión
4Fe2+ + S2- + 6OH- FeS + 3Fe(OH)2
Reacción total general
4Fe2+ + SO42- + 4H2O 3Fe(OH)2 + FeS + 2OH-
El grupo de los microorganismos nocivos, llamado bacterias del hierro y el azufre, no es
homogéneo desde los puntos de vista morfológico y fisiológico, pero puede caracterizarse
por su capacidad para transformar o depositar cantidades significativas de hierro y azufre,
en general en forma de cienos. Sin embargo, estas bacterias no son las únicas productoras
de cienos bacterianos. Los microorganismos de este grupo se pueden clasificar en
filamentosos o unicelulares, autótrofos y heterótrofos, aerobios o anaerobios. En función
de la clasificación bacteriana convencional, se incluyen en diversos órdenes, familias y
géneros. Las bacterias del hierro y el azufre son estudiadas por su eventual importancia en
el tratamiento de aguas y sistemas de distribución y especialmente en aguas para uso
industrial en calderas y torres de enfriamiento donde ocasionan contaminación del agua y
ampollamiento; en el agua causan olor, sabor, color, espuma desagradables e
incrementan la turbiedad, el suministro de nutrimentos puede ser total o parcialmente
inorgánico, un claro ejemplo de este microorganismo es Gallionella que obtiene su
energía de la oxidación del hierro ferroso, otras utilizan pequeñas cantidades de sulfuro
de hidrógeno. Thiobacillus ferroxidans contribuye al problema del drenaje de minas
ácidas, se identifica por pruebas de transformación de hiero ferroso a férrico u oxidación
de sulfuros a pH bajo. La temperatura, luz, pH y suministro de oxígeno son críticos para el
crecimiento de estos microorganismos (Tributsch y Rojas-Chapana, 2000; Else y col., 2003;
Lee y col., 2006).
Las bacterias ferruginosas son capaces de utilizar el hierro reducido presente en habitats
acuosos y depositarlo en forma de oxido férrico hidratado o en sus secreciones
mucilaginosas, de un modo similar a las bacterias que utilizan manganeso. El hierro
ferroso lo obtienen de la tubería, en la obtención de energía la forma férrica es
precipitada como hidróxido férrico [Fe (OH)3] (Tributsch y Rojas-Chapana, 2000; Lee y col.,
2006).
7
Algunas bacterias que no oxidan el hierro ferroso pueden indirectamente disolverlo o
depositarlo. En su crecimiento ellas liberan hierro por utilización de compuestos
orgánicos a los cuales el hierro está unido o porque las condiciones ambientales permiten
la solución o depósito del hierro, bajo estas condiciones se produce menor hierro férrico,
pero puede generar obstrucción en el sistema (SIU, 2004; Lee y col., 2006).
1.5.2. Bacterias productoras de ácido
Las bacterias productoras de ácido disminuyen el pH, aceleran el ataque corrosivo,
algunas especies de Thiobacillus y Clostridium son las más relacionadas con la corrosión
del acero. T. thioxidans, aerobio, oxida varios compuestos que contienen azufre para
formar ácido sulfúrico que contribuye a la destrucción del concreto unido al metal y a la
corrosión ácida de los metales (Tributsch y Rojas-Chapana, 2000). Se encuentra en la
parte superior de los tubérculos (nódulos o ampollamientos por acción microbiana), se
asocia simbióticamente (mutualismo) con las bacterias reductoras de sulfato, oxida
sulfuros a sulfatos mientras que las bacterias reductoras de sulfato convierten sulfatos a
sulfuros. Las bacterias del género Clostridium, son anaerobias, producen ácidos orgánicos
de cadena corta que pueden ser bastante agresivos hacia el acero, se encuentran cerca de
las superficies de corrosión y en el interior de los tubérculos (Tributsch y Rojas-Chapana,
2000).
1.5.3. Bacterias depositadoras de metales
Las bacterias depositadoras de metales, oxidan el hierro ferroso (Fe2+) a hierro férrico
(Fe3+) dando como resultado hidróxido férrico. Algunas oxidan manganeso y otros
metales. Bacterias del género Gallionella se asocian al hidróxido de hierro en las ampulas
(90% del peso seco puede ser Fe(OH)3), dando un aspecto filamentoso (Tributsch y Rojas-
Chapana, 2000; Lee y col., 2006). Sin embargo, no existe suficiente evidencia que indique
que la picadura en acero inoxidable es causada por este microorganismo (SIU, 2004; Lee y
col., 2006).
1.5.4. Bacterias formadoras de babaza
Con la excepción del género Pseudomonas, las bacterias formadoras de babaza son en su
mayoría aerobias. Las babazas son mezclas de secreciones denominados polímeros
extracelulares donde el 99% es agua. Las capas de babaza contribuyen a la corrosión
tanto activa como pasiva, consumen oxígeno y estimulan la formación de celdas de
oxígeno diferenciales. Por ser aerobias están presentes sobre los productos de corrosión;
muchas veces debajo de la babaza se encuentran anaerobias y frecuentemente bacterias
reductoras de sulfato y productoras de ácido (Hedrick y col., 1964; SIU, 2004).
8
1.5.5. Otras bacterias
Dentro del grupo de otras bacterias, se encuentran las nitrificantes, aerobias
principalmente, oxidan NH3 a nitratos NO3–, Nitrosomonas y Nitrobacter, disminuyen el
pH y [O2], presentes en plantas de amoníaco. Nitrobacter disminuye el pH oxidando
nitritos NO2– a NO3
– produciendo ácido nítrico alcanzando un pH entre 3-5, requiere altas
concentraciones de oxígeno y causa problemas únicamente en los sistemas oxigenados.
Algunas cianobacterias producen masas densas y fibrosas que se comportan como fuentes
pasivas de corrosión, además crean altas concentraciones de oxígeno disuelto debido a su
crecimiento (Gevertz y col., 2000; Else y col., 2003).
1.6. Biocorrosión de manera pasiva
La corrosión biológica pasiva causada por sustancias químicamente inertes, es la misma ya
sea que el microorganismo esté vivo o muerto; debido a que la corrosión se da por los
productos metabólicos y no por procesos metabólicos en sí; entre estos materiales se
encuentran las capas de babazas o polímeros extracelulares como hebras entremezcladas
con bacterias, agua, gases y materiales extraños; la biomasa tiende a formarse sobre las
superficies y adherirse a ellas. (Keresztes y col., 2001; Marchal y col., 2001).
Se ha propuesto que las bacterias reductoras de metales como las que convierten los
iones férricos a ferrosos, actúan como aceleradoras para la corrosión del acero, pero hay
escasa evidencia de esto. En circunstancias especiales, ciertas bacterias anaerobias que
son capaces de producir hidrógeno pueden contribuir a la fragilización de aleaciones
debido al hidrógeno. La descomposición puede generar amoníaco en concentraciones
locales lo bastante altas como para producir un agrietamiento debido a corrosión y
esfuerzos en los tubos de latón. Este fenómeno ocurre donde hay material biológico
depositado o adherido sobre las superficies, el ataque microbiológico suele ocurrir donde
la temperatura del agua está por debajo de los 82 °C. Los tubérculos sobre el acero al
carbono y los hierros vaciados a veces contienen bacterias reductoras de sulfato y
productoras de ácidos. Las bacterias anaerobias, corrosivas en potencia, están presentes
muchas veces debajo de capas de babazas y, en la ausencia de babazas o tubérculos, en
sistemas que contengan poco oxígeno.
Los sistemas sucios con aceites y grasas generalmente contienen grandes cantidades de
bacterias. Los organismos que se observan a simple vista (hongos) son un indicador
seguro de la presencia bacterial y directamente pueden causar un ataque al metal (SIU,
2004; Else y col., 2003; Javaherdashti y col., 2006; Lee y col., 2006).
9
En lo que se refiere a factores críticos, el material biológico o los organismos ofensivos
tienen que estar presentes en un sistema que sufra un ataque actual. Sin embargo, no
todos los sistemas que contengan tales materiales u organismos serán atacados en forma
perjudicial. Una presencia biológica (actual o pasada) es virtualmente una certeza de
corrosión en cualquier sistema, pero no todos los sistemas son atacados en forma
significativa. Para que en un diagnóstico la corrosión pueda atribuirse a causas biológicas,
tienen que darse todas las siguientes condiciones (SIU, 2004):
El material biológico tiene que estar presente al ocurrir el ataque.
La morfología de la corrosión debe ser consistente con el ataque biológico.
Los productos de la corrosión y los depósitos deben ser característicos de una
interacción biológica.
1.7. Identificación
La corrosión inducida por microorganismos se puede reconocer mediante el examen de
las morfologías del desgaste, la composición y distribución de los productos de corrosión,
así como de los depósitos, los análisis biológicos y las condiciones ambientales
compatibles. Debe hacerse hincapié en que el conjunto de factores para identificar la
corrosión deben ser compatibles con el diagnóstico de una corrosión por influencia
biológica. La sola presencia de bacterias corrosivas potenciales u otros organismos no es
prueba de que la corrosión se relacione con estos organismos. El diagnóstico no se basa
en una preponderancia de indicios; se basa en la compatibilidad completa de toda la
evidencia (SIU, 2004; Lee y col., 2006).
Tienen que estar presentes cuatro factores para un diagnóstico de corrosión con
influencia microbiológica (SIU, 2004; Lee y col., 2006).
La presencia de microorganismos o de sus productos.
Morfologías de corrosión microbiológicamente únicas.
Productos y depósitos de corrosión específicos.
Condiciones ambientales compatibles.
Cada uno de los factores mencionados es único para bacterias específicas.
Las bacterias reductoras de sulfato se encuentran en ambientes anaerobios, tal como
dentro de un tubérculo o debajo de una mancha de depósito. Es difícil percibir una
biopelícula delgada y homogénea en tales microambientes. Las acumulaciones de
productos de corrosión que contengan recuentos de bacterias reductoras de sulfatos de
104 o más unidades formadoras de colonias por gramo (UFC/g) suelen asociarse con
desgastes significativos.
10
Si bien las reductoras de sulfato probablemente no estén distribuidas de manera uniforme
por toda la masa de depósitos y productos de corrosión (especialmente en los sistemas
aireados), son comunes los recuentos similares en grandes cantidades de material
tomadas de superficies de acero corroídas. Los recuentos en fluidos son casi siempre
mucho más bajos, pero cualquier recuento positivo en fluidos suele indicar números
grandes de bacterias sésiles (células fijas) viables en alguna parte del sistema (Keresztes y
col., 2001).
Recientemente se han desarrollado pruebas que no requieren del cultivo de las bacterias
reductoras del sulfato. Estas pruebas se basan en la detección de ciertos compuestos
producidos por estas bacterias y, en algunos casos, tienen aplicación aun si los organismos
productores han muerto recientemente. Los estudios de laboratorio han mostrado una
concordancia adecuada entre tales pruebas y los análisis por cultivos vivos cuando están
presentes organismos viables (SIU, 2004).
Cuando los recuentos biológicos de bacterias reductoras de sulfato en los materiales
sólidos raspados de las superficies corroídas son del orden de 104 UFC/g, es posible un
ataque significativo; pero los recuentos mayores de 105 UFC/g, son comunes sólo en los
sistemas que se encuentran atacados severamente (SIU, 2004).
Los recuentos planctónicos (células libres) suelen ser poco confiables como indicadores de
una corrosión activa. Sin embargo, la presencia de cualquier bacteria reductora de sulfato
indica concentraciones mucho más altas de estos organismos sobre superficies en algún
lugar del sistema (SIU, 2004).
1.8. Corrosión en la industria petrolera.
Las bacterias habituales en instalaciones petroleras pueden causar graves problemas de
corrosión o taponamiento en líneas, tanques o en los mismos yacimientos. Se han
identificado diversas bacterias, las cuales contribuyen a la corrosión en diferentes formas:
algunos actúan como despolarizantes catódicos, mientras otros forman películas o
crecimientos que cubren una parte del metal, produciendo celdas de concentración de
oxígeno, mientras que las bacterias reductoras de sulfato pueden producir H2S, el cual es
corrosivo (Gevertz y col., 2000; Keresztes y col., 2001).
1.10. Principales microorganismos en la industria petrolera.
Las bacterias reductoras del sulfato, como Desulfovibrio, son las más importantes y
dañinas, en cuanto a corrosión se refiere. Crecen en medios anaeróbicos, pero pueden
sobrevivir en ambientes oxigenados, creciendo debajo de depósitos o películas donde el
oxígeno no pueda penetrar. Las bacterias reductoras de sulfato utilizan en su metabolismo
11
hidrógeno atómico para reducir el ión sulfato existente en el medio (agua) y producir H2S.
El hidrógeno lo obtienen del cátodo de los procesos de corrosión del hierro, causando por
lo tanto una despolarización del cátodo en las celdas de corrosión, que incrementa el
grado de corrosión. Además, el sulfuro de hidrógeno generado (H2S) en el proceso se
combina con el ión ferroso producido en el ánodo para formar sulfuro ferroso (FeS) de
color negro (Gevertz y col., 2000).
Las ferrobacterias, como Gallionella, pueden causar corrosión en sistemas que manejen
agua. Los compuestos ferrosos provenientes de procesos de corrosión se oxidan a
hidróxido férrico hidratado, removiendo el oxígeno del agua y causando condiciones
anaeróbicas debajo de depósitos. En un segundo mecanismo, las ferrobacterias en áreas
de baja concentración de oxígeno, convierten el ión ferroso a ión férrico, el cual se
precipita como hidróxido férrico cubriendo las superficies del metal y produciendo celdas
de concentración de oxígeno (Gevertz y col., 2000).
Las bacterias formadoras de película, como las Aerobacterias, proliferan sobre las
superficies y producen grandes masas que impiden la penetración del oxígeno a las
superficies metálicas, creando ambientes propicios para las bacterias reductoras de
sulfato y celdas de concentración de oxígeno (Gevertz y col., 2000).
La biopelícula se forma en las tuberías del sistema de distribución cuando las células se
unen a la superficie de ésta y se multiplican para formar una película; al observarse en
microscopía electrónica de barrido (SEM) se aprecian comunidades complejas de
microorganismos sobre la superficie metálica (Gevertz y col., 2000; Marchal y col., 2001).
1.10. Indicios de la biocorrosión
La sola presencia de bacterias en el medio no necesariamente significa un problema grave
de corrosión, así como un bajo recuento de bacterias tampoco significa necesariamente
que no exista problema, puesto que las bacterias pueden estar debajo de depósitos y sólo
aparecen cuando la corriente de fluido o un fenómeno mecánico las descubre. Por lo
tanto, para detectar problemas de corrosión por bacterias se deben tener en cuenta
diferentes observaciones. De allí la importancia del cuidado en la toma de las muestras
para que realmente sean representativas.
La presencia de sulfuro de hidrógeno puede indicar la existencia de reductoras de sulfato,
también la presencia de partículas negras de FeS pueden indicar que el H2S se está
produciendo en el sistema (Gevertz y col., 2000; Marchal y col., 2001).
12
El examen de productos de corrosión encontrados en equipos, tuberías, tanques, etc. es
otra de las informaciones básicas para detectar problemas asociados a actividad
microbiana (Hedrick y col., 1964). La corrosión en forma de picadura que se encuentra
debajo de tubérculos y que da lugar a un producto de corrosión negro, en lugar de uno de
color rojizo, puede indicar la presencia de bacterias reductoras de sulfato. La forma de
diferenciar el sulfuro de hierro de la magnetita Fe3O4 (ambos de color negro) se basa en
que el FeS no es atraído por un imán, mientras que el FeO si. Otra forma de diferenciarlos
es poniendo unas gotas de HCl en el depósito negro. Sí se desprende un olor a sulfuro, el
depósito es de sulfuro de hierro lo cual es una fuerte evidencia de la existencia de
reductoras de sulfato (SIU, 2004; Javaherdashti y col., 2006).
Las posibles causas de la corrosión inducida por microorganismos son (Videla, 2002; SIU,
2004):
Ataque químico de metales, concreto y otros materiales, debido a los
subproductos de la actividad microbiana.
Ataque microbiológico de materiales orgánicos, algunas materias inorgánicas
naturales o inhibidores.
Despasivación de superficies metálicas e inducción de celdas de corrosión.
Ataque metálico por un proceso en el cual los microorganismos y el metal
cooperan entre sí para sostener la reacción de corrosión.
El ataque puede ser por combinación de bacterias.
1.11. Control del crecimiento bacteriano
Existe una amplia variedad de productos químicos usados para controlar el crecimiento de
bacterias. Se pueden clasificar en bactericidas o bacteriostáticos de acuerdo con sí
eliminan o retardan el crecimiento de las bacterias. Pueden ser inorgánicos, como el
cloro, los cromatos y compuestos de mercurio y plata; u orgánicos como aminas,
clorofenoles, derivados cuaternarios del amoníaco, etc. Algunos bactericidas tienen una
función dual en el sistema, por ejemplo, las aminas cuaternarias funcionan tanto como
biocidas como inhibidores de formación de películas. La adición insuficiente de estos
agentes químicos para cubrir adecuadamente las áreas puede dejarlas desprotegidas
contra la corrosión. Los bactericidas no pueden matar las bacterias a menos que entren en
contacto con ellas, esto significa que las bacterias que crezcan debajo de depósitos no
serán destruidas a menos que estos sean removidos. Por lo tanto, la operación de limpieza
es fundamental antes de iniciar la aplicación de un biocida. Esto incluye limpieza de líneas,
retrolavado de pozos y equipos, remoción de depósitos del fondo de tanques, etc.
(Gevertz y col., 2000; Videla, 2002; Hernández y col., 2005).
13
Como medida de prevención, se aconseja realizar lo siguiente (Videla, 2002; SIU, 2004).
Analizar posibilidades de contaminación.
Uso controlado de biocidas.
Asegurar un ambiente no agresivo.
Seleccionar materiales de resistencia adecuada.
Seleccionar materiales de recubrimiento.
Usar protección catódica.
Programar sistemas de limpieza frecuente.
A modo de conclusión, es importante señalar que si no existen las condiciones para que
haya corrosión en un determinado medio, las bacterias pueden crearlas, a condición (para
las heterótrofas) de que exista en el medio materia orgánica. Cuanto mayor sea la
cantidad de materia orgánica contenida en un electrolito, mayor será el crecimiento
microbiano y mayor y más intensa la actividad bioquímica y, por lo tanto, la corrosión
(Genescá, 1995; Keresztes y col., 2001; Marchal y col., 2001).
Todo ello justifica plenamente los esfuerzos que realizan numerosos investigadores en
todo el mundo para estudiar y conocer el mecanismo de desarrollo de estos organismos,
con el fin de tratar de combatirlos y reducir, en lo posible, las grandes pérdidas que
ocasionan (Genescá, 1995).
1.12. Métodos para evaluar velocidades de corrosión
Con el paso del tiempo se han desarrollado herramientas experimentales para determinar
la velocidad de corrosión de materiales metálicos expuestos a algún medio corrosivo, las
cuales aportan información mecanística del proceso y se agrupan de la forma siguiente.
Métodos gravimétricos.
Métodos basados en técnicas electroquímicas.
El primer tipo, se caracteriza por cuantificar la pérdida de peso y el segundo por aplicar un
sobrepotencial al sistema. Cabe mencionar que los métodos electroquímicos han
desplazado a los gravimétricos por la reproducibilidad en sus resultados; sin embargo, los
métodos tradicionales (gravimétricos) son bien aceptados en estos días (Vong, 1991).
14
1.13. Métodos gravimétricos
Históricamente, la primera forma de evaluar cuantitativamente la corrosión que el
material sufría fue la determinación de pérdida de peso de un material metálico en
contacto con un ambiente agresivo, líquido y/o vapor. Posteriormente, se relacionó la
pérdida de peso con el tiempo de exposición, la densidad del material metálico y el área
expuesta al ambiente agresivo; con lo que se obtiene una expresión que permite
determinar la velocidad de corrosión (Ávila y Genescá, 2003).
En las determinaciones gravimétricas, la velocidad de corrosión se expresa generalmente
en unidades de penetración de ataque conocidas como milésimas de pulgada por año
(mpy) donde se supone que la corrosión que sufre el material es uniforme, es decir, la
superficie geométrica del material se afecta de igual forma en toda su extensión. Esto
puede representar un gran error cuando el tipo de corrosión que ocurre es localizado, por
ejemplo, la picadura; ya que la velocidad de corrosión determinada será más baja que la
que ocurre realmente en la picadura (NACE, 2005; PEMEX, 2000).
Las principales ventajas que ofrece la prueba gravimétrica son: el bajo costo y la
simplicidad en la evaluación. Además, debido a la ausencia de perturbaciones
superficiales, este método simula mejor las condiciones reales que los métodos
electroquímicos y de análisis de superficie. Esta técnica es comúnmente usada como
primer paso en el estudio de la corrosión; sin embargo, proporciona información limitada
con respecto a los procesos y mecanismos de la corrosión. La determinación del tipo de
corrosión se realiza al final de la prueba de forma visual (González, 1989).
1.14. Métodos electroquímicos
En contraste con el método de pérdida de peso, los métodos electroquímicos son más
rápidos y, por lo tanto, ampliamente usados para medir la velocidad de corrosión en
menor tiempo (ASTM G 01-03). Estos métodos se basan en la electroquímica de la
corrosión y en la medición de potencial y corriente para evaluar el daño por corrosión
(Bardal, 2004). El potencial electroquímico está fundamentalmente relacionado a la
termodinámica de las reacciones de corrosión, mientras que la corriente está relacionada
a la cinética de la reacción (velocidad de corrosión) (González, 1989).
Frecuentemente para conocer los parámetros que controlan las reacciones
electroquímicas, se perturba al sistema y, con base en estas perturbaciones, las técnicas
electroquímicas se clasifican en tres grupos: mediciones no perturbadas, mediciones
perturbadas linealmente y mediciones perturbadas no linealmente (Zavala, 1997 y 2001).
15
Las mediciones no perturbadas, son aquellas que no requieren una perturbación externa
del sistema, por ejemplo, mediciones de potencial-tiempo, corriente-tiempo y ruido
electroquímico (Zavala, 1997 y 2001).
Las mediciones perturbadas linealmente, están diseñadas y analizadas bajo el supuesto de
que el sistema electroquímico puede ser tratado como una combinación de elementos de
circuitos lineales (resistores, capacitores, etc.). Esto es casi siempre una aproximación a
la realidad, pero con restricción a pequeños cambios de potencial (10 mV) y es posible
obtener una aproximación a un comportamiento lineal, dos claros ejemplos son las
técnicas de resistencia a la polarización (Rp) y espectroscopía de impedancia
electroquímica (EIE) (Zavala, 1997 y 2001).
Las mediciones perturbadas no linealmente, ejercen alteraciones de gran amplitud y, por
lo tanto, no responden de manera lineal y, como ejemplo, se tienen a las mediciones de
curvas de polarización y técnicas de análisis armónico (Zavala, 1997 y 2001).
Cuando se estudia la biocorrosión se recomienda utilizar mediciones no perturbadas y/o
mediciones perturbadas linealmente, ya que de esta forma no se altera la biopelícula
formada por los microorganismos sobre la superficie metálica y así se puede obtener un
registro contínuo a través del tiempo (Hernández y col., 2004, a y b).
Los detalles de esta metodología se indican en el anexo.
16
CAPÍTULO 2
ANTECEDENTES
17
2. Antecedentes En la última década se han realizado numerosas investigaciones en torno a la biocorrosión
o a la corrosión inducida por microorganismos (CIM). Sin embargo, existen pocos trabajos
que combinan diversas técnicas que sustentan la participación del microorganismo en el
fenómeno de corrosión. Los investigadores prefieren abordar el tema segmentándolo, ya
sea que sólo consideren el uso de ensayos bioquímicos, de técnicas moleculares, de
técnicas electroquímicas u otras técnicas, pero no se engloban todas las determinaciones.
Un claro ejemplo de esto lo expresaron Vásquez y colaboradores (2003), quienes
consideran que debido a las dificultades experimentales involucradas en el estudio de este
tipo de sistemas, existen en la literatura muy pocos trabajos relacionados con técnicas
electroquímicas basadas en el proceso de corrosión del acero utilizado en el manejo de
crudos de petróleo.
Aunque hace mucho tiempo se conoce el papel que desempeñan las bacterias en los
procesos de corrosión metálica, los primeros trabajos en este campo se deben a Von
Wolzogen-Kuhr, que en 1923 evidenció el mecanismo electroquímico del ataque del
hierro por los microorganismos reductores del sulfato (Genescá, 1995). No obstante, fue
en la década de los 80 que se reconoció a nivel mundial que la corrosión microbiológica
genera serios problemas en la industria petrolera (Prasad, 2000; Duque, 2004),
representando entre un 50 a 90 % de la corrosión metálica localizada y un 30 % del total
de los costos de corrosión metálica en la industria (Jones, 1992; Duque, 2004).
En 1997, el Corrosion Atlas publicó un compendio de casos reales en los que se muestran
los daños generados por la corrosión. En su mayoría, se exponen las agresiones sufridas a
diversos materiales (metales, cerámica, concreto, etc.), dejando una pequeña sección para
la CIM. Este apartado se divide en microorganismos aerobios y anaerobios, dándole peso
a los anaerobios, específicamente, a las bacterias reductoras de sulfato. De modo
particular se evidenció en los casos históricos No. 01.21.17.01 y 01.21.17.02, el deterioro
manifestado por dos piezas metálicas de acero al carbón en un barco. Una de ellas era
una tubería y, la otra, una sección de un compartimiento que estaba en contacto con
líquidos. En la tubería se manejaban altas temperaturas (70 °C) mientras que el
compartimiento estaba expuesto a temperaturas ambientales. En el reporte se describe
la apariencia interna de la tubería, presentando una excesiva corrosión localizada
(picadura), un adelgazamiento en las paredes y un ampollamiento en toda la superficie y,
en lo que respecta al compartimiento, se mostró la misma evidencia. Una bacteria
productora de ácido fue la causante de este tipo de corrosión. El ácido encontrado fue
ácido acético, que se produjo gracias a las condiciones dadas en estos sistemas
18
(temperatura y ausencia de oxigeno) y la autora de este tipo de corrosión inducida por
microorganismos fue la bacteria Clostridium aceticum.
En el año 2006 Padilla y col., estudiaron muestras provenientes del interior de gasoductos,
las cuales aislaron e identificaron bacterias anaerobias y, mediante el uso de técnicas
electroquímicas (ruido electroquímico), pudieron detectar la corrosión (localizada de tipo
picadura) generada por este tipo de bacterias. Al encontrar una diversidad de bacterias
anaerobias, con el propósito de evidenciar la capacidad metabólica de las bacterias
probaron diferentes medios de cultivo, tanto mínimos como enriquecidos. Asímismo,
aplicando técnicas de microscopia electrónica de barrido y de barrido de sonda
caracterizaron la biopelícula formada por los anaerobios y el daño inducido por estos.
En un estudio reportado entre 2004 y 2005 (Hernández y col., 2004 a y b; Hernández y
col., 2005) se puso de manifiesto que el uso de técnicas electroquímicas (resistencia a la
polarización, espectroscopía de impedancia electroquímica y ruido electroquímico) fue de
gran utilidad para describir el fenómeno de corrosión inducido por un consorcio
microbiano. Con estas técnicas también fue posible evaluar el efecto de biocidas en el
fenómeno de corrosión inducida por microorganismos.
El uso constante de la microscopía electrónica ha beneficiado, de manera considerable, al
entendimiento de los mecanismos de acción de los microorganismos. Tal es el caso de la
biocorrosión, en donde se emplea al microscopio electrónico de barrido (SEM) para
observar las biopelículas (Beech, 2004) o, últimamente, se visualizan en el microscopio
electrónico de barrido ambiental (ESEM) (Wagner y col, 1992).
Evidencias obtenidas en el 2004 mediante técnicas electroquímicas y análisis de superficie
(Padilla y col., 2004), demostraron que una bacteria reductora de sulfatos
(Desulfovibrio sp.) procedente de un gasoducto, fue la responsable del proceso de
biocorrosión.
La corrosión inducida por microorganismos (CIM) está, principalmente, constituida por
bacterias aerobias y anaerobias; siendo las últimas, particularmente las bacterias
reductoras de sulfato, las causantes de un daño progresivo al ambiente que las rodea,
reflejando una inestabilidad en su entorno; por lo que este tipo de bacterias son
consideradas como ofensivas (Postgate, 1984).
19
En el 2005 se describió la situación actual de la investigación en biocorrosión y
bioensuciamiento de metales y de aleaciones de uso industrial; así como los conceptos
claves para comprender los efectos principales de los microorganismos en el deterioro del
metal (Videla y Herrera, 2005). Los aspectos fundamentales que se abordaron en esta
revisión fueron las estrategias seguidas para el control de la corrosión inducida por
microorganismos, haciendo énfasis en las bacterias reductoras de sulfato y, como apoyo,
se sugirió hacer uso de las técnicas electroquímicas para evaluar los efectos de la
biocorrosión. La recomendación final dada fue sustentar el análisis con técnicas de
microscopia electrónica.
España y Venezuela sumaron esfuerzos en el 2004 (Duque y col., 2004) para resolver un
problema existente en la industria petrolera venezolana (el conflicto básico que se tiene
en este tipo de industria es la corrosión). Dicho conflicto lo detectaron en el sistema de
inyección de agua para la recuperación secundaria de crudo, en donde al recolectar
muestras encontraron microorganismos anaerobios, entre ellos del género Desulfovibrio y
Clostridium, por lo que decidieron evaluar la actividad (producción de H2S) y corrosividad
de éstas, llegando a la conclusión de que aunque las bacterias reductoras de sulfato
producen más H2S que las que no son consideradas como causantes de los problemas de
biocorrosión y, gracias a la valoración microscópica, dedujeron que el ataque generado
fue de tipo localizado para ambas bacterias.
20
CAPÍTULO 3
JUSTIFICACIÓN
21
3. Justificación
Debido al riesgo y a la importancia económica que para la industria petrolera tiene la
corrosión interna de ductos para el transporte de crudo o derivados del petróleo, ha
crecido el interés en los estudios de corrosión abiótica y biótica de las líneas de transporte
de hidrocarburos. En el segundo caso se han logrado definir algunos mecanismos y
agentes de biocorrosión.
Para investigar la corrosión inducida por microorganismos (CIM), se requieren diversas
herramientas, como técnicas electroquímicas para la evaluación de la velocidad de
corrosión, lo mismo que técnicas de biología molecular para el estudio de las biopelículas
responsables de la CIM. También se ha recurrido al apoyo de la microscopia electrónica
de barrido que magnifica y expone los daños en la superficie metálica.
En este trabajo se hace énfasis en la importancia que tiene la identificación y participación
de microorganismos presentes en el interior de gasoductos de la industria petrolera.
22
CAPÍTULO 4
OBJETIVOS
23
4. Objetivos
4.1. Objetivo general
Identificar y estudiar la influencia en el proceso de corrosión de dos cepas de bacterias
esporuladas, aisladas de cupones corrosimétricos retirados con diferencia de un año del
interior de un gasoducto.
4.2. Objetivos específicos
Identificar las bacterias esporuladas aisladas mediante técnicas bioquímicas
y técnicas de biología molecular (PCR-secuenciación del 16S rDNA).
Definir la diferencia, si es que existe, entre las dos cepas aisladas por
ensayos moleculares (ARDRA y RAPD).
Determinar la presencia de plásmidos en las cepas.
Evaluar la influencia en el proceso de corrosión de la cepa del último
aislamiento por técnicas gravimétricas y electroquímicas.
24
CAPÍTULO 5
METODOLOGÍA
25
Evaluación de la producción de ácidos
orgánicos en el medio seleccionado en
ampoviales durante los estudios de
corrosión.
Pureza de las cepas por PCR-TGGE. Ensayos bioquímicos. Técnicas moleculares:
PCR-ARDRA (16 S rDNA).
PCR-RAPD.
PCR-secuenciación (16S rDNA).
Determinación de la presencia de plásmidos.
Identificación del microorganismo
esporulado aislado recientemente
(cepa G1-2007) y del aislado (cepa G1-
2006) previamente (1 año) en un
gasoducto.
Selección del medio de cultivo para
estudios de crecimiento y corrosión.
Crecimiento celular (NMP).
Consumo de SO42-
.
Formación de H2S.
Fierro total
Acidez.
pH.
Concentración de ácidos orgánicos
por cromatografía de gases.
Acidez titulable.
pH.
pH.
Medición del crecimiento de bacterias
sésiles y planctónicas en los ampoviales
durante los estudios de corrosión. Crecimiento celular (NMP).
Determinación de la velocidad de corrosión
de los cupones metálicos.
Técnica gravimétrica.
Resistencia a la Polarización (RP).
Espectroscopía de Impedancia Electroquímica (EIE).
Gravimetría:
Problema.
Testigo abiótico con ácidos.
Testigo abiótico.
Observación de la corrosión en los cupones
metálicos.
Microscopia electrónica de barrido:
Problema.
Testigo abiótico con ácidos.
Testigo abiótico.
Determinación de la velocidad de corrosión
empleando una celda electroquímica.
Observación de los cupones de corrosión por
Microscopia Electrónica de Barrido (MEB)
26
CAPÍTULO 6
MATERIAL Y MÉTODOS
27
6. Material y Métodos
6.1. Recolección de la muestra
Para la recolección de la muestra se dividió el procedimiento en tres etapas:
1.- Elaboración de medio de cultivo de conservación para el transporte de las cepas (NACE
TM0194-2004).
Se emplearon dos botellas con tapa de rosca de polipropileno de 500 mL,
previamente esterilizados.
A cada botella se le adicionaron 300 mL de medio de cultivo PBS (solución
salina de fosfatos) para anaerobios (NaCl 8.7 g/L, KH2PO4 0.4 g/L, K2HPO4
1.23 g/L, ácido ascórbico al 5% 20 mL/L y resarzurina al 1% 1 mL/L;
solución a pH 7.0).
2.- Remoción del cupón corrosimétrico (NACE RP0775-2005).
Durante los procedimientos de retiro e instalación de testigos
corrosimétricos, se quitó un cupón de corrosión colocado en un gasoducto.
De los sedimentos depositados en el testigo de corrosión se tomó una
muestra representativa.
Los sedimentos fueron introducidos a la botella de polipropileno con medio
de cultivo PBS y se le adicionó una capa de aceite mineral; se cerró y se
rotuló adecuadamente.
Inmediatamente, el cupón corrosimétrico se introdujo a la segunda botella
con medio de cultivo PBS y se le agregó una capa de aceite mineral; se
cerró y se etiquetó debidamente.
3.- Manejo de las muestras en laboratorio (NACE TM0194-2004 y API RP 38-1990).
Para el manejó de las muestra se trabajó en condiciones asépticas.
Se preparó una solución concentrada de Tween™ 80 (detergente).
De la solución concentrada se hizo una dilución 1:100 con agua
desionizada.
A las botellas se les adicionaron 0.4 mL de la solución diluida para
solubilizar la materia orgánica (hidrocarburos) presente.
Se homogeneizó, invirtiendo las botellas 25 veces.
28
Con la finalidad de remover las incrustaciones y desprender las bacterias
adheridas al cupón, la botella que contenía el cupón corrosimétrico fue
sometida a baño ultrasónico por 7 minutos.
Transcurrido el tiempo de sonicación, se retiró la botella y se pudo apreciar
la formación de fases en su interior.
En la parte superior de la botella se ubicó el hidrocarburo solubilizado y en
el fondo se localizaron pequeñas partículas de hidrocarburo precipitado y
entre el hidrocarburo solubilizado y el precipitado, se observó turbiedad, a
la cual se le atribuyó la presencia de microorganismos. Esta característica
también se observó en la botella que no contenía cupón corrosimétrico.
Con un frote en fresco se corroboró la presencia de microorganismos en la
fase turbia de las botellas.
Atravesando la fase orgánica con una jeringa estéril de 10 mL, se tomó una
alícuota (10 mL) de cada botella.
Con el propósito de favorecer el crecimiento, cada alícuota de 10 mL fue
inoculada en un ampovial con 90 mL de medio de cultivo PBS para
anaerobios con la adición de extracto de levadura (1 g/L).
El crecimiento se detectó por la aparición de turbiedad, aproximadamente,
en 120 h.
Se subcultivó cada uno de los tubos positivos (con turbiedad) en medio
para anaerobios PBS con extracto de levadura y en medio de cultivo API RP
38 con intenciones confirmativas (cultivo puro).
El crecimiento en medio de cultivo API RP 38, se evidenció por la
producción de H2S, que junto con el fierro presente en solución, forma un
precipitado de sulfuro de fierro, confiriéndoles un color negro a los cultivos
positivos.
El cultivo se mantuvo activo, realizando resiembras cada 720 h en
ampoviales de 10 mL los cuales se conservaron en una atmosfera de
anaerobiosis a 37 °C.
De el procedimiento anteriormente descrito, se obtuvieron dos cepas, etiquetados como
G1-2006 y G1-2007.
29
6.2. Microorganismos
Cepa G1-2006. Microorganismo esporulado aislado de un cupón
corrosimétrico de un gasoducto.
Cepa G1-2007. Microorganismo esporulado aislado de un cupón
corrosimétrico, del mismo gasoducto, un año después del aislamiento de la
cepa G1-2006.
6.3. Medios de cultivo
6.3.1. Medio de conservación de cepas
Las dos cepas se conservaron en medio de cultivo API RP 38 en ampoviales en condiciones
de anaerobiosis (Tabla 1).
Tabla 1. Composición del medio de cultivo API RP 38.
Componente Concentración (g/L)
Lactato de sodio 60% (p/v) 8.0
Extracto de levadura 2.0
Ácido ascórbico 0.2
L-cisteína 0.5
MgSO4·7H2O 0.4
K2HPO4 0.02
FeSO4(NH4)2·6H2O 0.2
Na2SO3 0.4
NaCl 15
Resarzurina 0.5
6.3.2. Medios de cultivo empleados en la selección del medio para el estudio de
biocorrosión
Para la selección del medio de cultivo se propusieron: el API RP 38, el Bold basal
modificado y el Postgate C; cuya composición se muestra en las tablas 1, 2 y 3
respectivamente.
30
Tabla 2. Composición del medio Bold basal modificado.
Componente Concentración (g/L)
Lactato de sodio 60% (p/v) 8.0
NaCl 10
Extracto de levadura 0.5
Na2SO3 0.4
MgSO4·7H2O 0.32
L-cisteína 0.5
Resarzurina 0.5
Además de los reactivos anteriores, se adicionó 1 mL de cada una de las siguientes
soluciones.
Solución Componente Concentración (g/L)
1 NaNO3 25
2 MgSO4·7H2O 7.5
3 K2HPO4 7.5
4 KH2PO4 17.5
5 CaCl2·2H20 2.5
6 ZnSO4·7H2O MnCl2·4H2O MoO3 CuSO4·5H2O Co(NO3)2·6H2O
8.82 1.44 0.71 1.57 0.49
7 H3BO3 11.4
8 EDTANa2 KOH
50 31
Tabla 3. Composición del medio Postgate C.
Componente Concentración (g/L)
KH2PO4 0.5
NH4Cl 1.0
Na2SO4 4.5
MgSO4·7H2O 0.06
Lactato de sodio 60% (p/v) 6.0
CaCl2·2H20 0.06
FeSO4·7H20 0.004
Extracto de levadura 1.0
Citrato de sodio 0.3
NaCl 15
Resarzurina 0.5
31
6.3.3. Preparación de la celda electroquímica para la selección del medio de cultivo
Con la finalidad de elegir el medio de cultivo óptimo para las determinaciones se
prepararon tres celdas electroquímicas con 900 mL de cada medio de cultivo (Tabla 1, 2 y
3). Estas fueron inoculadas con 5 mL de un cultivo previamente propagado (360 h) en
medio de cultivo API RP 38 en condiciones de anaerobiosis a 37 °C por 720 h (Figura 2).
Figura 2. Celda electroquímica de volumen nominal de 1000 mL empleada para la
selección del medio de cultivo.
32
6.4. Cupones de acero
Para los estudios de corrosión se utilizaron cupones de acero al carbón API XL 52, con
forma cilíndrica y un área de exposición de 30.2922 pulgada2 y 25.6703 pulgada2
(Figura 3), pulidos hasta lija de carburo de silicio número 600.
Figura 3. Cilindros de acero al carbón API XL 52 referidos como electrodos de
trabajo o cupones corrosimétricos.
6.4.1. Acondicionamiento de los cupones de acero al carbón API XL 52
Antes de cada ensayo en donde se requería la presencia del cupón, la superficie del
electrodo de trabajo (cupones corrosimétricos) fue pulida con lijas de papel de carburo de
silicio marca FRADELI™. Las lijas utilizadas fueron número 80, 100, 120, 150, 180, 220,
240, 280, 320, 360, 400, 500 y 600; se empleó esta gran variedad de lijas con el propósito
de no alterar la estructura y apariencia del metal y poder obtener una superficie
uniformemente pulida. Para alcanzar un pulido homogéneo el cupón fue montado en un
motor monofásico de ½ caballo de fuerza a baja velocidad de rotación (1875 rpm). Una
vez concluido el lijado el cupón fue limpiado con agua y detergente en polvo, seguido de
un enjuague con agua desionizada y desengrasado con acetona, posteriormente se
registró el peso y área del cupón y se envolvió en papel de inhibidor de corrosión (Protek
Wrap™ de DAUBERT VCI, INC.), manteniéndose en un desecador hasta su uso.
33
6.5. Determinación de crecimiento por el número más probable (NMP)
Para establecer la cinética de crecimiento se empleó la técnica del NMP, la cual estima la
población microbiana a través de una serie de diluciones (Figura 4) de la muestra
problema y dependiendo de la sensibilidad requerida se hacen de 3 a 10 replicas de cada
dilución; estas son sometidas a ciertas condiciones de incubación (tiempo y temperatura)
y para apreciar el crecimiento, se evalúa el número más probable de microorganismos por
unidad de volumen de cada dilución hecha. Con ayuda de tablas estadísticas se conoce el
NMP/mL del microorganismo en estudio.
Las tablas (US FDA/CFSAN-BAM, 2006) ocupadas para esta determinación consideran que
la estimación se basa en la presunción de que las bacterias se encuentran
homogéneamente distribuidas en un medio líquido; dicho de otra forma, en muestras
repetidas del mismo tamaño y del mismo producto, debe esperarse que contengan, en
promedio, el mismo número de microorganismos. Sin embargo, algunas de las muestras
pueden contener microorganismos de más o de menos, pero la técnica permite calcular
una media logarítmica con un intervalo de confianza el 95 %, lo cual permite obtener la
cifra del NMP/mL.
Teniendo en consideración lo expuesto anteriormente se hizo lo siguiente.
Se prepararon 3 series de 10 ampoviales cada una con 9 mL de medio de
cultivo.
Condiciones de esterilidad fueron aplicados para los siguientes pasos.
Con una jeringa de 5 mL, previamente purgada con nitrógeno estéril (filtro
de 2 µm), se extrajeron 3 mL de la celda electroquímica (sistema: medio de
cultivo-bacteria-cupón de acero al carbón API XL 52).
Se inoculó con 1 mL cada serie de 10 ampoviales.
Se homogeneizó el primer ampovial de cada serie.
Partiendo del primer ampovial de cada serie, se realizaron diluciones
decimales hasta 10-10 para cada una; en cada transferencia se emplearon
jeringas nuevas, previamente purgadas; así como de una homogeneización
a los ampoviales.
Se incubaron los ampoviales a 37 °C por 240 h.
Los ampoviales que presentaron cambio, ya sea turbiedad (medio de
cultivo Postgate C y Bold basal modificada) o abundancia de precipitación
(API RP 38), se consideraron positivos.
Con tablas estadísticas, se estimó el NMP/mL de bacterias presentes en la
muestra.
34
Figura 4. Bosquejo de las diluciones realizadas para la estimación del número más
probable (NMP).
En la Figura 4, se muestran por triplicado los ampoviales realizados para el NMP con sus
respectivas diluciones que fueron incubados para su posterior observación.
35
6.6. Cuantificación de sulfuros
La concentración de sulfuros se estimó espectrofotométricamente a 665 nm empleando el
método de azul de metileno. Se siguió el procedimiento descrito por Hach™ en el 2005,
que se basa en el método de referencia equivalente a EPA, USEPA 376.2 y al método
estándar 4500-S2-D para aguas contaminadas (Hach, 2005).
La determinación de la concentración de sulfuro, ya sea como ion sulfuro (S2-), ion
sulfhídrico (HS-) y ácido sulfhídrico (H2S), en el sistema electroquímico se basó en la
reacción entre el ácido sulfhídrico e iones de sulfuros metálicos solubles, con
N,N-dimetil-p-fenilenediamina para formar azul de metileno en presencia de dicromato de
potasio (agente oxidante).
Esta determinación se hizo lo más rápido posible, ya que de no ser así se pueden tener
pérdidas en la concentración final.
La metodología fue la siguiente.
Se prendió el espectrofotómetro HACH™ DR2000 y después de 30 minutos
se calibró el equipo con estándares de registró rápido (HACH™).
Se corroboró el método instalado en el espectrofotómetro,
correspondiente a la determinación de sulfuros No. 690, empleando 10 mL
(aforo de las celdas) de agua desionizada tanto en la celda testigo como en
la celda problema y así verificar la precisión y exactitud del método.
Con una jeringa estéril, se extrajo una alícuota de 5 mL de la celda
electroquímica.
A la celda problema, se le adicionó 1 mL de muestra y se aforó con agua
desionizada.
A la celda testigo, se le agregó 10 mL de agua desionizada.
Tanto a la celda testigo como a la problema se le adicionó 1 mL de reactivo
Sulfide 1™ y se mezcló la solución con 5 movimientos circulares.
Se adicionó 1 mL de reactivo Sulfide 2™ a la celda testigo y problema.
Se taparon las celdas y se homogeneizaron invirtiéndolas 25 veces.
Se dejó reaccionar por 5 minutos.
Concluido el tiempo de reacción, se colocó la celda testigo al
espectrofotómetro y se calibró a cero (0 µg S2-/L).
Posteriormente, se instaló la celda problema en el espectrofotómetro y se
leyó la muestra.
Se consideró la dilución para conocer la concentración de sulfuros
(µg S2-/L).
36
6.7. Cuantificación de sulfatos
La concentración de sulfatos se valoró espectrofotométricamente a 450 nm utilizando el
método de cloruro de bario. Se siguió el procedimiento descrito por Hach™ en el 2005, el
cual se basa en el método de referencia equivalente a EPA, USEPA 375.4 y al método
estándar para aguas contaminadas (Hach, 2005).
Los iones de sulfato en la muestra reaccionan con el cloruro de bario y forman un
precipitado de sulfato de bario que es insoluble en medio acuoso, encontrándose como
partículas sólidas muy finas en la muestra. La turbiedad producida es proporcional a la
cantidad de sulfato presente.
El procedimiento fue el siguiente.
Se encendió el espectrofotómetro HACH™ DR2000 y después de 30
minutos se calibró el equipo con estándares de registro rápido (HACH™).
Se verificó el método instalado en el espectrofotómetro, correspondiente a
la determinación de sulfatos No. 680, utilizando 10 mL (aforo de las celdas)
de agua desionizada tanto en la celda testigo como en la celda problema y
así corroborar la precisión y exactitud del método.
Con una jeringa estéril, se extrajo una alícuota de 5 mL de la celda
electroquímica.
A la celda testigo y a la celda problema se les adicionó 1 mL de muestra y se
completó el aforo (9 mL) con agua desionizada.
Se le adicionó a la celda problema el contenido de 1 sobre del reactivo
SulfaVer4™.
La celda problema se agitó con movimientos circulares por 25 veces para
disolver el reactivo.
Se esperó a que se llevara a cabo la reacción (5 min).
Finalizado el tiempo de reacción, se introdujo la celda testigo al
espectrofotómetro y se calibró a cero (0 mg SO42-/L).
Posteriormente se insertó la celda problema en el espectrofotómetro y se
leyó la muestra.
Se consideró la dilución para conocer la concentración de sulfatos
(mg SO42-/L).
37
6.8. Cuantificación de fierro total
La concentración de fierro total se apreció espectrofotométricamente a 510 nm aplicando
el método de fenantrolina. Se siguió el procedimiento descrito por Hach™ en el 2005, el
cual se basa en el método de referencia equivalente a EPA, USEPA 45(126:43459) y al
método estándar para aguas contaminadas (Hach, 2005).
Para poder determinar el contenido de fierro total en el sistema electroquímico, se
necesitó convertir todo el fierro presente en ion ferroso (Fe2+), el cual reacciona con la
1,10 fenantrolina, propiciando la formación de un complejo colorido (rojo-naranja)
proporcional a la concentración de fierro total.
El desarrollo fue el siguiente.
Se encendió el espectrofotómetro HACH™ DR2000 y después de 30
minutos se calibró el equipo con estándares de registro rápido (HACH™).
Se confirmó el método instalado en el espectrofotómetro, correspondiente
a la determinación de fierro total No. 265, con ayuda de las celdas testigo y
problema, ajustando el volumen a 10 mL con agua desionizada y así poder
verificar la precisión y exactitud del método.
Con una jeringa estéril se extrajo una alícuota de 5 mL de la celda
electroquímica.
Se les adicionó 1 mL de muestra a la celda testigo y a la celda problema y se
aforó a 10 mL con agua desionizada.
Se le adicionó el contenido de 1 sobre del reactivo FerroVer4™ a la celda
problema.
Se homogeneizó la celda problema con 25 movimientos circulares.
Se dejó reaccionar por 3 min.
Transcurrido el tiempo de reacción se instaló la celda testigo al
espectrofotómetro y se calibró a cero (0 mg Fe/L).
Posteriormente se colocó la celda problema en el espectrofotómetro y se
leyó la muestra.
Se tomó en cuenta la dilución para conocer la concentración de fierro total
(mg Fe/L).
38
6.9. Determinación de acidez
Durante la selección del medio de cultivo para los ensayos de biocorrosión se empleó un
titulador digital marca Hach™, modelo 16900, el cual aplica el principio de que a un
determinado volumen de muestra se le adiciona un indicador para su posterior titulación
con un acido o base fuerte y la cantidad de titulante usado es directamente proporcional a
los mili equivalentes de ácido o base en la muestra (Whitten y col., 1980).
El procedimiento fue el No. 8200 (acid determination por Hach™).
Se acondicionó el titulador digital con un cartucho de titulación digital de
NaOH 0.16 N (14377-01 de Hach™).
Una vez instalado el cartucho se le incorporó la cánula distribuidora, se
verificó la salida del titulante a través de ésta y se llevó a cero los dígitos.
Con una jeringa estéril se extrajo una alícuota de 10 mL de la celda
electroquímica y se depositaron en un matraz Erlenmeyer de 250 mL.
Se diluyó la muestra con agua desionizada, aproximadamente hasta 100 mL
y se le agregó el contenido de un sobre de reactivo Phenolphthalein™.
Se homogeneizó el contenido con 25 movimientos circulares.
Se incorporó el titulador digital dentro del matraz Erlenmeyer procurando
que la cánula quedara hasta el fondo del matraz.
Se empezó a titular gota a gota con giros lentos dados a la perilla del
titulador.
El punto final de la titulación se hizo evidente con el cambio del indicador a
color rosa pálido.
Se tomaron en cuenta los dígitos requeridos, la normalidad y el factor
multiplicador correspondiente a los dígitos gastados en la titulación para
conocer los meq de ácido /L.
En forma alternativa en el ensayo de producción de ácidos orgánicos se realizó la
titulación directa con NaOH 0.1 N y fenolftaleína como indicador.
39
6.10. Determinación del pH
En este trabajo se emplearon dos electrodos de pH, uno de ellos se utilizó en las pruebas
electroquímicas y el segundo para el monitoreo de los productos metabólicos producidos
por las cepas G1-2006 y G1-2007.
Se verificó el buen funcionamiento de los potenciómetros empleando soluciones
estándares a pH´s diferentes. Para los ensayos electroquímicos se calibró el
potenciómetro antes de sumergirlo en la celda electroquímica y para los productos
metabólicos se calibró semanalmente; todas las calibraciones se hicieron a pH de 4 y 7.
El primer potenciómetro es de la marca Thermo Orion digital con conector BNC, el cual
fue sumergido dentro de la celda electroquímica.
El segundo potenciómetro es de la marca Lutron modelo YK-21PH, el cual se introdujo en
cada una de las muestras filtradas a través de membranas GF/F.
Ambos potenciómetros presentaron una resolución de 0.001 unidades de pH.
El valor de pH tardó en estabilizarse, aproximadamente, 30 segundos, por lo que se
esperó 1 minuto para registrar la lectura de pH reportada por los potenciómetros.
40
6.11. Identificación de los microorganismos
Para observar las características microscópicas de las bacterias se hizo lo siguiente:
Para verificar si es Gram positivo o Gram negativo se realizaron tres frotes
y se tiñeron por la técnica de Gram.
Para mostrar la presencia de esporas se elaboraron tres frotes y se tiñeron
por la técnica de Shaeffer y Fulton.
6.11.1. Pruebas bioquímicas de identificación tradicionales
Las cepas aisladas G1-2006 y G1-2007 se incubaron en ampoviales con medio de cultivo
Postgate C y en condiciones de anaerobiosis. Con estos cultivos se llevaron a cabo las
determinaciones bioquímicas (Bergey´s Manual).
Cada cepa, fue sometida al análisis bioquímico por duplicado y en forma paralela un
testigo, denominado cepa de referencia.
La fermentación de carbohidratos y la demostración de la presencia de algunas enzimas,
son parte de las pruebas diferenciales que se realizaron. El procedimiento fue el
siguiente:
Con una pipeta Pasteur se sembraron las bacterias en medio de cultivo,
gelosa sangre hemina menadiona y se incubaron en condiciones aeróbicas
y anaeróbicas a 37 °C por un lapso de 72 a 120 h. El objetivo de mantener a
las bacterias en condiciones diferentes es evidenciar el grado de
sensibilidad que manifiestan ante el oxígeno molecular presente en el
ambiente. A esta determinación se le conoce como prueba de
aerotolerancia.
Con la finalidad de observar el crecimiento de las bacterias y corroborar la
identificación microscópica al finalizar el tiempo de incubación se realizaron
frotes de las colonias y se tiñeron por las técnicas de Gram y Shaeffer y
Fulton.
A partir del medio de cultivo gelosa sangre hemina menadiona fue
necesario propagar a las bacterias en un caldo tioglicolato enriquecido con
hemina menadiona sin glucosa y sin indicador, ya que estos pueden
interferir o dar falsos positivos en la interpretación de las pruebas
bioquímicas. Se incubaron en condiciones anaeróbicas, mediante la
41
colocación de un sello de aceite mineral a 37 °C en un intervalo de 72 a 120
h.
Transcurrida la incubación, se observaron los tubos de caldo tioglicolato y
el crecimiento de las bacterias se expresó por la turbiedad en el fondo del
tubo y a este tubo se le nombró “semilla” y fue el inóculo para los ensayos
bioquímicos.
Con ayuda de una pipeta Pasteur se tomó una alícuota de la semilla y se
sembraron una serie de tubos con caldo base de tioglicolato sin glucosa y
sin indicador adicionados de los siguientes hidratos de carbono al 1%:
adonitol, almidón, arabinosa, celobiosa, dulcitol, esculina, fructosa,
galactosa, glicerol, glucosa, inulina, lactosa, maltosa, manitol, manosa,
melibiosa, rafinosa, ramnosa, ribosa, sorbitol, trehalosa y xilosa; asímismo
caldo indol nitratos, caldo urea, tiogel o gelatina, leche fierro, caldo
tioglicolato carne cocida, gelosa cerebro corazón en tubo inclinado y una
placa con gelosa yema de huevo.
Se efectuó el sembrado de todos los ensayos diferenciales, evitando
introducir aire y/o aceite mineral y se incubaron en condiciones
anaeróbicas a 37 °C con un tiempo de 72 a 120 h.
Una vez transcurrida la incubación se leyeron e interpretaron las pruebas
diferenciales.
Con la finalidad de observar el cambio efectuado por la bacteria a los tubos
con carbohidratos se les adicionó azul de bromotimol al 1%.
Para verificar la producción de indol se usaron xilol y reactivo de Ehrlich.
Ácido sulfanílico y dimetil naftil amina fueron utilizados en la determinación
de la reducción de nitratos a nitritos.
En la hidrólisis de la esculina se empleó citrato férrico de amonio al 10%.
Para interpretar la licuefacción de la gelatina se refrigeró el tubo de tiogel
(aproximadamente 4 °C) por una hora.
Para la determinación enzimática de la catalasa se usó peróxido de
hidrógeno al 3%.
Para observar la presencia de la lipasa fue empleada solución acuosa
saturada de sulfato de cobre.
Con el propósito de verificar la hidrólisis del almidón fue empleada solución
de lugol.
Con el manual de anaerobios obligados y el Bergey´s Manual se pudo
identificar el género y especie de las bacterias en estudio.
42
6.11.2. Aislamiento de DNA.
Para la extracción del DNA de las cepas G1-2006 y G1-2007 se empleó la técnica de lisis
química con la adición de lisozima, que consiste en lo siguiente (Becker y col., 1990).
Se recuperaron las células por centrifugación.
Se lavó el paquete celular con agua desionizada y se centrifugó a 11000 x g
durante tres minutos.
Se adicionaron 600 L de solución de lisis (SDS 0.5%, Tris 100 mM y EDTA
50 mM), succionando y descargando con la punta de la micropipeta hasta
suspender las células.
A la suspensión se le adicionaron 20 L de lisozima a 12.5 mg/mL en
regulador de Tris 100 mM y se incubó a temperatura ambiente por tres
minutos.
Posteriormente las muestras se mantuvieron a 80 °C por cinco minutos.
Finalizado el tiempo se enfrió a temperatura ambiente.
Se adicionaron al lisado 3 L de RNAsa (400 U/mg) invirtiendo 25 veces y se
incubó a 37 °C por 45 minutos.
Las muestras se colocaron en refrigeración (4 °C) durante 10 minutos.
Se adicionaron 200 L de solución de acetato da amonio (10 M) y se agitó
en vortex por 20 segundos.
Se centrifugó a 11000 x g durante tres minutos. Cuidadosamente se vació
el sobrenadante a tubos de 1.5 mL que contenían 600 L de isopropanol y
se mezcló invirtiendo las muestras 50 veces.
Se centrifugó a 11000 x g por tres minutos, se vació el sobrenadante y se
escurrieron los tubos sobre papel secante. Se adicionaron 600 L de etanol
al 70% y se invirtieron los tubos varias veces para lavar el precipitado.
Se centrifugó a 11000 x g durante tres minutos y cuidadosamente se vació
el etanol sin descargar el paquete de DNA.
Se drenaron los tubos sobre papel secante y se dejaron las muestras al aire
por 15 minutos.
Se rehidrató el DNA con 50 mL de agua desionizada estéril por 24 horas.
Se mantuvo en congelación (-20 °C) hasta su uso.
43
Asímismo, se utilizó un kit (DNeasy™ Tissue de QIAGEN™) para la extracción y purificación
de DNA (DNeasy™ Tissue Handbook, 2003) que se basa en la interacción entre las cargas
negativas de los grupos fosfato de la cadena de DNA y las cargas positivas de los grupos
DEAE™ de la superficie de la resina. Para ello se necesitan reguladores con ciertas
características (concentración de sales y pH) y por medio de estos el DNA se enlaza o
bien se eluye de la columna (QIAgen, 2001).
El procedimiento fue el siguiente.
Se recuperaron las células por centrifugación.
Se lavó el paquete celular con agua desionizada y se centrifugó a 5000 x g
por diez minutos.
Se resuspendió el paquete de bacterias en 180 µL de regulador de lisis (20
mM Tris-HCl a pH 8.0, 2 mM EDTA, 1.2% Triton™ X-100 y lisozima 20
mg/mL).
Se incubó a 37 °C durante 1 hora.
Se adicionaron 25 µL de proteinasa K y 200 µL de regulador AL y se mezcló
en vórtex.
Se incubó a 70 °C por 30 minutos.
Se agregaron 200 µL de etanol al 96% y se homogeneizó.
Se transfirió la mezcla dentro de la DNSC (DNeasy Spin Column), que se
había colocado previamente en un tubo de recolección de 2 mL.
Se centrifugó a 6000 x g durante 1 minuto.
Se colocó la DNSC en un tubo de recolección nuevo, se adicionaron 500 µL
de regulador AW1 y se centrifugó a 6000 x g por un minuto.
Se colocó la DNSC en un tubo de recolección nuevo, se agregaron 500 µL de
regulador AW2, se centrifugó por 3 minutos a máxima velocidad para secar
la resina contenida dentro del DNSC.
Se asentó la DNSC en un tubo de 2 mL y se agregó 100 µL de regulador AE,
directamente sobre la resina de DNSC.
Se incubó a temperatura ambiente por un minuto y luego se centrifugó 1
minuto a 6000 x g para eluir.
Se mantuvo en congelación (-20 °C) hasta su uso.
44
6.11.3. Amplificación del DNA por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La amplificación de una región especifica de DNA, se lleva a cabo mediante la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) (Vosberg, 1989).
Los requerimientos para una PCR son: solución amortiguadora de reacción, mezcla de
nucleótidos (dNTP´s: adenina, timina, citosina y guanina), que son la materia base para
fabricar el DNA y los iniciadores (oligonucleótidos) específicos que flanquean el gen o
segmento que actúa como blanco para la reacción (Mas Eva y col., 2001).
La reacción en cadena de la polimerasa se desarrolla en tres pasos consecutivos,
determinados por temperaturas y tiempos específicos:
1er paso.- Desnaturalización (92-98 °C, 30 a 90 segundos), en el cuál se separan las dos
cadenas complementarias del DNA blanco.
2do paso.- Alineamiento (50-60 °C, 30 a 60 segundos), en el que se realiza el
apareamiento especifico entre los iniciadores y las cadenas simples del segmento de DNA
blanco desnaturalizado.
3er paso.- Extensión (70-74 °C, 30 a 90 segundos), la DNA polimerasa extiende la longitud
de los iniciadores apareados al DNA blanco al ir polimerizando los desoxirribonucleótidos
libres, resultando en nuevas cadenas complementarias a las dos cadenas sencillas
presentes al inicio de la reacción.
Consecuentemente, con la sucesión de ciclos se logra una síntesis exponencial del
segmento de DNA blanco.
La reacción de PCR se llevó a cabo en un termociclador (Applied Boisystems GeneAmp PCR
System 2400) con el siguiente programa: primero se tiene una desnaturalización a 94 °C
por 5 minutos, seguidos de 35 ciclos consistentes en 1 minuto a 94 °C, un alineamiento a
55 °C por 1 minuto y una extensión a 72 °C por 2.5 minutos, apoyado por 10 minutos para
la extensión final a 72 °C. Finalizada la amplificación, se dejan enfriar las muestras
durante 10 minutos a 4 °C (Figura 5).
45
94 °C 94 °C
5´ 1´ 72 °C 72 °C
55 °C 2.5´ 10´
1´ 4 °C
10´
35 ciclos
Figura 5. Programa utilizado para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La mezcla de reacción para la amplificación fue de 25 µL de volumen final
Componente Volumen (µL)
Regulador 10X 2.5
MgCl2 (50mM) 0.75
dNTP´s (10mM) 0.5
Taq DNA polimerasa 0.125
H2O desionizada 18.125
Iniciador 1 (10mM) 1.0
Iniciador 2 (10mM) 1.0
DNA muestra 1.0
Los iniciadores fueron distintos dependiendo de la longitud deseada del amplificado, por ejemplo:
para los amplificados utilizados en la TGGE se utilizaron los iniciadores U 968-GC y L 1401 (Tabla 4)
(Felske y col., 1996), dando un producto de 500 pb aproximadamente del 16S rDNA. Para la
identificación de los microorganismos se utilizaron los iniciadores 8FLP y 13B (Tabla 5) (Relman
D.A. 1993), los cuales dan productos de amplificación de aproximadamente 1400 pb del 16S rDNA.
En el caso del análisis del DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) (Tabla 6) (Madico y
col., 1995; Chávez y col., 2005) la temperatura de alineamiento fue de 35 °C y el tiempo de
extensión de 2 minutos.
46
Tabla 4. Iniciadores utilizados para la evaluación de la riqueza de especies.
Iniciadores Secuencia
*U968-GC 5´-(GC pinza)-AAC GCG AAG AAC CTT AC-3´
L1401 5´-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3´
Tabla 5. Iniciadores utilizados para la identificación de las cepas aisladas.
Iniciador Secuencia
8FPL Forward
5´-GCG GAT CCG CGG CCG CTG CAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3´
13B Reverse
5´-CGG GAT CCC AGG CCC GGG AAC GTA TTC AC-3´
Tabla 6. Iniciadores empleados para el RAPD
Iniciador Secuencia
1283 Forward
5´-GCG ATC CCC A-3´
1290 Reverse
5´-GTG GAT GCG A-3´
47
6.11.4. Electroforesis en gel con gradiente de temperatura
La electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TGGE) es una técnica de
separación, que depende de la forma de la molécula, por lo que pueden separarse
fragmentos de la misma longitud. La forma está determinada principalmente por la
estructura secundaria y terciaria de la molécula y puede ser cambiada por factores
externos como la temperatura, concentración de sales, pH, etc. (Biometra™, 1999).
Mediante esta técnica se pueden separar fragmentos de DNA de la misma longitud con
secuencias de bases distintas, generando un patrón único de identificación; por lo que
cada banda obtenida representaría a un microorganismo.
El método consiste en amplificar, por medio de la reacción en cadena de la polimerasa,
fragmentos del gen 16S rDNA con una longitud entre 200 y 500 pb (la longitud está en
función del diseño de los iniciadores) y su posterior análisis electroforético utilizando un
gradiente de temperatura (agente desnaturalizante) a lo largo del gel de poliacrilamida.
Durante la migración de las muestras amplificadas en el gel con el gradiente de
temperatura, las muestras presentan diferentes estados de transición en su estructura,
pasando de estructura terciaria (DNA de doble cadena) a estructura secundaria (cadena
sencilla), este fenómeno ocurre en determinado punto del gel en donde la migración
termina o se vuelve más lenta.
Se aconseja utilizar en la amplificación del gen un iniciador rico en G-C o un iniciador con
una secuencia adicional en el extremo 5´ abundante de G-C. La región rica en G-C actúa
como una abrazadera que evita la formación de DNA de cadena sencilla y como la
secuencia de los fragmentos es diferente, cada muestra adopta una conformación
particular de DNA de cadena sencilla parcial, lo que ocasiona que los fragmentos se
detengan en diferente posición a lo largo del gel (Maniatis y col., 1982).
Para la realización de la TGGE, el procedimiento se segmentó en cuatro fases.
48
1.- Preparación del gel de poliacrilamida.
Se lavaron las placas de vidrio (molde) con alcohol al 70% y agua
desionizada.
En la placa que no tiene pozos se colocaron 200 µL de acryl glide y se
distribuyeron con papel cebolla uniformemente en toda la superficie de la
placa.
Se colocó una membrana de polibond entre las dos placas de vidrio,
sujetadas con tres pinzas.
Se preparó 1 mL de persulfato de amonio al 4%, es decir, se pesaron 40 mg
y se llevaron a 1 mL con agua desionizada.
En un matraz Erlenmeyer (estéril) de 25 mL, se pesaron 2.4 g de urea y se
adicionó 1 mL de acrilamida-bisacrilamida (40% w/v). A la mezcla, se le
adicionaron 100 µL de regulador TEA 10X (Tris base 400 mM,
Na2EDTA·2H2O 20mM, acetato de sodio anhidro 200 mM, ácido acético
glacial 296 mM, se aforó a 1 L con agua desionizada y el pH final de la
solución fue de 7.8), 250 µL de glicerol al 40% y 1.3 mL de agua desionizada
(estéril).
La solución anterior fue homogeneizada perfectamente hasta la disolución
de la urea y se transfirió a un matraz Kitasato y se eliminó el aire disuelto
conectando el matraz a una bomba de vacío durante 5 minutos en tiempos
intermitentes de 20 segundos.
Se llevó al aforo de 5 mL con agua bidestilada (estéril) y se adicionaron
23 µL de persulfato de amonio al 4% y 10 µL de TEMED
(N,N,N,N´-tetrametilendiamina), seguida de una homogeneización.
Se vertió la solución entre las placas y se dejó gelificar durante 30minutos.
49
2.- Acondicionamiento de las muestras.
En un tubo de 1.5 mL se colocó 1 µL de regulador de carga (0.25% de azul
de bromofenol y 0.25% de xilen cianol en una solución de sacarosa al 50 %;
la concentración final de esta solución es de 5X), 2 µL de regulador TAE 0.2X
y 1 µL de DNA amplificado.
Figura 6. Equipo para llevar a cabo una electroforesis en gel con gradiente
de temperatura (TGGE).
50
3.- Arreglo del sistema de electroforesis (Figura 6).
Se prepararon 500 mL de regulador TAE 0.2X (10 mL de regulador 10X y se
llevó al aforó a 500 mL con agua desionizada.
Se adicionaron 240 mL del regulador 0.2X en cada una de las cubetas de la
cámara de electroforesis.
En la superficie del equipo se encuentra la placa del gradiente de
temperatura que se caracteriza por tener líneas que proporcionan el grado
de temperatura y en estas líneas se adicionó 50 µL de tritón al 0.1 % y fue
puesta la membrana de polibond con el gel evitando la formación de
burbujas.
Se colocaron las muestras en cada pozo y se instalaron los puentes de papel
debidamente alineados.
Se cubrió el gel con la segunda membrana de polibond y finalmente se fijó
la placa de vidrio para cubrir el gel con los sellos de silicón.
Se cerró la cámara electroforética y se inició la corrida con las condiciones
de voltaje (125 V), corriente (8 mA), potencia (0.6 W) y tiempo (2 horas).
4.- Revelado y observación del gel.
Concluido el tiempo de corrida, se retiró el gel de la cámara electroforética
y se pasó al recipiente de revelado adicionando una solución de TEA 1X con
syber green I por 30 minutos.
Transcurrido el tiempo de revelado, se observó el gel en un transiluminador
(Bio-Imaging Systems, Visible & Ultraviolet Transilluminator) acoplado a un
documentador de geles (Kodak ID Image Analysis Software, 2000).
51
6.11.5. Electroforesis en gel de agarosa
El DNA, extraído de las cepas G1-2006 y G1-2007 y el generado por PCR, fueron sometidos
a una electroforesis en gel al 1% y el protocolo fue el siguiente.
Se midieron 20 mL de regulador TBE 10X (Tris 121.1 g, ácido bórico anhidro
61.8 g, Na2EDTA·2H2O 7.4 g y se aforó a 1 L con agua desionizada, el pH de
la solución fue de 8.3) y se llevó a 200 mL con agua desionizada para
obtener una concentración 1X.
Se preparó el gel de agarosa al 1% (0.2 g de agarosa) con 20 mL de
regulador 1X y se disolvió perfectamente la mezcla calentando en un horno
de microondas.
A la mezcla fundida se le adicionaron 0.7 µL de bromuro de etidio
(revelador).
Se preparó la cámara de electroforesis (Gibco™ BRL Electrophoresis
Apparatus) para la formación del gel, a la que previamente se le han
colocado el peine y los separadores.
Se adicionó la agarosa fundida al molde de la cámara y por 30 minutos se
dejó solidificar el gel.
Transcurrido el tiempo, se retiraron el peine y los separadores y se inundó
la cámara electroforética con el resto del regulador TBE 1X.
Se prepararon las muestras de DNA purificado, colocando en un tubo de
1.5 mL una mezcla de DNA (4 µL) y regulador de carga TBE 1X (1 µL). Para
el marcador de peso molecular (para comparar el tamaño de los
fragmentos de DNA), se adicionó en un tubo de 1.5 mL una mezcla de
regulador de carga TBE 1X (4 µL) y el marcador de peso molecular (1 µL).
Se colocaron las muestras en cada uno de los pozos, en uno de ellos el
marcador de peso molecular y se cerró la cámara de electroforesis.
Se conectó el equipo a una fuente de poder marca Thermo™ modelo
EC250-90; con las siguientes condiciones: voltaje 80 V, corriente 40 mA y
tiempo 1 hora.
Una vez concluido el tiempo de corrida se retiró el gel y se observó en un
transiluminador (Bio-Imaging Systems, Visible & Ultraviolet
Transilluminator) acoplado a un documentador de geles (Kodak ID Image
Analysis Software, 2000).
52
6.11.6. Purificación del DNA amplificado
Antes de llevar a cabo la secuenciación de los amplicones estos se purificaron empleando
el juego de reactivos QIAquick™ (Spin Handbook, 2001) de acuerdo con el protocolo
siguiente:
Se midió el volumen total de muestra de DNA amplificado y se agregó cinco
veces ese volumen de regulador PB para obtener una dilución 1:6.
Se depositó la muestra en una columna de intercambio iónico contenida en
un tubo de colección y se centrifugó a 11000 x g durante 1 minuto. Se
eliminó el filtrado y se colocó la columna en el mismo tubo.
Se lavó con 750 mL de regulador de PE y se centrifugó por 1 minuto a
11000 x g.
Se descargó el filtrado y se colocó la columna sobre el mismo tubo de
colección, se centrifugó a 11000 x g durante 1 minuto para eliminar
completamente el etanol que contiene el regulador PE.
Se colocó la columna en un tubo limpio y, a través de ella, se eluyó el DNA
adicionando 35 mL de agua desionizada estéril en el centro de la columna,
se dejó reposar 1 minuto y se centrifugó a 11000 x g por 1 minuto.
Se cuantificó la concentración de DNA midiendo la absorbencia a 260 nm
de la muestra diluida 1:126 (espectrofotómetro Beckman DU™ 650).
Para la cuantificación de DNA se consideró que 1 unidad de absorbencia a 260 nm es igual
a 50 µg/cm3; así que: 50 X Abs260 = concentración de la muestra de DNA (µg/cm3)
(Becker y col., 1990).
6.11.7. Secuenciación de un fragmento del gen 16S rDNA
Una vez obtenido el DNA de las cepas puras, se realizó la amplificación del 16S rDNA
por PCR, empleando los iniciadores universales 8FLP y 13B (Tabla 8) (Relman D.A., 1993)
para cada una de las cepas, los que generan amplicones de aproximadamente 1400 pb.
La secuenciación de los amplificados de DNA se llevó a cabo en el Laboratorio de Biología
Molecular del Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de México, con
un secuenciador ABI PRISM™DNA SEQUENCER™ modelo 310 de Perkin Elmer, el cual
funciona bajo el principio del método de Sanger (Sanger, 1981; Bohinski, 1998).
Una vez obtenidas las secuencias para cada una de las cepas, se compararon en la base de
datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) con secuencias de bases
conocidas o de referencia en el programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)
(Altschul y col., 1992).
53
6.11.8. Análisis de restricción del 16S rDNA amplificado (ARDRA)
El análisis de restricción de DNA ribosomal amplificado (ARDRA) se basa en la obtención
del 16S rDNA mediante amplificación por PCR utilizando iniciadores universales. El
producto resultante de la amplificación se digiere o se corta con enzimas de restricción y
los fragmentos generados se visualizan y analizan en geles de agarosa o poliacrilamida, los
cuales migran de acuerdo con su peso molecular. Con esta metodología se obtienen
patrones de bandas o “huellas digitales” que son particulares para cada microorganismo y
cada uno presenta diferentes longitudes en sus fragmentos debido a mutaciones en los
sitios de restricción, como inserciones o deleciones y estos fragmentos de restricción de
longitud polimórfica se utilizan para comparación con otros patrones de huella genética
(Liu y col., 1997; Díaz y Wacher, 2003; Ganesh-Babu, 2004).
El proceso fue el siguiente.
Se extrajo el DNA de las cepas G1-2006 y G1-2007.
El DNA obtenido de cada cepa se amplificó con los iniciadores 8FLP y 13B,
que amplificaron un fragmento de 1400 pb del 16S rDNA.
Para cada cepa se purificó el 16S rDNA.
El purificado fue sometido a una digestión con enzimas de restricción
(Mbo1, Alu1 y Eco R1).
Se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida al 17% [19.8 mL de
acrilamida, 7.9 mL de agua desionizada, 7 mL de regulador TBE 5X, 245 µL
de persulfato de amonio (APS) y 12.5 µL de TEMED].
Las condiciones de la electroforesis fueron: voltaje de 300V, corriente de 56
mA y un tiempo de 4 horas.
El gel se observó en un transiluminador acoplado a un documentador de
geles.
Se compararon las bandas características de cada una de las cepas.
La digestión enzimática del 16S rDNA de cada cepa se realizó con una mezcla de dos y tres
enzimas de restricción.
1.- Con dos enzimas de restricción.
Se hizo la mezcla digestora en un tubo de 1.5 mL y estuvo conformada por
1 µL de Alu1, 1 µL de Eco R1, 3 µL de regulador TBE 5X y 7 µL de agua
desionizada.
Fue adicionada a la mezcla el volumen constante (18 µL) del 16S rDNA.
Se incubó el tubo de 1.5 mL por 16 horas a una temperatura de 37 °C.
54
2.- Con tres enzimas de restricción.
En un tubo de 1.5 mL se realizó la mezcla digestora con un volumen final de
12 µL (el volumen está en función del número de enzimas de restricción
empleadas).
La solución digestora estuvo compuesta por 1 µL de Mbo1, 1 µL de Alu1,
1 µL de Eco R1, 3 µL de regulador TBE 5X (Tris 60.55 g, ácido bórico anhidro
30.9 g, Na2EDTA·2H2O 3.7 g y se aforó a 1 L con agua desionizada, el pH de
la solución fue de 8.3) y 6 µL de agua desionizada.
Se completó el volumen a 30 µL con 18 µL del 16S rDNA.
Durante 16 horas fue incubado el tubo de 1.5 mL a una temperatura de
37 °C.
Una vez obtenida la digestión, se preparó el digerido para ser sometido a una
electroforesis.
En un tubo de 1.5 mL se adicionaron 20 µL de producto digerido, más 5 µL
de regulador de carga (0.25% de azul de bromofenol y 0.25% de xilen cianol
en una solución de sacarosa al 50%; la concentración final de esta solución
es de 5X).
Para el marcador de peso molecular se agregaron 5 µL del marcador de
peso molecular y 2 µL de regulador de carga en un tubo de 1.5 mL.
Las preparaciones fueron homogeneizadas por medio de una punta de una
micropipeta por succión y descarga (25 veces).
Se tomó una alícuota de 7 µL y se colocó en el pozo del gel; de igual forma
se procedió con el marcador de peso molecular.
55
6.11.9. Análisis del DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD)
El análisis del DNA polimórfico amplificado al azar (RAPD) o también conocido como PCR
arbitrariamente iniciada (APPCR), es la técnica que ha tenido éxito en el análisis de
colecciones microbianas, debido a que es muy rápida y sencilla. El DNA extraído de los
microorganismos es amplificado en diversas regiones al azar y los iniciadores se
seleccionan arbitrariamente, por lo que no es necesario conocer las secuencias del DNA
de los microorganismos. Por lo general, se emplean temperaturas de alineación bajas, de
manera que se obtengan productos de PCR que permitan el alineamiento de los
iniciadores a pesar de que existan una o dos bases que no coincidan. Para la separación,
se realiza una electroforesis en gel de agarosa y se obtienen patrones únicos de
fragmentos de DNA de diferentes tamaños (Fell, 1993; Cocconcelli y col. 1997; Díaz y
Wacher, 2003).
El protocolo fue el siguiente.
A las cepas G1-2006 y G1-2007, se les extrajo el DNA.
Se utilizaron los iniciadores 1283 y 1290 (Tabla 9) (Madico y col., 1995;
Chávez y col., 2005).
A 4 µL de las muestras amplificadas, en tubos de 1.5 mL, se les adicionó 1
µL de regulador de carga TBE 1X y, para el marcador de peso molecular, se
agregó en un tubo de 1.5 mL una mezcla de regulador de carga TBE 1X
(4 µL) y el marcador de peso molecular (1 µL).
Se hizo una electroforesis en gel de agarosa al 1% con las siguientes
características: voltaje 80 V, corriente 40 mA y tiempo 1 hora.
Finalizado el tiempo de corrida el gel se observó en un transiluminador
acoplado a un documentador de geles.
56
6.11.10. Extracción de plásmidos
La presencia de DNA plasmídico o plásmidos en las bacterias se relaciona con algunas
funciones metabólicas que realizan los microorganismos; debido a sus características o
por las tareas que desempeñan, a los plásmidos se les considera generalmente benéficos.
Para la extracción de plásmidos de las cepas G1-2006 y G1-2007 se aplicó la técnica de lisis
alcalina (Birnboim y Doly., 1979), de acuerdo con el siguiente protocolo:
Se sembraron las cepas en condiciones anaeróbicas en medio de cultivo
Luria Bertani (Triptona 10 g/L, extracto de levadura 5 g/L y NaCl 5 g/L;
solución a pH 7) y se incubaron a 37 °C, hasta obtener turbiedad, la cual
apareció, aproximadamente en 120 h.
Se recuperaron las células por centrifugación en tubos de 1.5 mL.
Se lavaron los paquetes celulares con agua desionizada y se centrifugaron a
11000 x g durante tres minutos.
Se desecharon los sobrenadantes y se adicionaron 100 L de solución de
lisozima a cada uno de los tubos.
Se resuspendió la silución de los tubos agitando en vórtex por 1 minuto.
Se incubaron a 4 °C por 30 minutos.
Se agregaron 200 L de SDS (duodecil sulfato de sodio) a cada uno de los
tubos y se mezcló por inversión.
Se incubaron a 4 °C por 5 minutos.
Se añadieron 150 L de acetato de sodio 3M y se mezclaron los tubos por
inversión.
Se incubaron a 4 °C por 60 minutos.
Se centrifugaron a 11000 x g por 5 minutos.
Los sobrenadantes se transfirieron a otros tubos de 1.5 mL y se adicionaron
1000 L de etanol frio.
Se incubaron a 4 °C por 30 minutos.
Se centrifugaron a 11000 x g por 30 minutos.
Se transfirieron los sobrenadantes a otros tubos de 1.5 mL y se adicionaron
100 L de acetato de sodio 1M y tris 0.05M a pH8.
Se precipitó el DNA adicionando 300 L de etanol frio.
Se eliminaron los sobrenadantes y se agregaron a cada tubo 10 L de
solución amortiguadora 5X (sacarosa al 25%, acetato de sodio 5mM, azul
de bromofenol al 0.05% y SDS al 0.1%).
A cada tubo se le adicionaron 3 L de RNAsa (400 U/mg).
Se incubaron los tubos a 60 °C por 10 minutos.
57
Se mantuvo el DNA plasmídico a -20 °C.
Posteriormente se aplicaron, aproximadamente, 10 L de cada muestra
obtenida en los pozos de los geles de agarosa al 0.7% para el análisis por
electroforesis.
Simultáneamente se probó un Kit de extracción de plásmidos (StrataPrep™ Plasmid
Miniprep Kit de Stratagene™) y el protocolo fue el siguiente.
Se sembraron las cepas en condiciones anaeróbicas en medio de cultivo
Luria Bertani y se incubaron a 37 °C, hasta obtener turbiedad, la cual
apareció, aproximadamente en 120h.
Se recuperaron las células por centrifugación en tubos de 1.5 mL.
Se lavaron los paquetes celulares con agua desionizada y se centrifugaron a
11000 x g por 1 minuto.
Se adicionaron 100 µL de la solución 1 al tubo de 1.5 mL y se resuspendió
por 1 minuto en vortex.
Se agregaron 100 µL de la solución 2 y se mezcló invirtiendo el tubo de 1.5
mL 25 veces.
Se adicionaron 125 µL de la solución 3 y se homogeneizó invirtiendo el tubo
25 veces.
Se centrifugó a 11000 x g durante 5 minutos (el sobrenadante formado
contiene el DNA plasmídico).
Se transfirió el sobrenadante con una micropipeta, aproximadamente 325
µL, y se descargó al centro del tubo columna de 2 mL.
Se centrifugó a 11000 x g por 1 minuto (el DNA plasmídico se retuvo en la
columna, ya que esta presenta una capacidad de retención de
aproximadamente 20 µg).
Se desechó el filtrado y se volvió a ocupar el tubo columna.
Se adicionaron 750 µL de buffer nucleasa al tubo columna y se centrifugó a
11000 x g durante 1 minuto.
Se desechó el filtrado y nuevamente se centrifugó a 11000 x g por 1
minuto.
Se eliminó el filtrado del tubo columna.
Se preparó la solución buffer de lavado 1 X con etanol al 100% en
proporción 1:1.
Se adicionaron 750 µL de buffer de lavado a la columna y se centrifugó a
11000 x g durante 1 minuto.
58
Nuevamente, se centrifugó a 11000 x g por 1 minuto para eliminar el buffer
de lavado.
Se retiró la columna del tubo y se colocó en un nuevo tubo de 1.5 mL.
Se eluyó el DNA plasmídico con 50 µL de buffer.
El tubo se conservó a temperatura ambiente por 5 minutos y se centrifugó
a 11000 x g durante 1 minuto.
Se almacenó el DNA plasmídico a -20 °C.
El análisis electroforético se llevó a cabo en un gel de agarosa al 0.7%.
Para la visualización del DNA plasmídico, se realizó una electroforesis en gel al 0.7%
utilizando detergentes y el procedimiento fue el siguiente.
Se preparó un gel de agarosa al 0.7% con regulador TBE 0.5X.
Se preparó el marcador de peso molecular (LAMBDA DNA HIND III DIGEST
AQUEOUS) en un tubo de 1.5 mL, adicionando 0.5 µL del marcador, 2 µL de
regulador (gel loading solution) y 4.5 µL de agua bidestilada.
La solución contenida en el tubo de 1.5 mL se calentó en un termoblock
(Boekel Scientific) a 65 °C por 5 minutos e inmediatamente se colocó en
baño de hielo.
Para preparar la muestra (DNA plasmídico de las cepas G1-2006 y
G1-2007), a un tubo de 1.5 mL se le adicionaron 5 µL de muestra (DNA
plasmídico) y 2 µL de regulador (gel loading solution).
Se colocó en cada pozo del gel de agarosa al 0.7%, el marcador de peso
molecular y las muestras.
A la cámara electroforética se le aplicó un voltaje de 40 V, una corriente de
20 mA y un tiempo de 12 horas.
Finalizado el tiempo de corrimiento el gel se reveló en una solución de
bromuro de etidio durante 30 minutos.
Una vez transcurrido el tiempo de revelado, el gel se observó en un
transiluminador acoplado a un documentador de geles.
El marcador de peso molecular evidenció 8 bandas y cada una tiene un
valor de 125, 564, 2027, 2322, 4361, 6557, 9416 y 23130 pb.
59
6.12. Medición de la velocidad de corrosión
En la técnica gravimétrica y en las pruebas electroquímicas se empleó una celda
electroquímica (Figura 7) con las mismas características (volumen nominal de 1 L) que
para la selección del medio de cultivo, lo único que varió fue el medio de cultivo y la
procedencia del inóculo, ya que aquí se emplearon 900 mL de medio de cultivo
seleccionado (Postgate C) y 5 mL de inóculo de un cultivo de 360 h de propagación en
medio de cultivo Postgate C y de igual manera se conservó por 720 h en condiciones
anaeróbicas.
Figura 7. Esquema de la celda utilizada en las técnicas electroquímicas.
Se empleó una celda de volumen nominal de 1000 mL (Figura 7) que cuenta con cinco
entradas y una horadación; estas son empleadas para soportar a cada uno de los
siguientes elementos: un electrodo auxiliar (electrodo de grafito) inmerso dentro de un
capilar de Luggin (conteniendo una solución saturada de cloruro de potasio), un electrodo
de referencia (electrodo saturado de calomel), un electrodo de trabajo (cupón de acero al
carbón API XL 52), un difusor de nitrógeno (cuenta con un extractor de gases) y un
electrodo de pH; así como el orificio para inyección y toma de muestra. Toda esta
estructura (celda electroquímica) provee al sistema de condiciones de presión,
temperatura, esterilidad, hermeticidad y anaerobiosis para el crecimiento de las cepas.
60
6.12.1. Técnica gravimétrica
En los últimos años se han implementado e incorporado nuevas técnicas para la
evaluación de la corrosión, sin embargo, el método para la determinación que ha
perdurado por su sencillez y bajo costo es el método gravimétrico.
El procedimiento descrito por la NACE (RP0775-2005), el recomendado por la ASTM
(G 01-03 y 31-72) y el establecido por PEMEX (NRF-005-PEMEX-2000), se fundamentan en
el cálculo de la pérdida de peso de cupones metálicos debido a la corrosión. De tal forma
que para conocer la velocidad de corrosión por la técnica gravimétrica se hizo lo siguiente:
Con la finalidad de obtener una superficie homogénea se pulió el cupón de
acero al carbón API XL 52 hasta lija No. 600 (papel de carburo de silicio).
El cupón se limpió con agua y detergente (en polvo) y se enjuagó con agua
desionizada.
El cupón fue desengrasado con acetona por 5 minutos en un sonicador.
Se enrolló el cupón en papel inhibidor (Protek Wrap™ de DAUBERT VCI,
INC.) y se mantuvo en un desecador por 24 horas.
Se registró el peso y área del cupón.
Durante 720 h, se expuso el cupón al medio de cultivo Postgate C y a la
cepa G1-2007.
Finalizado el tiempo, se retiró el cupón embebido en el medio de cultivo.
Se limpió el cupón con ácido inhibido (HCl 100mL/L, SbO3 2g/L y SnCl2 5g/L),
para eliminar la biopelícula y los productos de corrosión formados durante
el tiempo de exposición.
Se colocó inmediatamente el cupón en una solución saturada de
bicarbonato de sodio para neutralizar al ácido inhibido.
Se enjuagó el cupón con agua desionizada para eliminar los productos
neutralizados, se secó con papel adsorbente libre de pelusas y se le dio una
ligera frotada con acetona.
Se enrolló el cupón en papel inhibidor y se mantuvo en un desecador
durante 24 horas.
Nuevamente, se determinó el peso del cupón.
Se determinó la velocidad de corrosión del cupón.
61
Al mismo tiempo, un cupón de acero al carbón API XL 52 fue sometido a un sistema
electrolítico, el cual fungió como blanco del sistema en estudio.
Para conocer la velocidad de corrosión de los cupones de acero al carbón API XL 52 se
empleó la siguiente ecuación:
Donde:
Vcorr = velocidad de corrosión en mpy.
K = factor de velocidad de corrosión, es de 2.227x104 (NACE RP0775-2005)
W = pérdida de peso del material en gramos.
A = área expuesta del material en pulgada cuadradas.
T = tiempo de exposición en días.
D = densidad del material (7.86 g/cm3).
Existen diferentes unidades que han sido usadas para reportar los resultados de pérdida
de peso, como son milímetros por año (mm/y) o milésimas de pulgada de penetración por
año (mpy), pero normalmente se expresa en milésimas de pulgada de penetración por año
(mpy).
62
6.12.2. Resistencia a la polarización (Rp)
El criterio usado por la NACE (TM0169-2000) y por la ASTM (G 59-91) se basa en la
creación de curvas de polarización y éstas a su vez forman pendientes, las cuales están
relacionadas con la velocidad de corrosión.
Tomando en consideración las recomendaciones (NACE, ASTM y PEMEX) se realizó lo
siguiente:
Se verificó el buen funcionamiento del potenciostato (marca Solartron,
modelo SI 1280B) con ayuda de un estándar (Dummy cell).
Se conectaron las terminales correspondientes a los electrodos de
trabajo (cupón de acero al carbón API XL 52), de referencia (ESC) y al
auxiliar (grafito).
El software utilizado para la adquisición de datos fue el CorrWare™.
Fue empleado el método potenciodinámico para obtener la relación E-i
(potencial y densidad de corriente).
Se obtuvo la relación E-i aplicando un sobrepotencial de -10 a 10 mV
con respecto al potencial de corrosión, con una velocidad de barrido de
10 mV/min.
Se registraron 350 puntos por sesión.
Las mediciones fueron hechas cada 24 h por un lapso de 720 h.
Con ayuda del programa CorrView™ fueron visualizados y analizados los
datos electroquímicos.
63
6.12.3. Espectroscopía de Impedancia Electroquímica (EIE)
Debido a que en un proceso electroquímico se puede deducir el comportamiento de la
interfase metal-solución, la EIE ofrece mayor información del fenómeno de corrosión. El
siguiente protocolo se basa en el principio establecido por la NACE (1989) y por la ASTM
(G 106).
Para obtener información del desarrollo del proceso en la celda electroquímica se hizo lo
siguiente:
Con ayuda de un estándar (Dummy cell) se confirmó el funcionamiento del
potenciostato (marca Solartron, modelo SI 1280B).
Se conectaron las terminales correspondientes a los electrodos de trabajo
(cupón de acero al carbón API XL 52), de referencia (ESC) y al auxiliar
(grafito).
Empleando el software ZPlot™ se obtuvieron valores electroquímicos.
Fueron realizados los diagramas de impedancia al potencial de corrosión
(Ecorr).
Se utilizó una amplitud en la señal sinusoidal de -10 a 10 mV con respecto
al Ecorr.
El intervalo de frecuencia utilizado fue de 10 KHz a 0.01 Hz.
Se registraron 61 puntos por sesión.
Las condiciones experimentales fueron a temperatura de 37 °C y a presión
ambiental.
Las determinaciones se realizaron cada 24 h por 720 h.
El programa utilizado para la visualización, análisis y modelación de datos
electroquímicos fue el ZView™.
64
6.13. Análisis de las superficies metálicas
Hoy en día, la microscopia electrónica es una herramienta fundamental en muchas de las
investigaciones, científicas, ya que su principal objetivo es conocer la microestructura de
cualquier material (Yacamán y Reyes, 1995).
Por la naturaleza de las muestras tratadas en esta investigación se decidió utilizar el
microscopio electrónico de barrido (MEB). Este tipo de microscopio produce imágenes
con electrones, con radiaciones emitidas o reflejadas por el espécimen del mismo lado
que recibe el haz electrónico, de manera que generalmente se observa una superficie de
un objeto opaco al haz (Vazquez-Nin y Echeverría, 2000).
Para la obtención de imágenes características relacionadas con el estudio electroquímico
se emplearon dos diferentes tipos de microscopio electrónico, siendo el primero de
barrido y el segundo de barrido ambiental (MEBA); la diferencia significativa que existe
entre los dos microscopios es que en el primero se introducen muestras secas mientras
que en el segundo se pueden colocar muestras húmedas; ya que el MEBA permite
controlar su cámara ambiental. Por tal razón, no es necesario dar un tratamiento a las
muestras para poder ser visualizadas en el microscopio.
Los cupones de acero al carbón API XL 52 que fueron sometidos al análisis electroquímico
fueron observados en el MEBA antes y después de cada ensayo electroquímico; mientras
que los cupones de acero al carbón API XL 52 que sustentaron las determinaciones
restantes fueron visualizados en el MEB.
Se utilizó un MEBA marca Philips™ Electronic Instruments modelo A XL 30 equipado con
un controlador de cámara ambiental. Las observaciones se realizaron al vacio, con una
aceleración de voltaje de 25 kV y un límite de resolución de 3.5 nm.
El MEB empleado es de la marca JEOL, modelo JSM-58000 LV, con una aceleración de
voltaje de 15 kV.
El procedimiento utilizado en el MEB se segmentó en dos fases (Bozzola y Russell, 1999).
65
1.- Antes de la prueba
Los cupones de acero al carbón API XL 52 previamente pulidos, limpiados y
desengrasados, fueron sujetados con cinta adhesiva conductora (carbón)
en un porta espécimen metálico y observados en el MEB.
Se tomaron micrografías a diferentes magnitudes.
2.- Después de la prueba
Se retiró el cupón de acero al carbón API XL 52 del ampovial de sacrificio e
inmediatamente se sumergió en la primera solución fijadora durante dos
horas a 4 °C.
La solución fijadora fue glutaraldehído al 2.5% (10 mL de glutaraldehído al
25%, 90 mL de solución amortiguadora de fosfatos y 0.5 mL de CaCl2 al 1%
[1 g de CaCl2 en 100 mL de agua desionizada]).
La solución amortiguadora de fosfatos que se utilizó es la solución
reguladora de Sörensen y se preparó con 405 mL de solución A (Na2HPO4
28.4 g/L) y 95 mL de solución B (NaH2PO4·H2O 27.6 g/L); posteriormente se
aforó a 1 L con agua desionizada.
Transcurrido el tiempo de la primera fijación se realizaron a 4 °C tres
lavados de 10 minutos cada uno con una solución lavadora para eliminar el
exceso de gluteraldehído.
La composición de la solución lavadora en 100 mL fue: 100 mL de solución
amortiguadora de fosfatos, 10 g de sacarosa y 0.5 mL de CaCl2 al 1% (1 g de
CaCl2 en 100 mL de agua desionizada).
Se realizó una segunda fijación con tetraóxido de osmio al 1% por 2 horas a
4 °C.
La postfijación se lleva a cabo con una solución de tetraóxido de osmio al
1% (1 ampolleta de OsO4 de 1 g en 100 mL de agua desionizada).
Finalizado el tiempo de la segunda fijación, se hicieron tres lavados a 4 °C
de 10 minutos cada uno con la solución lavadora para eliminar el exceso del
tetraóxido de osmio.
A los cupones se les realizó un tren de deshidratación con alcohol etílico a
diferentes concentraciones (del 10 al 90%). La corrida consistió en
conservar los cupones en cada una de las concentraciones por 10 minutos a
4 °C.
66
Para completar la deshidratación, se realizó una serie de tres pasos; cada
paso estuvo conformado de una deshidratación con alcohol etílico al 100%
durante 30 minutos a 4 °C.
Para eliminar el alcohol etílico, se realizó un secado al punto crítico de los
cupones con CO2 (licuefacción del CO2), ya alcanzadas las condiciones de
temperatura (-120 °C) y presión (1800 psi) se mantuvo en el secador
(secadora de punto crítico Marca tousimis research corporation modelo
Samdri™-780B™) por 40 minutos.
A los cupones se les recubrió con una capa de oro en una ionizadora de
metales marca Denton Vacuum modelo Desk II.
Con mucho cuidado se evitó desprender la película de oro y se montaron
los cupones en el porta espécimen metálico con ayuda de una cinta
adhesiva conductora (carbón).
Se distinguieron diferentes características presentes en los cupones y se
tomaron micrografías a diferentes aumentos.
67
6.14. Determinación del crecimiento de las bacterias planctónicas y sésiles
Las condiciones que se generan en el gasoducto permiten el desarrollo bacteriano, por lo
cual se origina una biopelícula sobre la superficie del metal base y, como es bien sabido, la
biocorrosión es dominada por la biopelícula generada por las bacterias. En la corrosión
inducida por microorganismos, a las bacterias adheridas al metal se les denomina
bacterias sésiles, mientras que las bacterias que se encuentran en el seno del líquido se
conocen como bacterias planctónicas. Siguiendo las recomendaciones establecidas por la
NACE (TM0194-2004) se pudo cuantificar la población bacteriana, tanto sésil como
planctónica. El siguiente protocolo de estimación bacteriana se realizó cada 72 horas
durante 720 h (Figura 8).
Figura 8. Dibujo emblemático de la elaboración de los ampoviales.
68
6.14.1. Bacterias planctónicas
Se retiró un ampovial de sacrificio de la incubadora a 37 °C.
El ampovial fue homogeneizado.
En los pasos subsecuentes se trabajó en condiciones de asepsia.
Con una jeringa estéril de 3 mL, previamente purgada con nitrógeno estéril
(filtro de 0.2µm), se tomó 1 mL del ampovial de sacrificio.
El mililitro fue inoculado en un ampovial de 10 mL de volumen nominal con
9 mL de medio de cultivo Postgate C.
Se siguió la técnica del número más probable con 3 series de 10 ampoviales
y en cada transferencia se ocupó una jeringa estéril previamente purgada
con nitrógeno estéril.
Con ayuda de las tablas de la US FDA/CFSAN-BAM se determinó el NMP de
bacterias planctónicas/mL.
6.14.2. Bacterias sésiles
Un ampovial con 9 mL de medio de cultivo Postgate C fue sometido por 5
minutos al proceso de desgasificación en un baño ultrasónico.
De aquí en adelante, se realizó el proceso en condiciones de asepsia.
Se retiró el cupón de acero al carbón API XL 52 del ampovial de sacrificio
que se extrajo 1 mL para la determinación de bacterias planctónicas.
El cupón se introdujo inmediatamente en el ampovial desgasificado y
sometido a un baño ultrasónico por intervalos uno a uno de sonicación-
descanso durante tres minutos para remover las bacterias adheridas al
cupón.
Con una jeringa estéril de 3 mL se tomó una alícuota (1 mL) de la
suspensión resultante de la ultrasonicación.
Se inoculó el mililitro en un ampovial de 10 mL de volumen nominal con 9
mL de medio de cultivo Postgate C.
Fue utilizada la técnica del número más probable con 3 series de 10
ampoviales, ocupando en cada transferencia una jeringa estéril
previamente purgada con nitrógeno estéril.
Mediante las tablas de la US FDA/CFSAN-BAM se determinó el NMP de
bacterias sésiles/pulgada2.
69
6.15. Determinación de la concentración celular
Se cuantificó la biomasa producida por la bacteria, tanto por peso seco como por
turbiedad.
6.15.1. Por peso seco:
Se utilizaron membranas de fibra de vidrio con diámetro de poro de 0.7 µm
(GF/F marca Whatman™), las cuales fueron secadas hasta peso constante,
en una estufa a 98 °C.
Se registró el peso de cada membrana en una balanza analítica con poder
de resolución de 0.0001 g (marca OHAUS).
Se filtraron 20 mL del sistema electroquímico (medio de cultivo-bacteria-
cupón de acero al carbón API XL 52), previamente filtrado con membranas
GF/A (diámetro de poro de 1.2 µm).
Se dejó secar la membrana durante 24 h a 98 °C.
Transcurrido el tiempo de secado se volvió a pesar la membrana.
Se consideró la diferencia de peso y el volumen filtrado y se obtuvo la
concentración de la biomasa.
6.15.2. Por turbiedad:
Se empleó un espectrofotómetro (Spectronic 20 de Milton Roy Company).
Se calibró el equipo a cero de absorbencia con el medio de cultivo Postgate
C.
Se tomaron 5 mL del ampovial filtrado en membranas GF/A.
Se leyó la absorbencia de la muestra a 600 nm.
Cuando se presentaron valores de absorbencia mayores de 0.3 la
suspensión celular se diluyó con agua desionizada, ya que la curva de
calibración es lineal solo a valores inferiores a éste.
Considerando las diluciones se calculó la densidad óptica a 600 nm.
70
6.16. Determinación de ácidos orgánicos por cromatografía de gases (GC).
La cromatografía de gases tiene dos importantes campos de aplicación, por una parte
sirve para separar mezclas orgánicas complejas, compuestos organometálicos y sistemas
bioquímicos. Su otra aplicación es como método para determinar cuantitativamente y
cualitativamente los componentes de la muestra. Para el análisis cualitativo se suele
emplear el tiempo de retención, que es único para cada compuesto dadas determinadas
condiciones (mismo gas portador, rampa de temperatura y flujo), o el volumen de
retención. En aplicaciones cuantitativas, integrando las áreas de cada compuesto o
midiendo su altura, y utilizando los estándares adecuados se obtiene la concentración o
cantidad presente de cada analito (Skoog y Leary, 1994).
Mediante la cromatografía de gases se determinó la presencia y concentración de los
ácidos orgánicos: acético, butírico, fórmico y láctico, por ser los metabolitos
característicos del genero Clostridium al que pertenece la bacteria esporulada aislada.
Para llevar a cabo la extracción de ácidos orgánicos presentes en el medio de cultivo de la
cepa G1-2007, se requirió un disolvente soluble en compuestos orgánicos y el más
adecuado fue el acetato de etilo, por lo que se utilizó como agente extractor.
Fue importante conocer el punto de ebullición ( 77 °C) del agente extractor (acetato de
etilo/CH3COOCH2CH3/C4H8O2), así como de los estándares empleados para la realización
de la curva tipo, ácido acético (CH3COOH/C2H4O2) con punto de ebullición de 118 °C, ácido
butírico (CH3CH2CH2COOH/C4H8O2) con punto de ebullición de 164 °C, ácido fórmico
(HCOOH/CH2O2) con punto de ebullición de 101 °C y ácido propiónico
(CH3CH2COOH/C3H6O2) con punto de ebullición 141 °C. El punto de ebullición es una
variable importante, ya que de él va a depender el grado de separación de los diferentes
componentes de la muestra. Todos los estándares empleados son ChemService Inc., con
una pureza del 99% y el acetato de etilo es J.T. Baker grado cromatográfico.
Como se puede ver en el párrafo anterior, los analitos (ácidos) muestran diferentes puntos
de ebullición y para que se pueda observar la elución de todos los componentes de la
muestra, es necesario ajustar adecuadamente la temperatura de corrida. Debido a esto
se ajusta la temperatura en forma gradual, ya que mediante el gradiente de temperatura,
se permitirá la separación de cada componente y a esto se le llama rampa de
temperatura. Cabe mencionar que a temperaturas muy altas la velocidad de elución es
más alta pero se corre el riesgo de descomponer los analitos.
71
Por las características requeridas en esta determinación (polaridad de la muestra), se
empleó una columna capilar (de alto desempeño) polar, siendo la fase estacionaria
(composición de la columna) polietilenglicol, el cual es muy útil para separar compuestos
polares y de esta forma evidenciar los ácidos orgánicos producidos por la cepa. La
columna empleada es de la marca Hewlett Packard™ (HP™) y el modelo HP-INNOWax. Las
propiedades físicas de la columna fueron: 30 m de longitud, diámetro interno de 0.53 mm,
espesor del recubrimiento de la película de 1 µm; cabe mencionar que este tipo y modelo
de columna es eficaz para determinar alcoholes, ácidos libres, aromáticos y aceites
esenciales.
Se utilizó un cromatógrafo de gases marca Perkin Elmer™ modelo AutoSystem XL
acoplado a un carrusel automuestreador, equipado con un detector de ionización de
flama (FID), un sistema de interfase PE™ Nelson modelo NCI 900 y un integrador de datos
(software) Turbo crom™ versión 4.1.
El gas portador usado fue el nitrógeno de ultra alta pureza de la marca PRAXAIR™ con una
presión 10 psi y un flujo de 30 mL/min.
Para el análisis de las muestras por cromatografía de gases se procedió en la forma
siguiente:
Del ampovial de sacrificio empleado para la determinación de la
concentración celular, se tomó una alícuota (2 mL) del filtrado con
membranas de fibra de vidrio GF/F.
En un embudo de separación se colocaron los 2 mL junto con 2 mL de
acetato de etilo, se agitó por 5 veces y se expulsó el gas formado; se siguió
agitando 25 veces más, se dejó reposar por 2 minutos y se desecho la fase
inorgánica.
A la fase orgánica (acetato de etilo + ácidos orgánicos), se le adicionaron
otros 2 mL de acetato de etilo, se agitó por 5 veces y se expulsó el gas
formado; se continuó agitando 25 veces más, se permitió la formación de
las fases y se eliminó la fase inorgánica. Con el propósito de saturar y
permitir la adición de ácidos orgánicos al agente extractor este paso se
repitió dos veces.
El extracto final fue depositado en dos tubos de 1.5 mL.
Se centrifugaron los dos tubos a 11000 x g por cinco minutos.
La suspensión obtenida fue decantada y colectada en otros dos tubos de
1.5 mL.
Los tubos fueron sellados con papel parafilm para evitar la volatilización de
los componentes.
72
Los tubos se mantuvieron en refrigeración (4 °C) hasta su análisis por CG.
El cromatógrafo y la columna capilar fueron acondicionados por 12 horas.
Finalizado el acondicionamiento del equipo, las muestras se sacaron del
refrigerador y se atemperaron por 1 hora.
Las muestras fueron transferidas a tubos portamuestras, se sellaron y se
colocaron en el carrusel.
Para la reproducibilidad de los datos, se empleó el automuestreador, el
cual inyectó 1 µL de cada muestra.
La temperatura del inyector fue de 160 °C, con la finalidad de preparar a la
muestra, la cual va a entrar a la columna.
La muestra entró a la columna a una temperatura de 50 °C por 2 minutos
seguido de una velocidad de incremento en la temperatura de 5 °C/minuto
hasta alcanzar una temperatura de 180 °C.
Conforme se separaron los analitos el detector FID los registró.
El integrador permitió visualizar los espectros cromatográficos
característicos de la muestra y de los estándares.
Con ayuda del software se pudo comparar los espectros de las muestra y de
los estándares.
Se consideró el tiempo de elución y el área de cada analito para la
realización de las curvas tipo y de esta forma se pudo determinar la
concentración de cada analito.
73
6.17. Cupón de referencia adicionado de ácidos orgánicos
En las determinaciones en donde se expuso el cupón de acero al carbón API XL 52 a la
acción de la cepa G1-2007, se observó corrosión de la estructura metálica, por lo que se
pretendió averiguar si los ácidos orgánicos en el seno del liquido producidos por la
bacteria contribuyen al daño del metal.
Para hacer evidente la corrosión por acidez se hizo lo siguiente.
De los datos generados de la determinación de ácidos orgánicos por
cromatografía de gases, se consideró la mayor concentración de ácidos
orgánicos formados por la cepa G1-2007.
Con base en estos resultados, se tomó un cupón de acero al carbón API XL
52, previamente pulido a lija 600, limpio, desengrasado, a peso constante y
dimensionado; y fue introducido en un ampovial de sacrificio con medio de
cultivo Postgate C.
Al ampovial de sacrificio se le adicionó ácido acético para dar una
concentración de 18 ppm y ácido butírico para dar una concentración de 24
ppm.
El ampovial fue homogeneizado con 25 movimientos circulares.
El ampovial fue incubado durante 720 h a 37 °C (Figura 9).
Finalizado el tiempo de incubación, se retiró el cupón del ampovial de
sacrificio, se limpió con acido inhibido y se neutralizó con bicarbonato de
sodio.
Se enjuagó el cupón con agua desionizada, se secó y se desengrasó con
acetona.
Se enrolló el cupón en papel inhibidor y se mantuvo a peso constante por
24 horas.
Se registró el peso y se calculó la velocidad de corrosión inducida por
acidez.
El daño causado o el desgaste generado se visualizó por microscopía
electrónica de barrido.
En forma paralela se desarrolló un cupón de referencia al que no se le
adicionaron ácidos orgánicos.
74
Figura 9. Sistema de anaerobiosis para incubar los cupones de referencia y los
cupones de referencia adicionados de ácido acético y ácido butírico.
75
CAPÍTULO 7
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
76
7. Resultados y Discusión
7.1. Identificación de los microorganismos aislados de un gasoducto
7.1.2. Observación microscópica de las cepas G1-2006 y G1-2007
La identificación de las bacterias esporuladas aisladas del mismo sitio de un gasoducto con
un año de separación se inició con la observación microscópica por contraste de fases
(100 x).
La morfología microscópica mostró que los microorganismos son bacilos esporulados
(Figura 10), sin embargo, esta observación directa no permitió diferenciar las
características de ambas cepas.
Figura 10. Morfología microscópica de las bacterias aisladas (A) de la cepa
G1-2006 y (B) de la cepa G1-2007.
A
B
77
Con los frotes realizados a las cepas G1-2006 y G1-2007 se pudo definir que ambas
corresponden a bacilos esporulados Gram positivos.
Se verificó con la prueba de aerotolerancia que las cepas G1-2006 y G1-2007 requieren
condiciones especiales de cultivo, ya que en condiciones de aerobiosis no hay crecimiento;
sin embargo, cuando se trabajó en condiciones de anaerobiosis el crecimiento fue bueno;
por lo que se deduce que las bacterias son anaerobios estrictos.
7.1.3. Identificación de las cepas mediante ensayos bioquímicos
Con el uso de un sistema bioquímico convencional, es posible (Tabla 7) apreciar las
características diferenciales de las cepas G1-2006 y G1-2007 y con ayuda de la cepa de
referencia se puede identificar a las bacterias.
Tabla 7. Pruebas bioquímicas para identificación de bacterias. Fermentación de
carbohidratos.
Fermentación de carbohidratos
Cepa de referencia ENCB 1040
G1-2006 G1-2007
Adonitol - + +
Almidón - - -
Arabinosa - + +
Celobiosa - - -
Dulcitol - - -
Esculina - + +
Fructosa - + +
Galactosa - + +
Glicerol - - -
Glucosa - + +
Inulina - - -
Lactosa - + +
Maltosa - + +
Manitol - + +
Manosa - + +
Melibiosa - + +
Rafinosa - + +
Ramnosa - + +
Ribosa - + +
Sorbitol - - -
Trehalosa - + +
Xilosa - + +
78
Tabla 8. Pruebas enzimáticas para identificación de bacterias.
Actividad enzimática
Cepa de referencia ENCB 1040
G1-2006 G1-2007
Catalasa - - -
Lecitinasa - - -
Digestión de la carne cocida
+ - -
Digestión y coágulo de la leche
+ + +
Hidrólisis de la caseína
+ - -
Licuefacción de la gelatina
+ + +
Lipasa - - -
Producción de indol - + +
Reducción de nitratos
- - -
Ureasa - - -
Con los resultados anteriores, se pudo conocer el perfil bioquímico (Tabla 7) y el perfil
enzimático (Tabla 8), lo que permitió identificar a las bacterias usando la base de datos de
los manuales de anaerobios obligados y Bergey, así como en los libros de diagnóstico
microbiológico, en donde se puede apreciar el comportamiento de cada género y especie.
Las dos cepas ensayadas mostraron el mismo perfil bioquímico y enzimático, entre sí, y
diferente al de la cepa de referencia. De acuerdo con los resultados éstas se pudieron
clasificar como:
Identificación Cepa de referencia ENCB 1040
G1-2006 G1-2007
Especie Clostridium subterminale
Clostridium celerecrescens
Clostridium celerecrescens
Al finalizar el análisis bioquímico fue revelada la información del tipo de cepa de
referencia utilizada en el ensayo bioquímico, la cual es una cepa de colección, identificada
como ATCC® 29748™.
79
Aparentemente, la cepa G1-2007 es la misma que se aisló un año antes en el mismo
gasoducto, sin embargo, es necesario confirmar su identidad mediante el análisis de su
material genético, es decir, recurrir a técnicas moleculares.
7.1.4. Identificación de las cepas empleando técnicas moleculares
7.1.4.1. Aislamiento de DNA.
Debido a las condiciones de crecimiento de las cepas, fue un requisito demostrar la
extracción del DNA, ya que los productos de corrosión y las sustancias poliméricas
extracelulares formadas durante el proceso de biocorrosión (Geesey, 2000) suelen ser un
factor determinante en la obtención de DNA, por tal motivo, se verificó la extracción de
DNA de las cepas G1-2006 y G1-2007.
En la Figura 11 se muestra la fotografía del electroferograma del DNA sometido a
electroforesis en gel de agarosa. Las bandas reveladas son nítidas demostrando que el
método de extracción (lisis química con la adición de lisozima) de DNA fue adecuado para
estas cepas.
Figura 11. Fotografía del electroferograma en gel de agarosa al 1% del DNA
extraído de las cepas.
Carril 1.- DNA de la cepa G1-2006.
Carril 2.- DNA de la cepa G1-2007.
1 2
80
7.1.4.2. Amplificación de un fragmento del 16S rDNA y TGGE
Para evaluar la pureza de las cepas y la similitud entre ellas, se extrajo el DNA de cada
cultivo y se amplificaron fragmentos de DNA de, aproximadamente, 450 pb del 16S rDNA
con los iniciadores U968 y L1401 y se visualizaron por electroforesis en gel de agarosa
(Figura 12). Posteriormente, los fragmentos de DNA se analizaron mediante una
electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TGGE).
El perfil electroforético obtenido (Figura 13) mostró una sola banda con migración similar,
lo que denota que los cultivos están formados por una sola especie y, debido a que la
TGGE es una técnica presuntiva, se puede presumir que se trata del mismo
microorganismo.
Figura 12. Electroferograma en agarosa de los amplicones de 470 pb del 16S rDNA
de los cultivos G1-2006 y G1-2007.
Carril 1.- Marcador de peso molecular (100 bp DNA Ladder).
Carril 2.- Amplicón del DNA del cultivo G1-2006.
Carril 3.- Amplicón del DNA del cultivo G1-2007.
1 2 3
600 pb
470 pb
81
Figura 13. Resultados de la electroforesis en gel con gradiente de temperatura
(TGGE) de un fragmento del 16S rDNA de los cultivos.
Carril 1.- Amplicón del cultivo G1-2006.
Carril 2.- Amplicón del cultivo G1-2007.
La comigración sería un indicador de que la secuencia de bases en el fragmento
amplificado es la misma, ya que, de acuerdo con algunos autores (Maniatias y col., 1982;
Malacinski, 2003) la diferencia en una sola base presentaría un corrimiento distinto. Sin
embargo, se ha observado que amplicones procedentes de diferentes géneros presentan
la misma velocidad de migración; por lo que es necesario recurrir a otras alternativas
como la obtención de la huella digital por análisis de restricción del 16S rDNA.
1 2
470 pb
82
7.1.4.3. Análisis de restricción del 16S rDNA amplificado (ARDRA)
El 16S rDNA de las cepas G1-2006 y G1-2007 se amplificó empleando los iniciadores 8FLP y
13B, seguido de una purificación del DNA amplificado, el cual se sometió a una digestión
enzimática con las enzimas de restricción Alu1, Eco R1 y Mbo1. Finalmente, el DNA
digerido se separó en un gel de poliacrilamida al 17% para obtener una banda o bandas
características de las cepas.
Al comparar las bandas características de cada una de las cepas, se evidencio el patrón
electroforético, el cual fue idéntico para ambas cepas, con las diferentes enzimas de
restricción.
Figura 14. Patrón electroforético del análisis de restricción del 16S rDNA de las
cepas G1-2006 y G1-2007.
Carril 1.- Marcador de peso molecular.
Carril 2.- 16S rDNA de la cepa G1-2006 digerido con Alu1, Eco R1 y Mbo1.
Carril 3.- 16S rDNA de la cepa G1-2007 digerido con Alu1, Eco R1 y Mbo1.
Carril 4.- 16S rDNA de la cepa G1-2006 digerido con Alu1 y Eco R1.
Carril 5.- 16S rDNA de la cepa G1-2007 digerido con Alu1 y Eco R1.
1 2 3 4 5
5
83
Como se puede apreciar (Figura 14), en los dos primeros carriles después del marcador de
peso molecular, se empleó una mezcla de tres enzimas de restricción; de igual manera en
los últimos dos carriles se utilizó una mezcla con dos enzimas de restricción. Estas mezclas
propiciaron un perfil único de identidad para ambas cepas, ya que el ARDRA se basa en la
generación de patrones de bandas, cuyo número y tamaño depende de la presencia o
ausencia de sitios de restricción al interior del gen 16S rDNA (Massol y col., 1997).
Consecuentemente, los resultados obtenidos por el ARDRA, permitieron establecer que se
trata de la misma cepa, ya que el mapa de restricción es el mismo cuando se utilizan los
dos juegos de enzimas de restricción.
84
7.1.4.4. Análisis del DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD)
Una alternativa más para corroborar los resultados encontrados de todo el análisis
molecular es mediante la amplificación inespecífica (RAPD). En este caso se utilizó el DNA
total de la bacteria y se amplificó utilizando iniciadores inespecíficos (1283 y 1290). Para
ambas cepas, el producto generado de la amplificación fue igual, lo que reveló que son de
la misma especie. La electroforesis reflejó una analogía muy específica entre las bandas
obtenidas (Figura 15) de las dos cepas y con este argumento se presume que se trata de la
misma cepa.
Figura 15. Patrón electroforético del RAPD.
Carril 1.- Marcador de peso molecular (100 bp DNA Ladder).
Carril 2.- Cepa G1-2006.
Carril 3.- Cepa G1-2007.
1 2 3
600 pb
85
7.1.4.5. Secuenciación del gen 16S rDNA
Con base en los resultados obtenidos de la TGGE, en donde se observó una sola banda
para cada una de las cepas, se procedió a amplificar el DNA de cada microorganismo con
los iniciadores 8FLP y 13B, obteniéndose amplicones que se purificaron y se sometieron a
una electroforesis en gel de agarosa al 1% para verificar su presencia y pureza.
Figura 16. Electroferograma en gel de agarosa de los amplificados del 16S rDNA de
las cepas.
Carril 1.- Amplicón de la cepa G1-2007.
Carril 2.- Amplicón de la cepa G1-2006.
Carril 3.- Marcador de peso molecular (100 bp DNA Ladder).
Se cuantificó el DNA de ambas cepas espectrofotométricamente, leyendo absorbencia a
260 nm. Para la cepa G1-2006 se tuvo una concentración de DNA de 95 µg/mL y para la
cepa G1-2007 fue de 98 µg DNA/mL.
1 2 3
600 pb
86
Posteriormente, los amplicones de aproximadamente 1400 pb, se secuenciaron en el
Laboratorio de Biología Molecular del Instituto de Biología de la Universidad Autónoma de
México.
Una vez obtenidas las secuencias, se procedió a comparar cada una de estas en la base de
datos del Gen Bank de la NCBI, lo que permitió identificar al microorganismo esporulado
persistente en el gasoducto y posiblemente asociado al proceso de corrosión (Tabla 9).
Tabla 9. Microorganismos identificados por secuenciación de un fragmento del 16S
rDNA.
Cepa Iniciadores Nombre científico Identidad Clave de acceso
G1-2006 8FLP y 13B Clostridium celerecrescens
99 % X71848
G1-2007 8FLP y 13B Clostridium celerecrescens
99 % X71848
Los resultados obtenidos de la secuenciación indicaron que se trata de la misma bacteria,
por lo que se concluye que debido a su residencia y persistencia en los ductos las cepas
G1-2006 y G1-2007 resisten ambientes agresivos.
87
7.1.4.6. Perfil de plásmidos
En lo que se refiere a la determinación de plásmidos, se obtuvo el mismo resultado con las
dos técnicas probadas, lisis alcalina (Figura 17) y kit de extracción de plásmidos (Figura
18). En ambos casos, en las electroforesis en gel de agarosa al 0.7% no se registró
evidencia alguna de la presencia de plásmidos.
Figura 17. Perfil electroforético de la cuantificación de plásmidos mediante la
prueba de lisis alcalina de las cepas G1-2006 y G1-2007.
Carril 1.- Marcador de peso molecular.
Carril 2.- Cepa de referencia.
Carril 3.- Cepa G1-2006.
Carril 4.- Cepa G1-2007.
1 2 3 4
23.1 kpb
2.3 kpb
88
Figura 18. Electroferograma correspondiente a las cepas G1-2006 y G1-2007 con
ayuda del kit para extracción de plásmidos.
Carril 1 y 15.- Marcador de peso molecular.
Carril 2, 3 y 4.-. Cepa G1-2006.
Carril 5, 6 y 7.- Cepa G1-2007.
Carril 9, 10, 11, 12 y 13.- Cepa de referencia.
Con base en los productos obtenidos del corrimiento electroforético, en los que no se
presentó indicio alguno de la presencia de plásmidos, se concluye que toda la información
genética de las cepas G1-2006 y G1-2007 reside en el genoma.
Todos los estudios posteriores se realizaron con la cepa etiquetada como G1-2007 y
referida como Clostridium celerecrescens.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
89
7.2. Cinética de crecimiento, consumo de sulfatos, producción de H2S y de fierro
total
Con el propósito de conocer su comportamiento y establecer un sistema de trabajo
(medio de cultivo más adecuado para su desarrollo) se determinó el consumo de sulfatos,
la producción de H2S y fierro total e indirectamente el crecimiento celular de
C. celerecrescens, expuesto al cupón de acero al carbón API XL 52 y en diferentes medios
de cultivo.
7.2.1. Selección del medio de cultivo para los estudios de corrosión
Cuando se probaron los medios de cultivo API RP 38, Bold basal modificado y el Postgate
C (Figura 19) para el crecimiento de C. celerecrescens en presencia del cupón de acero al
carbón API XL 52, el microorganismo presentó curvas de crecimiento características, en
donde se presentaron las diferentes fases del comportamiento bacteriano y en la fase
exponencial se determinó la velocidad específica de crecimiento máximo (µmáx). En el
medio de cultivo Postgate C se obtuvo una µmáx de 0.0048 h-1, en el medio de cultivo API
RP 38 una µmáx de 0.0037 h-1 y en el medio de cultivo Bold basal modificado una µmáx de
0.0031 h-1. Es importante mencionar que la µmáx se obtuvo a partir de los logaritmos
naturales del número más probable de bacterias por mililitro en cierto período. Con base
en estos resultados, se eligió el medio de cultivo más adecuado para el desarrollo de la
bacteria y éste fue el medio de cultivo Postgate C.
Figura 19. Cinética de crecimiento de C. celerecrescens en diferentes medios de cultivo.
90
Es claro que la µmáx es un respuesta a las variables ambientales, entre éstas, la
composición del medio de cultivo, por lo que resulta lógico que la mayor velocidad
especifica de crecimiento se obtenga en el medio Postgate C, que es un medio rico
adecuado para el crecimiento de bacterias, mientras que el medio API RP 38 es un medio
de sostenimiento y selectivo para un grupo determinado de bacterias (BRS´s = bacterias
reductoras de sulfato); mientras que el de Bold basal es un medio rico para desarrollo de
bacterias, pero al ser modificado, está limitado en sus nutrientes (Balows y col., 1992; Holt
y col., 1994).
En la literatura se han reportado diversas investigaciones en donde hacen uso del medio
de cultivo Postgate C, las cuales están enfocadas al estudio de las bacterias reductoras de
sulfato (Mora y col., 2003; Galván y col., 2003; Duque y col., 2004); sin embargo, hay poca
información para otro tipo de géneros, por lo que resulta inapropiado para este análisis
utilizarlos como punto de referencia o comparación.
El comportamiento obtenido por C. celerecrescens en los tres diferentes medios de cultivo
es muy similar al obtenido en el estudio de bacterias reductoras de sulfato (Mora y col.,
2003; Galván y col., 2003; Duque y col., 2004). En esas investigaciones consideran el uso
de cepas de referencia, que por lo general es Escherichia coli, la cual es una bacteria no
reductoras de sulfato. En la comparación, el desarrollo de C. celerecrescens es análogo al
de una BSR, aunque las concentraciones alcanzadas son inferiores por varios órdenes de
magnitud (Hernández y col., 2004).
Se realizaron 10 réplicas de cada dilución, lo que permitió tener cierta exactitud en los
datos obtenidos, ya que el método del número más probable (NMP) da una sensibilidad
con el 95% de confianza en sus resultados (US FDA/CFSAN-BAM, 2006).
91
Figura 20. Consumo de SO42- y producción de S= y fierro total por C. celerecrescens
en medio de cultivo API RP 38.
Figura 21. Consumo de SO42- y producción de S= y fierro total por C. celerecrescens
en medio de cultivo Bold basal modificado.
92
Figura 22. Consumo de SO42- y producción de S= y fierro total por C. celerecrescens
en medio de cultivo Postgate C.
7.2.2. Consumo de sulfatos
En lo que respecta al consumo de SO42-, C. celerecrescens causó una disminución
considerable de sulfatos; no obstante, estos valores no pueden ser equiparables con los
obtenidos con una BSR; ya que ésta por su naturaleza asimila casi el 100% de sulfatos
disponibles a su alrededor (Colleran y col., 1995; Hulshoff y col., 1998), pero si puede
compararse en cuanto a la trayectoria del consumo de sulfatos seguida por una BSR
(Galushko y col., 1999; Imachi y col., 2006). El mayor consumo de SO42- se presentó en el
medio de cultivo Postgate C (Figura 22), seguido del medio de cultivo API RP 38 (Figura 20)
y, por último, el medio de cultivo Bold basal modificado (Figura 21).
93
7.2.3. Producción de sulfuros
Como era de esperarse, C. celerecrescens, no mostró una producción de S=
estequiométrica con respecto a la disminución de sulfatos, ya que en medio de cultivo
Postgate C (Figura 22) alcanzó un valor máximo de 30 ppm, en medio de cultivo API RP 38
(Figura 20) alcanzó un valor máximo de 17 ppm y en medio de cultivo Bold basal
modificado (Figura 21) de 8 ppm. Estos valores de producción de sulfuro son bajos al
compararse con los obtenidos con BRS´s, las que presentan un amplio rango de
producción, tal es el caso de las especies de Desulfotomaculum con 50 ppm de sulfuros
(Min y Zinder, 1990) o las especies Desulfovibrio (Desulfovibrio desulfuricans) con 230 ppm
de sulfuros (Okabe y col., 1995) o, en general, para las BRS´s que arrojan valores de 80
ppm de sulfuros (Widdel, 1988), 400 ppm de sulfuros (Nazina y col., 1987), 500 ppm de
sulfuros (Reis y col., 1992) o hasta 1000 ppm (Duque y col., 2004). Por lo anterior podría
considerarse a C. celerecrescens como una bacteria productora de sulfuros débil.
Es evidente, por las características metabólicas presentadas, que C. celerecrescens es una
bacteria reductora débil de sulfatos, sin embargo, no está considerado como BSR, es por
eso que surge la necesidad de reclasificar a las bacterias en géneros más acordes con sus
propiedades funcionales, ya en 1997 Stackebrandt y colaboradores (1997) reclasificaron a
una BSR y propusieron la reclasificación de bacterias Gram positivas, así como en el 2006
(López y col., 2006) se dio la reclasificación de una bacteria reductoras de sulfato
(Desulfovibrio oxamicus).
7.2.4. Formación de fierro total en el medio de cultivo
Ahora bien, con el otro producto, Fe2+, derivado de la acción de C. celerecrescens hacia el
cupón de acero al carbón API XL 52, se obtuvo una concentración máxima de fierro total
de 40 ppm en medio de cultivo Postgate C, de 35 ppm de fierro total en medio de cultivo
API RP 38 y de 15 ppm de fierro total en medio de cultivo Bold basal modificado. Sin
embargo, la concentración de fierro total no es proporcional a la producción de sulfuros
(Parkin y col., 1990), pero si es un indicativo del daño causado al metal (Hamilton, 1998),
ya sea mediante desgaste, desprendimiento o pérdida de alguna fracción del cupón
corrosimétrico (Lee y Newman, 2003). Lo más probable es que el fierro se encuentre en
solución o como sulfuros o como óxidos, y estos últimos son muy evidentes, ya que se
aprecian como precipitados (Hutchens y col., 2007).
Por todo lo anteriormente descrito y por los resultados encontrados, se seleccionó al
medio de cultivo Postgate C como medio de cultivo base para todas las determinaciones,
además de ser el medio de referencia para las pruebas electroquímicas (Mora y col., 2003;
Hernández y col., 2005).
94
7.3. Producción de ácidos orgánicos
Una vez que se seleccionó el medio de cultivo para realizar los experimentos de corrosión,
se consideró pertinente determinar la producción de ácidos orgánicos, ya que el género
Clostridium es, en general, productor de ácidos, que también contribuyen en los procesos
de corrosión.
Los resultados mostrados en la Figura 23 indican que por lo menos se generan dos ácidos:
acético (tiempo de elución de 11.85 minutos) y butírico (tiempo de elución de 16.2).
Figura 23. Cromatogramas de productos metabólicos de C. celerecrescens junto
con los perfiles de los estándares de ácido acético y ácido butírico. Las muestras se
tomaron a diferentes tiempos (504, 672, 840 y 1008 h) de cultivo.
95
En los tiempos de elución del ácido fórmico y del ácido láctico no se detectó señal de las
muestras tomadas del ampovial retirado a los diferentes tiempos. En la misma figura
(Figura 23) se puede apreciar el incremento de la concentración del ácido acético y ácido
butírico en función del tiempo.
Los perfiles para la determinación cuantitativa se presentan en la Figura 24. En las dos
primeras semanas no se presenció la formación de ácidos orgánicos, sino hasta la tercer
semana en donde aparecieron pequeñas crestas a los tiempos de 11.85 y 16.2 con una
concentración de ácido acético de 1.2 ppm y 2.7 ppm de ácido butírico, alcanzando un
máximo a las seis semanas de 18 ppm de ácido acético y 24 ppm de ácido butírico.
Figura 24. Determinación cromatográfica de la concentración de ácido acético
(Tr = 11.85) y ácido butírico (Tr = 16.2) de las muestras del cultivo de
C. celerecrescens.
96
Como se puede ver en los cromatogramas (Figuras 23 y 24), C. celerecrescens es capaz de
producir tanto ácido acético como ácido butírico. A manera de comparación, se
encontraron en la literatura tres especies del género Clostridium, los cuales producen
ácidos orgánicos similares a los que excreta C. celerecrescens; como primer ejemplo, se
tiene a C. aceticum, que produce ácido acético (Cato y col., 1986; Balows y col., 1992; Holt
y col., 1994; During, 1997), así como el C. butyricum, que genera ácido butírico (Cato y
col., 1986; Balows y col., 1992; Holt y col., 1994) y, por último, C. acetobutyricum con la
formación de ácido acético y ácido butírico (Cato y col., 1986; Balows y col., 1992; Holt y
col., 1994). Esta última bacteria es la más próxima metabólicamente a C. celerecrescens,
ya que genera los mismos ácidos orgánicos. Sin embargo, en la literatura consultada no se
tiene registrada la cantidad o concentración de ácidos formados por estas bacterias.
A la par de la cuantificación de ácidos orgánicos se registraron la acidez total y el pH. En la
Figura 25 se observa que la acidez total generada por C. celerecrescens se incrementó
gradualmente en función del tiempo y, por consiguiente, el pH disminuyó; lo cual
concuerda con la acumulación de ácidos producidos por la bacteria (Figura 23).
Figura 25. Producción de acidez total y pH en función del tiempo del cultivo de
C. celerecrescens en el medio Postgate C.
97
Es importante no perder de vista que las mediciones se hicieron en el seno del líquido,
donde la concentración de los metabolitos es inferior al que se tiene en el interior de la
biopelícula del cupón de corrosión; por lo que se consideró primordial medir el
crecimiento de C. celerecrescens tanto en el seno del líquido (células planctónicas) como
en la superficie del cupón metálico (células sésiles).
7.4. Determinación del crecimiento de las bacterias planctónicas y sésiles
La cinética de crecimiento de las bacterias planctónicas y sésiles se muestra en la Figura
26.
Figura 26. Cinética de crecimiento de las bacterias planctónicas y sésiles en el cultivo de
C. celerecrescens durante la evaluación de la corrosión inducida por microorganismos.
98
El comportamiento cinético de las bacterias adheridas a la superficie del cupón (sésiles),
permitieron corroborar la afinidad que presenta C. celerecrescens ante una superficie
metálica de acero al carbón. Cabe mencionar que en las primeras horas,
aproximadamente 144 h, las bacterias sésiles no colonizan la superficie del cupón y esto
se ve reflejado en una pronunciada fase de adaptación, pero, una vez concluida esta fase,
las bacterias sésiles empiezan a saturar la superficie del cupón y comienzan a desarrollar
un crecimiento acelerado en toda el área del cupón y es en este momento donde empieza
a formarse una biopelícula de bacterias sésiles alrededor del cupón (Figura 27). Una vez
finalizada la saturación del cupón, las bacterias sésiles empiezan a decaer por la falta de
soporte y por el inadecuado suministro de nutrimentos a la biopelícula (Marshall, 1997).
La contraparte de las bacterias sésiles son las bacterias que se encuentran libremente en
la fase acuosa (planctónicas), las cuales presentaron un comportamiento cinético clásico al
de una curva de crecimiento microbiano, con una pequeña fase de adaptación, con un
crecimiento activo y una fase de desaceleración, logrando un equilibrio con las bacterias
sésiles (Zintel y col., 2001).
Se evaluó la velocidad máxima de crecimiento, tanto para las bacterias planctónicas, como
para las bacterias sésiles, siendo la µmáx de 0.0049 h-1 para las planctónicas y una µmáx de
0.0088 h-1 para las sésiles. Es evidente que las bacterias crecieron más rápido en la
biopelícula adherida a la superficie metálica, lo cual explica una alta concentración de
microorganismos en el cupón y esto se refleja en el daño generado al acero al carbón API
XL 52.
99
Figura 27. Imagen obtenida por microscopía electrónica de barrido de la
biopelícula formada por C. celerecrescens durante la evaluación de la corrosión por
microorganismos.
100
La corrosión inducida por microorganismos se debe a la actividad metabólica de
éstos, por lo que será mayor en las superficies donde crece la biopelícula, puesto
que los productos metabólicos se encuentran ahí en mayor concentración que en
el resto del sistema. Sin embargo, los metabolitos capaces de dañar la superficie
metálica, pueden difundir y llegar a zonas donde no hay formación de biopelícula
y, aunque su concentración suele ser menor, también podrían causar corrosión.
Por esta razón se consideró conveniente evaluar la corrosión causada por los
ácidos orgánicos producidos por C. celerecrescens (acético y butírico) en las
concentraciones que se alcanzaron en el seno del líquido.
7.5. Evaluación gravimétrica de la biocorrosión y de la corrosión abiótica con adición de
ácidos orgánicos
Con el propósito de evaluar la contribución de los ácidos orgánicos producidos por
C. celerecrescens en el proceso de corrosión se emplearon dos sistemas: el primero de
ellos estaba destinado a medir la corrosión inducida por microorganismos, por lo tanto se
incubó a C. celerecrescens por seis semanas en medio Postgate C y en compañía del cupón
de aceró al carbón API XL 52. En el segundo sistema, se consideraron los resultados
obtenidos en la determinación de producción de ácidos orgánicos generados por la
bacteria (ácido acético y ácido butírico, con una concentración máxima en seis semanas de
18 ppm y 24 ppm respectivamente), ya que se pretendió averiguar el efecto que causa el
ácido acético y el ácido butírico a la superficie metálica (cupón de acero al carbón API XL
52). Este sistema fue idéntico al primero, ya que se incubó en las mismas condiciones de
temperatura, de medio de cultivo y del mismo tipo de cupón, pero la diferencia en
comparación con el primer sistema radicó en la sustitución del microorganismo por la
adición de 18 ppm de ácido acético y de 24 ppm de ácido butírico y así poder visualizar la
corrosión que causan estos ácidos. El testigo del experimento se realizó en las mismas
condiciones sólo que no incluyó microorganismos ni adición de los ácidos orgánicos.
Con los resultados de velocidad de corrosión obtenidos (Figura 28) se puede concluir que
la contribución a la corrosión de los ácidos orgánicos producidos por la bacteria y
difundidos al seno del líquido, aunque es importante, es mucho menor a la ocasionada por
la biopelícula formada en la superficie del cupón. Estos resultados podrían explicarse en
términos de concentración de estos metabolitos y la presencia de otros no evaluados en
este experimento, como es el H2S cuyo papel en el fenómeno de corrosión está bien
documentado (Bardal, 2004; Perez, 2004).
101
Figura 28. Velocidades de corrosión de los cupones metálicos en el sistema biótico (-), en
el sistema abiótico adicionado de ácidos orgánicos (-) y en el sistema de referencia
(testigo) (-).
7.6. Observaciones al microscopio electrónico de barrido de los cupones sometidos a
corrosión
Por microscopía electrónica de barrido se observó el tipo de daño causado en la superficie
metálica, tanto en el sistema abiótico adicionado de ácidos orgánicos (Figura 30), como en
el sistema que a C. celerecrescens (Figura 29) en un lapso de seis semanas.
El análisis microscópico permitió corroborar lo determinado por la técnica gravimétrica
con las siguientes precisiones: en el sistema adicionado de ácido acético y ácido butírico la
corrosión fue generalizada en toda la superficie del cupón (Figura 30); mientras que en el
sistema con biopelícula se presentó el daño localizado (Figura 29). Asímismo, se visualizó
la formación de la biopelícula, la cual se fue incrementando en función del tiempo de
incubación (Figura 29).
102
Primera semana Tercera semana Sexta semana
z
T
Figura 29. Observación microscópica de la biopelícula (P) y de la biocorrosión (B), así como
de los testigos (referencias) (R) de los cupones de acero al carbón API XL 52 para el sistema
que explica la corrosión inducida por microorganismos.
R
P
B
103
Referencia Problema adicionado de ácidos orgánicos
Figura 30. Observación microscópica de la corrosión de los cupones de acero al
carbón API XL 52, tanto para el sistema abiótico adicionado de ácido acético y de
ácido butírico, como para sus respectivos testigos (referencias) en función de las
seis semanas de incubación.
1
3
6
S
e
m
a
n
a
s
6
104
7.7. Determinación de la velocidad de corrosión inducida por C. celerecrescens
7.7.1. Técnica gravimétrica
Con los resultados de la técnica gravimétrica se pudo establecer la pérdida de peso que sufrió el
cupón de acero al carbón API XL 52 en presencia y ausencia de C. celerecrescens durante la
prueba.
Tabla 10. Velocidades de corrosión para el cupón de acero al carbón API XL 52 expuesto a
tres diferentes medios de cultivo (API RP 38, Bold basal modificado y Postgate C) en
presencia de C. celerecrescens obtenidas por gravimetría.
Sistema Velocidad de corrosión
(mpy)
Medio API RP 38 + cupón de acero al carbón API XL 52 1.68
Medio API RP 38 + cupón de acero al carbón API XL 52 + C clerecrescens 5.73
Medio Bold basal modificado + cupón de acero al carbón API XL 52 1.35
Medio Bold b.m. + cupón de acero al carbón API XL 52 + C clerecrescens 5.11
Medio Postgate C + cupón de acero al carbón API XL 52 1.38
Medio Postgate C + cupón de acero al carbón API XL 52 + C clerecrescens 5.48
Es evidente que los valores de la velocidad de corrosión obtenidos por ésta técnica son
considerablemente mayores para los sistemas compuestos por C. celerecrescens que para los
sistemas de referencia (ausencia del microorganismo); lo cual sugiere que el microorganismo
aporta una variable más en el sistema. Mediante estos resultados (Tabla 10) se puede conocer
cuál es el medio de cultivo más agresivo o activo para la superficie de acero al carbón API XL 52 e
indirectamente da información de la actividad microbiana.
La NACE (RP0775-2005) categoriza el tipo de daño causado a las superficies de acero al carbón
empleadas en la industria petrolera en bajo, moderado, alto y severo; por lo que, interpolando los
valores obtenidos para los sistemas de referencia, se consideran de bajo a moderado y para los
sistemas con C. celerecrescens se clasifican de moderado a alto. Con base en estos resultados, se
establece que la función del microorganismo influye en una pérdida considerable del material
base del cupón (API XL 52).
Con este ensayo gravimétrico se estimó la susceptibilidad del acero al carbón API XL 52 a sufrir un
ataque tanto químico (sistemas de referencia) como biológico (sistemas con el microorganismo),
sin embargo, esta técnica considera que la velocidad de corrosión es uniforme y no de forma
puntual o localizada que es la que se presenta en la biocorrosión (Beech y Sonner, 2004).
105
7.8. Determinación de la velocidad de corrosión por técnicas electroquímicas, Rp
y EIE
7.8.1. Resistencia a la polarización (Rp)
Se evaluó la resistencia a la polarización (Figura 31) mediante las curvas de polarización.
Tomando en cuenta que existe una relación lineal entre el potencial y la corriente aplicada
(ASTM G 59-91). Se obtuvo la resistencia a la polarización (Figura 31) y, por aplicación de
los principios de Stern-Geary, se determinó la velocidad de corrosión (Vcorr) (Figura 32).
Figura 31. Resistencia a la polarización para el sistema de referencia y para el de
C. celerecrescens en función del tiempo.
106
Figura 32. Evaluación en función del tiempo de la velocidad de corrosión del acero
al carbón API XL 52 para ambos sistemas, tanto para el de referencia, como para el
de C. celerecrescens, estimada por medida de la resistencia a la polarización.
Haciendo una comparación entre ambas mediciones, se puede apreciar que son
inversamente proporcionales; por lo que conociendo el comportamiento que tuvo la
prueba de Rp, automáticamente se deduce cuál es la tendencia de la Vcorr.
La velocidad de corrosión (Figura 32) determinada en el sistema de referencia disminuyó
conforme transcurría la prueba, presentando un valor inicial de 11 mpy; el cual fue
decayendo constantemente hasta 0.5 mpy a un tiempo de 168 h; después de este lapso la
Vcorr se estabilizó hasta valores próximos a 0.2 mpy. En lo que se refiere al sistema que
incluye a la bacteria, la velocidad de corrosión tomó un rumbo muy similar al de
referencia en las primeras 360 h, posteriormente la Vcorr se incrementó en el intervalo de
384 a 792 h hasta alcanzar un valor de 5 mpy.
107
Cabe mencionar que ambos sistemas presentaron al inicio de la determinación
velocidades de corrosión altas (Figura 32), lo cual es atribuido a la composición del medio
de cultivo utilizado (Postgate C), que es rico en iones, específicamente, aniones, como, Cl-,
SO4= y S=. Sin embargo, conforme transcurrió la prueba electroquímica, en ambos
sistemas, se forman productos de corrosión en la superficie del cupón de acero al carbón
API XL 52, dando lugar a una película que puede ser protectora, por lo que se disminuye el
área del electrodo de trabajo y así se da una disminución en la Vcorr. En el sistema que
incluye a C. celerecrescens la bacteria coloniza el cupón después de varias horas de
incubación, formando una biopelícula adherida a la superficie metálica (bacterias sésiles)
donde secretan metabolitos agresivos al cupón, favoreciendo el ascenso de la velocidad
de corrosión.
Una ventaja de la técnica de Rp es que permite obtener valores de resistencia
instantáneos, por lo que a cada momento da información relevante del proceso y
obviamente a cada momento se puede conocer la Vcorr (Bardal, 2004).
108
7.8.2. Espectroscopía de Impedancia Electroquímica (EIE)
Para la realización de la Espectroscopía de Impedancia Electroquímica (EIE) se empleó
acero al carbón API XL 52 embebido en medio de cultivo Postgate C por 792 h. Las
pruebas para el sistema de referencia y el sistema problema (C. celerecrescens) se llevaron
a cabo en forma paralela.
Se registraron 33 espectros de impedancia para cada sistema estudiado. Debido a que
esta información es muy abundante, es difícil mostrar los 33 diagramas de cada uno en
una sola imagen, ya que diversos espectros llegan a traslaparse e impiden su fácil
entendimiento e interpretación; es por eso que sólo se muestran los característicos de la
determinación espectroscópica (al inicio, en el intermedio y al final de la prueba
electroquímica).
7.8.2.1. Prueba de EIE para el sistema de referencia.
EL sistema de referencia fue monitoreado cada 24 h y los espectros de impedancia del
sistema de referencia reportan un mismo comportamiento, el cual tiende a incrementar
sus magnitudes de impedancia imaginaria (Z'') e impedancia real (Z') en el transcurso de
las mediciones (Figura 33).
109
Figura 33. Diagramas de Nyquist para el sistema de referencia, expuesto el cupón
de acero al carbón API XL 52 al medio de cultivo.
En la Figura 33 se observan los espectros de impedancia a diferentes tiempos de la
prueba, donde las magnitudes de impedancia imaginaria y real alcanzan valores de
Z'' -218.9 Ω cm2 y Z' 912.95 Ω cm2 al inicio, a la mitad de Z'' -8779.3 Ω cm2 y Z' 9503.3 Ω
cm2 y al final de Z'' -11653 Ω cm2 y Z' 9678.9 Ω cm2. Estos valores sugieren que bajo estas
condiciones de trabajo se están originando películas o capas semiconductoras de
productos de corrosión y, conforme transcurre la determinación electroquímica, la
película se torna resistiva, es decir, protectora y esto se debe a que ya no existen especies
oxidantes que promuevan el fenómeno de oxidación o corrosión; dicho de otra manera, a
medida que la resistencia aumenta, la velocidad de corrosión disminuye (Pérez, 2004;
Marín y col., 2004).
0 5000 10000 15000
-15000
-10000
-5000
0
Z'
Z''
0 h..z384 h..z792 h..z
Ohm cm2
Ohm cm2
110
Figura 34. Diagramas de Bode para el sistema de referencia, expuesto el cupón de
acero al carbón API XL 52 al medio de cultivo. A) modulo; B) ángulo de fase.
Se presentan en una sola impresión los diagramas de Bode [de módulo (|Z|) y de ángulo
de fase (theta)] (Figura 34) por estar estrechamente relacionados, ya que si se exponen
por separado es muy difícil su interpretación. En el diagrama de Bode de ángulo de fase
se observa la presencia de tres máximos, uno de ellos bien definido en el inicio de la
determinación y al ir avanzando en el tiempo los dos últimos no logran concretarse; sin
embargo, es un indicativo de que el proceso electroquímico es constante al primer tiempo
e inconstante para los tiempos restantes. De esta forma se puede saber que la película
formada por los productos de corrosión se va alterando en función del tiempo toda esta
información se corrobora con el diagrama de Bode de módulo, donde se presentan
pendientes bien definidas en cierto intervalo y de esta manera se puede deducir el
comportamiento del fenómeno de corrosión.
Con la finalidad de establecer un significado físico o tangible del proceso corrosivo, se
simularon y modelaron en un circuito equivalente los espectros de impedancia, llegando
así, a un ajuste de los datos experimentales; tal circuito eléctrico satisfizo las necesidades
físicas de cada etapa del proceso electroquímico. El programa que ayudó a establecer las
condiciones reales del proceso fue el Zview™ y con base en éste se dio una explicación
física del sistema.
100 101 102 103 104100
101
102
103
104
105
Frequency (Hz)|Z
|0 h..z384 h..z792 h..z
100 101 102 103 104
-100
-75
-50
-25
0
Frequency (Hz)
theta
A
B
111
Con el manejo adecuado de los datos de impedancia y con el circuito equivalente
propuesto, se logró dar un seguimiento a la determinación electroquímica, ya que de esta
forma se puede decir que fenómeno o circunstancia se está llevando a cabo en el sistema
de referencia.
El modelo del circuito equivalente que presentó un mejor ajuste a los datos
experimentales se muestra en la Figura 35. Este circuito eléctrico consta de una
resistencia (Rs), de un elemento de fase constante (EFC), cuya función es muy similar a un
capacitor, y de una resistencia (Rtc); y para tales elementos del circuito eléctrico, la Rs
representa la resistencia de la solución, el EFC simboliza la capacitancia de la doble capa y
la Rtc constituye la resistencia a la transferencia de carga. Todos estos componentes del
circuito equivalente están designados a facilitar el entendimiento del fenómeno de
corrosión, es por eso que estos adquieren un significado real para las mediciones.
Figura 35. Circuito equivalente empleado en el ajuste de los datos experimentales
del sistema de referencia.
Con la finalidad de verificar el funcionamiento del circuito equivalente, se probó al inicio
de la prueba electroquímica el espectro de impedancia a las 0 h con el circuito eléctrico
(Figura 35), dando como resultado un adecuado ajuste a los datos experimentales (Figura
36), por lo tanto el arreglo utilizado en el circuito equivalente fue apropiado.
Rs EFC
Rtc
Element Freedom Value Error Error %
Rs Free(±) 9.193 N/A N/A
EFC-T Free(±) 0.0092484 N/A N/A
EFC-P Free(±) 0.91639 N/A N/A
Rtc Free(±) 1126 N/A N/A
Data File:
Circuit Model File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Análisis Electroquímico\EIS\BLANCO\Segundo blanco\Blanco final final.mdl
Mode: Run Fitting / Freq. Range (0.001 - 1000000)
Maximum Iterations: 100
Optimization Iterations: 0
Type of Fitting: Complex
Type of Weighting: Calc-Modulus
112
Figura 36. Diagrama de Nyquist para el sistema de referencia ajustado al inicio de
la prueba electroquímica con el programa ZView™. Experimental (-); Ajuste (-).
Al igual que el diagrama de Nyquist (Figura 36) los diagramas de Bode tuvieron un buen
ajuste al aplicar el circuito eléctrico (Figura 35), por lo que para esta etapa del ensayo
electroquímico el circuito funcionó bien, de tal forma que se puede decir que el modelo
de circuito equivalente seleccionado es el apropiado en este intervalo.
0 250 500 750 1000
-1000
-750
-500
-250
0
Z'
Z''
0 h..zFitResult
Ohm cm2
Ohm cm2
113
Figura 37. Diagramas de Bode para el sistema de referencia ajustados al inicio de la
prueba electroquímica con el programa ZView™. Experimental (-); Ajuste (-).
Con los valores de cada componente del circuito (resistencia, elemento de fase constante
y resistencia), se obtuvieron porcentajes de error muy bajos (Figura 38), por lo que se dice
que el grado de confiabilidad del circuito equivalente es satisfactorio, por lo menos al
inicio de la prueba.
100 101 102 103 104100
101
102
103
Frequency (Hz)|Z
|
0 h..zFitResult
100 101 102 103 104
-75
-50
-25
0
Frequency (Hz)
theta
114
Figura 38. Circuito equivalente y valores de cada elemento que forman el circuito
al tiempo de inicio de la prueba, estimados mediante el programa ZView™.
Asímismo, se probó el circuito equivalente a la mitad de la prueba electroquímica a las
384 h. El diagrama de Nyquist simulado muestra una buena aproximación a los resultados
experimentales (Figura 39).
Figura 39. Diagrama de Nyquist para el sistema de referencia empleando el
programa ZView™ a la mitad de la prueba electroquímica.Experimental(-);Ajuste(-).
Rs EFC
Rtc
Element Freedom Value Error Error %
Rs Free(±) 3.503 0.018046 0.51516
EFC-T Free(±) 0.00020875 1.7448E-6 0.83583
EFC-P Free(±) 0.88858 0.00152 0.17106
Rtc Free(±) 1026 8.1555 0.79488
Chi-Squared: 0.00091165
Weighted Sum of Squares: 0.082048
Data File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Análisis Electroquímico\EIS\PROBLEMA MODIFICADO\EIS\0 h..z
Circuit Model File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Análisis Electroquímico\EIS\PROBLEMA MODIFICADO\EIS\20070307 inicio.mdl
Mode: Run Fitting / Freq. Range (0.001 - 1000000)
Maximum Iterations: 100
Optimization Iterations: 0
Type of Fitting: Complex
Type of Weighting: Calc-Modulus
0 2500 5000 7500 10000
-10000
-7500
-5000
-2500
0
Z'
Z''
384 h..zFitResult
Ohm cm2
Ohm cm2
115
El acoplamiento dado en los diagramas de Bode (Figura 40), muestra un ajuste adecuado
en la fase intermedia de la prueba electroquímica, de tal forma que para este período fue
útil el modelo de circuito equivalente.
Figura 40. Diagramas de Bode para el sistema de referencia utilizando el programa
ZView™ a la mitad de la técnica electroquímica.
Se empleó el modelo de circuito equivalente (Figura 35) en los diagramas de Nyquist
(Figura 39) y Bode (Figura 40) en el intervalo intermedio de la determinación, permitiendo
estimar los valores representativos del sistema electroquímico (Figura 41).
10-1 100 101 102 103 104100
101
102
103
104
105
Frequency (Hz)
|Z|
384 h..zFitResult
10-1 100 101 102 103 104
-100
-75
-50
-25
0
Frequency (Hz)
theta
116
Figura 41. Circuito equivalente y valores de cada elemento que forman el circuito
al tiempo intermedio de la técnica electroquímica.
Para finalizar el estudio del proceso electroquímico del sistema de referencia; en la última
etapa (792 h) nuevamente se recurrió a la simulación con el circuito eléctrico (Figura 35).
Los diagramas de Nyquist (Figura 42) y de Bode (Figura 43), muestran una respuesta que
se ajusta aceptablemente a los resultados experimentales.
Rs EFC
Rtc
Element Freedom Value Error Error %
Rs Free(±) 3.577 0.030045 0.83995
EFC-T Free(±) 0.00032956 2.2771E-6 0.69095
EFC-P Free(±) 0.87116 0.0016052 0.18426
Rtc Free(±) 23938 829.35 3.4646
Chi-Squared: 0.0033002
Weighted Sum of Squares: 0.36302
Data File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Análisis Electroquímico\EIS\PROBLEMA MODIFICADO\EIS\384 h..z
Circuit Model File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Análisis Electroquímico\EIS\PROBLEMA MODIFICADO\EIS\20070320 mitad.mdl
Mode: Run Fitting / Freq. Range (0.001 - 1000000)
Maximum Iterations: 100
Optimization Iterations: 0
Type of Fitting: Complex
Type of Weighting: Calc-Modulus
117
Figura 42. Diagrama de Nyquist para el sistema de referencia al final de la
determinación electroquímica correspondiente al ajuste con el programa ZView™.
Experimental (-); Ajuste (-).
0 5000 10000 15000
-15000
-10000
-5000
0
Z'
Z''
792 h..zFitResult
Ohm cm2
Ohm cm2
118
Figura 43. Diagramas de Bode para el sistema de referencia al final de la
determinación electroquímica ajustados mediante el programa ZView™.
El ajuste de los diagramas de impedancia en la última etapa de la medición electroquímica
proporcionó los valores de cada elemento usado en el circuito equivalente (Figura 44);
con lo que se pudo caracterizar todo el comportamiento seguido en el ensayo
espectroscópico.
10-1 100 101 102 103 104100
101
102
103
104
105
Frequency (Hz)|Z
|792 h..zFitResult
10-1 100 101 102 103 104
-100
-75
-50
-25
0
Frequency (Hz)
theta
119
Figura 44. Circuito equivalente y valores de cada elemento que forman el circuito
al tiempo final de la determinación electroquímica.
De manera general, en las Figuras 33 y 34 se puede visualizar la trayectoria que siguió el
espectro de impedancia para el acero al carbón API XL 52 expuesto al medio de cultivo
Postgate C en condiciones estériles por un lapso de 792 h. De modo particular, en las
Figuras 36 y 37 se aprecia el comportamiento al inicio de la prueba, en las Figuras 39 y 40
se muestra la conducta seguida al intermedio del ensayo electroquímico y en las Figuras
42 y 43 se evalúa el final del proceso electroquímico. Cada Figura que engloba la prueba
electroquímica del sistema de referencia presentó un comportamiento particular, el cual
básicamente va incrementando los valores de impedancia imaginaria y real y, con esto, se
establecieron las condiciones reales del sistema a un tiempo e indirectamente se va
registrando el fenómeno de corrosión.
Con base en las características utilizadas en la medición electroquímica, se pudo modelar
un circuito equivalente, el cual representa las condiciones físicas de este ensayo, ya que
permitió simular ante una señal eléctrica la respuesta generada del conjunto acero al
carbón API XL 52-medio de cultivo Postgate C. Para tal simulación se emplearon tres
elementos de un circuito eléctrico, los cuales esquematizan paso a paso el proceso de
corrosión. El primer componente del circuito equivalente es una resistencia, llamada
resistencia de la solución (Rs), la cual confiere a la solución la habilidad de oponerse al
flujo de corriente que pasa por ella; el segundo componente del circuito equivalente es
un tipo de capacitor, denominado elemento de fase constante (EFC), el cual representa a
la capacitancia de la doble capa presente entre la solución y el metal, por lo que este
elemento almacena la carga eléctrica en un determinado punto del circuito, además de
que permite compensar las desviaciones que se presentan en el sistema (semicírculos
imperfectos); y el tercer componente del circuito equivalente es una resistencia, asociada
Rs EFC
Rtc
Element Freedom Value Error Error %
Rs Free(±) 3.508 0.014954 0.42628
EFC-T Free(±) 0.00035983 1.2391E-6 0.34436
EFC-P Free(±) 0.88037 0.00082951 0.094223
Rtc Free(±) 33241 704.77 2.1202
Chi-Squared: 0.00098516
Weighted Sum of Squares: 0.11034
Data File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Análisis Electroquímico\EIS\PROBLEMA MODIFICADO\EIS\792 h..z
Circuit Model File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Análisis Electroquímico\EIS\PROBLEMA MODIFICADO\EIS\20070327 final.mdl
Mode: Run Fitting / Freq. Range (0.001 - 1000000)
Maximum Iterations: 100
Optimization Iterations: 0
Type of Fitting: Complex
Type of Weighting: Calc-Modulus
120
a la resistencia de la transferencia de carga (Rtc), la cual esta relacionada con los procesos
de intercambio iones-electrones en la superficie del metal.
Para corroborar la calidad en el ajuste del circuito equivalente empleado en el proceso de
la prueba electroquímica, se compararon los porcentajes de error atribuidos a las
diferentes etapas de la medición, teniendo como principal fuente de error la resistencia a
la transferencia de carga que se fue incrementando a partir de la mitad del ensayo
electroquímico, lo cual se puede justificar por la creación de una película de productos de
corrosión, que en este caso son diferentes óxidos de hierro; es por tal razón, que los
porcentajes varían a lo largo del proceso electroquímico, sin embargo, el porcentaje de
error global es pequeño (del orden de 3.5%) y tomando como base esto, se dice que el
ajuste hecho a los espectros de impedancia con ayuda del programa ZView™ fueron los
adecuados, permitiendo entender el proceso de corrosión.
De acuerdo con el circuito equivalente empleado en la prueba electroquímica para el
sistema de referencia expuesto a medio de cultivo Postgate C y acero al carbón API XL 52,
se pudo recabar información de los componentes que formaron parte del circuito
eléctrico a lo largo del proceso electroquímico, los cuales se muestran en la Tabla 11.
121
Tabla 11. Valores de los elementos eléctricos que componen el circuito
equivalente durante el ensayo electroquímico con el sistema de referencia.
Tiempo (h)
Rs (Ohm cm2)
EFC-T (F cm2)
Rtc (Ohm cm2)
Rp (Ohm cm2)
Vcorr (mpy)
0 3.503 0.00020875 1026 1029.503 11.57872974
24 3.534 0.00012521 2583 2586.534 4.608614076
48 3.531 0.00013423 3689 3692.531 3.228229364
120 3.616 0.00020029 4032 4035.616 2.953783759
144 3.622 0.00024612 4201 4204.622 2.835055565
168 3.611 0.00028104 4560 4563.611 2.612040553
192 3.591 0.00021987 4730 4733.591 2.518243972
216 3.614 0.00026350 4742 4745.614 2.511864007
312 3.590 0.00032530 22548 22551.59 0.528580779
336 3.611 0.00032584 23060 23063.611 0.516846083
360 3.441 0.00046448 23142 23145.441 0.515018789
384 3.577 0.00032956 23938 23941.577 0.497892724
456 3.58 0.00033397 26572 26575.58 0.448544754
480 3.451 0.00042564 26752 26755.451 0.445529287
504 3.452 0.00041232 27019 27022.452 0.441127141
528 3.441 0.00041950 27129 27132.441 0.439338908
552 3.457 0.00039474 27791 27794.457 0.428874613
624 3.469 0.00038694 30522 30525.469 0.390504631
648 3.508 0.00035026 31241 31244.508 0.381517833
672 3.477 0.00037414 33133 33136.477 0.359734591
792 3.508 0.00035983 33241 33244.508 0.358565601
En la Tabla 11 se muestran los valores para la Rs que son asociados a la resistencia de la
solución, los cuales fueron constantes. En lo que respecta al elemento de fase constante
(EFC), se observaron cambios en los datos reportados, ya que al ir transcurriendo la
prueba electroquímica éstos se iban incrementando hasta alcanzar un equilibrio, lo que
está estrechamente vinculado con la formación de productos de corrosión establecidos en
la interfase acero al carbón API XL 52 y el medio de cultivo. Asímismo se consideró el
factor que utiliza el EFC, por lo que se conoció la heterogeneidad de la película formada
por los productos de corrosión, indicando posiblemente una superficie rugosa, ratificando
el comportamiento no ideal de un capacitor. Por último, se notó un aumento
considerable en las cifras de la resistencia a la transferencia de carga (Rtc) después de las
122
216 h; al inicio se atribuye al proceso de oxidación del hierro o a la reducción de los iones
presentes en el medio de cultivo, dándole una capacidad de activación al metal y, para los
tiempos posteriores, la película formada por los productos de corrosión empezó a tener
un efecto positivo en el sistema de referencia, ya que constituyó una barrera en la
interfase acero al carbón API XL 52-película contra el fenómeno de corrosión, provocando
una disminución en la velocidad de corrosión (Figura 45).
Con todos estos resultados (Tabla 11) se pudo evaluar la resistencia a la polarización (Rp),
en donde la Rp se vio favorecida en los primeros tiempos y, conforme avanzaba la
determinación electroquímica, las Rp iban decayendo debido a que están en función de la
Rs y la Rtc.
De acuerdo con los resultados obtenidos del análisis electroquímico se puede conocer la
velocidad de corrosión en milésimas de pulgada por año (Tabla 11) para el sistema de
referencia.
En la Figura 45 se aprecia la tendencia de la velocidad de corrosión que originó el sistema
de referencia al someterse a las pruebas electroquímicas.
Figura 45. Velocidad de corrosión para el sistema de referencia calculada
mediante EIE.
123
7.8.2.2. Prueba de EIE para el sistema con C. celerecrescens (problema)
Para llevar a cabo la prueba electroquímica con el cultivo bacteriano se aplicaron las
mismas condiciones que en el sistema de referencia.
El microorganismo junto con el acero al carbón API XL 52 fue sometido al ensayo
electroquímico por 792 h en medio de cultivo Postgate C. Mediante esta asociación se
generó información suficiente para comprender el fenómeno de corrosión originada por la
bacteria.
En el transcurso de la medición electroquímica se observaron dos patrones de los
espectros de impedancia, lo cual sugiere que la prueba no siguió un mismo
comportamiento. El primero de ellos es muy similar al observado en el sistema de
referencia, ya que se da un incremento en las magnitudes tanto imaginarias como reales
y, en el segundo, ya no es tan evidente el avance de las magnitudes, sino por el contrario,
los espectros forman una línea inclinada casi recta, con pendientes aproximadas entre los
45° y 55°. Por lo general, cuando se presenta este tipo de variaciones en los sistemas, es
atribuible a una transferencia de masa y, con base en esto, se supone que el sistema con
el microorganismo es controlado por un fenómeno de difusión. Siguiendo la misma
dinámica que en el sistema de referencia, en la Figura 46 se aprecian los diagramas de
Nyquist para el análisis electroquímico en tres diferentes intervalos, al principio, en medio
y final del ensayo.
124
Figura 46. Diagramas de Nyquist para el metal expuesto al microorganismo y al
medio de cultivo.
En la Figura 46 se distinguen los espectros de impedancia a lo largo de la prueba
electroquímica, teniendo que para la etapa de inicio se observó una Z'' -428.08 Ω cm2 y
Z' 301.04 Ω cm2, las cuales fueron aumentando hasta las 120h y posteriormente
disminuyeron a magnitudes de Z'' -167.34 Ω cm2 y Z' 77.116 Ω cm2 a la mitad y al final de
Z'' -95.803 Ω cm2 y Z' 53.916 Ω cm2, lo cual refleja una modificación evidente causada por
la bacteria en la interfase de acero al carbón API XL 52 - medio de cultivo Postgate C. Para
los primeros tiempos (antes de 120 h), el avance de las magnitudes expresó un efecto
protector sobre la superficie del cupón de acero al carbón API XL 52 ante el proceso de
oxidación, ya que se estaba creando una película de productos de corrosión; sin embargo,
en los tiempos subsiguientes las magnitudes disminuyeron debido a que en la interfase
metal-medio de cultivo la película formada por los productos de corrosión ya no ejercía
ningún efecto, debido a que se estaba gestionando otro tipo de película, conocida como
biopelícula, es por tal razón que mientras el cupón se iba colonizando las Z''y Z' iban
aminorando y de esta forma se propició la corrosión. Una vez colonizado o cubierto el
cupón por el microorganismo se originó una nueva interfase, compuesta por el acero al
carbón-biopelícula-medio de cultivo y es por eso que se involucró una nueva variable al
sistema relacionada con el proceso de difusión.
0 100 200 300 400 500
-500
-400
-300
-200
-100
0
Z'
Z''
0 h..z384 h..z792 h..z
Ohm cm2
Ohm cm2
125
Figura 47. Diagramas de Bode para el metal expuesto al microorganismo y al
medio de cultivo.
En los diagramas de Bode (Figura 47), se distingue que en el de ángulo de fase se aprecian
tres máximos, en los cuales uno de ellos si está bien definido y los otros dos no, esto es
claro debido a que se presentó el fenómeno de difusión, es por ello que se alcanzan a
cerrar los valles en las amplitudes de las ondas y para el de módulo se observan tres
pendientes asociadas a tres constantes de tiempo, en donde cada una de ellas representa
una etapa del proceso electroquímico, siendo más evidente que dos de ellas son muy
similares. Por lo tanto, se originan dos etapas en la interfase del cupón-biopelícula-medio
de cultivo y es justificable debido a que a medida que la prueba electroquímica se
desarrolla la parte lineal de la frecuencia tarda en desaparecer.
Durante la prueba electroquímica se produjeron dos tendencias en los espectros de
impedancia, las cuales se analizaron mediante el programa Zview™. La simulación arrojó
diversos prototipos de circuitos equivalentes, pero acotando y definiendo las constantes,
se consiguió el circuito equivalente apropiado para el proceso dando una representación
física al sistema electroquímico.
100
101
102
103
104
100
101
102
103
Frequency (Hz)|Z
|0 h..z
384 h..z792 h..z
100
101
102
103
104
-75
-50
-25
0
Frequency (Hz)
the
ta
126
Para la primera etapa del estudio electroquímico, el modelo del circuito equivalente
(Figura 48) que presentó un mejor ajuste a los datos experimentales, se compone de una
resistencia (Rs) y de un arreglo en paralelo de un elemento de fase constante (EFC) y de
una resistencia (Rtc); y, básicamente, es el mismo modelo que se utilizó en el sistema de
referencia.
Figura 48. Circuito equivalente empleado en el ajuste de los datos experimentales
del sistema con el microorganismo en su primera etapa.
Para la segunda etapa del estudio electroquímico fue necesario añadir un nuevo
elemento, el elemento de Warburg (W), el cual está en serie con la resistencia a la
transferencia de carga (Rtc). Con esta nueva adaptación al modelo del circuito
equivalente (Figura 49), se observó un adecuado ajuste a los datos experimentales, por lo
que el circuito equivalente empleado es el siguiente:
Figura 49. Circuito equivalente empleado en el ajuste de los datos experimentales
del sistema con el microorganismo en su segunda etapa.
El modelo de circuito equivalente (Figura 49) que contempla el elemento de Warburg, se
rige por el fenómeno de difusión, debido a la formación de la biopelícula sobre el acero al
carbón API XL 52.
Rs EFC
Rtc
Element Freedom Value Error Error %
Rs Free(±) 9.193 N/A N/A
EFC-T Free(±) 0.0092484 N/A N/A
EFC-P Free(±) 0.91639 N/A N/A
Rtc Free(±) 1126 N/A N/A
Data File:
Circuit Model File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Análisis Electroquímico\EIS\BLANCO\Segundo blanco\Blanco final final.mdl
Mode: Run Fitting / Freq. Range (0.001 - 1000000)
Maximum Iterations: 100
Optimization Iterations: 0
Type of Fitting: Complex
Type of Weighting: Calc-ModulusRs EFC
Rtc W
Element Freedom Value Error Error %
Rs Free(±) 8.152 N/A N/A
EFC-T Free(±) 0.0023474 N/A N/A
EFC-P Free(±) 0.93621 N/A N/A
Rtc Free(±) 307.6 N/A N/A
W-R Free(±) 3198 N/A N/A
W-T Free(±) 393.4 N/A N/A
W-P Free(±) 1.005 N/A N/A
Data File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Electroquímica\BLANCO\Segundo Blanco\EIS\20070313.z
Circuit Model File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Análisis Electroquímico\EIS\PROBLEMA MODIFICADO 2\EIS\prueba para (4) 20070313.mdl
Mode: Run Fitting / Freq. Range (0.001 - 1000000)
Maximum Iterations: 100
Optimization Iterations: 0
Type of Fitting: Complex
Type of Weighting: Calc-Modulus
127
Al inicio de la medición electroquímica se ajustaron los datos experimentales con el
primer modelo de circuito equivalente propuesto para esta determinación, de tal forma
que se obtuvo el diagrama de Nyquist (Figura 50) representativo para este intervalo.
Figura 50. Diagrama de Nyquist para el sistema con el microorganismo ajustado
con el programa Zview™ para la primera etapa de la prueba electroquímica.
Con los diagramas de Bode (Figura 51) y con el diagrama de Nyquist, se deduce que el
ajuste hecho mediante el circuito equivalente propuesto para esta etapa de la medición
electroquímica es satisfactorio.
0 100 200 300 400 500
-500
-400
-300
-200
-100
0
Z'
Z''
0 h..zFitResult
Ohm cm2
Ohm cm2
128
Figura 51. Diagramas de Bode para el sistema con el microorganismo ajustados por
medio del programa ZView™ al inicio de la prueba electroquímica.
Por medio del modelo del circuito equivalente (Figura 50) empleado en este lapso (inicio),
se obtienen valores de los elementos físicos aplicados y se puede apreciar que el circuito
equivalente complace con los requisitos establecidos para éste, los cuales son los mismos
que se consideraron para el sistema de referencia, donde la Rs representaba la resistencia
a la solución o al medio de cultivo, el EFC que se asociaba a la capacitancia de la doble
capa presente entre el medio de cultivo y el cupón de acero al carbón API XL 52 y la Rtc
que manifestaba la resistencia que se daba a la transferencia de carga entre los productos
de corrosión formados en la interfase.
10-1 100 101 102 103 104100
101
102
103
Frequency (Hz)|Z
|
0 h..zFitResult
10-1 100 101 102 103 104
-75
-50
-25
0
Frequency (Hz)
theta
129
Figura 52. Circuito equivalente y valores de cada elemento que forman el circuito
en los primeros tiempos de la determinación generados por el programa ZView™.
Conforme transcurre la prueba electroquímica, el primer modelo del circuito eléctrico no
cumple con el acoplamiento de los espectros de impedancia, por lo que se emplea el
segundo modelo planteado.
Haciendo uso del modelo de circuito equivalente propuesto para el segundo período del
análisis electroquímico, el diagrama de Nyquist (Figura 53) y los diagramas de Bode (Figura
54), crearon una respuesta apropiada con los espectros de impedancia generados en esta
fase.
Rs EFC
Rtc
Element Freedom Value Error Error %
Rs Free(±) 9.193 0.060159 0.6544
EFC-T Free(±) 0.0092484 7.9806E-5 0.86292
EFC-P Free(±) 0.91639 0.0042527 0.46407
Rtc Free(±) 1126 33.423 2.9683
Chi-Squared: 0.022453
Weighted Sum of Squares: 2.6494
Data File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Electroquímica\BLANCO\Segundo Blanco original\EIS\20070409.z
Circuit Model File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Análisis Electroquímico\EIS\BLANCO FINAL\Segundo blanco\CE 20070409.mdl
Mode: Run Fitting / Selected Points (0 - 60)
Maximum Iterations: 100
Optimization Iterations: 0
Type of Fitting: Complex
Type of Weighting: Calc-Modulus
130
Figura 53. Diagrama de Nyquist para el sistema con el microorganismo empleando
el programa Zview™ a la mitad de la prueba electroquímica.
0 50 100 150 200
-200
-150
-100
-50
0
Z'
Z''
384 h..zFitResult
Ohm cm2
Ohm cm2
131
Figura 54. Diagramas de Bode para el sistema con el microorganismo con el
programa ZView™ a la mitad de la prueba electroquímica.
Como se puede apreciar, el modelo propuesto para la segunda ruta de la medición
electroquímica ajusta perfectamente con los espectros de impedancia, por tal razón, se
dice que el diagrama de Nyquist (Figura 53) y los diagramas de Bode (Figura 54) mostraron
una buena correlación.
El modelo de circuito equivalente establecido para la segunda etapa del ensayo
electroquímico (Figura 49), mostró un adecuado ajuste de los espectros de impedancia, y,
por lo tanto, se pudieron analizar y simular el resto de los espectros obtenidos en la
determinación espectroscópica.
100
101
102
103
104
100
101
102
103
Frequency (Hz)
|Z|
384 h.
FitResult
100
101
102
103
104
-75
-50
-25
0
Frequency (Hz)
the
ta
132
Figura 55. Circuito equivalente y valores de cada elemento que forman el circuito
a la mitad de la técnica aplicando el programa ZView™
Los datos obtenidos para la parte final de la prueba electroquímica dieron una clara idea
del curso que tomó dicho ensayo; por lo que el diagrama de Nyquist (Figura 56) y los de
Bode (Figura 57) permitieron corroborar el efecto electroquímico.
133
Figura 56. Diagrama de Nyquist para el sistema con el microorganismo
correspondientes al ajuste con el programa ZView™ al final de la prueba
electroquímica.
0 25 50 75 100
-100
-75
-50
-25
0
Z'
Z''
792 h..zFitResult
Ohm cm2
Ohm cm2
134
Figura 57. Diagramas de Bode para el sistema con el microorganismo usando el
programa ZView™ al final de la prueba electroquímica.
El modelo de circuito equivalente (Figura 58), expone el último paso realizado en la
examinación electroquímica.
Figura 58. Circuito equivalente y valores de cada elemento que forman el circuito
al final de la determinación valorados con el programa ZView™.
100
101
102
103
104
100
101
102
103
Frequency (Hz)|Z
|792 h..z
FitResult
100
101
102
103
104
-75
-50
-25
0
Frequency (Hz)
the
ta
135
Finalizado el estudio electroquímico, se puede observar en las Figuras 46 y 47 el
comportamiento que presentó el sistema problema; claramente se distingue que el metal
de acero al carbón API XL 52 expuesto a C. celerecrescens y al medio de cultivo Postgate C
tomó un rumbo diferente, probablemente se deba a la presencia de la bacteria, cuya
actividad metabólica favorece la corrosión.
En las Figuras 50 y 51 se aprecia que se originó un fenómeno de corrosión simple, el cual
considera un circuito eléctrico sencillo conformado por una Rs, un EFC y una Rtc; y
posteriormente (Figuras 53, 54, 56 y 57) se da un proceso de corrosión compuesto, ya que
se involucra a un nuevo elemento, el elemento de Warburg, que está relacionado con el
efecto de la difusión, debido a la inducción de biopelículas en la superficie del metal.
Con la simulación se pudieron modelar los circuitos eléctricos más convenientes para el
ensayo electroquímico y así dar una explicación física el fenómeno de corrosión inducida
por la bacteria. En el tipo de corrosión inducida por el microorganismo se emplearon
cuatro elementos para el planteamiento del circuito eléctrico; los tres primeros son los
mismos que se emplearon en el sistema de referencia y, por consecuencia, tienen el
mismo significado físico y, el último elemento requerido para darle una estructura lógica
al circuito eléctrico y al proceso de corrosión, es el elemento de Warburg (W), el cual
describe un proceso a través de una interfase donde una de las fronteras obstruye las
especies en difusión.
El porcentaje de error aumenta al introducir el elemento de Warburg al sistema, sin
embargo, se mantuvo un porcentaje menor al 10%. Los porcentajes de error para la
prueba electroquímica son: 4.95% al inicio, 9.38% a la mitad y 9.71% al final de la
medición electroquímica, generando un porcentaje de error global del sistema
electroquímico para el microorganismo de 8.01%. Por tal motivo, se establece que el
sistema de corrosión inducida por el microorganismo propuesto, es satisfactorio.
Los circuitos eléctricos empleados durante el análisis electroquímico para el sistema con
C. celerecrescens expuesto al medio de cultivo Postgate C y a acero al carbón API XL 52,
permitieron conocer los valores de los componentes que formaron parte del circuito
eléctrico, dichos valores se presentan en la Tabla 12.
136
Tabla 12. Valores de los elementos eléctricos que componen el circuito
equivalente durante el ensayo electroquímico en el sistema que incluye al
microorganismo.
Tiempo (h)
Rs (Ohm cm2)
EFC-T (F cm2)
Rtc (Ohm cm2)
W1-R (Ohmcm2)
W1-T ( cm2)
Rp (Ohm cm2)
Vcorr (mpy)
0 9.193 0.0092484 1126 NA NA 1135.20225 10.5006284
24 9.138 0.00925138 2987 NA NA 2996.14725 3.97855512
48 9.073 0.00925752 4592 NA NA 4601.08226 2.59076807
120 8.892 0.0092692 7962.4 NA NA 7971.30127 1.49540666
144 8.829 0.0092199 13794 NA NA 13802.8382 0.86361492
168 8.724 0.0092024 17850.8 NA NA 17859.5332 0.66744953
192 8.515 0.0091886 24184.5 NA NA 24193.0242 0.49271794
216 8.637 0.0089964 30189.2 NA NA 30197.846 0.3947413
312 8.363 0.0087723 723.8 27368 456.7 28100.1718 0.42420869
336 8.372 0.0086539 721.1 23251 475 23980.4807 0.49708499
360 8.307 0.0084323 689.8 20552 474.9 21250.1154 0.56095399
384 8.239 0.0082444 644.1 16568 474.8 17220.3472 0.69222396
456 8.529 0.0079122 607.1 6356 455.6 6971.63691 1.70983331
480 8.474 0.0074109 526.5 3758 455.1 4292.98141 2.77670361
504 8.57 0.0029828 351.7 3662 392.7 4022.27298 2.9635823
528 8.533 0.003766 374 3563 392.9 3945.53677 3.02122061
552 8.338 0.0072263 492.4 3184 454.9 3684.74523 3.23505053
624 8.379 0.0069617 470.5 3099 454 3577.88596 3.33167047
648 8.152 0.0023474 307.6 3198 393.4 3513.75435 3.39247876
672 8.609 0.0044372 380.4 2571 413.6 2960.01344 4.0271226
792 8.523 0.0065998 447 1999 410.2 2454.5296 4.85646496
En la Tabla 12, se encuentran los valores de la resistencia a la solución, Rs, los cuales no
variaron; asímismo se expone el elemento de fase constante, EFC, cuyos resultados se
pueden atribuir al efecto dado en la doble capa, en donde se presenciaron alteraciones
debido a que se creó una nueva interfase, compuesta por el cupón de acero al carbón
API XL 52 - la película de los productos de corrosión-la biopelícula generada por
C. celerecrescens - medio de cultivo Postagte C, dotándola de propiedades
semiconductoras que al ir evolucionando se torna altamente conductora, lo cual explica el
proceso de corrosión y, ya que esta unión es más compleja, el fenómeno de corrosión se
llevó a frecuencias intermedias y con el factor que considera el EFC se pudo conocer que
la biopelícula se adhirió de manera heterogénea, generando una superficie activa para la
corrosión. También se verificó la responsabilidad de la resistencia a la transferencia de
carga, Rtc, asociada al mecanismo que se derivó de la interfase, la cual va disminuyendo
en función del tiempo; es por eso que un componente de la interfase, la biopelícula, se
137
vuelve más activo impidiendo la transferencia de iones; de igual forma se estudió el
proceso de difusión, W1-R, que se presentó a bajas frecuencias, explicando el porqué los
componentes químicos involucrados en el sistema tardan en difundirse a través de la
interfase.
Con base en los resultados obtenidos (Tabla 12) se calculó la Rp, resistencia a la
polarización y, como era de esperarse, en los primeros tiempos se mostró un aumento
seguido de una disminución que posteriormente se transformó en un incremento, todo
esto se justifica, ya que la Rp depende de la Rs, Rtc y de la W1-R, permitiendo conocer la
velocidad de corrosión para el sistema que consideró la participación de C. celerecrescens
(Tabla 12).
Reuniendo todos los datos del análisis electroquímico se obtuvo la velocidad de corrosión
del acero al carbón API XL 52 ocasionada por el microorganismo (Tabla 12) expuesto al
medio de cultivo Postagate C.
En la Figura 59, se visualiza el comportamiento dado por el microorganismo en términos
de velocidad de corrosión a lo largo del ensayo electroquímico.
138
Figura 59. Velocidad de corrosión para el sistema con C. celerecrescens expuesto
al medio de cultivo Postgate C y a acero al carbón API XL 52 determinada mediante
EIE.
En la Figura 60 se trazan en forma comparativa los perfiles de la velocidad de corrosión del
sistema de referencia y del problema, donde se puede observar que el sistema de
referencia evidenció velocidades de corrosión muy bajas (después de 200 h), casi cercanas
a 0 mpy, por lo que se dice que el medio de cultivo, después de este tiempo, no es
agresivo para la superficie metálica de acero al carbón API XL 52; sin embargo, el sistema
que incluyó a C. celerecrescens reportó velocidades de corrosión altas, aproximadamente
de 4 mpy, de tal forma que la bacteria contribuyó a que se dieran las condiciones para el
fenómeno de biocorrosión
139
Figura 60. Velocidad de corrosión para los sistemas de referencia y con el
microorganismo, expuestos a acero al carbón API XL 52 y al medio de cultivo
Postgate C.
140
7.9. Microscopía electrónica de barrido ambiental (MEBA)
Con base en los resultados obtenidos de las pruebas electroquímicas, se deduce que las
interacciones que se dieron entre C. celerecrescens y el cupón de acero al carbón API XL 52
fueron sumamente importantes para la integridad del cupón.
Por medio de la microscopia electrónica de barrido ambiental se pudieron observar
diversas micrografías representativas para el proceso de corrosión y para el fenómeno de
biocorrosión (Figura 61), también se aprovecharon estas imágenes para realizar un análisis
por energía dispersiva de rayos-X (EDAX), el cual consistió en un microanálisis sobre la
superficie de los cupones de acero al carbón API XL 52, tanto para el sistema de referencia
(Figura 62) como para el del microorganismo (Figura 63), en donde se aprecian los
productos de corrosión generados.
Fue evidente, como se aprecia en la Figura 63, que la bacteria generó un daño irreparable
en la superficie del cupón de acero al carbón API XL 52, ya que en el microanálisis se
observaron modificaciones de la composición química en la superficie del acero, es por
ello que a la bacteria se le considera como un agente agresor.
141
Figura 61. Observación microscópica del sistema de referencia (R), de la biopelícula
(P) y de la corrosión (C) (una vez eliminada la biopelícula) de los cupones metálicos
obtenidos al finalizar los ensayos electroquímicos.
R
P
C
142
Figura 62. Microanálisis de la superficie metálica del cupón retirado de la celda
electroquímica al término del ensayo espectroscópico del sistema de referencia.
143
Figura 63. Microanálisis de la superficie metálica del cupón retirado de la celda
electroquímica al término de la determinación espectroscópica para el sistema con
C. celerecrescens.
144
CAPÍTULO 8
CONCLUSIONES
145
8. Conclusiones
Se demostró, bioquímicamente, que las cepas de bacterias esporuladas aisladas
con un año de diferencia de un gasoducto, pertenecen al género Clostridium y a la
especie celerecrescens.
Por secuenciación del 16S rDNA y comparación en la base de datos del GeneBank
se corroboró que ambas cepas son Clostridium celerecrescens con un 99% de
homología (número de acceso X71848).
Por técnicas moleculares utilizadas en este estudio, específicamente ARDRA
(Análisis de restricción del 16S rDNA amplificado) y RAPD (Análisis del DNA
polimórfico amplificado aleatoriamente), se demostró que no hay diferencia entre
las dos cepas aisladas, es decir que se trata de la misma cepa que ha persistido en
el gasoducto.
No se detectaron plásmidos en la cepa.
La cepa de C. celerecrescens es productora de ácido acético y acido butírico.
Se demostró que los ácidos orgánicos producidos por la cepa contribuyen
moderadamente al proceso de corrosión de acero al carbón API XL 52.
La mayor velocidad de corrosión se obtuvo cuando la bacteria formó una
biopelícula en la superficie del cupón corrosimétrico, siendo de 5.48, 5.05 y 4.85
mpy cuando se mide por gravimetría, por resistencia a la polarización (Rp) y por
espectroscopía de impedancia electroquímica (EIE), respectivamente.
Por microscopía electrónica de barrido se visualizó que el tipo de corrosión
ocasionada por la bacteria fue uniforme y localizado.
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CAPÍTULO 9
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158
CAPÍTULO 10
ANEXO
PRUEBAS ELECTROQUÍMICAS
159
10. Pruebas electroquímicas
10.1. Medición de potencial-tiempo
Para que haya una transformación electroquímica neta, es decir, para que se produzca
una reacción, se necesita combinar dos elementos, por ejemplo, un metal sumergido en
una solución tiende a reaccionar con el electrolito y así acumula una carga positiva o
negativa, de tal forma que alcanza un valor de potencial conocido como potencial de
corrosión (Ecorr), el cual es el potencial mixto entre los potenciales anódico y catódico. Por
lo que la reacción electroquímica se divide en dos o más reacciones parciales de oxidación
y reducción, tal es el caso que se presenta, durante la corrosión de un material metálico,
donde las velocidades totales de oxidación y reducción deben ser equivalentes, de modo
que el proceso global de corrosión se verifica a un potencial intermedio entre los
potenciales anódicos y catódicos (González, 1989).
Es importante indicar que aunque Ecorr es muy útil, su análisis debe complementarse con
otras técnicas electroquímicas para corroborar los mecanismos de corrosión (Padilla y col.,
2004).
10.2. Resistencia a la polarización (Rp)
La técnica de resistencia a la polarización es una prueba rápida y fácil que permite
determinar la velocidad de corrosión instantánea de un sistema. Para determinar la Rp se
emplea el procedimiento descrito por la ASTM G 59-91, el cual hace referencia a un
barrido potenciodinámico en las proximidades del potencial de corrosión (Ecorr).
El método de resistencia a la polarización se fundamenta en la teoría del potencial mixto y
en conceptos básicos desarrollados por Stern y Geary en 1957 (Fontana, 1986). Tales
fusiones demostraron que existe una relación lineal entre el potencial aplicado (mV) o
sobrepotencial (η) y la densidad de corriente total (ίneta) aplicada a potenciales poco
alejados del potencial de corrosión (η≤0.020 V) (Cottis y Turgoose, 1999).
La medición de la velocidad de corrosión es actualmente equivalente a la determinación
de los procesos electroquímicos cinéticos de la corrosión. La fórmula fundamental que
describe la cinética de las reacciones electroquímicas es la ecuación de Butler-Volmer.
160
10.2.1. Ecuación de Butler –Volmer
De acuerdo a la teoría del potencial mixto de la corrosión en ausencia de potenciales
externos aplicados, los procesos de oxidación y reducción ocurren simultáneamente en la
interfase metal/electrolito, y no puede haber acumulación de la carga eléctrica neta. Bajo
estas circunstancias la corriente medida neta es cero, por ejemplo la corriente de
corrosión no se puede medir directamente.
Para determinar la cinética electroquímica de corrosión, una perturbación por un
potencial de polarización externo es aplicada al electrodo, V, necesario para cambiar el
sistema de corrosión al potencial de corrosión Vcorr. Si las reacciones anódicas y catódicas
en el electrodo de trabajo son totalmente controladas por activación, y el potencial de
corrosión está lejos de los potenciales de equilibrio de las reacciones anódicas y catódicas,
la ecuación de Butler and Volmer puede ser aplicada.
Donde:
= Densidad de corriente.
= Densidad de corriente de corrosión.
Coeficientes que relacionan el potencial a través de la doble capa electroquímica.
Número de electrones transferidos en la reacción anódica y catódica.
Constante de Faraday.
Constante de los gases.
Temperatura absoluta.
Sobrepotencial .
La ecuación anterior desarrollada por Butler (1924) y Volmer (1930) es la fórmula
fundamental para determinar las reacciones cinéticas electroquímicas. Sin embargo, en
su aplicación práctica para calcular la corriente de corrosión electroquímica, la ecuación
ha sido simplificada. Aunque hay otras maneras de simplificar la ecuación de Buttler-
Volmer, tal como el método de tres puntos las dos formas más comunes para simplificar la
ecuación es por la ecuación de Tafel y Stern-Geary (Bard y Faulkner, 1980).
161
10.2.2. La ecuación de Tafel
La ecuación de Tafel, primero planteada empíricamente por dicho autor en 1905, puede
ser deducida de la ecuación de Buttler-Volmer para valores lo suficientemente grandes de
potenciales aplicados.
Para la polarización anódica, cuando , la siguiente ecuación es obtenida:
Para la polarización catódica, cuando , se tiene:
Las ecuaciones que involucran el sobrepotencial (η y –η) tienen la forma de la ecuación de
Tafel:
Donde a y b son las pendientes de Tafel, para polarización anódica y para polarización
catódica:
162
Sin embargo, el método de Tafel (también conocido como método de extrapolación de
Tafel) tiene una desventaja, ya que es destructivo para la muestra evaluada debido al uso
de altos potenciales de polarización. Así que el método Tafel puede ser usado para
valores limites para el monitoreo continuo de la corrosión.
La extrapolación de las curvas de polarización ha sido ampliamente usada para medir la
velocidad de corrosión (Emregül y Hayvali, 2004). Sin embargo, algunas de las limitaciones
de la extrapolación de Tafel para calcular la velocidad de corrosión, pueden ser superadas
con el uso de la resistencia lineal a la polarización. A diferencia de la extrapolación de
Tafel, en la técnica de polarización lineal la superficie del metal es perturbada a bajo
potencial. Como tal, después de cada experimento las condiciones de la superficie inicial
son restablecidas, sin algún cambio importante en la superficie del metal corroído.
Además, las variaciones de la velocidad de corrosión pueden ser determinadas fácilmente
con este método. El cálculo de la velocidad de corrosión por la técnica de resistencia a la
polarización está basado en la ecuación de Stern-Geary (Fontana, 1986).
10.2.3. Ecuación de Stern y Geary
En 1957, Stern y Geary simplificaron la ecuación de Buttler-Volmer para valores de
polarización bajos (≤ 10 mV) y desarrollaron su famosa ecuación, la cual pude ser usada
para medir la polarización lineal y determinar la velocidad de corrosión sin dañar
significativamente las muestras a estudiar (Singh, 1995).
Donde:
= Densidad de corriente de corrosión.
Pendientes de Tafel anódica y catódica.
Resistencia a la polarización.
La resistencia a la polarización es definida como la tangente a la curva de polarización en
el potencial de corrosión.
163
Donde:
y = Sobrepotencial anódico y catódico.
y = Densidad de corriente de polarización anódica y catódica.
Cuando se mide la velocidad de corrosión usando la ecuación de Stern-Geary, sólo
potenciales bajos son aplicados (normalmente ± 10 mV) para evaluar el sistema. Si se
compara el método de Tafel donde potenciales grandes son empleados, el método de
Stern-Geary obviamente tiene la ventaja debido a que básicamente es una técnica no
destructiva.
Los valores (βa y βc) pueden ser determinados de diferentes formas: de las curvas de
Tafel, por mediciones de pérdida de peso y por aproximaciones de curvas no lineales
propuesto por Mansfeld (Mansfeld y Kending, 1981). Pero además, pueden ser estimados
por mediciones de polarización lineal de la ecuación de Stern-Geary. Para una más rápida
estimación de la velocidad de corrosión los valores de las constantes de Tafel, βa y βc,
pueden ser consideradas próximas a 100 mVdec-1. Pourbaix (1973) estableció que si los
valores de βa y βc son de ~ 100mVdec-1, la velocidad de corrosión calculada debe ser
corregida por un factor de corrección de 2.2.
Aunque la polarización lineal es un método tradicional para las mediciones
experimentales de los valores de Rp, en algunas circunstancias se ha encontrado que se
puede incurrir en errores en la medición de la velocidad de corrosión (ASTM G 01-03,
2003). Esto puede ocurrir cuando los valores experimentales de Rp contienen
contribuciones de resistencias óhmicas considerables. Se han propuesto diferentes
métodos para eliminar los efectos de la resistencia óhmica, pero un estudio detallado de
estas técnicas demostró que éstos tienen limitaciones y son difíciles de aplicar (Pourbaix,
1973).
164
En la práctica, los valores de Rp para un sistema en corrosión se pueden estimar
polarizando la muestra en η = ± 10 a ± 20 mV desde el Ecorr y se calcula la pendiente de la
grafica η en función de ίneta, como se muestra en la Figura 63.
Figura 64. Relación lineal entre la densidad de corriente, ί, y el sobrepotencial η, que se obtiene cuando se polariza un sistema de corrosión (± 10 a ±20 mV) desde el Ecorr.
165
10.3. Espectroscopía de Impedancia Electroquímica (EIE)
La técnica de Espectroscopia de Impedancia Electroquímica, es un método electroquímico
utilizado en estudios de corrosión, el cual se basa en el uso de una señal de corriente
alterna (CA) que es aplicada a un electrodo (metal de corrosión) y se determina la
respuesta correspondiente.
En el procedimiento experimental más comúnmente usado, se aplica una pequeña señal
de potencial (E) a un electrodo y se mide su respuesta en corriente (I) a diferentes
frecuencias. No obstante, en ciertas circunstancias, es posible aplicar una señal pequeña
de corriente y medir la respuesta en potencial del sistema. Así, el equipo electrónico
usado procesa las mediciones de potencial-tiempo y corriente-tiempo, dando como
resultado una serie de valores de impedancia correspondientes a cada frecuencia
estudiada. Esta relación de valores de impedancia y frecuencia se denomina “espectro de
impedancias” (Cottis y Turgoose, 1999; Mendoza y col., 2003).
En el caso de los estudios de corrosión que utilizan las técnicas de EIE, los espectros de
impedancia obtenidos suelen ser analizados mediante circuitos eléctricos, compuestos por
componentes tales como resistencias (R), capacitancias (C), inductancias (L), etc.,
combinados de tal manera que reproduzcan los espectros de impedancia medidos. Estos
circuitos eléctricos son denominados “circuitos eléctricos equivalentes”. (González, 1989;
Cottis y Turgoose, 1999; Mendoza y col., 2003).
Es común referir el comportamiento electroquímico de un sistema simple de corrosión
bajo control por activación y por corrosión uniforme en superficies homogéneas, al
circuito equivalente de Randles (Figura 64).
Figura 65. Circuito equivalente para un proceso de corrosión simple.
166
La Figura 64 involucra: una resistencia (Rs), que se atribuye a la resistencia de la solución,
resistencia de la película de productos de corrosión, resistencia de los conductores y
resistencia del electrodo. Estos dos últimos son despreciables con respecto a las dos
primeras resistencias. Rs se coloca en serie porque todas las corrientes durante el
proceso electroquímico deben pasar a través de ésta, y también a un capacitor (C),
asociado a la capacitancia de la doble capa, y una resistencia (Rtc), que representa la
resistencia a la transferencia de carga de electrones a través de la superficie del metal.
Estos elementos se encuentran en paralelo porque la corriente total a través de la
interfase de trabajo es la suma de la carga del capacitor de la doble capa y la corriente
farádica.
El tratamiento teórico de la impedancia de este circuito (Figura 64) representa un
semicírculo con un componente real y uno imaginario (Figura 65), donde la impedancia
puede expresarse como (Silverman, 1986):
Ztotal = [Rs + Rtc / (1 + w2 C2 Rtc2)] – [(j w C Rtc2 / (1 + w 2 C2 Rtc2)]
Donde, w representa la velocidad angular y j el componente imaginario
Figura 66. Diagrama de Nyquist para un metal en proceso de corrosión con sus
componentes real e imaginario.
167
En el diagrama de Nyquist (Figura 65) se representa el comportamiento general de esta
ecuación. A altas frecuencias, el capacitor no produce impedancia y toda la corriente
pasa por el capacitor; la única impedancia es la resistencia óhmica Rs. Conforme w
disminuye, la impedancia total es una combinación de Rtc y C y se manifiesta en forma de
un semicírculo. A frecuencias muy bajas la C produce impedancias altas y por lo tanto el
flujo de corriente aumenta a través de Rtc y Rs. Los diagramas de Nyquist permiten
calcular Rs, Rtc y C, además de otros posibles componentes que controlan un proceso de
corrosión.
La velocidad de una reacción química puede estar fuertemente influenciada por la
difusión de uno o más reactantes o productos hacia la superficie. La respuesta de
impedancia a un proceso de corrosión dominado por control de difusión frecuentemente
tiene una única característica conocida como impedancia de Warburg. El diagrama de
Nyquist creado para este fenómeno se representa en la Figura 66.
Figura 66. Diagrama de Nyquist para un proceso gobernado por control de
difusión.
168
El circuito equivalente para este proceso es mostrado en la Figura 67. Donde W es la
impedancia de Warburg y representa un proceso de corrosión gobernado por el
fenómeno de difusión.
Figura 67. Circuito equivalente que modela la impedancia de Warburg.
La impedancia es un término que describe la resistencia eléctrica (R), utilizada en circuitos de
corriente alterna (CA). En un circuito de corriente directa (CD) la relación entre la corriente (I) y el
potencial (E) está dada por la Ley de Ohm.
En donde E es en volts, I en amperes y R en ohms. En el caso de una señal alterna la expresión
equivalente es la siguiente.
En donde Z representa la impedancia del circuito, con unidades de ohm. Es necesario hacer notar
que a diferencia de la resistencia, la impedancia de un circuito de CA depende de la frecuencia de
la señal que sea aplicada. La frecuencia (f) de un sistema de CA se expresa en unidades de hertz
(Hz) o número de ciclos por segundo (s-1).
De esta manera, es posible definir la admitancia (Y) de un circuito de CA. La admitancia es el
recíproco de la impedancia y es un parámetro de importancia en los cálculos matemáticos que
involucra la técnica y por otra parte, los equipos usados en estudios de EIE miden en realidad la
admitancia.
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La impedancia de un sistema a cada frecuencia está definida por: la razón entre la amplitud de la
señal de corriente alterna y la amplitud de la señal de potencial alterno y el ángulo de fase. Un
listado de estos parámetros a diferentes frecuencias constituye el “espectro de impedancia”. El
desarrollo matemático de la teoría que fundamenta la técnica de EIE permite describir la
impedancia de un sistema en términos de un componente real y un componente imaginario
(asociado a la raíz cuadrada de -1) (Cottis y Turgoose, 1999; Mendoza y col., 2003).
Los métodos y técnicas usadas para el estudio de la corrosión están basados en mediciones
gravimétricas, electroquímicas, ópticas y/o cambios en la superficie que ocurren durante los
procesos corrosivos. Sin embargo, cada una de estas técnicas tienen sus limitaciones y
requerimientos, por lo tanto, el estudio de los procesos corrosivos sólo puede ser realizado
mediante el uso de estas técnicas de manera complementaria (Pérez, 2004).
