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PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 1

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

INFORME TÉCNICO PARCIAL

PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO

Clave del programa: 1539

“DESARROLLO DE BIOINSECTICIDAS MICRO Y

NANOENCAPSULADOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS

DEL TOMATE”

COORDINADOR: Dr. Cipriano García Gutiérrez

Módulo I. “Caracterización molecular de hongos y bacterias entomopatógenos, e

identificación de genes implicados en su patogenicidad y virulencia”. Registro

asignado por la SIP: 20130246, Director: Dr. Cesar Marcial Escobedo Bonilla.

(CIIDIR Sinaloa).

Módulo II. “Escalamiento de procesos de producción de hongos y bacterias

entomopatógenas”. Registro asignado por la SIP: 20130173, Director: Dr. Sergio

García Salas. (UPIBI).

Módulo III. “Diseño y evaluación de bioinsecticidas micro y nanoencapsuladas

para el control de plagas del tomate en Sinaloa”. Registro asignado por la SIP:

20130074, Director: Dr. Cipriano García Gutiérrez. (CIIDIR Sinaloa).

Módulo IV. “Validación de la efectividad de bioinsecticidas micro y

nanoencapsulados para el control de plagas del tomate”. Registro asignado por la

SIP: 20130144, Director: Dr. Adolfo Dagoberto Armenta Bojórquez. (CIIDIR

Sinaloa).


RESUMEN

Se presentan resultados de producción de la bacteria Bacillus thuringiensis y de

los hongos entomopatógenos Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae e Isaria

fumosorosea a nivel de laboratorio, en matraces y en biorreactores de 0.5 L y 5 L.,

generando información básica de ingeniería para desarrollar estos procesos a

nivel industrial. En los experimentos con la bacteria se obtuvieron los siguientes

resultados: velocidad específica de crecimiento máxima de 0.38 h-1 y productividad

de 7.3 x 108 esporas/L h; el uso de quitina al 1% en el medio de cultivo aumentó

un 10 % la productividad, comprobando un efecto inductor. También se encontró

que la productividad depende del coeficiente volumétrico de transferencia de

oxígeno (kLa), el cual se considera como el criterio más importante de

escalamiento de este proceso, pues la productividad aumentó 6 veces al aumentar

el kLa de 23 h-1 a 240 h-1.En los trabajos con hongos entomopatógenos destacan

los resultados con B. bassiana siendo los siguientes: velocidad específica de

crecimiento máxima de 0.040 h-1 y productividad de 1.79 x 109 esporas/L h; el uso

de quitina al 1% en el medio de cultivo no tuvo efecto para aumentar la

productividad, pero si aumento el complejo enzimático patogénico. En este

proceso la zona de escalamiento es muy amplia, pues la productividad se

mantiene en un intervalo de 1 x 109 esporas/L h a 3.6 x 109 esporas/L h en

amplios intervalos de kLa (23 h-1 a 240 h-1) y de consumo de potencia (0.21 a 1.56

W/L).Con respecto a la reología de los caldos de cultivo, en ambos procesos el

medio de cultivo tuvo un comportamiento Newtoniano, permitiendo mantener

condiciones de homogeneidad en el reactor, sobre todo en los biorreactores de

mayor tamaño (5L). En este trabajó se seleccionaron las cepas B16 de Beauveria

bassiana, la cepa HM13 de Metarhizium anisopliae y la cepa If19 de Isaria

fumosorosea, así como 3 aislamientos de Bacillus thuringiensis, para evaluar su

efectividad contra plagas de tomate; respecto a la identificación molecular de los

hongos hasta el momento se ha caracterizado a B. bassiana con los siguientes

resultados: tres de los siete ISSR (Biss22, M11 y M10) amplificaron exitosamente

con el aislado B4 y para el B2 solamente amplificaron los marcadores Biss22 y

B11. Cepas de Bt se formularon con lignina, aceite de maíz, harina de maíz


nixtamalizado y sales minerales, utilizando como ingrediente activo esporas y

micelio, sometiéndose a un proceso de secado por aspersión para obtener un

insecticida microencapsulado. A estos formulados se les determinaron diversos

parámetros como rendimiento de esporas, humedad, estabilidad a temperatura

ambiente y en refrigeración, porcentaje de germinación y patogenicidad causada a

larvas de gusano del fruto, soldado, paratrioza y mosquita blanca. Todos los

formulados presentaron pérdida en el número y viabilidad de las esporas, de 98%

inical-86% final. La humedad de los microencapsulados fue del 10% -40%. El

formulado a base de B. bassiana tuvo mejor viabilidad de esporas (90% ). En los

bioensayos con dieta natural se utilizó una temperatura de 26°C y una humedad

relativa del 80%. La mortalidad máxima en larvas neonatas de gusano soldado y

del fruto fue del 80%-90% y en mosquita blanca del 60% utilizando

microencapsulados elaborados con los tres hongos, hubo diferencia significativa

de la mortalidad (p,0.5) en los formulados elaborados con esporas y blastosporas-

micelio de los bioinsecticidas. Los resultados en campo indican que el mejor

microencapsulado a base de B. bassiana tuvo mejores resultados que el control,

aunque fue ligeramente menor al uso del hongo en fresco, esto respecto al

porcentaje de frutos dañados (5%). Sin embargo se observó una mortalidad de

larvas del gusano del fruto mayor al 70%.

INTRODUCCIÓN

En los procesos industriales donde intervienen microorganismos es necesario

previamente hacer investigaciones a nivel de laboratorio y de planta piloto (García

y Medrano 2006). En estos se obtiene información sobre los requerimientos de

transferencia de momento, masa y calor, para que los microorganismos produzcan

los metabolitos de interés a máxima velocidad, reflejándose en alta productividad y

por lo tanto en menores costos de inversión y operación del biorreactor y en

consecuencia de todo el proceso.

Cuando se pasa de laboratorio a una escala mayor ocurre la disminución de la

productividad y/o rendimientos. Esta situación no es deseable, por lo que se tiene


que investigar cuales son las constantes cinéticas y coeficientes de rendimiento de

los microorganismos en determinadas condiciones de cultivo, y en particular las

condiciones de mezclado, transferencia de oxígeno y calor; para tratar de

reproducirlas en escala mayor; y así garantizar que al menos en escala mayor se

obtenga productividad aceptable y coeficientes de rendimiento semejantes a las

obtenidas en menor escala.

Las estrategias de escalamiento se basan en determinar cuál es el factor más

importante que influye sobre la productividad. A este factor se le denomina criterio

de escalamiento. Los criterios más usuales son la potencia consumida por unidad

de volumen y el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (Rocha-

Valadez y col., 2006). Entonces habrá que encontrar los valores del criterio de

escalamiento para los que ya no hay un cambio importante en el valor de la

productividad. Al intervalo donde ya no hay un efecto sobre la productividad se le

llama zona de escalamiento (Yuh-Lih y Wen-Teng, 2002).

Las plagas agrícolas han sido controladas durante años mediante el empleo de

plaguicidas químicos que tienen un fuerte impacto negativo sobre los organismos

benéficos presentes en el ambiente y diversos problemas de salud en humanos.

La finalidad de diseñar y evaluar bioinsecticidas micro y nanoencapsulados a base

de hongos y bacterias entomopatógenas para el control de plagas en el cultivo de

tomate, permite tener formulaciones eficaces y estables para su aplicación en

campo en programas de control biológico, las esporas son las unidades infectivas

y la dormancia es la clave para prolongar su sobrevivencia o detener la

germinación reduciendo su metabolismo tanto como sea posible, una posibilidad

para lograr esto es la deshidratación de las mismas, utilizando un proceso de

secado por aspersión, y aprovechar esta tecnología para su formulación

(Horaczek and Viernstein, 2004).

Al respecto, Castrejón-Ayala (2013) elaboraron un bioinsecticida

microencapsulado a partir del hongo entomopatógeno Beauveria bassiana Mulsant

para el control del picudo del nopal Metamasius spinolae, obteniendo una

mortalidad del 31.1%, a una concentración de 1.58x1012 esporas viables.


En relación a la microencapsulación de Bacillus thuringiensis Berlinier se han

utilizado diferentes materiales encapsulantes, como la maltodextrina (5%), con

altos niveles de toxicidad; sin embargo después del proceso de secado por

aspersión se degrada rápidamente debido a la calidad del producto, por lo que es

recomendable utilizar materiales que permitan mantener la viabilidad de las

esporas y su persistencia a la lluvia y a la luz solar, una vez que son aplicadas

(Nafari, 2012).

Namasivayam et al. (2013) diseñaron diferentes nano bioinsecticidas a base del

hongo entomopatógeno Nomurea rileyi (Farlow) Samson, aislado en la India,

utilizando quitosano cubierto con cobre y plata, como materiales encapsulantes,

para evaluar su toxicidad y el desarrollo del hongo, logrando tamaños de partícula

de 3-5 nm.

Por esta razón, el desarrollo de bioinsecticidas microencapsulados a base de

bacterias y hongos utilizando esta tecnología (microencapsulación) permite

obtener productos para el control de plagas de diferentes cultivos, donde también

se requiere realizar pruebas de validación de estos productos a nivel de

laboratorio y campo para demostrar su eficacia en el control de las diferentes

plagas.


Módulo I. “Caracterización molecular de hongos y bacterias

entomopatógenos, e identificación de genes implicados en su patogenicidad

y virulencia”.

1. Objetivo y metas cumplidas

Caracterización molecular de cepas de hongos y bacterias entomopatógenos, e

identificación de genes involucrados en su patogenicidad y virulencia. En esta

primera etapa se han adquirido los reactivos y servicios necesarios para cumplir

con el objetivo propuesto. Para el estudio del hongo entomopatógeno Beauveria

bassiana se están siguiendo dos estrategias:

(1) evaluación de la diversidad genética de aislados de B. bassiana y (2) estudio

de su patogenicidad por medio de la determinación de una serie de genes

relacionados con virulencia y/o patogenicidad del hongo.

Entre los ensayos moleculares usados para evaluar la diversidad genética, los

marcadores basados en PCR, como los marcadores ISSR (inter-simple sequence

repeat) son muy efectivos; en particular porque amplifican múltiples alelos a lo

largo de todo el genoma usando oligonucleótidos compuestos de una secuencia

repetida con un ancla de 2 a 4 nucleótidos al azar al inicio., determinando los

genes que pueden estar involucrados en la patogenicidad de los aislados de

Beauveria bassiana.

2. Materiales y métodos

Para extraer DNA, 100 mg de micelio fresco de los aislados fue homogeneizado

en fresco en presencia del amortiguador DNAzol (Invitrogen) de acuerdo al

protocolo reportado por el fabricante. La calidad del DNA fue confirmada por

medio de electroforesis en gel de agarosa al 1% y las concentraciones fueron

determinadas por espectrometría empleando el equipo Nanodrop. La

concentración del DNA resultante fue ajustado a 50 ng/ul para la amplificación por

PCR.


Siete oligonucleótidos ISSR fueron seleccionados como panel para análisis de

diversidad genética. Estos oligonucleótidos (Tabla 1), han sido empleados

previamente y resultado muy informativos en estudios de diversidad de B.

bassiana y han encontrado entre 3 a 12 bandas polimórficas en estudios genéticos

de aislados de esta especie del mismo hospedero (Wang et al., 2013).

TABLA 1. Oligonucleótidos empleados para amplificar los ISSR en los aislados

entomopatogénicos de B. bassiana. Se muestran la secuencia y el número de bandas

polimorficas reportadas en estudios de diversidad previos con colecciones de aislados de

esta misma especie.

IDENTIFICADOR

SECUENCIA BANDAS POLIMORFICA

S REPORTADAS

REFERENCIA

M1 TGTGTGTGTGTGTGTGGT 3 Wang etal 2013

M2 AGAGAGAGAGAGAGAGCT

7 Wang etal 2013

M8 ACACACACACACACACT 7 Wang etal 2013

M10 GTCGTCGTCGTCGTCGTC 7 Wang etal 2013

M11 GAGGAGGAGGAGGC 4 Wang etal 2013

M17 TAGACAACAACAACAACA 5 Wang etal 2013

BIS22 GTGGTGGTGGTGGTGGTG

12 Wang etal 2005

La amplificación por PCR fue llevada a cabo en un volumen de 25 ul conteniendo

2.5 ul de amortiguador 10X, 2 ul de MgSO4 25mM, 1 ul de dNTPs 2.5mM, 1.25

unidades de Taq DNA polimerasa (Invitrogen), 1 ul de cada primer (20uM) y 100

ng de DNA como templado. El programa de amplificación fue de la siguiente

forma: Desnaturalización inicial por 2 min a 94C, seguido por 35 ciclos de

amplificación compuesto de 30 segundos de desnaturalización a 94C, alineación

de cada oligonucleótido por un minuto con temperatura de acuerdo a su Tm (47-

55C), extensión a 68C por 1.5 minuto y una amplificación final a 68C por 10

minutos. Los productos de PCR fueron revelados por electroforesis en agarosa al

2% y visualizados en fotodocumentador con luz UV.


En cuanto al estudio de la patogenicidad y virulencia, se determinó que al menos

13 genes que codifican para quitinasas pueden estar relacionados con la

patogenicidad y/o virulencia del hongo. Estas secuencias incluyen:

class V chitinase, putative

chitinase A1

chitinase 18-11

chitinase 18-3

chitinase 18-4

symbiotic chitinase

acidic chitinase

class V chitinase Chi100

chitinase-like protein

Chitinase II

class III chitinase

bacteriodes thetaiotaomicron symbiotic chitinase

putative endochitinase

chitinase-like protein

protein=endo-N-acetyl-beta-D-glucosaminidase precursor

Los oligonucleótidos que amplifican estos genes ya han sido sintetizados y se está

trabajando en su determinación en el genoma del hongo.

3. Resultados

Al momento se realizó extracción de DNA genómico a partir de micelio fresco, sin

embargo la extracción de DNA no tuvo el rendimiento esperado sin embargo fue

posible obtener DNA de dos de los cinco aislados para pruebas posteriores de

PCR. De acuerdo a otros reportes de extracción de DNA de Beauveria, la

extracción a partir de micelio liofilizado a resultado muy eficiente por lo que el

siguiente paso será aislar DNA a partir de tejido con este tratamiento.

Del DNA de los aislados B4 y B2, que se obtuvo DNA, se llevó a cabo una

amplificación de DNA con los siete ISSR para evaluar si son informativos y

presentan bandas polimórficas. La Figura 1 muestra los resultados de esta


amplificación y se revela que tres de los siete ISSR (Biss22, M11 y M10)

amplificaron exitosamente con el aislado B4 y para el B2 solamente amplificaron

los marcadores Biss22 y B11.

FIGURA 1. Visualización de productos de PCR amplificados con 5 marcadores ISSR

(Biss22, M17, M11, M10 y M8) utilizando DNA genómico de los aislados B2 y B4

de Beauveria bassiana) para identificar marcadores que puedan ser informativos

para los aislados en estudio. Electroforesis en gel de agarosa al 2% con

amortiguador TBE 0.5X por 1h a 90 Volts.

Los oligonucleótidos que amplifican los genes de quitinasas ya han sido

sintetizados y se está trabajando en su determinación en el genoma del hongo.

4. Conclusiones e impacto de la investigación

Los resultados preliminares implican que los ISSR Biss22, M11 y M10 son

potencialmente útiles para caracterizar molecularmente los aislados y aún no se

descarta que el resto de los ISSR sean útiles e informativos también. Se

procederá a extraer DNA a partir de micelio liofilizado o bien con alguna técnica

alternativa que permita hacer más eficiente la extracción. En este mismo sentido


se procederá a optimizar los PCRs con cada ISSR informativo para diferenciar

cada banda polimórfica.

Los oligonucleótidos que amplifican secuencias de quitinasas están siendo

evaluados y se espera que algunos de ellos arrojen información relevante sobre su

función en la patogenicidad y virulencia del hongo.

5. Bibliografía.

Aquino de Muro M, Sarah Elliott, David Moore, Bruce L. Parker, Margaret

Skinner, William Reid y Mustapha El Bouhssini (2005). Molecular

characterisation of Beauveria bassiana isolates obtained from

overwintering sites of Sunn Pests (Eurygaster and Aelia species). Mycol.

Res. 109 (3): 294-306.

Emma L. Ormond, Alison P.M. Thomas, Philip J.A. Pugh, Judith K. Pell y

Helen E. Roy (2010). A fungal pathogen in time and space: the population

dynamics of Beauveria bassiana in a conifer forest. FEMS Microbiol Ecol

74: 146–154.

Estrada M. Elena, Manuel V. Camacho y C. Benito (2007). The molecular

diversity of different isolates of Beauveria bassiana (BALS.) VUILL. As

assessed using intermicrosatellites (ISSRS). Cellular & Molecular Biology

Letters 12: 240-252.

Wang S, Xuexia Miao, Weiguo Zhao, Bo Huang, Meizhen Fan, Zengzhi Li y

Yongping Huang (2005). Genetic diversity and population structure

among strains of the entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, as

revealed by inter-simple sequence repeats (ISSR). Mycol. Res. 109 (12):

1364–1372.

Wang Jing-jie, Li Yang, Xin Qiu, Yong-gui Liu, Wei Zhou, Yong-Ji Wan (2013).

Diversity analysis of Beauveria bassiana isolated from infected silkworm in

southwest China based on molecular data and morphological features of

colony. World J. Microbiol. Biotechnol. 29:1263-1269.


Módulo II. “Escalamiento de procesos de producción de hongos y bacterias

entomopatógenas”.


Escalar los procesos de producción de los hongos Beauveria bassiana,

Metarhizium anisopliae, Isaria fumosorosea y de la bacteria Bacillus thuringiensis.

Obtener metabolitos y toxinas con actividad insecticida sobre insectos plaga del

tomate.

Las metas cumplidas son las propuestas en el protocolo 2013 de este proyecto,

las cuales corresponden al primer año de realización del mismo. Estas metas se

describen en la sección de resultados y discusión, correspondiendo principalmente

a B. thuringiensis y B. bassiana.


Cepas del hongo entomopatógeno B. bassiana BbPM y de la bacteria B.

thuringiensis, proporcionadas por el CIIDIR Sinaloa.

Formulación del medio de cultivo para el hongo B. bassiana: 14.5 mL/L de melaza,

6 g/L de (NH4)2SO4, 3.5 g/L de KH2PO4, 0.5 g/L de MgSO4, 0.1 g/L de NaCl y 0.1

g/L de CaCl2.

Las condiciones de cultivo fueron pH de 5.4 y temperatura de 28oC.

Formulación del medio de cultivo para la bacteria B. thuringiensis: 10 g/L de

glucosa, 0.86 g/L extracto de levadura, 1.82 g/L de (NH4)2SO4, 0.8 g/L de KH2PO4,

0.5 g/L de NaCl.

Las condiciones de cultivo fueron pH de 7 y temperatura de 30oC.

Equipo utilizado:

Biorreactores y condiciones de operación:


Biorreactor de tanque agitado de 0.5 L. 400 y 700 rpm; 0.5 y 1 vvm.

Biorreactor de tanque agitado de 5 L. 400 y 700 rpm; 0.5 y 1 vvm.

Métodos analíticos

Determinación de viscosidad con el viscosímetro Haake modelo RV20 con control

de temperatura (Nuñez y col., 2001).

Determinación de velocidad de corte en matraz de acuerdo a Fujita y col. (1994) y

en biorreactor de tanque agitado de acuerdo a Sánchez y col. (2006).

Determinación de consumo de potencia, de acuerdo a Aiba y col. (1973).

Determinación del número de esporas, empleando cámara de Neubauer.

Determinación de azúcares reductores, por el método del DNS.

Determinación de biomasa, por peso seco.

3. Resultados y discusión.

Meta 1. Constantes cinéticas de los hongos y bacterias entomopatógenas.

Actividades:

Obtención de información sobre los antecedentes relacionados con el cultivo de la

bacteria y los hongos entomopatógenos.

La bacteria B. thuringiensis se produce principalmente a nivel industrial por

compañías transnacionales y existen muchos reportes de su cultivo sobre estudios

realizados para optimizar su producción. Sin embargo, esos estudios se realizan

usando materias primas de producción regional, como suero de leche, melazas e

incluso aguas residuales de la industria cervecera, así como cepas de B.

thuringiensis nativas de esas regiones.

En la literatura se ha reportado una velocidad específica de crecimiento de 0.65 h-1

(González y col., 2011), sin mencionar las condiciones en las que lo lograron.

También se ha reportado una concentración de 5 x 109 esporas /mL en

biorreactores de 1100 L (Razo y col., 1997), que es de los mayores volúmenes

que se han empleado. Sin embargo, a nivel industrial es posible que la producción

se realice en biorreactores de mayor tamaño.


Con respecto al hongo B. bassiana se han reportado concentraciones hasta de 1.2

x 109 esporas/mL, en un biorreactor de tanque agitado de 7 L, equipado con una

turbina Rushton y una propela Maxflo (Aquiles y col., 2006).

Meta 2. Estrategia de preparación de inóculos.

Actividades:

Establecimiento de los programa de preparación de inoculo de la bacteria y de los

hongos entomopatógenos.

Para la bacteria Baciluus thuringuiensis

La preparación de inoculo se realizó a partir de cepas crecidas en medio de agar

nutritivo en tubo inclinado. 5 mL de medio de cultivo estéril se agregaron al tubo y

se agitó en vortex para formar una suspensión celular, la cual se usó para inocular

un matraz Erlenmeyer de 250 mL, conteniendo 45 mL de medio de cultivo estéril a

pH de 7.0. El cultivo se incubó a 30 °C durante 24 h a 200 rpm. Los 50 mL de

cultivo se utilizaron para inocular el biorreactor de 0.5 L y el cultivo se realizó a pH

7, 30 °C, variando las condiciones de agitación y aireación. Al final, éste cultivo

sirvió para inocular el biorreactor de 5 L, operándolo a pH 7, 30 °C y variando las

condiciones de agitación y aireación.

Para el hongo Beauveria bassiana.

La preparación de inoculo se realizó a partir de cepas crecidas durante 20 días en

medio PDA en tubo inclinado. 5 mL de una solución isotónica con Tween 80 al 1%

se agregaron al tubo y se agitó en vortex para formar una suspensión celular, la

cual se usó para inocular un matraz Erlenmeyer de 250 mL, conteniendo 45 mL de

medio de cultivo estéril a pH de 5.4. El cultivo se incubó a 28 °C durante 4 días a

130 rpm. Los 50 mL de cultivo se utilizaron para inocular el biorreactor de 0.5 L y

el cultivo se realizó a pH 5.4, 28 °C, variando las condiciones de agitación y

aireación. Al final, éste cultivo sirvió para inocular el biorreactor de 5 L, operándolo

a pH 5.4, 28 °C y variando las condiciones de agitación y aireación.


Meta 3. Constantes cinéticas de los microorganismos a nivel de matraz.

Actividades:

Determinación de cinéticas de crecimiento y producción en el cultivo de la bacteria

y de los hongos en matraz, empleando reactivos grado técnico.

Para la bacteria B. thuringiensis se presenta la figura 1, que muestra la cinética de

crecimiento y producción de esporas creciendo en glucosa a nivel de matraz. Las

constantes cinéticas fueron: velocidad específica máxima de crecimiento de 0.38

h-1 y productividad global de 7.3 x 108 esporas/L h.

Figura 1. Cinética de crecimiento de Bacillus thuringiensis en matraz. Peso seco

(□), glucosa (∆) y esporas/mL (●).

Para el hongo B. bassiana se presenta la figura 2, que muestra la cinética de

crecimiento y producción de esporas creciendo en melaza a nivel de matraz. Las

constantes cinéticas fueron: velocidad específica máxima de crecimiento de 0.040

h-1 y productividad global de 1.79 x 109 esporas/L h.

0.00E+00

5.00E+06

1.00E+07

1.50E+07

2.00E+07

2.50E+07

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 10 20 30 40E

spo

ras/

mL

Pes

o s

eco

(g

/L),

Glu

cosa

(g

/L)

Tiempo (h)


Figura 2. Cinética de crecimiento de Beauveria bassiana en matraz. Peso seco

(□), azúcares reductores (∆) y esporas/mL (●).

Meta 4. Constantes cinéticas de los microorganismos usando inductores a

nivel de matraz.

Actividades:

Estudiar el efecto de inductores sobre la productividad del cultivo de los hongos en

matraz.

Para la bacteria B. thuringiensis se presenta la figura 3, que muestra la cinética de

crecimiento y producción de esporas creciendo en melaza y usando quitina como

inductor a nivel de matraz. Las constantes cinéticas fueron: velocidad específica

máxima de crecimiento de 0.248 h-1 y productividad global de 8.3 x 108 esporas/L

h

El uso de quitina en el medio de cultivo, provocó la disminución (30%) de la

velocidad de crecimiento máxima y aumentó (10%) la productividad de esporas,

comprobando el efecto inductor de la quitina en la producción de esporas.

0.00E+00

5.00E+07

1.00E+08

1.50E+08

2.00E+08

0.000

1.000

2.000

3.000

4.000

5.000

6.000

7.000

0 50 100 150

Esp

ora

s/m

L

Bio

ma

sa (

g/L

), A

zúca

res

red

uct

ore

s (g

/L)

Tiempo (h)


Figura 3. Cinética de crecimiento de Bacillus thuringiensis utilizando quitina al 1%

en matraz. Peso seco (□), glucosa (∆) y esporas/mL (●).

Para el hongo B. bassiana se presenta la figura 4, que muestra la cinética de

crecimiento y producción de esporas creciendo en melaza y usando quitina como

inductor a nivel de matraz. Las constantes cinéticas fueron: velocidad específica

máxima de crecimiento de 0.036 h-1 y productividad global de 1.85 x 109 esporas/L

h.

Figura 4. Cinética de crecimiento de Beauveria bassiana utilizando un inductor

(quitina al 1%) en matraz. Peso seco (□), glucosa (∆) y esporas/mL (●).

0.00E+00

5.00E+06

1.00E+07

1.50E+07

2.00E+07

2.50E+07

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 5 10 15 20 25 30

Esp

ora

s/m

L

Pes

o s

eco

(g

/L),

Glu

cosa

(g

/L)

Tiempo (h)

0.00E+00

5.00E+07

1.00E+08

1.50E+08

2.00E+08

0

1

2

3

4

5

6

7

0 20 40 60 80 100

Esp

ora

s/m

L

Bio

ma

sa (

g/L

), A

zúca

res

red

uct

ore

s (g

/L)

Tiempo (h)


El empleo de quitina como un ingrediente del medio de cultivo, ocasionó una

disminución (10%) de la velocidad de crecimiento máxima y un aumento (3%) en

la productividad de esporas. En efecto, son valores mínimos que no muestran

claramente un efecto inductor de la quitina sobre la producción de esporas.

Meta 5. Parámetros de hidrodinámica y de transferencia de oxígeno en

biorreactor de 0.5 L.

Actividades:

Estudio de reología, parámetros hidrodinámicos, de transferencia de oxígeno y

consumo de potencia en el cultivo de la bacteria y de los hongos en biorreactor de

0.5 L. Determinar productividades y rendimientos.

El comportamiento reológico del cultivo de B. thuringiensis obtenido al final de la

fermentación, se presenta en la figura 5. En efecto, el caldo de cultivo conteniendo

células, cristal y esporas, se comporta como un líquido Newtoniano.

Figura 5. Comportamiento reológico del cultivo de Bacillus thuringiensis (o) y del

cultivo de Beauveria bassiana obtenidos en biorreactor de 0.5 L (□).

y = 0.0012x - 0.0797R² = 0.9976

y = 0.0014x - 0.2779R² = 0.992

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0 500 1000 1500 2000

Esf

uer

zo d

e co

rte

(Pa)

Velocidad de corte (1/s)


El comportamiento reológico del cultivo de B. bassiana obtenido al final de la

fermentación, se presenta en la figura 5. En efecto, el caldo de cultivo conteniendo

células se comporta como un líquido Newtoniano.

Debido a que el comportamiento reológico de ambos caldos de cultivo al final de la

fermentación son Newtonianos, se puede considerar que los parámetros

hidrodinámicos, de transferencia de oxígeno y consumo de potencia, son

semejantes a los que se obtuvieron en el biorreactor empleando agua y que se

presentan en las tablas 1 y 2, junto con las productividades de los cultivos de B.

thuringiensis y B. bassiana, respectivamente.

Tabla 1. Parámetros hidrodinámicos, de transferencia de oxígeno y consumo de

potencia en el cultivo de Bacillus thuringiensis en biorreactor de 0.5 L.

Velocidad

de

agitación

(rpn)

Velocidad

de

aireación

(vvm)

Velocidad

de corte

(s-1)

Coeficiente

volumétrico

de

transferencia

de oxígeno

(h-1)

Consumo

de

potencia

(W/L)

Productividad

(Esporas/Lh)

400

0.5 270 23 0,23 1.5 x 108

400 1.0 260 30 0,21 2.3 x 108

700 0.5 635 158 1,32 6.9 x 108

700 1.0 603 170 1,21 7.3 x 108


potencia en el cultivo de Beauveria bassiana en biorreactor de 0.5 L.

Velocidad

de

agitación

(rpm)

Velocidad

de

aireación

(vvm)

Velocidad

de corte

(s-1)

Coeficiente

volumétrico

de

transferencia

de oxígeno

(h-1)

Consumo

de

potencia

(W/L)

Productividad

(Esporas/Lh)

400 0.5 270 23 0,23 2.3 x 109

400 1.0 260 30 0,21 1.2 x 109

700 0.5 635 158 1,32 2.7 x 109

700 1.0 603 170 1,21 3.3 x 109


Meta 6. Criterio y zona de escalamiento para biorreactor de 5 L.

Actividades:

Desarrollo de la estrategia de escalamiento de biorreactor de 0.5 L a biorreactor

de 5 L. Diseño de experimentos.

A partir de la información obtenida en los experimentos realizados en biorreactores

de 0.5 L, con respecto a la productividad alcanzada en función del coeficiente

volumétrico de transferencia de oxígeno, se estableció la zona efectiva de

escalamiento.

Para la bacteria B. thuringiensis el factor más importante a considerar como factor

de escalamiento es el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, que

debe ser mayor a 150 h-1 para que la productividad de formación de esporas sea

mayor a 6 x 108 esporas/Lh, tal y como se muestra en la tabla 3.

Para el hongo B. bassiana, el factor más importante a considerar como factor de

escalamiento no es el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno ni el

consumo de potencia, tal y como se muestra en la tabla 4. Al parecer, es posible

emplear un bajo coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, del orden de

23 h-1; y potencias bajas, del orden de 0.21 W/L, para obtener la misma

productividad de esporas que la obtenida a mayores coeficientes volumétricos de

oxígeno y mayores potencias.

Meta 7. Parámetros de hidrodinámica y de transferencia de oxígeno en

biorreactor de 5 L.

Actividades:

Caracterización cinética, reológica, hidrodinámica, de transferencia de oxígeno y

consumo de potencia en los cultivos de la bacteria y de los hongos en biorreactor

de 5 L. Evaluación de productividades y rendimientos.

La cinética de crecimiento de B. thuringiensis realizada en biorreactor de 5 L,

produjo una velocidad específica máxima de crecimiento de 0.40 h-1 y una


productividad global de 8.9 x 108 esporas/L h. Estos dos parámetros son mayores

que los encontrados en el biorreactor de 0.5 L; la razón de este hecho es

principalmente que en el biorreactor de 5 L el coeficiente volumétrico de

transferencia de oxígeno y la potencia por unidad de volumen son mayores que

los que hubo en el biorreactor de 0.5 L.

En la cinética de crecimiento de B. bassiana en biorreactor de 5 L resultaron con

una velocidad específica máxima de crecimiento de 0.039 h-1 y una productividad

de 1.85 x 109 esporas/L h. Estos dos parámetros son semejantes a los

encontrados en el biorreactor de 0.5 L. En efecto, al parecer no hay un efecto

significativo del coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, ni de la

potencia consumida por unidad de volumen, sobre la productividad de formación

de esporas.

Con respecto al comportamiento reológico del cultivo de B. thuringiensis obtenido

al final de la fermentación en biorreactor de 5 L, se tuvo que el caldo de cultivo

conteniendo células, cristal y esporas, se comporta como un líquido Newtoniano.

De la misma manera, el comportamiento reológico del cultivo de B. bassiana

obtenido al final de la fermentación, fue el de un líquido Newtoniano.

Los parámetros hidrodinámicos, de transferencia de masa y de consumo de

potencia se presentan en las tablas 3 y 4. Debido a que el comportamiento

reológico de ambos caldos de cultivo al final de la fermentación son Newtonianos,

se puede considerar que los parámetros hidrodinámicos, de transferencia de

oxígeno y consumo de potencia, son semejantes a los que se obtuvieron en el

biorreactor empleando agua y que se presentan en las tablas 3 y 4, junto con las

productividades de los cultivos de B. thuringiensis y B. bassiana, respectivamente.


potencia en el cultivo de Bacillus thuringiensis en biorreactor de 5 L.

Velocidad Velocidad Velocidad Coeficiente Consumo Productividad


de

agitación

de

aireación

de corte volumétrico

de

transferencia

de oxígeno

de

potencia

Esporas/Lh

400 0.5 503 39 0.22 5.5 x 108

400 1.0 477 50 0.21 6.0 x 108

700 0.5 1165 210 1.52 7.9 x 108

700 1.0 1105 240 1.36 8.9 x 108


potencia en el cultivo de Beauveria bassiana en biorreactor de 5 L.

Velocidad

de

agitación

Velocidad

de

aireación

Velocidad

de corte

Coeficiente

volumétrico

de

transferencia

de oxígeno

Consumo

de

potencia

Productividad

Esporas/Lh

400 0.5 503 39 0.22 2.9 x 109

400 1.0 477 50 0.21 1.0 x 109

700 0.5 1165 210 1.52 2.2 x 109

700 1.0 1105 240 1.36 3.6 x 109

Los resultados de la tabla 3 demuestran que en efecto, la productividad de

esporas de B thuringiensis aumenta al aumentar el coeficiente volumétrico de

transferencia de oxígeno. Este comportamiento ya se había observado en el

cultivo de B. thuringiensis en el biorreactor de 0.5 L; por lo cual, para alcanzar

productividades del orden de 8.9 x 108 esporas/L h, es necesario que el

biorreactor provea de un coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno del

orden de 240 h-1. Este hecho concuerda con la literatura, pues el cultivo de B.

thuringiensis es un proceso altamente demandante de oxígeno.


Los resultados de la tabla 4 confirman lo observado en el biorreactor de 0.5 L, que

la productividad de esporas de B. bassiana no depende del coeficiente volumétrico

de transferencia de oxígeno. Estos resultados denotan que la zona de

escalamiento para el proceso de producción de esporas de B. bassiana es muy

amplia, de manera que aún a bajos coeficientes volumétricos de transferencia de

oxígeno (39 h-1) y vahos valores de consumo de potencia (0.21 W/L), la

productividades obtenidas son semejantes a las obtenidas a mayores coeficiente

volumétricos de transferencia de oxígeno (ver tabla 6).


La mayor velocidad específica máxima de crecimiento y la mayor productividad de

esporas de B. thuringiensis se obtuvieron en el biorreactor de 5 L, donde hubo

mayores coeficientes volumétricos de transferencia de oxígeno y potencia por

unidad de volumen que en el biorreactor de 0.5 L. Para tener una productividad de

8.9 x 108 esporas/L h, el cultivo debe ser realizado en un biorreactor que

proporcione un coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno de 240 h-1 y

una potencia por unidad de volumen de 1.36 W/L

La velocidad específica máxima de crecimiento y la mayor productividad de

esporas de B. bassiana, al parecer no dependen del coeficiente volumétrico de

transferencia de oxígeno ni del consumo de potencia, pues en los intervalos de

dicho coeficiente de 23 h-1 a 240 h-1; y de 0.21 W/L a 1.21 W/L, la productividad

estuvo en el intervalo de 1 a 3.6 x 109 esporas/L h.

El comportamiento reológico de los cultivos de B thuringiensis y B bassiana fue de

tipo Newtoniano; situación que permite la aplicación de ecuaciones considerando

propiedades físicas del agua y favorece trasladar los resultados a varias escalas

de producción.

Impacto de la investigación


Los resultados de este proyecto son la base para el desarrollo de procesos

industriales de producción de 2 bioinsecticidas, que al estar en un solo producto

confieren un espectro de acción sobre un mayor número y tipo de plagas de

cultivos de importancia económica, como por ejemplo el cultivo de tomate en el

Estado de Sinaloa.

En este proyecto se realizaron cultivos del hongo B. bassiana y de la bacteria B.

thuringiensis empleando materias primas baratas y se encontraron las condiciones

de operación de los biorreactores, con los que sus costos de operación son los

más bajos, en la obtención de los bioinsecticidas. Entonces, a menores costos de

producción, menores precios de venta y mayores las posibilidades para que los

productores los puedan emplear, minimizando el uso de insecticidas químicos y

los daños que esto ocasiona.

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Módulo III. “Diseño y evaluación de bioinsecticidas micro y

nanoencapsuladas para el control de plagas del tomate en Sinaloa”.


Diseñar y evaluar la patogenicidad, persistencia y residualidad de nuevas

formulaciones nano y microencapsuladas a base dos hongos y bacterias

entomopatógenas contra las principales plagas del tomate.

1. Aislamiento y conservación de cepas de hongos entomopatógenos

2. Aislamiento y conservación de cepas de Bt

3. Cría de insectos

4. Establecimiento de las crías en laboratorio

5. Producción de hongos y bacterias

6. Diseño de formulaciones de HE

7. Diseño de formulaciones de Bt

8. Evaluación de formulados de HE

9. Evaluación de formulados de Bt


META 1. AISLAMIENTO Y CONSERVACIÓN DE CEPAS DE HONGOS

ENTOMOPATÓGENOS

Aislamiento, propagación y conservación de cepas de Bb, Ma e If

Se colectaron muestras de suelo en 5 municipios de la zona Norte del Estado de

Sinaloa (5 puntos por cada municipio, 25 sitios en total): Choix, Ahome, El Fuerte,

Guasave y Sinaloa de Leyva (Cuadro 1). El aislamiento de los hongos

entomopatógenos se realizó utilizando un medio selectivo para Beauveria

bassiana, Metarhizium anisopliae e Isaria fumosorosea a base de cloruro de cobre,

cristal violeta y benzoato de sodio, a diferentes concentraciones (Ruelas y García,

2010).

La identificación se llevó a cabo de acuerdo a las características morfológicas de

los hongos, especialmente las estructuras de reproducción de acuerdo a las claves


taxonómicas de Humber (1997). Los aislamientos fueron conservados por

triplicado en crioviales con medio de cultivo LB y 15% de crioprotector

almacenándose en un ultracongelador a –70° C. Además, se realizó su

identificación molecular.

META 2. AISLAMIENTO Y CONSERVACIÓN DE CEPAS DE BT

Aislamiento y conservación de cepas nativas y cepas de colección de Bt

Colecta de muestras de suelo

Se recolectaron muestras de suelo en áreas cultivadas con tomate y de áreas no

cultivadas en los mismos sitios anteriormente indicados en Sinaloa, las colectas se

realizaron semanalmente.

Se tomó 1kg de muestra de suelo de cada uno de los sitios por triplicado a una

profundidad de alrededor de 10 a 15 cm, por medio de la técnica de 5 de oros, que

consiste en tomar una cantidad de suelo de cada una de las cuatro esquinas que

conforman el terreno donde se encuentra establecido el cultivo y una del centro,

se homogenizo hasta obtener 1 Kg, en el caso de las áreas no cultivadas cercanas

al cultivo, las muestras se tomaron de los surcos de tomate que no contenían

plántulas, las muestras se colocaron en bolsas de plástico y se trasladaron al

laboratorio de biotecnología agrícola del CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa, debidamente

etiquetadas.

En el laboratorio las bolsas se dejaron una semana al aire libre para eliminar el

contenido de humedad. Después se tamizaron para retirar piedras, terrones,

plantas, insectos o basura.

Técnica de aislamiento

Se realizaron diluciones 1:10 a partir de las muestras de suelo. Se tomó 1g de

suelo de tamaño de partícula fina. Se adiciono en 9 mL de agua destilada estéril

en un tubo de ensaye de 18x150 mm. Esta dilución 1:10 fue pasteurizada a 80 °C

durante 15 min. La muestra se sometió a un shock térmico frío, colocando los

tubos en baño de hielo durante 5 min. Posteriormente el tubo se sometió a un

nuevo proceso de pasteurización a 80 °C durante 5 min.


A partir de esta se realizaron diluciones seriadas tomando 1 mL de la dilución 1:10

y colocándola en un tubo con 9 mL de agua destilada estéril para de esta manera

obtener la solución 1:100 o 1x10-2, a partir de esta se repitió el procedimiento

hasta generar una dilución del suelo de 1x10-5. De las tres últimas se tomó una

alícuota de 100 µl (0.1 ml) y se pasó a una placa con agar nutritivo. La muestra se

expandió mediante un proceso de estriado en 3 cuadrantes.

Identificación macroscópica

Las placas se incubaron a 30 °C durante 24 h, y se seleccionan colonias con

características típicas de Bt (colonias color crema, con bordes redondeados, ligera

elevación cóncava). Cada colonia fue trasferida a una nueva placa, las colonias

resembradas fueron incubadas a 30 °C por espacio de 96 h, cerciorándose de

llevar a cabo el monitoreo de la aparición de las esporas y de los respectivos

cristales proteicos.

Las colonias cristalíferas fueron conservadas en tubos con agar nutritivo inclinado

e incubadas por espacio de 24 h, las cuales posteriormente se conservaron a 4

°C.

Prueba de la Catalasa

Una vez seleccionadas las colonias a resembrar, se realizó la prueba de la

catalasa adicionando una pequeña gota de H2O2 sobre la colonia original con la

finalidad de observar la efervescencia de la solución (Catalasa positiva).

Identificación microscópica

Posteriormente se seleccionan las colonias para realizarles un frotis y la tinción de

Gram, la cual permite diferenciar bacterias Gram positivas de bacterias Gram

negativas.

Frotis y tinción de Gram

Se colocó una gota de solución salina estéril en un portaobjetos, con el asa

bacteriológica estéril, se tomó un inoculo de la colonia elegida y se colocó en la


gota de solución salina, con el asa bacteriológica se logró esparcir a lo largo del

portaobjetos, se dejó secar al aire libre, fijando el frotis a la flama del mechero y se

tiñe de la siguiente manera: Cubrir con cristal violeta 1 min, lavar con agua

corriente, sacudir levemente para quitar el exceso de agua, cubrir con lugol un

min, lavar nuevamente, poner un instante alcohol acetona para decolorar, lavar

nuevamente, cubrir con safranina por 30 s, lavar nuevamente, dejar secar y

observar al microscopio.

META 3. CRÍA DE INSECTOS

Selección de los insectos plaga para su cría en laboratorio

Se seleccionaron las principales plagas que están ejerciendo daños de

importancia económica en tomate en Sinaloa con base a los daños observados en

los cultivos en hojas y fruto, así como en los virus y enfermedades que transmiten,

para evaluar los micro y nano encapsulados elaborados.

META 4. ESTABLECIMIENTO DE LAS CRÍAS EN LABORATORIO

Establecimiento de la cría de los cuatro insectos plaga en laboratorio

Cría de gusano del fruto Helicoverpa zea (Boddie) y gusano soldado

Heliothis virescens (Fabricius)

Se colocaron individualmente larvas neonatas de gusano del fruto y gusano

soldado en recipientes de plástico con dieta artificial (cubos de 3 cmx3 cm). Se

mantuvieron a 25 ± 2 °C y una humedad relativa (HR) entre el 30 y 50%

(Humidificador Bio-Rad).

La dieta fue elaborada siguiendo la metodología de Greene et al., (1976) con

algunas modificaciones (Gaxiola, 2012). Consiste en una mezcla de proteínas,

vitaminas, bacteriostáticos y fungistáticos (Cuadro 2).

Elaboración de la dieta:

Se disuelve el agar en 400 mL de agua destilada, la mezcla se calienta en

agitación constante durante 20 min a 95 °C y se mezcla con 300 mL de agua

destilada, la harina de maíz nixtamalizado, el germen de trigo y la levadura de


cerveza. La mezcla se enfrió a 60 °C y se incorporará el ácido ascórbico, el ácido

sórbico, las vitaminas y el metilparabeno sódico. Previamente el ácido ascórbico,

el ácido sórbico y las vitaminas se diluyeron en 10 mL de agua, el metilparabeno

sódico se disuelve en 10 mL de alcohol. La dieta artificial se colocó en recipientes

de plástico de forma rectangular a temperatura ambiente, finalmente una vez

solidificada se corta en cubos de 1 x3 cm y se almacena a 4°C.

Las larvas de gusano del fruto y soldado se colocaron en recipientes de plástico

con dieta artificial por separado y se guardaron a 25 ± 2 °C y una HR de 30 a 50%.

Las pupas fueron transferidas a una trampa para adultos, la cual está formada por

un cubo metálico cubierto por una malla, y en el fondo se coloca arena húmeda

para mantener la HR. Los adultos se colocaron en bolsas de papel en contacto

con una solución de glucosa al 1% para su alimentación y cópula. Las pupas y los

adultos se mantienen a 25 ± 2 °C y una HR del 50-70%.

Cuadro 2. Dieta artificial para cría de larvas de H. virescens (modificada por

Greene et al., 1976)

Reactivo Cantidad

Harina de maíz nixtamalizado 120 g

Germen de trigo 55 g

Levadura de cerveza 35 g

Ester metílico de ácido 4- hidroxibenzóico

(Metilparabeno sódico)

2.2 g

Vitaminas 15 mL

Ácido ascórbico 3.5 g

Ácido sórbico 1.1 g

Agar bacteriológico 15 g

Agua destilada 700 mL

Cría de mosquita blanca (Bemisia tabaci (Genn.)

Antes del inicio de la cría de mosquita blanca, se preparan macetas con plántulas

de tomate de 15-20 cm de altura. La cría inicial se estableció colectando


especímenes en plantas infestadas con la especie de interés. En el laboratorio se

purifico la especie a criar al seleccionar los adultos que sirvieron para infestar las

plántulas de tomate. Las plántulas se colocaron en una jaula entomológica,

elaborada con organdí o Tricot y mantenida bajo condiciones de invernadero.

Los adultos colectados de mosquita blanca se introducen en la jaula con las

plántulas de tomate. Los adultos ovipositan en el envés de las hojas y las ninfas

recién emergidas se desplazaron unos centímetros hasta quedar en un lugar de

manera permanente. Conforme las ninfas se alimentaron y completaron su

desarrollo, apareció la nueva generación de adultos. Para continuar con la cría se

introdujeron plántulas nuevas para ser infestadas por los nuevos adultos. Se

continúa con este proceso hasta contar con la población de adultos necesarios

para el objetivo del estudio.

Cría de paratrioza (Bactericera cockerelli Sulc.)

Se prepararon plántulas de chile de 30 a 40 días de edad, las cuales se colocaron

en una jaula entomológica elaborada con tela tricot u organdí. La colecta de

adultos se realizó directamente con un aspirador sobre plantas de chile o papa

infestadas en campo. Los adultos colectados se colocaron en las jaulas con

plántulas de chile bajo condiciones de invernadero donde posteriormente

ovipositaron.

Los huevos eclosionaron a los 5 días y posteriormente las ninfas se establecieron

en el envés de las hojas y puntas de crecimiento. Los adultos emergieron a los 20-

25 días posterior a la oviposición. Con la aparición de la nueva generación de

adultos se colocan nuevas plántulas de chile para repetir el ciclo del insecto hasta

contar con los especímenes necesarios para los bioensayos.

Todos los insectos criados en laboratorio debieron completar por lo menos 2

generaciones para que se encontraran libres de los contaminantes del campo.

META 5. PRODUCCIÓN DE HONGOS Y BACTERIAS ENTOMOPATÓGENAS

Propagación masiva de hongos y bacterias en matraz y fermentador de 7L


En laboratorio se mantienen activas las cepas de hongos entomopatógenos en

medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA), en cajas petri se les adiciono quitina y

extracto de levadura, a los tubos de ensayo solo se le adiciona extracto de

levadura como suplemento, en el caso de las muestras que se mantienen en

crioconservación para mantener su viabilidad se les adiciona quitina y extracto de

levadura; para llevar acabo la activación de las cepas utilizadas en la

crioconservación llevando un proceso de esterilización para evitar contaminación.

Aplicando la técnica de vaciado en cajas Petri.

Los aislamientos de hongos entomopatógenos fueron conservados en tubos de

ensayo como un resguardo para luego ser resembrados, en cajas de Petri con

medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA) más quitina, con la técnica de estriado

que se realizó en una campana de flujo laminar específica para hongos. Los

aislamientos resembrados se incubaran en una cámara bioclimática hasta su

esporulación. Una vez esporulados se resguardaran para luego llevar acabó su

cosecha.

Los aislamientos esporulados en cajas Petri se cosechan en crioviales, a los

cuales se les agregó medio de cultivo líquido papa dextrosa con glicerol, por

triplicado. Una vez en el ultracongelación por varios días una repetición fue

descongelada a temperatura ambiente y resembrados por estriado en cajas Petri

con medio de cultivo PDA para verificar su viabilidad.

Propagación masiva de HE

Se propagaron los hongos entomopatogenos Beauveria bassiana (cepa B16),

Metarhizium anisopliae (Cepa HM13) e Isaria fumosorosea (Cepa If19) en medio

de cultivo sintético con melaza como fuente de carbono. El medio contenía una

concentración de 7g/L de azúcares reductores y sulfato de amonio como fuente de

carbono. La corrida se realizó en matraz de 500 mL con 200 mL de medio. Las

condiciones de la fermentación fueron: 25°C, pH =4.5, y 200 rpm el tiempo de

fermentación fue de 36 h. Estos microorganismos una vez propagados en matraz

fueron inoculados en un fermentador de 7L para contar con cantidades mayores

para su formulación micro y nanoencapsulada en el secador por aspersión.


Propagación masiva de BE

Obtención del complejo espora-cristal mediante la técnica de co-

precipitacion lactosa-acetona

Se trabajó con cepas de Bacillus thuringiensis proporcionadas por el Centro de

Biotecnología Genómica del IPN. Debido a que los aislamientos obtenidos en

Sinaloa aún requieren pruebas de identificación molecular para conocer los genes

Cry y Cyt que contienen y la morfología de los cristales.

Los extractos espora cristal fueron obtenidos mediante la técnica de co-

precipitación con lactosa- acetona descrita por Dulmage (1970). Las cepas fueron

activadas en tubos con agar nutritivo inclinado, e incubadas por 18 h, a 30 °C.

Posteriormente las cepas activadas fueron utilizadas para inocular matraces de

250 mL con 50 mL de caldo triptosa fosfato (CTP), los cuales fueron incubados por

18 h a 30 °C y 200 rpm de agitación. Finalmente fueron inoculados 10 matraces de

500 mL de capacidad con 100 mL de medio de cultivo a base de melaza, harina

de soya, líquido de remojo de maíz y carbonato de calcio. Los matraces se

incubaron a una atmosfera y 30 ºC, con una agitación de 200 rpm, y a la vez

fueron monitoreados en diferentes intervalos de tiempo hasta obtener cultivos con

un 80% de las células en la fase final de la esporulación. El pH del medio de

cultivo fue medido y ajustado en el rango de 7.0-7.2.

El complejo espora-cristal se obtuvo por el método de co-precipitación lactosa-

acetona (Dulmage, 1970), para ello el medio de cultivo fue centrifugado a 10,000

rpm por 30 min a 5 °C. El pellet es pesado para después preparar una solución de

lactosa al 5% en una proporción de 1.71 (factor) el volumen del peso del

precipitado. Este volumen fue adicionado al pellet y se sometió a agitación en una

base magnética a una velocidad media por espacio de 30 min. A continuación se

adicionó 3.34 volúmenes de acetona en relación al peso del precipitado y el

volumen de lactosa al 5% adicionado, continuando la agitación por 30 min más.

Posterior a este proceso, el complejo espora- cristal de cada cepa de B.

thuringiensis fue obtenido mediante filtración al vacío. Finalmente el extracto

obtenido fue lavado con 2 volúmenes de acetona, pulverizado y almacenado.


META 6. DISEÑO DE FORMULACIONES DE HE

Las diluciones de los diferentes hongos (Beauveria bassiana, cepa B16),

(Metarhizium anisopliae cepa HM13) y cepa If19 de Isaria fumosorosea,

blastosporas-micelio, ajustadas a una concentración de 1x106 blastosporas/mL, y

esporas a una concentración de 1.5x1011 esporas/g fueron formuladas para

obtener un polvo microencapsulado obtenido por aspersión en un secador a

escala laboratorio B-191 (Büchi, Flawil, Switzerland), en la planta piloto de la

UPIBI-IPN, el equipo cuenta con una boquilla de 0. 7 mm; el flujo de aire se ajustó

al 100%, la bomba al 5- 10%, el máximo valor del aspersor tuvo un valor máximo

de 100%.

El ingrediente activo: blastosporas, micelio y/o esporas fueron colocados en 10 mL

de agua en un vaso de precipitados y cubierto con papel parafilm por 30 min.

Después del periodo de hidratación, la suspensión fue agitada para formar una

pasta homogénea, hasta lograr una concentración del ingrediente activo de 0.11

g/mL. El aceite de canola y/o girasol (1-2-3) y la harina de maíz nixtamalizado

(Maseca ), fueron adicionados a la suspensión y mezclados , después la

solución de lignina y la de KH2PO4 y finalmente se adicionó la solución de NaCl.

Los ingredientes que se pusieron para formar la microcápsula aparecen en el

Cuadro 3.

Las muestras de los diferentes hongos entomopatógenos fueron procesadas a una

temperatura de entrada de 120°C y 62°C de salida. Con un flujo de alimentación

de 20 mL/min. Se pusieron 300 mL de la suspensión de cada hongo para la

alimentaron del secador por cada lote.


Cuadro 3. Ingredientes de las formulaciones de hongos entomopatógenos.

Ingredientes Componentes de la

formulación

Blastosporas-micelio-esporas 10 g

Agua 87 mL

Harina de maíz nixtamalizado 3.4 g

Aceite de maíz 2 g

Solución de lignina 100 g/L 67 mL

Solución de KH2PO4 100g/L 2 mL

Solución de NaCl, 41.6 g/L 26.6 mL

META 7. DISEÑO DE FORMULACIONES DE BT

Diseño y elaboración de formulaciones micro y nanoecapsuladas con la

bacteria Bt

Aún no se realizan las formulaciones con Bacillus thuringiensis, sin embargo, ya

se cuenta con los microorganismos y los protocolos para la realización de las

mismas.

META 8. EVALUACIÓN DE FORMULADOS DE HE

Bioensayos DL50 y TL50, de micro y nanoencapsulados contra insectos

plaga

Una vez ya obtenidos los formulados se hicieron las siguientes determinaciones:

Recuperación de los formulados después del secado por aspersión

Contenido de Humedad

Concentración de esporas totales

Viabilidad de las esporas

Porcentaje de germinación al inicio y después del almacenamiento a

temperatura ambiente y de refrigeración

Mortalidad en larvas de B. tabaci, Bactericera cockerelli, Heliothis virescens

y Helicoverpa zea en dieta natural o artificial a nivel de laboratorio


Recuperación de los formulados después del secado por aspersión

La determinación del peso del formulado se obtuvo, por una diferencia de pesos

del formulado recuperado y colocado en un frasco de la siguiente manera:

Primeramente se obtuvo el peso promedio de los frascos, después se determinó el

peso total (frasco + formulado) y después se obtuvo el peso del formulado,

restando el peso promedio del frasco al peso total. Posteriormente con los

resultados obtenidos de la determinación de sólidos totales, se hizo una relación a

1000 mL para obtener la cantidad de sólidos totales presentes en este volumen.

Después se obtuvo el porcentaje del formulado haciendo una relación de estos

sólidos totales y la cantidad de formulado obtenido.

Contenido de humedad

A cada formulado se le determinó la humedad contenida de la siguiente manera:

Se utilizaron vidrios de reloj previamente tarados, a los cuales se les agregó 0.1 g

del formulado. Los vidrios de reloj con la muestra se colocaron en una estufa a 95

°C por 24 h, para después obtener la diferencia del peso, correspondiente a la

humedad, la cual se determinó en porcentaje.

Concentración de esporas totales iniciales en los formulados

Se disolvió 0.01 g de cada formulado en 1 mL de agua destilada estéril (en un

volumen de 10 ml), se hicieron las diluciones necesarias y se procedió al conteo

de conidias en una Cámara de Neubauer.

Viabilidad de esporas después del secado por aspersión

En matraces Erlenmeyer de 250 mL conteniendo 50 mL de caldo dextrosa

saboraud CSD + 1% de extracto de levadura estéril y 0.025 mg de estreptomicina,

se agregó 0.05 g de cada uno de los formulados a base de esporas, y se

sometieron a una agitación de 200 rpm por 24 h, esto para determinar el

porcentaje de germinación de esporas. Una vez obtenido; se calculó el número de

esporas viables, haciendo una relación entre el porcentaje de germinación y el


número de esporas iniciales del formulado, el cual representa el 100% de

viabilidad. El resultado se expresó en forma exponencial.

Porcentaje de germinación

Se prepararon matraces Erlenmeyer de 250 mL conteniendo cada uno 50 mL de

CSD + extracto de levadura al 1% y se agregó 0.05 g de cada formulado a probar.

Se colocaron los matraces en un agitador a 250 rpm y las determinaciones se

realizaron cada 24 h. Se tomó una alicuota que se colocó en un portaobjetos con

un cubreobjetos y se observó al microscopio. Se contaron 100 esporas en total

diferenciando las germinadas y no germinadas, se consideran germinadas

aquellas conidias cuyo tubo germinativo sea de la mitad del diámetro de la espora.

Esta cuenta se hizo por triplicado para cada formulado hecho a base de esporas.

Aún es necesario observar la formación de los gránulos formados en un

microscopio electrónico de barrido.

Mortalidad de larvas y ninfas a nivel de laboratorio

La determinación de la mortalidad de cada insecto de prueba se hizo por medio de

bioensayos, los cuales se realizaron de la siguiente manera: Se utilizaron vasitos

de plástico del No. 0, las cuales contenían hojas de tomate de 1 cm de diámetro,

ésta se roció con 100 L de una suspensión del formulado re suspendido en agua,

según la cantidad de sólidos totales obtenida, para obtener una concentración de

1x106 esporas/mL, el control correspondiente se re suspendió en base a los

sólidos totales. Para cada formulado y su control se utilizaron 25 vasitos por

triplcado, para dar un total de 75. En cada una se colocó una larva neonata o

ninfas en el caso de B. cockerelli y B. tabaci. Cada vasito se tapó. A los 7 días se

determinó la mortalidad de insectos. Los resultados obtenidos de este bioensayo

se sometieron a un análisis de varianza y una prueba de LSD con una P<0.05.

Mortalidad de larvas a nivel de invernadero

Se utilizaron cajas de Petrí desechables de 45 mm, a cada una de las cuales se

les colocó un disco de hoja de tomate de 12.56 cm2 de área, previamente


sumergido en la suspensión del formulado o del control, de la misma manera que

en el bioensayo con dieta natural y se dejó secar, también se colocó un disco de

papel filtro en la base de la caja para absorber el exceso de humedad. Para cada

formulado, se hicieron 8 repeticiones cada una con 10 larvas neonatas de los

diferentes insectos.

A las larvas y ninfas se les permitió alimentarse de la hoja por 24 h, para que

tuvieran suficiente contacto con las esporas o el micelio de los formulados,

posteriormente los individuos sobrevivientes se transfirieron a vasitos con dieta

natural, para determinar la mortalidad a los 7 días. Los resultados obtenidos de

este bioensayo se sometieron a un Análisis de Varianza y Prueba de Tukey para

comparación de medias con una P< 0.05.

3. Resultados

Se obtuvieron un total de 16 aislamientos de hongos entomopatógenos, de los

cuales 8 pertenecen a B. bassiana, 5 a M. anisopliae y 3 a I. fumosorosea, sus

claves están registrados en la colección del laboratorio de Bioinsecticidas del

CIIDIR Sinaloa. De los 5 municipios muestreados, en tres de ellos se encontró la

presencia de hongos entomopatógenos para éste estudio en particular (cuadro 4).

Cuadro 4. Aislamientos obtenidos en las localidades muestreadas.

Clave Aislamiento Localidad y municipio

B1 Beauveria bassiana El Vado, Choix



HM12 Metarhizium anisopliae El Vado, Choix



B16 Beauveria bassiana El Guayabito, Choix

B17 Beauveria bassiana Colexio, Choix




HM29 Metarhizium anisopliae La Uva, Guasave

HM32 Metarhizium anisopliae Cubiri, Sinaloa de Leyva

If12 Metarhizium anisopliae Cubiri, Sinaloa de Leyva

If19 Beauveria bassiana Bacubirito, Sinaloa de Leyva

If22 Beauveria bassiana Porohuí, Sinaloa de Leyva


En relación a la producción de B. thuringiensis en el tiempo cero existe una

concentración de esporas de 41000 esporas/mL de la cepa HD133, una fase de

adaptación de 10 horas, y una fase exponencial con un tiempo de 14h. La

concentración de esporas final fue de 1x108esporas/mL.

Cuadro 5. Porcentajes de mortalidad de gusano del fruto y soldado a los 7 días.

Larvas

neonatas

Gusano del

fruto

Gusano

soldado

Aislados R1 R2 R3 % de

mortalidad

R1 R2 R3 % de

mortalidad

HM13 90 70 60 73.33% 90 80 70 80%

If19 50 50 50 50% 50 50 60 53.33%

B16 90 90 80 86.66% 10 90 90 93.33%

CONTROL 20 0 20 13.33% 20 0 20 13.33%

Cuadro 6. Porcentajes de mortalidad de ninfas de mosquita blanca y paratrioza.

Ninfas Mosquita

blanca

Paratrioza

Aislados R1 R2 R3 % de

mortalidad

R1 R2 R3 % de

mortalidad

HM13 80 70 70 73.33% 90 70 90 83.33%

B16 70 60 50 60% 10 90 50 80%

If19 10 70 60 76.66% 10 70 70 80%

CONTROL 20 0 20 13.33% 20 0 20 13.33%


Después del proceso de secado, todos los formulados presentaron pérdida en el

número y viabilidad de las esporas (98% inical-86% final). La humedad de los

microencapsulados fue superior al 10% por lo que fue necesario reducirla a ˂4%

con ayuda de un deshumidificador. Los microencapsulados tuvieron solubilidad y

estabilidad a temperatura ambiente al término de un mes, y a temperaturas de


refrigeración conservaron su viabilidad por 60 días, el formulado a base de B.

bassiana mostró una adecuada conservación en las esporas, ya que su viabilidad

fue mayor de 90%. Las esporas de todos los formulados tardaron un mínimo de 12

horas en empezar a germinar, después del proceso de secado, lo cual indica que

sufrieron daño durante el proceso de secado.

Los porcentajes de mortalidad de insectos se indican en los Cuadros 5 y 6, con los

tres formulados elaborados a base de blastosporas-micelio presentando mayor

estabilidad y capacidad de rehidratación, que el elaborado a base de esporas. Se

puede observar también que con B. bassiana se obtuvieron altos porcentajes de

mortalidad (93.33%) para el gusano soldado y 86.66% para el del fruto, en relación

a los productos elaborados con M. anisopliae e I. fumosorosea menor a 80%-40%.

Con respecto a las ninfas, en el cuadro 6 se muestran los resultados de mortalidad

de ninfas de B. cockerelli y B. tabaci, siendo los productos microencapsulados

menos efectivos para el control de éstos insectos, debido probablemente a la

especificidad de los hongos entomopatógenos, y hábitos de alimentación logrando

mayor mortalidad con M. anisopliae en ambos insectos, en mayor porcentaje en

paratrioza respecto a mosquita blanca.

El desarrollo de formulaciones microencapsuladas de B. bassiana y M. anisopliae

han demostrado hasta el momento tener efectividad en las pruebas de laboratorio,

por lo que en este ciclo agrícola 2013-2014 se tendrán los resultados de validación

de la efectividad de estos formulados en campo.

Uno de los formulados elaborados destaca entre los otros por su toxicidad contra

larvas de gusano del fruto respecto a las otras plagas, esto abre la posibilidad de

obtener un bioinsecticida debidamente caracterizado que sea útil para el control

del gusano del fruto en mediano plazo.

5. BIBLIOGRAFÍA

Greene, G. L., Leppla, N. C., Dickerson, W. A., 1976. Velvetbean caterpillar: a

rearing procedure and artificial diet. Journal Economic Entomology Vol. 69,

Num 4, pp. 487 – 488.


Horaczek, A., Viernstein, H. 2004. Comparison of three commonly used drying

technologies with respect to activity of aerial conidia of Beauveria brogniartii

and Metarhizium anisopliae. Biological control. 31: 65-71.

Humber R. A. 1997. Fungi: preservation of cultures. In: (Ed). L. Lacery. Manual of

Techniques in insect pathology. Academic Press. New York USA.

Nafari, I. B. 2012. Study of microencapsulated bioinsecticide from Bacillus

thuringiensis. Bogor Agricultural University. Disponible en:

http://repository.ipb.ac.id/handle/123456789/60765

Namasivayam, K. R., Bharani R. S. A., Ansari M. R. 2013. Natural ocurrence of

potential fungal biopesticide Nomuraea rileyi (Farlow) Samson associated

with agriculture fields of Tamil Nadu, India and it´s compatibility with metallic

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Doi:10.4172/2155-6202.1000132.

Ruelas Ayala D. y C. Garcia Gutierrez. 2010. Optimization of a media with

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society for invertebrate pathology, Halifax, Canada.

http://repository.ipb.ac.id/handle/123456789/60765


Módulo IV. “Validación de la efectividad de bioinsecticidas micro y

nanoencapsulados para el control de plagas del tomate”.


Validación de la efectividad de bioinsecticidas micro y nanoencapsulados en el

control del gusano del fruto (H. virescens) del tomate.


Producción de plántula de tomate en invernadero.

En la producción de plántula de tomate en invernadero, se utilizó charolas de

poliuretano de 200 cavidades de 40 cm3 de volumen. Se sembró el híbrido Tisey,

el manejo en invernadero consistió principalmente, en aplicación de riego,

fertilización y control de plagas. La plántula de tomate fue transportada a campo

en charolas a los 35 días después de sembrada.

Establecimiento de la parcela experimental de tomate

Para la evaluación en campo se estableció una parcela de cultivo de tomate

(fotografía 1). El experimento consistió en un diseño de bloques completamente al

azar, con tres repeticiones o bloques, se preparó el terreno de acuerdo a la

tecnología regional; barbecho rastreo cruzado y marca de camas a una distancia

de 1.6 metros por 10 metros de largo y una distancia entre planta de 25

centímetros, la parcela útil consistió en un tramo de tres metros centrales de la

cama para eliminar el efecto orillas, a los costados del experimento se plantaron 4

camas de tomate que sirvieron como barreras. La plantación se realizó el día 2 de

octubre 2013 en un suelo de aluvión.


Figura1. Experimento de tomate con 3 m sin plantar entre cada bloques.

Control de plagas y maleza

Durante el desarrollo del cultivo hasta inicio de floración no se presentaron

insectos-plagas que ameritara medida de control. Se presentaron lluvias al inicio

del desarrollo del cultivo que favoreció la crecimiento de malezas para su control

se realizó de manera manual con la ayuda de herramientas de trabajo (machetes,

palas y azadones) (Fotografía 2). Las malezas que se presentaron en el cultivo

fueron correhuela Convolvulus arvensis (L), Bledo Amarantus palmeri (S),

Chuales Chenopodium spp, Zacate Jhonson Shorgum halepensis (L).

Figura 2. Control de malezas en la parcela experimental.


Monitoreo de H. virescens.

Durante floración e inicio de formación de frutos se presentó de manera natural

huevecillos de H. virescens se procedió a monitorear, en la hoja inferior

inmediata donde la planta tiene más flores abiertas, que es donde se ha

encontrado con mayor frecuencia, se encontró de cinco a seis Huevecillos viables

por cada 30 hojas muestreadas (algunos Huevecillos estaban eclosionados se

contó por igual larvas recientes), lo cual está por arriba del umbral de acción que

es al encontrar cuatro o más huevecillos viables en 30 hojas, para facilitar el

conteo se realizó a las primeras horas del día ya que las temperaturas bajas

reducen la locomoción de larvas.

Aplicación de los tratamientos

Para la aplicación de los tratamientos se utilizó una bomba de mochila marca

Truper ® con capacidad de 3.8 litros, para cada tratamiento por separado para

evitar contaminación entre ellos.

Figura 3. Mochila marca Truper ®


Cuadro 1. Descripción de tratamientos

Núm. De tratamiento

Tratamiento Descripción

1 Bb + ACEITE MINERAL Beauveria bassiana más aceite mineral

2 MA + ACEITE MINERAL Metarhizium anisopliae más aceite mineral

3 Bb MICROCAPSULAS Beauveria bassiana microencapsulado

4 MA MICROENCAPSULADO Metarhizium anisopliae microencapsulado

5 Bb + GLICERINA Beauveria bassiana más glicerina

6 MA + GLICERINA Metarhizium anisopliae más glicerina

7 QUIMICO Fastac (alfacypermetrina)

8 CONTROL Sin aplicación

Figura 4. Aplicación de los tratamientos en la parcela experimental

Evaluación del rendimiento de frutos

La cosecha de tomate se realizó de forma manual, colectando frutos totales

únicamente de la parcela útil que consistió en 4 m (6 m2), para esto se utilizaron

cubetas de 20 litros de capacidad, se contaron y pesaron los frutos de cada

tratamiento en una báscula digital marca TORO REY® . Los resultados de

rendimiento se extrapolaron a ton ha-1 para tener datos más ilustrativos.


Evaluación de daño en frutos causados por H. virescens

Una vez que se pesó el rendimiento de tomate en la parcela útil se procedió a

sacar el número de frutos daños. Se contaron los frutos que presentaron el daño

característico causado por la larva, que son perforaciones irregulares en todo el

fruto. Para evaluar el daño se observaron los frutos identificando las perforaciones

o en el fruto.

Figura 5. Larvas de H. virescens

Figura 6. Frutos dañados por larvas de H. virescens

Análisis estadístico

Los datos obtenidos de campo fueron analizados a través de un análisis de

varianza y un análisis de comparación de medias por la prueba de Tukey con un

nivel de significancia del 95% (p≤0.05) empleando el programa estadístico SAS.


3. Resultados

Evaluación de frutos totales y frutos dañados por larvas de H. virescens en

la parcela útil de cada tratamiento.

En el siguiente cuadro se observan el total de frutos de tomate y frutos dañados

recolectados en la cosecha.

Cuadro 2. Comparación de medias de frutos totales y frutos dañados por larvas de H. virescens en experimento de tomate

Núm. de tratamiento

Tratamiento Frutos totales Frutos dañados

1 Bb + ACEITE MINERAL 420.67a 9.66bc

2 MA + ACEITE MINERAL 453.33a 8.33bc

3 Bb MICROCAPSULAS 400.33a 11.66abc

4 MA MICROENCAPSULADO 412.67a 19.33ab

5 Bb + GLICERINA 407.00a 11.00abc

6 MA + GLICERINA 393.67a 13.33abc

7 QUIMICO 466.33a 4.33c

8 CONTROL 403.67a 21.33a

Medias con letras iguales dentro de cada columna y de cada factor son iguales según, Tukey (p0.05).

En frutos totales no se presentaron diferencias significativas entre tratamientos

esto es debido a que todos los tratamientos presentaron la misma fertilización y

manejo del cultivo en frutos dañados el tratamiento control (sin aplicación de

biorracional), presentó el mayor número de frutos dañados, sin presentar

diferencias significativas con los tratamientos Bb MICROCAPSULAS, MA

MICROENCAPSULADO, Bb + GLICERINA y MA + GLICERINA.

El tratamiento con menor frutos dañados fue el tratamiento químico Fastac

(alfacypermetrina), que no presentó diferencias significativas con los tratamientos

de Bb + ACEITE MINERAL y MA + ACEITE MINERAL.


Rendimiento en frutos del cultivo del tomate

El mayor rendimiento de tomate se obtuvo con el control químico y el menor

rendimiento con el tratamiento control sin aplicación de bioinsecticidas, como se

puede observar en el siguiente cuadro.

Cuadro 3. Comparación de medias de cosecha comercial y porciento de frutos dañados por larvas de H. virescens en experimento de tomate

Núm. de tratamiento

Tratamiento Rendimiento

tha-1

% Frutos dañados

1 Bb + ACEITE MINERAL 68.50 2.00

2 MA + ACEITE MINERAL 74.10 1.83

3 Bb MICROCAPSULAS 64.78 2.91

4 MA MICROENCAPSULADO 65.55 4.00

5 Bb + GLICERINA 66.00 2.7

6 MA + GLICERINA 63.41 3.33

7 QUIMICO 77.00 0.92

8 CONTROL 63.72 5

En porcentaje de frutos dañados la Universidad California (1999), establece el

umbral económico de (3.25 %) para tomate industrial, de acuerdo a esto los

mejores tratamientos serían 1,2,3,5 y el control químico y los tratamientos menos

efectivos serían 4, 6 y el control sin bioinsecticida.

Loa tratamientos de bioinsecticidas con menor porcentaje de fruto dañados fueron

Beauveria bassiana más aceite mineral y Metarhizium anisopliae más aceite

mineral, quizás el aceite mineral actué como protector solar, anti desecante,

abrillantadores que reflejen la luz solar y eviten que las esporas de los hongos se

inactiven por la acción de la luz.



El aceite mineral favorece a las cepas de hongos Beauveria y Metarhizium, a

presentar una mayor efectividad como bioinsecticidas, al aislarlos del medio

ambiente que puede afectar a las esporas de estos hongos.

El mecanismo lento de infección de los hongos para producir mortalidad en

insectos, es una desventaja frente a los productos químicos que causan una

muerte rápida; pero en comparación con los insecticidas, éstos no generan

poblaciones de insectos resistentes y no generan condiciones tan adversas al

medio ambiente como los insecticidas químicos.

5. Bibliografía.

Gastélum Luque R. 2006. El gusano del fruto en tomate y chile. Manejo de plagas

en tomate y chile (memorias). FPS, UAS, INIFAP, FIRA. 136-174 p

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UCLA (University of California). 1999. Integrate Pest Management for Tomatoes.

State Wide Integrated Pest Management Projet. Division of Agriculture and

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