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Instituto politécnico nacionali
Escuela nacional de ciencias biológicas
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN EN
ALIMENTOS
ESTUDIO DE LA ENCAPSULACIÓN DE
Bifidobacterium animalis subsp. lactis
Y SU USO COMO PROBIÓTICO
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
DOCTOR EN CIENCIAS CON
ESPECIALIDAD EN ALIMENTOS
P R E S E N T A:
GONZÁLEZ SÁNCHEZ JOSÉ FERNANDO
Director de tesis: Dr. Humberto Hernández Sánchez
Director de tesis: Dr. Gustavo Fidel Gutiérrez López
México D.F. JUNIO 2009
ii
iii
―La sabiduría consiste en saber que se sabe lo que se sabe y saber que no se
sabe lo que no se sabe‖
―Las buenas fuentes se conocen en las grandes sequías; los buenos amigos, en
las épocas desgraciadas.‖
―Si un problema tiene solución, no hace falta preocuparse. Si no tiene solución,
preocuparse no sirve de nada‖
―Si haces planes para un año, siembra arroz. Si los haces para dos lustros, planta
árboles. Si los haces para toda la vida, educa a una persona‖
iv
DEDICATORIA
A mi madre y mis hermanos,
por dedicarme un poco de su tiempo,
tiempo para demostrar su preocupación por mí,
tiempo para escuchar mis problemas
y ayudarme a buscarles solución.
A todos mis amigos que conoci
personas maravillosas.
Gracias a ustedes
me conoci un poco más
e incluso a apreciar lo que soy.
A los profesores del doctorado,
Por lo enseñado, en cada clase y
hacer nacer en mi el deseo de aprender.
A Nora, por todos los momentos
que hemos compartido
momentos llenos de sentimientos
y pensamientos compartidos,
sueños y anhelos,
secretos, risas y lágrimas,
y sobre todo, amistad.
v
AGRADECIMIENTOS
A LETY, QUE SIMPRE ESTA ATENTA A TODOS NOSOTROS, YA FUERA PARA
QUE ENTREGARAMOS DOCUMENTACIÓN Ó NO SE NOS OLVIDARAN
CIERTOS DETALLES.
A ALEX Y PATO, POR SU AYUDA EN LA PARTE EXPERIMENTAL EN SU
LABORATORIO Y POR SU APOYO INCONDICIONAL.
AL CONACYT POR LA BECA OTORGADA, QUE ME HIZO MAS FACIL LA
PERMANECNIA EN EL DOCTORADO.
vi
CONTENIDO
Página
ÍNDICE DE CUADROS…………………………………………………………... viii
ÍNDICE DE FIGURAS……………………………………………………………. ix
RESUMEN………………………………………………………………………… xi
ABSTRACT………………………………………………………………………... xiii
I. Introducción…………………………………………………………… 1
II. Antecedentes…………………………………………………………. 4
II.1. Ecología microbiana del tracto digestivo humano………………… 4
II.2. Interacción entre la bacteria comensal del intestino y el sistema
inmune………………………………………………………………….
7
II.3. Probióticos y prebióticos…………………………………………….. 8
II.4. Características de las bifidobacterias………..…………………….. 11
II.4.1 Taxonomía del Género Bifidobacterium…………………………… 12
II.4.2 Uso seguro de las Bifidobacterias…………………………………. 16
II.5. Propiedades antimicrobianas………………………………………. 20
II.5.1. Bacteriocinas…………………………………………………………. 21
II.5.2. Compuestos con función de bacteriocinas………………………… 24
II.5.3. Compuestos que inhiben la adherencia de patógenos………….. 25
II.5.4. Sideróforos……………………………………………………………. 25
II.6. Efectos fisiológicos y clínicos de las bifidobacterias……………… 26
II.6.1. Tiempo de tránsito colónico..………………………………………... 26
II.6.2 Fermentación colónica………………………………………………. 28
vii
II.6.3. Estimulación de la inmunidad………………………………………. 28
II.6.4 Efectos en el sistema inmune del colon…………………………... 29
II.6.5 Efecto de las bifidobacterias en las enfermedades
gastrointestinales……………………………………………………..
30
II.6.6. Efecto de las bifidobacterias sobre la carcinogénesis del colon… 32
II.7 Aplicaciones…………………………………………………………… 33
II.8. Encapsulación de ingredientes bioactivos………………………… 34
III Justificación…………………………………………………………… 40
IV Hipótesis……………………………………………………………..... 41
V Objetivos………………………………………………………………. 41
V.1. Objetivo General……………………………………………………… 41
V.2. Objetivos Específicos………………………………………………… 41
VI Materiales y métodos………………………………………………… 42
VI.1. Materiales……………………………………………………………… 42
VI.2. Desarrollo experimental……………………………………………… 43
VI.3. Metodología…………………………………………………………… 44
VII Resultados y discusión……………………………………………… 53
VIII Conclusiones………………………………………………………… 80
IX Referencias…………………………………………………………… 82
viii
ÍNDICE DE CUADROS
Página
Cuadro 1 Lista de especies del género Bifidobacterium………………... 12
Cuadro 2 Resumen del nombre de las bacteriocinas purificadas de
bifidobacterias…………………………………………………….
21
Cuadro 3 Espectro de la actividad antimicrobiana de los compuestos
proteínicos inhibitorios obtenidos de las bifidobacterias……..
23
Cuadro 4 Algunas cepas de bifidobacterias empleadas en
aplicaciones comerciales………………………………………..
33
Cuadro 5 Efectos favorables de la encapsulación de probióticos…….. 39
Cuadro 6 Peso y diámetro de las cápsulas de alginato…………………. 56
Cuadro 7 Células atrapadas por gramo de cápsulas……………………. 58
Cuadro 8 Comparación de las características de las cápsulas
hidratadas y deshidratadas……………………………………...
61
Cuadro 9 Indicadores morfométricos de cápsulas tratadas en
condiciones de simulación gástrica……………………………
65
Cuadro 10 Viabilidad de las bifidobacterias libres y encapsuladas por
tamaño y concentración de alginato después de la
simulación gástrica……………………………………………….
67
Cuadro 11 Cambios de pH del kéfir con bifidobacterias durante el
almacenamiento…………………………………………………..
77
ix
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1 Cambios en la microbiota intestinal en bebes desde recién nacido
hasta los 7 días de edad…………………………………………………
5
Figura 2 Cambios de la microbiota intestinal con la edad…………………….. 6
Figura 3 Defensa inmune contra la bacteria comensal del intestino…………. 8
Figura 4 Formación de acetato y lactato de glucosa por el ciclo bifidum…….. 13
Figura 5 Árbol filogenético de las bifidobacterias……………………………….. 15
Figura 6 Criterios de selección para probioticos….…………………………….. 16
Figura 7 Estructura química de los ácidos biliares……………………………… 19
Figura 8 Esquema hipotético que muestra los efectos antimicrobianos de
los componentes proteínicos obtenidos de las bifidobacterias……..
20
Figura 9 Métodos de cubierta por aspersión para encapsular probióticos….. 37
Figura 10 Tecnologías de gelificación de partícula para la
microencapsulación de probióticos…………………………………….
38
Figura 11 Morfología de las bifidobacterias………………………………………. 54
Figura 12 Cinética de la fermentación de Bb 12…………………………………. 54
Figura 13 Curva tipo bacterias vs absorbancia a 660 nm……………………….. 55
Figura 14 Curvas de secado de las esferas de alginato………………………… 59
Figura 15 Efecto de la temperatura de secado del aire sobre la rapidez de
secado …………………………………………………………………...
59
Figura 16 Cápsulas de alginato……………………………………………………. 60
Figura 17 Imágenes de microscopia de barrido de las cápsulas deshidratadas
a temperatura de 20ºC (A), de 40ºC x 15 minutos (B) y de 40ºC
(C) y correspondientes imágenes binarizadas del área
proyectada.………………………………………………………………..
60
Figura 18 Viabilidad de las capsulas hidratadas y deshidratadas……………… 62
Figura 19 Efecto de las sales biliares en cápsulas de 1.44 mm y 3% de
alginato…………………………………………………………………….
65
Figura 20 Difusión en agar………………………………………………………….. 70
Figura 21 Modelo general para la formación de poros………………………….. 71
x
Figura 22 Viabilidad de las bifidobacterias encapsuladas y no encapsuladas
durante el periodo de almacenamiento del Kefir de 0 a 28 días en
refrigeración……………………………………………………………..
74
Figura 23 Viabilidad de Bifidobacterium animalis subsp. lactis encapsulada y
sin encapsular durante el almacenamiento por 28 días del kéfir en
refrigeración antes y después de someterse a la simulación
gástrica a pH2……
75
Figura 24 Cambios en la acidez titulable del kéfir…………………………… 78
xi
RESUMEN
La viabilidad y actividad de los probióticos (lactobacilos y bifidobacterias) en los
productos es un pre-requisito para obtener los beneficios en la salud. Sin embargo
la viabilidad de las bifidobacterias en leches fermentadas, depende de la cepa
seleccionada, interacción entre las especies microbianas presentes, producción de
peróxido de hidrógeno del metabolismo bacteriano, actividad acuosa y la acidez
del producto final. Adicionalmente la viabilidad puede ser afectada por la
disponibilidad de nutrientes, inhibidores de crecimiento, concentración de
azucares, potencial redox (presencia de oxígeno) debido a la permeabilidad del
empaque al oxígeno, cantidad de inoculo y tiempo de fermentación. Por esta razón
las técnicas de encapsulación y microencapsulación son un método prometedor
para mejorar la supervivencia y liberación de bifidobacterias fisiológicamente
activas al sitio donde deben ejercer su acción benéfica. El objetivo de este trabajo
fue estudiar el proceso de encapsulación de Bifidobacterium animalis subsp. lactis
para emplearse como probiótico en Kéfir. Se empleo la bifidobacteria, cepa BB12
(Chr. Hansen), se activo la bacteria, se cultivo en medio TPYG y se conservo en
congelación con glicerol. La encapsulación se realizo con alginato de calcio al 1, 2
y 3% en tres tamaños diferentes (1.4, 1.8 y 2.4 mm); las bifidobacterias libres y
encapsuladas se sometieron a la simulación gástrica a pH 2, por tres horas y
posteriormente se pasaron a la solución de sales biliares por dos horas. Al Kéfir
previamente elaborado, se le adicionaron bifidobacterias encapsuladas y
bifidobacterias libres; se determinó el pH y acidez titulable en muestras de kéfir por
un periodo de 4 semanas; se sometió a una simulación gástrica a pH2 después
del almacenamiento y se realizo la enumeración de bifidobacterias viables. Así
mismo las cápsulas se secaron por lecho fluidizado. Se evaluó el efecto de la
nisina en el crecimiento de las bifidobacterias encapsuladas y sin encapsular, así
mismo se evaluó la susceptibilidad de las bifidobacterias a antimicrobianos. El
número de células libres disminuyo 36% después de estar en contacto con la
solución gástrica, en cambio las células encapsuladas disminuyeron entre 0.4 a
9.9%. Al pasar a las sales biliares las cápsulas de tamaño de 1.4 y 1.8 mm, se
xii
desintegran o se rompen y la viabilidad de las células encapsuladas disminuye
1% y las libres su viabilidad disminuye 3% durante este periodo. En el kéfir se tuvo
una disminución del 35% de la población de bacterias encapsuladas y del 56% de
bifidobacterias no encapsuladas; el pH del kéfir varió de 4.7 a 4.3 a partir de su
elaboración hasta el final del tiempo de almacenamiento, el valor más bajo de pH
se encontró en el control y fue mayor en el kéfir con células encapsuladas; la
acidez titulable fue similar en el kéfir con células libres y el control, fue mayor la
acidez en estos que en el kéfir con cápsulas. Las cápsulas secadas por lecho
fluidizado tuvieron un peso de 1 mg con un contenido de humedad de 2% (b.h.)
al final del secado; el mejor método de deshidratación fue el de 40ºC x 15 minutos
y el resto a 20ºC, estas cápsulas tuvieron una cuenta viable de 1.7 x 106 UFC/g
después de tres meses de almacenamiento. La encapsulación ayuda a que las
bifidobacterias resistan la acción de la nisina. Las bifidobacterias fueron
susceptibles a 10 antimicrobianos. El tamaño y concentración de gel influye en la
viabilidad durante toda la digestión gástrica. La encapsulación en alginato mejoro
la supervivencia de las bifidobacterias después de la exposición a 3 horas en
ácido clorhídrico a pH2, antes y después del periodo de almacenamiento del kéfir.
xiii
ABSTRACT
The viability and activity of probiotics in products is a prerequisite for obtaining
health benefits. However viability of bifidobacteria in fermented milk products
depends on the selected strain, interactions between microbial species, production
of hydrogen peroxide from bacterial metabolism, water activity and final product
acidity. Additionally, viability may be affected by nutrients availability, growth
inhibitors, sugars concentration, redox potential (presence of oxygen) and oxygen
permeability of packaging, inoculum amount and fermentation time. Hence,
encapsulation or microencapsulation techniques are a promising approach to
improve viability of bifidobacteria and their release in physiologically active sites
where they exert their beneficial action. The aim of this work was to study the
process of encapsulation of Bifidobacterium animalis subsp. lactis as a probiotic for
use in Kefir. Bifidobacteria strain BB12 (Chr Hansen) was cultured in TPYG broth
and freezed in glycerol solution. Encapsulation was carried out with calcium
alginate 1, 2 and 3% and three different beads sizes (1.4, 1.8 and 2.4 mm), free
and entrapped cells were tested in gastric simulation at pH 2; for three hours and
then passed to a bile salts solution for two hours. Encapsulated and free cells were
added to previously developed Kéfir and pH, titratable acidity and cell viability were
measured weekly for a month in the product. Both types of cells were subjected to
a simulated gastric digestion at pH 2 after the storage period. Capsules were dried
in a fluid bed dryer. The effect of nisin and different antibiotics on the growth of free
and encapsulated bifidobacteria was evaluated. Free cell number decreases 36%
after contact with the gastric solution; however encapsulated cells decreased only
to a range of 0.4 to 9.9%. In the case of the bile salts, the beads of sizes 1.4 and
1.8 mm were disintegrated and the viability of encapsulated cells decreased 1%,
compared with free cells which viability decreased 3% during this experiment. In
the case of Kefir, a decline of 35% in the population of encapsulated bacteria and
56% in free bifidobacteria could be observed. The pH of kefir ranged from 4.8 to
4.34 after its development and until the end of storage. The lowest pH was found in
the control sample and the highest in kefir with encapsulated cells. Titratable
xiv
acidity was similar in the control kefir and in the kefir with free cells and in both
cases higher than the acidity in kefir with beads. Dried beads had a mass of 1 mg
with a moisture content of 2% (w.b.) at the end of the drying process. The best
method of dehydration was 40 º C x 15 minutes and the rest at 20 ° C, where the
beads had a count of 1.7 x 106 viable UFC after three months of storage.
Encapsulated bifidobacteria resisted the action of nisin. Bifidobacteria were
susceptible to 10 antimicrobials. The size and concentration of gel affected the
viability during gastric digestion. Encapsulation in alginate improves the
bifidobacteria survival after 3 hours at pH2, before and after the storage period of
kefir.
1
I. INTRODUCCIÓN
El incremento del costo en el cuidado de la salud, el constante aumento de la
esperanza de vida y el deseo de las personas mayores por mejorar su calidad de
vida son factores que han conducido a la investigación y desarrollo en el área de
alimentos funcionales. Aunque el concepto de alimentos funcionales fue
introducido muchos años atrás con Hipócrates y su lema ―Que vuestros alimentos
sean vuestras medicinas, y que vuestras medicinas sean vuestros alimentos‖,
recientemente las pruebas en organismos vivos han comenzado a apoyar la
hipótesis de que el alimento juega un papel importante en la modulación de las
funciones fisiológicas del cuerpo humano. Entre los muchos compuestos
funcionales reconocidos hasta la fecha, los componentes bioactivos de los
alimentos probióticos y fermentados han sido el centro de atención debido a su
larga tradición de alimento seguro y sus efectos benéficos (Valsiljevic and Shah,
2008).
Los probióticos son microorganismos vivos (bacterias o levaduras) los cuales
benefician la salud del consumidor por el mejoramiento del balance de su
microbiota intestinal (Fuller, 1989); cuando estos se adicionan a un producto
alimenticio, adecuado de tal forma que se mantengan vivos y en suficiente
cantidad, a éste producto se le denomina alimento probiótico y después del
consumo del mismo, se espera obtener los efectos deseados en salud, más allá
de usarse solo como alimento (Marteu y col., 2001);
Los principales probióticos son bacterias de los géneros Lactobacillus y
Bifidobacterium, nativas del tracto gastrointestinal humano y han sido
tradicionalmente utilizadas en diversas fermentaciones alimentarías. Las
bifidobacterias ayudan a estimular el sistema inmune, producir vitaminas del grupo
B, inhibir el crecimiento de patógenos, reducir los niveles de colesterol en la
sangre y ayudar a restablecer la microbiota normal después de una terapia con
antibióticos. Los lactobacilos pueden ayudar a la digestión de la lactosa en
2
personas intolerantes a la misma, reducir el estreñimiento y la diarrea infantil,
ayudan a resistir infecciones como salmonella y ayuda a aliviar el síndrome del
intestino irritable (Gibson y Roberfroi, 1995; Manning y Gibson, 2004).
Las bifidobacterias han sido objeto de gran interés debido a su contribución en el
mantenimiento de la salud gastrointestinal (Lievin y col., 2000). Por esta razón
diversas cepas de este género se consideran como probióticos, y entre ellas la
más uasada es Bifidobacterium animalis subsp. lactis (Bb12). A menudo se
adiciona como bacterias viables a los productos lácteos (por ejemplo el yogurt) o
se suministran en alimentos infantiles.
Con el fin de ejercer sus propiedades funcionales, los probióticos necesitan llegar
viables al sitio activo. La viabilidad y actividad de los probióticos en los productos
es un pre-requisito para obtener los beneficios en la salud. Sin embargo, algunos
cultivos no viables pueden ejercer ciertas propiedades funcionales como la
inmunomodulación (Ouwehand y col., 1999). Además, en general no se ha
alcanzado un acuerdo sobre los niveles recomendados y se sugieren niveles
desde 106 ufc/mL (Kurman y Rasic, 1991) hasta 107 y 108 ufc/mL (Lourens-
Hattingh y Viljoen, 2001). Estas sugerencias se han realizado por la posible
disminución en la concentración de células viables durante el procesamiento,
congelación, descongelación y almacenamiento del producto probiótico, así como
el paso por la parte superior del tracto gastrointestinal. En Japón, la Asociación de
Leches Fermentadas y Bebidas de Bacterias Ácido Lácticas, ha implementado un
estándar y ha promovido que al menos se debe tener una concentración de 107
unidades formadoras de colonias (ufc) de bifidobacterias por gramo de producto
para que se considere un alimento probiótico para humanos (Ishibashi y
Shimamura, 1993). Sin embargo varios estudios han demostrado que las cepas
probióticas crecen poco en leche, lo que resulta en bajas concentraciones en el
yogurt terminado e incluso la perdida de la viabilidad durante el tiempo de
almacenamiento en frío (Vasiljevik y Shah, 2008).
3
El número de bacterias probióticas en los productos lácteos fermentados, se ve
reducido significativamente por la acidez, la concentración de azúcar en el
producto y la toxicidad del oxígeno. Por esta razón, las tecnologías tales como la
cubierta entérica y microencapsulación se han estudiado como métodos
prometedores para la protección eficaz y liberación efectiva de las cepas
probióticas fisiológicamente activas. La microencapsulación es un proceso en el
que las células se mantienen dentro de una película envolvente con el fin de
reducir el daño celular o pérdida de la célula. Se han empleado materiales
envolventes como la gelatina o gomas vegetales para brindar protección a
organismos probióticos sensibles a la acidez. El alginato es otro excipiente que ha
mostrado un gran potencial debido a los requerimientos sencillos del proceso y los
costos generales. Además el alginato no es toxico por lo cual puede usarse de
manera segura en los alimentos. El gel de alginato puede solubilizarse por el
secuestro de los iones de calcio dando como resultado la liberación de las células
atrapadas. Los organismos probióticos encapsulados muestran una mejor
viabilidad en comparación con los organismos no encapsulados cuando son
adicionados en postres fermentados congelados y yogurt (Ravula y Shah, 2000;
Capela y col., 2006).
4
II. ANTECEDENTES
II.1. Ecología microbiana del tracto digestivo humano
La microbiota del tracto gastrointestinal (TGI) es una comunidad muy compleja,
que incluye microorganismos anaerobios y anaerobios facultativos. La microbiota
predominante del estómago es anaerobia Gram-positiva, con concentraciones de
<103 ufc/mL. La concentración más alta de estos microorganismos se encuentra
en el intestino delgado (Naidu, 1999). Se reconocen diferentes hábitats
pertenecientes al tracto digestivo, por ejemplo, la boca, el estómago, el intestino
delgado (duodeno, yeyuno e íleon), intestino grueso (ciego y colon) y recto.
Normalmente existe una estabilidad en estos hábitats. El equilibrio se ve
influenciado individualmente por el hospedero. Esto significa que existen
variaciones interpersonales (individuales). Cada persona tiene una microbiota fija
en cuanto a lo que concierne a la cantidad de lactobacilos y bifidobacterias
(Reuter, 2001). Este hecho es de gran interés, pues se pueden identificar más de
400 especies de bacterias pertenecientes a la microbiota intestinal y pueden
alcanzar niveles de células bacterianas en el colon de aproximadamente de 1014 lo
cual es 10 veces más del total de células del cuerpo humano que es de 1013
(Mitsuoka, 1982). Entre estas, solo de 30 a 40 especies constituyen casi el 99% de
la masa de la microbiota intestinal. Los factores ambientales, interacciones
fisiológicas y la dieta rigen la distribución de la microbiota en diferentes regiones
del tracto. De estos factores, la dieta es el principal factor que regula la frecuencia
y concentración de especies individuales y grupos de microorganismos que
colonizan el tubo digestivo (Naidu y col., 1999).
La población bacteriana en el TGI puede dividirse en bacterias autóctonas y
alóctonas. Las bacterias autóctonas forman parte de la microbiota estable y se
define como las bacterias que habitan un lugar o región por primera vez, es decir
las que son encontradas donde se formaron, mientras las bacterias alóctonas se
encuentran en un sitio diferente de aquel en el que crecieron. La cuenta relativa de
5
esta última puede variar con el tiempo dependiendo de los cambios del medio
ambiente o por el consumo de bacterias vivas encontradas en los alimentos
(Tannock, 1999). Las bifidobacterias pueden encontrase en el TGI como
residentes autóctonas y alóctonas.
Los niños recién nacidos tienen un TGI estéril y la colonización bacteriana inicia
inmediatamente después de nacidos. Durante los primeros días de vida, la
microbiota detectada en heces es relativamente simple, compuesta principalmente
por enterobacterias y estreptococos y se vuelve más diversa con el tiempo
(Figura1). La composición fecal de los niños se ve influenciada por el tipo de parto
al nacer, el medio ambiente, la dieta (Fanaro y col., 2003) y posiblemente la
genética como revelan estudios en gemelos monocigotos (Zoetendal y col., 2001).
Varios estudios han mostrado que las heces de los bebes tienen grandes
cantidades de bifidobacterias, cuando estos son alimentados con leche materna,
comparados con bebes alimentados con fórmula láctea, en donde sus heces
contienen una microbiota más diversa (Favier y col., 2002). Aunque otros estudios
reportan que no existe diferencia de la microbiota entre los dos regímenes de
alimentación (Penders y col., 2005). Las diferencias pueden deberse a las
variaciones individuales entre infantes y/o a la diferente composición de las
fórmulas usadas para los estudios, la cual puede en algunos casos estimular la
población endógena de bifidobacterias (Klijn y col., 2005).
Figura 1. Cambios en la microbiota intestinal en bebes desde recién nacido hasta los 7 días de edad (Tomado de Arunachalam, 1999)
6
En adultos sanos la composición de la microbiota varía entre individuos y se
mantiene estable a través de una gran parte de nuestra vida (Figura 2). Las
especies más dominantes son del género Bacteroides y Clostridium (Matsuki y
col., 2004). Anteriormente utilizando métodos de cultivo dependientes se estimó
que las bifidobacterias comprenden el 10% de la microbiota intestinal en adultos,
pero las últimas evaluaciones basadas en métodos de cultivos independientes
sugieren que las bifidobacterias constituyen hasta el 3% de la microbiota total.
Esta menor estimación es el reflejo probable a un aumento en el número total de
especies detectadas, las cuales incluyen especies no cultivables, en lugar de una
disminución de bifidobacterias totales (Klijn y col., 2005).
Figura 2. Cambios de la microbiota intestinal con la edad (Lourens-Hatlingh y Viljoen, 2001).
Se observo en pacientes ancianos que la composición fecal cambia con el
incremento de la edad y disminuye el número total de bifidobacterias junto con la
disminución de otra diversidad de especies (Woodmansey y col., 2004). La
presencia de bifidobacterias en heces humanas está asociada con el buen estado
de salud y se ha encontrado que existen diferencias al comparar la composición
microbiana entre individuos sanos y enfermos. Por ejemplo la microbiota de los
pacientes con la enfermedad de Crohn difiere de la de las personas sanas por el
contenido mayor de enterobacterias y aparentemente menos bifidobacterias
(Seksik y col., 2003). Al comparar niños lactantes sanos y alérgicos se observo
diferencias en la cantidad de Bifidobacterium spp. (Ouwehand y col., 2001).
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7
II.2. Interacción entre la bacteria comensal del intestino y el sistema inmune
La barrera física que separa a la gran cantidad de bacterias comensales del
intestino de los tejidos subyacentes es solo una simple capa epitelial (célula
simple); aunque es reforzada por la secreción por parte del epitelio de una capa de
moco, inmunoglobulina A (IgA) y la producción de moléculas antibacterianas
(como defensinas) (Figura 3). Teniendo en cuenta esto, no es sorprendente que
tanto en humanos como en animales de experimentación algunas bacterias
puedan penetrar esta barrera para llegar a tejidos más profundos (Ganz, 2003;
Berg, 1996). Algunos estudios mostraron que aunque las bacterias comensales
son eliminadas en cuestión de horas por los macrófagos, estas pueden sobrevivir
por varios días dentro de las células dendríticas (CDs). Sin embargo las CDs que
han atrapado a bacterias comensales en la placa de Peyer no penetran más allá
de los nodulos linfáticos mesentéricos, de modo que las CDs cebadas por
bacterias vivas son generalmente restringidas al sistema inmune de las mucosas.
Es importante señalar que este efecto in vivo se pierde si se mata a las bacterias
por un tratamiento térmico, porque este efecto no es mediado por polisacáridos y/o
moléculas inmunoestimuladoras derivadas de otras bacterias. (Aunque las CDs
pueden concentrar estos componentes al atrapar a bacterias vivas). Así la
producción de IgA y probablemente la respuesta intestinal a células T, puede ser
selectivamente inducida por las CDs cargadas con bacterias comensales y este
incrementa la secreción de IgA local limitando la penetración de bacterias
comensales (Macpherson y Uhr, 2004). Durante mucho tiempo se ha establecido
que las células B y las células T se activan en las placas de Peyer, después de lo
cual estas recirculan a través de los vasos linfáticos intestinales, entran en el
torrente sanguíneo a nivel del conducto torácico y regresan a la lámina propia
intestinal. Debido a que las CDs contienen bacterias comensales vivas estas son
confinadas al sistema inmune mucoso, la inducción de células T y B se enfoca en
la mucosa donde es requerida una respuesta. (Macpherson y Harris, 2004).
8
Figura 3. Defensa inmune contra la bacteria comensal del intestino. Las bacterias comensales están presentes a altas densidades en el lumen intestinal (más de 10
12 bacterias por gramo de
contenido luminal). La mayoría de las bacterias comensales reside fuera de la placa de moco que cubre las células epiteliales del intestino. Algunas bacterias pueden ser eliminadas por moléculas antibacteriales, como las defensinas, las cuales son producidas por las células epiteliales. Las bacterias que penetran la placa epitelial de enterocitos son rápidamente eliminadas por los macrófagos de la lámina propia. Las bacterias comensales pueden también penetrar por medio de folículos especializados asociados al epitelio, las células M, las cuales están sobre las placas de Peyer. Estas bacterias son rápidamente eliminadas por macrófagos, pero pequeñas cantidades pueden sobrevivir por algunos días dentro de las células dendríticas (CDs). Esto permite la interacción entre las CDs con las células T y B de las placas de Peyer y/o la migración de CDs por drenado a los nódulos linfoides mesentéricos.
II.3. Probióticos y prebióticos
Definición de probióticos. La palabra probiótico fue inicialmente usada como un
antónimo de la palabra ―antibiótico‖. Esta deriva de las palabras griegas προ y
βιοτοσ traducido como ―por la vida‖ (Hamilton-Miller y col., 2003).
Vasiljevic (2008) refiere la historia del concepto, enunciado que el primero en
utilizar esta palabra fue Kollan en 1952, para describir la recuperación de la salud
de pacientes malnutridos empleando suplementos orgánicos e inorgánicos y que
un año después Vergin propuso, que el desbalance en el cuerpo debido al
9
tratamiento con antibióticos, puede ser restablecido con una dieta rica en
probióticos. Posteriormente en 1955 Kolb reconoció los efectos detrimentales de la
terapia con antibióticos y propuso utilizar a los probióticos como preventivo.
Tiempo después Lilly y Stillwell (1965) definieron los probióticos como substancias
producidas por un microorganismo que promueve el crecimiento de otros
organismos. Similar a esta propuesta, Sperti en 1971 y posteriormente en 1973
Fujji y Cook, describieron a los probióticos como componentes que pueden
estimular el crecimiento microbiano o mejorar la respuesta inmune del hospedero
sin inhibir el crecimiento de un cultivo in vitro. Otra definición fue ofrecida por
Parker en 1974 definiéndolos como organismos y substancias las cuales
contribuyen al balance microbiano del intestino. Esta definición fue criticada por
muchos autores debido a que al decir ―sustancias‖, pueden quedar incluidos los
antibióticos (Vasiljevic, 2008).
La definición más frecuentemente citada es la de Fuller (1992), quien los definió
como ―Suplemento alimenticio de microorganismos vivos, los cuales afectan
benéficamente al animal hospedero por el mejoramiento de su balance microbiano
intestinal‖. Aunque su definición fue más aplicable a animales que a humanos.
Otros autores siguiendo esta línea ofrecieron sus versiones, estando de acuerdo
que probióticos incluye microorganismos vivos. En 1999 Salminem y
colaboradores ofrecieron su definición incorporando bacterias no viables en la
misma. Siguiendo las recomendaciones del grupo de trabajo para la evaluación de
los probióticos de la FAO/OMS (Food and Agricultural Organization/Organización
Mundial de la Salud) en el 2002, sugirieron describir a los probióticos como
microorganismos vivos, los cuales cuando son administrados en cantidad
adecuada confieren un beneficio a la salud del hospedero. Por consecuencia una
gran variedad de especies y géneros pueden ser considerados probióticos
potenciales (Holzapfel y col., 1998); aunque las cepas más importantes
comercialmente pertenecen a las bacterias ácido lácticas (BAL) y bifidobacterias.
10
Prebióticos. Los prebióticos, como la inulina y los oligosacaridos, se definen
como ingredientes no digeribles que tienen un efecto benéfico en la salud por el
estímulo selectivo en el crecimiento y/o actividad de una o varias bacterias del
colon (Gibson y Roberfroid, 1995). Esta definición fue actualizada en el 2004,
ahora prebióticos se define como ―Ingredientes fermentables selectos que
permiten cambios concretos, tanto en la composición y/o en la actividad de la
microbiota gastrointestinal que brinda al hospedero un bienestar en su salud‖
(Gibson y col., 2004).
Sin embargo, el efecto de un prebiótico es en esencia indirecto, por que sirve de
fuente de carbono selectivo para el crecimiento de una o un número limitado de
microorganismos, causando así una modificación selectiva de la microbiota
intestinal del huésped (especialmente en el colon). No es el prebiótico en sí
mismo, sino más bien los cambios inducidos en la composición de la microbiota,
que es la responsable de los efectos. De hecho las bacterias más importantes,
objeto de la estimulación selectiva, son del género Bifidobacterium y Lactobacillus
(Teitelbaum y Walker, 2002).
Dentro de estos ingredientes fermentables los que más se emplean son la
lactulosa, fructooligosacaridos y diversos polisacáridos. Estos azúcares son de
origen natural, algunos como la inulina son considerados como parte de la fibra
dietética. La lactulosa ha sido empleada clínicamente para el alivio sintomático en
algunas enfermedades hepáticas. En concreto, reduce las concentraciones de
amoniaco en la sangre e impide el desarrollo de enfermedades hepáticas y
encefalopatías (Bezkorovainy, 2001).
Un estudio demostró la modificación de la microbiota intestinal por medio de
prebióticos, al incluir germinados de cebada en la alimentación, los cuales
sirvieron como complemento en el tratamiento de colitis ulcerosa (Fukuda y col.,
2002). Sin embargo, a pesar de que el tratamiento más recomendado para
pacientes con el síndrome del intestino inflamado, es un aumento en la ingesta de
11
fibra dietética, actualmente pruebas clínicas no apoyan el empleo de prebióticos
en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (Sartor, 2004).
Los mecanismos de acción deben ser definidos adecuadamente, debido a que la
modificación de la microbiota por la ingestión de los prebióticos puede interactuar
con el sistema inmunológico y tener efectos no solo de protección gastrointestinal,
sino un efecto sistémico, dada la naturaleza de la respuesta inmune asociada a
tejido linfoide de los intestinos, que a su vez puede tener importancia en otras
mucosas, como la piel y las vías respiratorias, proporcionando de esta forma un
beneficio sistémico más amplio (Saavedra y Tschernia, 2002).
II.4. Características de las bifidobacterias
Las bifidobacterias son habitantes normales del tracto gastrointestinal humano y
están presentes durante toda nuestra vida, apareciendo a los pocos días después
del nacimiento. Las especies nativas de bifidobacterias son dependientes de la
edad del individuo. Bifidobacterium infantis y B. breve son predominantes en
infantes mientras B. adolescentis es predominante en adultos y B. longum está
presente a lo largo de la vida del individuo (Gomes y Malcata, 1999). Constituyen
una de las diversas especies predominantes de la microflora del colon, junto con
Peptostreptococcus, Eubacterias, Clostridia y Bacteroides; las bifidobacterias se
encuentran presentes en niveles que van de 108-1011 bacterias/g de material del
colon (Perdigón y col., 2003).
Las bifidobacterias difieren de las bacterias ácido lácticas en que no solamente
producen ácido láctico sino también ácido acético, como uno de sus principales
productos de fermentación (Klein y col., 1998). La clasificación de las
bifidobacterias ha cambiado muchas veces, desde que fueron aisladas por Tissier
en 1899, de heces de bebés alimentados con leche materna. Para el año de 1994,
se habían incluido en la lista a tres especies adicionales, B. inopinatum,
B.denticolens (Crociani y col, 1996) y B. psychraerophilum (Simpson y col., 2004),
12
con un total de 33 especies; pero Masco y col. (2004), así como Ventura y Zink
(2002) dan evidencia de que B. animalis y B. lactis pertenecen a una misma
especie (B. animalis).
II.4.1. Taxonomía, Género Bifidobacterium
En 1899-1900 Tissier fue el primero en aislar y describir a las bifidobacterias
como microorganismos anaerobios con morfología de bífido, en forma de
bastones, no productoras de gases, las cuales están presentes en las heces de
bebes, y les asignó el término de Bacillus bifidos. Las bifidobacterias son
generalmente caracterizadas como gram positivas, no formadores de esporas, no
móviles, anaerobias y catalasa negativa. Hay varios tipos incluyendo bastones
pequeños, curvos, circulares y bifurcados en forma de Y. Existen 33 especies
incluidas en el género Bifidobacterium, 14 de las cuales son de origen humano
(dental, heces y vaginal), 17 de tractos intestinales o del rumen de animales, dos
de aguas de desecho y una de leches fermentadas (ver Cuadro 1). Las
bifidobacterias están filogenéticamente agrupadas en la rama de los actinomicetos
de bacterias gram positivas (Velásquez y Feirtag, 1997), se caracterizan por un
alto contenido de guanina más citosina (G+C), el cual varia de 54 a 67% mol.
Cuadro 1. Lista de especies del género Bifidobacterium
B. adolescentis a B. choerinum B. infantisa B. pollorum
B. angulatanum a B. coryneforme B.animalis subsp.
Lactis
B. ruminantium
B. animalis B. cuniculi B. longuma B. saeculare
B. asteróides B. dentiuma B. magnum B. subtile
B. bifidum a B. gallicum B. merycicum B. suis
B. boum B. gallinarum B. minimum B. termophilum
B breva.a B. globosuma B. pseudocatenulatum a
B. catenulatuma B. indicum B. psudolongum
B. denticoles a B. inopinatuma B. psychraerophilum
a Especies aisladas de fuentes humanas. Fuente: Gomes y Malcata, 1999.
13
Son organismos sacarolíticos que producen ácido acético y ácido láctico sin la
generación de CO2, excepto durante la degradación de gluconato (Figura 4).
Figura 4. Formación de acetato y lactato de glucosa por el ciclo bifidum. 1- Hexoquinasa y fructosa 6 fosfato isomerasa, 2- fructosa 6-fosfato fosfocetoloasa, 3-transaldolasa, 4-transcetolasa, 5- Ribosa-5fosfato isomerasa, 6- ribulosa 5-fosfato-3 pimerasa, 7- xylulosa 5 fosfocetolasa, 8- acetato cinasa, 9- enzimas del ciclo homofermentativo (adaptado de Rasic y Kurmann, 1983).
La heterofermentación es iniciada por el rompimiento de la fructosa 6 fosfato entre
la parte de un C2 y un C4. La conversión de la porción de C2 a acetato es paralela
a la formación de heptosa 7 fosfato de la parte concomitante del C4 con la
formación de una parte de triosa derivada de la adición molecular de fructosa 6
fosfato. La heptosa 7 fosfato es dividida subsecuentemente en dos moléculas de
14
acetato y una molécula de piruvato. La segunda triosa de la parte izquierda de la
fructosa 6 fosfato es convertida a lactato. Por lo cual la fermentación de dos moles
de hexosa da como resultado tres moles de acetato y dos moles de lactato. La
enzima clave en la fermentación tipo glicolítica es la fructosa 6 fosfato
fosfocetolasa, la cual puede ser usada como una carácter taxonómico en la
identificación del género, pero ésta no hace posible la diferenciación ínter especie
(Masco y col., 2004).
El pH óptimo para el crecimiento es entre 6 –7, y prácticamente no crecen a pH de
4.5 - 5.0 o por encima de pH de 8.0-8.5. La temperatura óptima de crecimiento es
de 37 a 41°C, con crecimiento a una temperatura máxima de 43 a 45°C y sin
crecimiento por debajo de los 25-28°C (Gomes y Malcata, 1999).
En lo que respecta a Bifidobacterium animalis subsp. lactis subsp. nov., la
temperatura óptima de crecimiento es de 39-42°C. No ocurre crecimiento en agar
en caja expuestos al aire, pero es tolerante a un 10% de oxígeno en la atmósfera
sobre un medio líquido. Ocurre crecimiento en leche o en medios a base de leche.
La relación molar de acetato a lactato del metabolismo de la glucosa es cercano a
10 a 1 bajo condiciones anaeróbicas, por ejemplo, la producción de lactato es
remplazada por la producción de formiato. Las cepas han sido aisladas de
muestras de leches fermentadas, heces de infantes, conejos, pollos y aguas
negras. El contenido de DNA G+C es de 61.0 0.5%mol. Cepa tipo:
Bifidobacterium animalis subsp. lactis UR1 T(LMG19314T=DSM10140
T=JCM10602 T) ( Masco y col, 2004).
Respecto a la taxonomía, las técnicas moleculares modernas incluida la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) y otros métodos moleculares para determinar el
de genotipo, han sido importantes para la identificación de las especies y de
diferenciación de cepas de bifidobacterias.
15
El análisis de la secuenciación de la cadena del rRNA 16s (normalmente utilizado
para producir árboles filigeneticos) no es apropiado para distinguir las diferentes
especies del género Bifidobacterium (Miyake y col., 1998). Por lo cual se utiliza
preferentemente la secuencia de la proteína de 60kDa de choque térmico (HSP
60); además, se encuentra en una sola copia en casi todas las especies
bacterianas. El árbol filogenético es realizado comparando un fragemento de DNA
de 0.6kb de la HSP60 de cada especie de bifidobacteria estudiada (Picard y col.,
2005). En la figura 5 se presenta en detalle la filogenia de B. animalis subsp. lactis.
Figura 5. Árbol filogenético de las bifidobacterias basado en la secuencia parcial de DNA de la
HSP60. Barra 5% de divergencia de la secuencia (Picard y col., 2005).
16
II.4.2. Uso seguro de las Bifidobacterias
El uso seguro de las bifidobacterias es apoyado históricamente por el consumo de
leches fermentadas y por el conocimiento cada vez mayor sobre la taxonomía y
fisiología de las bifiodobacterias (Ishibashi y Yamazaki, 2001). Las bacterias ácido
lácticas de los alimentos son consideradas microorganismos comensales con
poco o ningún potencial patógeno (Makclainen, 2003). Borrielo y col. (2003)
llegaron a la conclusión de que los lactobacilos y bifidobacterias empleados como
probióticos no representan un riesgo para la salud del consumidor.
Se han hecho tres propuestas para asegurar la seguridad de las cepas probióticas
(a) estudios de las propiedades intrínsecas de la cepa probiótica. (b) estudios de la
farmacocinética de las bifidobacterias (sobrevivencia, actividad en el intestino,
interrelacion dosis-respuesta y recuperación de las mismas en heces y mucosa) y
(c) estudios de la interacción entre el hospedero y las bifidobacterias (Saarela y
col., 2000). Los criterios para seleccionar a las cepas probioticas se ilustran en la
Figura 6.
Figura 6. Criterios de selección para probióticos (Salminen y col., 1998)
Caracterización/origen/ definición
Género y cepa. Propiedades de seguridad
Aspectos generales
Actividad y viabilidad en el producto.
Resistencia a pH bajo, jugo gástrico, sales biliares, jugo del pancreas, colonización/sobrevivencia in vivo
Efectos clínicos en pacientes voluntarios
Adherecia al epitelio intestinal/ tejido
Estimulación del sistema inmune
Seguridad y estabilidad
Actividad antimicrobiana antagonismo a patogenos
Aspectos funcionales y fisilogicos
17
La valoración del riesgo por el consumo de probióticos puede ser muy costosa y
exigir demasiado tiempo. Un riesgo muy bajo puede ser aceptado cuando se
recomienda a individuos inmunocomprometidos, pero la relación riesgo beneficio
debe ser claramente establecida en cada caso (Saarela y col., 2000).
Debido al indiscriminado uso de antibióticos en humanos, en medicina veterinaria
y en animales, como promotores de crecimiento, la resistencia a los antibióticos ha
llegado a existir como una característica común en los microorganismos, esto
causa graves problemas en el tratamiento de infecciones microbianas. La
resistencia a los antibióticos en las bacterias puede ser intrínseca o adquirida. La
resistencia intrínseca es una característica natural y puede ser considerada como
una característica de una especie, mientras la resistencia adquirida deriva ya sea
de una mutación genética o de la adquisición de un DNA ajeno de otra bacteria. La
mayoría de las bifidobacterias son intrínsecamente resistentes al ácido nalidixico,
polimixina B, kanamicina, gentamicina, estreptomicina y metronidazol (Chateris y
col., 1998).
La farmacocinética de los probióticos ha sido estudiada en vivo usando técnicas
de entubación, perfusión y de biopsia. Algunas propiedades enzimáticas como la
excesiva desconjugación de las sales biliares o degradación del mucus pueden
ser potencialmente perjudicial (Marteau y col., 1993, 1995 y 1997).
Resistencia de las bifidobacterias en el tracto gastrointestinal. El
conocimiento de la sobrevivencia de las bifidobacterias dentro del TGI, sus
propiedades de translocación, colonización y el destino de los componentes
activos derivados de las bifidobacterias es importante para la evaluación de los
efectos positivos o negativos del consumo de las bifidobacterias (Salminen y col.,
1998).
La supervivencia de diferentes cepas probióticas en diferentes partes del TGI es
importante, puesto que estas deben de realizar varios efectos físiologicos en
18
diferentes partes del mismo, hasta llegar a implantarse en el intestino; pero esta
supervivencia varía: algunas cepas se mueren rápidamente en el estómago,
debido al jugo gástrico del estómago contiene ácido clorhídrico, pepsina y renina;
mientras otras pueden pasar en alto número al intestino delgado y posteriormente
al intestino grueso. En el intestino delgado, principalmente en el duodeno algunas
cepas también pueden ser objeto de elimación debido a que en esta parte se lleva
a cabo otra hidrolis producida por líquido pancreático, líquido intestinal y sale
biliares; la sobrevivencia de las bifidobacterias en esta parte es de suma
importancia puesto que la actividad metabólica que exhiben casi todas las
bifidobacterias es la desconjugación de las sales biliares, que se produce
naturalmente en los seres humanos. Las sales biliares desconjugadas pueden
disminuir los niveles de colesterol sérico en los seres humanos
hipercolesterolémicos o prevenir la hipercolesterolemia en individuos con niveles
normales de colesterol (Tanaka y col., 2000).
Para tratar de comprender como se da este fenómeno anterior es importante
conocer como se da el ciclo de producción de las sales biliares. Begley y col
(2005) describen a la bilis como una solución acuosa verde-amarillenta cuyos
principales componentes son los ácidos biliares, colesterol, fosfolipidos y el
pigmento biliverdina. Es sintetizada en los hepatocitos pericentrales del hígado, se
almacena y se concentra en la vesícula biliar y se libera en el duodeno después de
la ingesta de alimentos. La bilis funciona como un detergente biológico que
emulsiona y solubiliza lípidos, desempeñando de esta forma un papel esencial en
la digestión de las grasas. Esta propiedad detergente de la bilis confiere también
potente actividad antimicrobiana, principalmente a través de la disolución de
membranas bacterianas.
Begley y col. (2006) describen que los ácidos biliares primarios, ácido cólico y
quenodesoxicólico, son sintetizados de novo en el hígado a partir del colesterol. La
solubilidad de los esteroides de núcleo hidrofobico se ve incrementado por su
conjugación de una N-acil amida con alguna glicina (glicoconjugado) o la taurina
19
(tauroconjugado) antes de la secreción (Figura 7 A). El resultado son moléculas
anfipáticas que pueden solubilizar lípidos para formar micelas mixtas.
Figura 7. (A) Estructura química de los ácidos biliares. Primero los ácidos biliares son sintetizados en el hígado a partir del colesterol y se conjugan ya sea con glicina o taurina antes de la secreción. El grupo carboxilo de los ácidos biliares y el grupo amino de los aminoácidos están unidos por un enlace peptídico. (B) Reacción catalizada por las enzimas hidrolasas de sales biliares (BSH). La BSH rompe el péptido que une a los ácidos biliares, lo que se traduce en la eliminación del aminoácido del grupo esteroide. Resultando en la precipitación de los ácidos biliares desconjugados.
Además, Carey y Duane (1994) detallan que los ácidos biliares son conservados
de manera eficiente, en condiciones normales por un proceso denominado
recirculación entero-hepática. Los ácidos biliares conjugados y descongujados
son absorbidos por difusión pasiva a lo largo de todo el intestino y por transporte
activo en el íleon terminal. Los ácidos biliares reabsorbidos entran al torrente
sanguíneo portal y son llevados a los hepatocitos los cuales los re-conjugan y
secretan en bilis. Aproximadamente el 5% del total de ácidos biliares mezclados
(0.3 a 0.6g) por día eluden la absorción epitelial y pueden ser modificados por las
bacterias autóctonas del intestino (Bortolini y col., 1997). Una transformación
importante es la desconjugación, una reacción que tiende a producirse antes que
otras modificaciones sean posibles. La desconjugación es catalizada por las
enzimas hidrolasas de sales biliares (BSH por sus siglas en ingles), EC 3.5.1.24,
las cuales hidrolizan el enlace peptidico y libera la glicina/taurina de la fracción
básica del esteroide (Figura 7 B). Los ácidos resultantes se denominan ácidos
biliares no conjugados o desconjugados.
20
II.5. Propiedades antimicrobianas
Ibrahim y Salameh (2001), refieren que la actividad antimicrobiana de las
bifidobacterias fue descrita por primera vez por Tissier en 1990, quien detalló
diversos efectos antagonicos de B. bifidum contra E. coli. Las bifidobacterias
tienen la capacidad de producir ácidos orgánicos y otros compuestos
antimicrobianos de tipo proteínico llamados bacteriocinas. Algunos estudios
atribuían la capacidad antimicrobiana de las bifidobacterias únicamente al efecto
de la reducción del pH como resultado de la producción de ácido láctico y ácido
acético, mientras otros autores lo han atribuido a compuestos proteínicos y al
efecto de la reducción del pH (Meghrous y col., 1990; Ibrahim y Bezkorovainy,
1993). Un esquema hipotético de los efectos antimicrobianos de los compuestos
proteínicos obtenidos de las bifidobacterias se muestra en la Figura 8
(Cheikhyoussef y col., 2008).
Figura 8. Esquema hipotético que muestra los efectos antimicrobianos de los componentes
proteínicos obtenidos de las bifidobacterias (Cheikhyoussef y col., 2008)
Inhibición de la replicación de
patógenos por la privación de
hierro
Inhiben el crecimiento de
bacterias patógenas
sideróforos Compuestos con función
de bacteriocinas
Componentes proteínicos
antimicrobianos de las
bifidobacterias
Proteínas de la capa S
Adhesinas y lectinas
Lectinas con función de
Bacteriocinas
Bacteriocinas (bifidina,
bifilog y bifidocina B)
Componentes inhibidores de
adhesión de patogenos
Organización del dominio y espacial
de los factores de
adhesión
Complexation con
biopolimeros y bioefectores
Formación de
biofilms microbianos
y colonización del TGI
Antagonista de patógenos y co-funcionamiento con otras
citoquinas (pro y anti inflamatorias), regulación de las
propiedades de las células blanco
Competición con patógenos por los sitios de unión en las
células epiteliales
21
11.5.1. Bacteriocinas
Las bacteriocinas son definidas como proteínas biológicamente activas contra
miembros de la misma especie o especies muy relacionadas a la cepa productora
(Klaenhammer, 1988).
Los primeros reportes sobre la producción de bacteriocinas de bifidobacterias los
realizaron Anand y colaboradores (1984, 1985) y Kang y colaboradores (1989)
quienes mencionaron que B. bifidum puede producir bifidin y B. longum produce
biflong. La cepa B. bifidum 1452 exhibe mayor zona de inhibición cuando crece en
leche descremada en comparación que cuando crece en caldo MRS (Man,
Rugosa y Sharp). Se observo inhibición después de 30 h y la máxima inhibición
después de 48h.
La bifidina se ha aislado de B. bifidum por el proceso de extracción metanol –
acetona y purificado parcialmente mediante cromatografía con Sephadex G-15
(Anand y col., 1984 y 1985).
En el cuadro 2 se resumen las bacteriocinas y compuestos parecidos a
bacteriocinas (Bacteriocin-like compounds) que han sido aisladas y purificadas de
bifidobacterias (Cheikhyoussef y col., 2008).
Cuadro 2. Resumen del nombre de las bacteriocinas purificadas de bifidobacterias
Especie Peptido Referencia
B. bifidum Bifidina Anand y col., (1984, 1985)
B. Longum Biflong Kang y col., 1989
B. bifidum NCFB 1454 Bifidocina B Yildirim y Johnson 1998.
B.Lactis Bifilact Bb12 Abd El-Salam y col., 2004
B. longum Bb-46 Bofilong Bb-46 Abd El-Salam y col., 2004
22
La bifidina es de consistencia aceitosa, de color amarillo pálido y nihidrina positiva.
Tiene un pH óptimo de 4.8 y su rango de inhibición máximo se encuentra entre pH
de 4.8 a 5.5. La bifidina es estable al calor y no tiende a perder su actividad
cuando se calienta a 100°C durante 30 minutos. El extracto obtenido por metanol
– acetona puede ser almacenado entre 5 y 8°C por más de tres meses sin pérdida
de su actividad antimicrobiana. La fracción purificada de bifidina tiene dos
aminoácidos principalmente en cantidades considerables, fenilalanina y ácido
glutamico y solo tiene trazas de aminoácidos como el ácido aspártico, treonina,
serina, prolina, glicina, isoleucina y leucina (Anand y col., 1985).
El extracto crudo de bifidocina B inhibe el crecimiento de cepas selectas de los
géneros Listeria, Bacillus, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc y
Pediococcus pero no es activa contra otras bacterias Gram-positivas y Gram-
negativas. La bifidocina B es sensible a las enzimas proteolíticas, pero resistente
al pH (2-10), al calor y a disolventes orgánicos su peso molecular es de 3300 Da
(Yildirim y Johnson, 1998). B. lactis Bb-12 y B. longum Bb-46 al cultivarse en caldo
MRS con 0.05% L-cisteína HCl, producen bacteriocinas designadas como bifilact
Bb12 y Bifilong Bb-46 respectivamente. Bifilact y Bifilong inhiben la actividad de
Staphylococus aureus, Salmonella typhimurium, Bacillus cereus y E. coli.
El efecto de inhibición es dependiente de las especies. La concentración mínima
inhibitoria (CMI) de bifilact Bb12 y bifilong Bb46 contra E. coli fue de 20 y 16
mg/mL, respectivamente, mientras la CMI contra S. aureus fue de 40 y 20mg/mL,
respectivamente (Abd El-Salam y col., 2004).
En el cuadro 3 se sintetizan las cepas de bifidobacterias y su espectro de
inhibición hacia las bacterias patógenas (Cheikhyoussef y col., 2008).
23
Cuadro 3. Espectro de la actividad antimicrobiana de los compuestos proteínicos inhibitorios obtenidos de las bifidobacterias
Especie Espectro inhibitorio*
Bifidobacterium (Aisladas de
productos lacteos)
Algunas especies de Bifidobacterium,
Lactococcus, Clostridium y Lactobacillus.
B. breve 4, B. infantis1 E. coli enteropatogena; Yersinia
pseudotuberculosis, Salmonella typhimurium
B. infantis Escherichi coli y Clostridium
B. bifidum Perfringes, Salmonella ssp.
B. adolescentes Campylobacter ssp.
B. bifidum Shigella dysenteriae
B. infantis Yesrsenia enterolitica y Clostridium difficile
ATCC 9689
B. longum SBT 2829 E. coli enterotoxigenica Pb176(ETEC)
B. animalis Salmonella enteritidis
B. bifidum NCFB 1454 (extracto crudo
de Bifidocina B)
Listeria, Bacillus, Enterococcus, Lactobacillus,
Leuconostoc y Pediococcus
Bifidobacterium CA1 and F9 (aisladas
de heces de infantes)
Salmonella typhimurium SL 1344
B. animalis subsp. lactis DR10 E. coli entero-hemorrágica (O157:H7)
B. animalis subsp. lactis LKM512 Clostridium perfringens
B. adolescentes, B. bifidum and B.
longum
E. fecalis, S.typhimurium, C. sporogenes, B.
cereus y Listeria monocytogenes.
B. adolescentis (RBL85), B.
longum(RBL67), B. Bifidum (RBL
68,69,70 y 86)
Listeria monocytogenes
B. thermacidophilum RBL71 E. coli entero-hemorrágica (O157:H7)
B. longum y B. infantis B. cereus y E. coli.
B. thermophilum subsp. infantis RBL
67
Listeria monocytogenes
BIR-032 y BIR-0307 (aislado de heces
humanas)
Listeria innocua ATCC 33090, Escherichia coli
NCTC 8603 y Salmonella typhimurium
ATCC29631
BIR-0307, BIR-0312 y BIR-0324 Helicobacter pylori
B. longum CIDCA 5320, 5323 Clostridium dificile ATCC 9689 y ATCC 43593
* El espectro de inhibición se refiere a la zona de inhibición más alta reportada de la especie indicada
24
II.5.2. Compuestos con función de bacteriocina (Bacteriocin-like compounds
o BLC)
El término compuestos con función de bacteriocina se ha acuñado para referirse a
sustancias antagónicas que no se ajustan a la definición típica o no cumplen con
los criterios de las bacteriocinas y tienden a tener un espectro de actividad más
amplio (Boris y Barbés, 2000). Algunos investigadores, han identificado estos
compuestos sobre la base de que el efecto inhibitorio dirigido hacia una cepa no
depende únicamente de la producción de ácido o el peróxido de hidrógeno sino de
otros compuestos presentes en el medio de producción.
Meghrous y col. (1990) reportaron la producción de BLC en cepas de
Bifidobacterias las cuales tenían actividad frente a cepas de Lactococcus lactis y
contra otras especies de bifidobacterias, Clostridium y Lactobacillus, pero no
mostraron actividad frente a bacterias Gram-negativas. Las bacteriocinas
producidas fueron de de un tipo de proteína estable al calor y actividad a pH del
rango de 2 a 10.
Se demostró que cinco cepas de bifidobacterias (RBL 70, RBL 85, RBL 69, RBL
68 y RBL67) y una de referencia (B. infantis ATCC 15697) producían cierto
compuesto proteínico estable al calor con actividad antimicrobiana contra L.
monocytogenes. Los compuestos antimicrobianos de RBL 70, RBL 69, RBL 68 y
RBL67 pueden ser extraídos con acetona pero los de RBL 85 fueron extraídos con
metanol. Los compuestos de RBL85 exhibieron una característica altamente
hidrofílica. Las diferencias en las características de los compuestos
antimicrobianos, extraídos de las cepas de bifidobacterias aislados con el mismo
método revelaron la existencia de varios tipos de moléculas inhibitorias y
posteriormente esto llevó a determinar diversos mecanismos por los cuales las
bifidobacterias son capaces de inhibir a bacterias patógenas (Touré y col., 2003).
25
II.5.3. Compuestos que inhiben la adherencia de patógenos
La adhesión a las células epiteliales es un prerrequisito importante para la
colonización de los microorganismos probióticos y para las bacterias patógenas
esto es un paso fundamental para la virulencia (Servin, 2004).
Bernet-Camard y col., (1993) reportaron, que la adhesión de las bifidobacterias a
las células Caco-2 es mediada por un factor proteínico promotor de la adhesión
(componente proteínico lábil asociado a la superficie) presente en la superficie de
la célula bacteriana y en el sobrenadante del cultivo de Bifidobacterium. Este
factor parece ser especie-especifico. Los factores promotores de la adhesión de
los lactobacilos son también especie específicos, pero el mecanismo de
adherencia parece ser diferente del obtenido para las bifidobacterias (Coconnier y
col., 1997).
Los componentes proteínicos denominados BIF, producidos por B. longum
BL2928 es el único compuesto activo hacia las bacterias Gram-negativas,
caracterizado hasta ahora, el BIF inhibe la unión de E. coli a las células epiteliales
humanas. (Cheikhyoussef y col., 2008).
El BIF tiene un peso molecular de 100 000 Da, con un punto isoeléctrico neutral e
inhibe la adhesión de E. coli enterotoxigenica cepa Pb176 in vitro, expresando la
colonización del factor de adhesión II a la molécula gangliotetrasilceramida GA4
(Fujiwara y col., 2001).
II.5.4. Sideróforos
El término ―sideróforo‖ se refiere a un compuesto, que pueden ser un polipéptido o
de algún otro material orgánico que es secretado por un organismo e inhibe el
crecimiento de otros microorganismos al privarlos de hierro. El sideróforo actúa
como un agente bacteriostático por la reducción en la cantidad de hierro libre
26
disponible para los microorganismos y por lo tanto impide su crecimiento.
(O´Sullivan, 2004). O´Sullivan aislo del tracto de gastrointestinal de animales
cepas de Bifidobacterium que secretan un sideróforo que inhibe el crecimiento de
microorganismos como L. lactis, C. difficile y C. perfirngens.
II.6. Efecto fisiológico y clínico de las bifidobacterias
Los productos del metabolismo de los probióticos van desde ácidos grasos de
cadena corta, hasta ácidos orgánicos esenciales como el ácido fólico y el ácido
orótico. Estos compuestos crean un medio ambiente ácido en el intestino por la
disminución del pH y modulan una serie de eventos fisiológicos y benéficos en el
hospedero. La liberación de varias enzimas dentro del lumen intestinal por las
bacterias probióticas, ejerce efectos sinérgicos en la digestión y alivio de síntomas
por la mala absorción intestinal (Naidu y col., 1999).
II.6.1 Tiempo de tránsito colónico
Se ha definido el tiempo de tránsito colónico (TTC) como la medición objetiva del
tiempo en el que transcurre el contenido intestinal a través de colon (Pacheco y
col., 2005). Las alteraciones en el tiempo de tránsito colónico, asociado con
diarrea y estreñimiento, son frecuentes y constituyen un objetivo importante para
los alimentos funcionales, incluidos los probióticos. Varias cepas bacterianas han
demostrado actividad contra la diarrea de varias etiologías (Marteau, 2002).
Sin embargo; varios estudios han evidenciado que los probióticos aceleran el
tiempo de tránsito colónico. En un estudio en el que se incluyeron 70 voluntarios
sanos, se les dieron 375g/día (125 g, tres veces al día) de leche fermentada con la
cepa B. animalis subsp lactis durante 11 días, se tuvo como resultado el
acortamiento en el tiempo de tránsito colónico en un 20% en comparación al grupo
de referencia y el grupo placebo. El efecto fue más pronunciado en mujeres, en
particular en aquellas con un tiempo de tránsito colónico largo. Estos efectos no se
27
encontraron en productos probióticos con un tratamiento térmico, lo que sugiere
que es necesario la supervivencia y actividad metabólica del probiótico (Bouvier y
col., 2001).
Otro estudio controlado demostró que mujeres, a las que se les dio 375g de yogurt
con bifidobacterias por 10 días, tuvieron menor tiempo de tránsito colónico y
sigmoideo (p<0.05) en comparación con el tiempo del producto testigo que no
tenia bifidobacterias (Marteau y col., 2002). La ingestión de 375g de yogurt
corresponde a una ingestión de 3.6 x 1010 ufc de Bifidobacterium animalis que es
del mismo orden de magnitud en escala logarítmica que la dada por 125 o 250g
del producto (1.2 x1010 y 1.4x1010 ufc respectivamente).
En otros dos estudios se investigó la eficiencia de diferentes dosis de B. animalis
contenidas en leches fermentadas en el tiempo de tránsito, enfocándose en
personas mayores. La primera demostró que el consumo regular de 250 o
375g/día de leche fermentada con bifidobacterias, acorta el tiempo de tránsito
intestinal. El efecto fue más evidente con 375g/día que con los 250g/día. En el
segundo estudio se evaluaron dosis más bajas y la duración del efecto benéfico
del consumo después de que el producto fue retirado. El estudio incluyó 200
voluntarios con edades entre 50 a 75 años, divididos en dos, un grupo de 100
individuos con un tiempo de tránsito normal (40-50 h) y otro de 100 individuos con
tiempo de tránsito bajo (>50h) asignados al azar para recibir 125 o 250g de leche
fermentada con bifidobacterias al día durante 2 semanas. Los autores
concluyeron que: (i) los voluntarios que recibieron 125 y 250 g/día de leche
fermentada con bifidobacterias, ambas dosis reducen significativamente el tiempo
de tránsito oral-fecal. (ii) El efecto en el tiempo de tránsito oral-fecal duró de 2 a 4
semanas, después de que se dejo de dar la leche fermentada (Meance y col.,
2001 y 2003).
28
Los datos demuestran que las leches fermentadas con bifidobacterias reducen el
tiempo de tránsito intestinal con un efecto dosis respuesta, especialmente en
sujetos con lentitud en el tiempo de tránsito.
II.6.2. Fermentación colónica.
A través de la fermentación, se estimula el crecimiento bacteriano (biomasa) y
ácidos orgánicos (ácido láctico y ácidos grasos de cadena corta - AGCC), estos
son producidos junto con gases: H2, CO2 y CH4. EL ácido láctico es producido por
varias especies bacterianas, principalmente por bifidobacterias y lactobacilos. Los
AGCC (principalmente acetato, propionato y butirato) son los principales
productos finales de las reacciones fermentativas de las bacterias y los principales
aniones en el intestino grueso del humano (Mortensen, 1996). Todos los AGCC se
absorben rápidamente en el intestino grueso y estimulan la absorción de agua y
sal. Estos se metabolizan principalmente en el epitelio intestinal, hígado y
músculo. Una de sus principales características es su efecto trófico sobre el
epitelio intestinal. Además, el butirato es importante como fuente de energía para
el epitelio colónico y regula la diferenciación y crecimiento celular (Bugaut y
Bentejac, 1993). Aun cuando las bifidobacterias no producen directamente
butirato, producen lactato el cual puede ser transformado a butirato (Duncan y col.,
2004). Además de los productos de fermentación, las bacterias del intestino
incluyendo las bifidobacterias, son capaces de sintetizar vitaminas, especialmente
vitaminas del complejo B (Crittenden y col., 2003).
II.6.3. Estimulación de la inmunidad
En un estudio aleatorio, se les dio a 30 adultos, que no consumían habitualmente
alimentos fermentados, una leche fermentada que contenía B. animalis BB-12
durante tres semanas y se les infectó con una cepa atenuada de Salmonella
enteropatogenica para simular una infección y se midió el efecto sobre la flora
intestinal y se evaluó la respuesta inmune. Se concluyó que B. animalis puede
29
persistir en el tracto gastrointestinal y puede actuar como coadyuvante a la
respuesta inmune humoral (Link-Amster, 1994).
El efecto barrera generado por algunos probióticos puede derivar de una
modulación positiva de la capa mucosa que separa el lumen intestinal de los
colonocitos. De hecho, los probióticos pueden cambiar la barrera de la mucosa
intestinal por estabilización de la mucosa intestinal, la regulación de la
permeabilidad intestinal y mejorando la inmunidad del TGI, permitiendo la
prevención del sobrecrecimiento de bacterias y virus patógenos (Brandtzaeg y
col., 1989).
II.6.4. Efectos sobre el sistema inmune del colon.
El primer contacto que tienen las bacterias ingeridas con el sistema inmune es el
tejido linfoide relacionado con mucosas (TLRM). El intestino humano es la mayor
masa de tejido linfático en el cuerpo, contiene más de 106 linfocitos/g de tejido.
Diferentes componentes del sistema inmune de la mucosa actúan enfocando una
respuesta específica contra antígenos exógenos. La primera línea de defensa del
sistema es la secreción de IgA, la cual produce abundantes anticuerpos de la
mucosa. La principal función es la secreción de anticuerpos, en cooperación con
mecanismos de defensa no inmunológicos, esto es mediante la exclusión de
antígenos extraños por prevención de la adherencia al epitelio y penetración de
microorganismos patógenos invasivos. Los anticuerpos son también responsables
para la neutralización de toxinas y multiplicación viral.
Las bacterias (patógenas y no patógenas) constituyen antígenos que sirven para
obtener un sistema de respuesta específica inmune local. Además que ejercen
una considerable influencia en el número y distribución de las poblaciones de
células del TLRM y juegan un importante papel en la regulación de la respuesta
inmune (Brantzaeg, 1995).
30
Se ha reportado que algunos probióticos estimulan el sistema inmune a través de
modos de acción no específicos, resultando en un incremento en la respuesta
inmune a una amplia variedad de antígenos. En un estudio no controlado se
suministro BB12 (1x1010 ufc/día) y Lactobacillus johnsonii LA1 (7x1010 ufc/día), a
14 voluntarios durante 3 semanas, encontrando que se duplico el número de
linfocitos con actividad fagocitaria en la sangre periférica, desde el inicio hasta el
final del tratamiento (Shiffrin, 1995).
II.6.5. Efecto de las bifidobacterias contra las enfermedades
gastrointestinales
La diarrea infecciosa es una infección aguda del intestino, es usualmente auto-
limitante y se caracteriza por diarrea y algunas veces vómitos. Los principales
agentes patógenos son virus y bacterias (Brown y Valiere, 2004).
La infección por rotavirus es la causa más común de diarrea en niños. Muchos
estudios clínicos han evaluado el efecto de los próbioticos sobre la diarrea aguda
asociada con el rotavirus. Haschke y col. (1998) concluyeron que las
bifidobacterias sobreviven a través del TGI y están presentes en las heces, al
suministrar fórmulas lácteas con BB-12 a niños, además estos experimentaron
menor diarrea por infección por rotavirus. El uso de fórmulas con BB-12 es seguro
y puede prevenir enfermedades y molestias, a menudo visto en países
industrializados y en desarrollo.
En otro estudio realizado por Saavedra y col. (1994) mencionan que la
administración de una fórmula infantil con bifidobacterias redujo significativamente
la incidencia de diarrea y la insidencia de infección por rotavirus fue menor. La
fórmula complementada fue bien tolerada por los niños, muchos de los cuales
estaban desnutridos o inmunocomprometidos. El uso de las preparaciones con
probióticos puede ser un método práctico para la prevención de la diarrea.
31
La diarrea causada por el crecimiento de bacterias patógenas es la más común
debido al uso indiscriminado de antibióticos. Los probióticos pueden inhibir este
crecimiento por la liberación de sustancias inhibidoras o bacteriocinas, como se ha
demostrado con algunas cepas in vitro (de Ross y Katan, 2000).
Wang y col. (2004) concluyeron que la ingesta regular de yogurt al que le
adicionaron BB12 y LA5, efectivamente suprime la infección por Helycobacter
pylori en humanos.
En otro estudio, los sujetos que recibieron una mezcla de prebiótiocos
(fructooligosacaridos) y probióticos (incluyendo B. longum) durante la
administración oral de cefpodoxima proxetil dos veces al día fueron menos
susceptible a la colonización de Clostridium difficile que los sujetos placebo o que
recibieron solo prebióticos (Orrhage y col., 2000).
Otros problemas gastrointestinales son la enfermedad inflamatoria intestinal de los
humanos y la pouchitis. La inflamación aguda o crónica ocurre hasta en el 50% de
pacientes con colitis ulcerativa (CU) después de una proctocolectomía y asociado
con la reconstrucción de la bolsa con la anastomosis ileoanal (Kruis, 2004).
La mayoría de las investigaciones en este ámbito se han hecho con probióticos,
pero al mismo tiempo hay un creciente interés en la capacidad de los prebióticos y
simbióticos para controlar los síntomas de la enfermedad inflamatoria intestinal,
son muy pocos los ensayos aleatorios controlados reportados. Aunque los
resultados han sido variables, los estudios en humanos y animales han
demostrado que en muchas circunstancias, los alimentos con probióticos pueden
alterar la composición de la microbiota del colon, reducir los procesos inflamatorios
en la mucosa intestinal y tienen el potencial de inducir la remisión de la
enfermedad (Brown y Valiere, 2004; Steed y col., 2008).
32
II.6.6. Efecto de las bifidobacterias sobre la carcinogénesis del colon
Existen pruebas de que la flora intestinal normal puede influir en la carcinogénesis
por la producción de enzimas que transforman procarcinógenos en activos
cancerígenos. Estas enzimas son β-glucoronidasa, azoreductasa y nitroreductasa
(McGarr y col., 2005, Marteau y col., 1990).
Myllyluoma y col. (2007), evaluaron una combinación de probióticos que incluye a
Lactobacillus rhamnosus GG es útil como tratamiento adyuvante durante la
erradicación de H. pylori. La infección por H. pylori está asociada con aumentos de
la secreción basal de gastrina y de la secreción de ácido clorhídrico. La gastrina-
17 está aumentada en la atrofia gástrica y el cáncer gástrico. Por si misma, la
atrofia produce hipergastrinemia. Los probióticos ensayados en este estudio hacen
descender la gastrina-17 pero los mecanismos exactos de este proceso no son
conocidos. La capacidad de los probióticos de adherirse a la mucosa gástrica es
desconocida. Los niveles de los pepsinógenos y su proporción no sufrieron
alteraciones. Si bien disminuye la densidad de la población de H. pylori en la
mucosa gástrica, ninguno de los probióticos fue capaz de erradicarlo.
En otros estudios realizados por Roller y col. (2007) y Rafter y col. (2007), se
evaluaron el efecto de sinbióticos en el proceso de desarrollo de pólipos colónicos
teniendo como base evidencia obtenida de estudios en animales de laboratorio.
Los estudios fueron efectuados en pacientes colectomizados o en quienes se
habían practicado polipectomías. En ambos estudios se les administró inulina
enriquecida con oligofructosa y una mezcla de Bifidobacterium lactis Bb12 y
Lactobacillus rhamnosus GG. Se estudiaron marcadores de cáncer del colon y de
procesos inflamatorios en ambos estudios durante un período de 12 semanas. En
ambos estudios se produjeron alteraciones favorables de varios de los
biomarcadores de cáncer del colon y asimismo en los enfermos con pólipos. Estos
resultados sugieren que el sinbiótico puede producir una menor exposición del
33
epitelio a productos citotóxicos y genotóxicos, disminuye la proliferación de los
colonocitos y mejora la estructura de la mucosa.
II.7. Aplicaciones
Los cultivos de bifidobacterias han sido ampliamente explotados en la industria
láctea como herramienta para el desarrollo de nuevos productos funcionales. Shah
(2004), reporto que existía un estimado de 70 productos que contenían probióticos
comercializándose en el mundo, éste número ha aumentado desde entonces.
Tradicionalmente, las bifidobacterias han sido incorporados en el yogurt, sin
embargo, se han examinado otro tipo de productos para incorporarlas, se han
incluido en mayonesa (Khalil y monsour, 1998), alimentos para untar (Charteris y
col., 2002), en carne (Arihara, 1998), además de otros productos de origen lácteo,
como queso Cheddar (Ong y col., 2006) y salsas a base de queso (Tharmaraj y
Shah, 2004). Las bifidobacterias están disponibles en leches comerciales, leches
fermentadas, jugos de fruta, helados y productos de avena (Valsijevic y Shah,
2008). Los cultivos comerciales utilizados en estas aplicaciones se listan en el
cuadro 4. Las cepas probióticas se utilizan principalmente como complemento de
los cultivos iniciadores debido a su escaso crecimiento en la leche.
Cuadro 4. Algunas cepas de bifidobacterias empleadas en aplicaciones comerciales.
Cepa Fuente
B. animalis ssp.lactis Bb12 Chr. Hansen
B. lactis HOWARUTM/B1 Danisco
B. lactis LAFTI® B94 DSM Food Specialties
B. longum SBT-29281 Snow Brand Milk Products Co. Ltd
B. breve strain Yakult Yakult
B. lactis HN019(DR10) Fonetarra
B. animalis DN173010(Bioactivia) Danone
B. longum BB536 Morinaga milk industry Co.Ltd.
34
II.8. Encapsulación de ingredientes Bioactivos
La adición de ingredientes bioactivos presentes en alimentos funcionales provoca
muchos cambios, particularmente en la estabilidad del componente bioactivo
durante el procesamiento y almacenamiento, además es necesario prevenir
interacciones indeseables del ingrediente bioactivo con la matriz del alimento. En
este aspecto la microencapsulación de ingredientes bioactivos puede ayudar a
disminuir algunos de estos problemas. Obviamente, la obtención de los beneficios
en la salud requiere acciones para asegurar la estabilidad de los componentes en
el sistema gastrointestinal y facilitar la liberación apropiada en el sitio activo
(Champagne y Fustier, 2007).
La encapsulación se define como la tecnología de empacado de materiales
sólidos, líquidos y gaseosos en pequeñas cápsulas que controlen la tasa de
liberación de su contenido en periodos de tiempo prolongados. La cápsula o
envoltura, puede ser de muchas formas diferentes, de membrana simple,
membrana esférica o irregular, estructura multimembrana con paredes de la
misma composición o de otra. En general son tres los pasos involucrados en la
encapsulación: Formación de la pared alrededor del material, aseguramiento de
que no exista fugas y asegurase de que no existan materiales extraños (Gibbs,
1999).
Los tipos de tecnologías empleadas para encapsular, son de interés significante
para el sector farmacéutico (ej. liberación de vacunas y drogas), pero también es
relevante para la industria alimentaria, ya que algunas veces se requiere la adición
de ingredientes funcionales, los cuales son típicamente utilizados para controlar
las propiedades de sabor, color, textura y preservación. Pero también se está
incrementando la inclusión de ingredientes con potencial benéfico a la salud como
son los probióticos. Se han propuesto e investigado varios métodos de protección
para los probióticos en diferentes productos lácteos, como es la encapsulación
(las perlas esféricas de polímero tienen un diámetro entre 0.3 y 3.0 mm) y la
35
microencapsulación (tamaño menor a 100 m) para mejorar la viabilidad de los
microorganismos tanto en productos alimenticios como en el tracto intestinal
(Champagne y col., 1994).
Los probióticos presentan dos tipos de problemas cuando se considera la
microencapsulación: el tamaño, normalmente entre 1 y 5 µm de diámetro el cual
inmediatamente excluye a la nanotecnología, y el hecho de que se tienen que
mantener vivas a las células. Este último aspecto ha sido crucial en la selección de
la tecnología apropiada para encapsular. Asimismo, los diferentes tipos de
materiales utilizados para encapsular dependen de las propiedades funcionales de
la microcápsula y el proceso de encapsulación empleado (Champage y Fustier,
2007).
Los materiales de la cápsula puede ser goma arábiga, la cual es muy utilizada por
sus características de viscosidad, solubilidad y emulsión; también se usan
almidones derivados de papas, maíz, trigo, arroz, y otros, aunque la desventaja de
estos es que son muy viscosos cuando se mezclan con agua y su concentración
es limitada a 3%. En el caso de las maltodextrinas, su viscosidad es menor que la
de la goma arábiga y no tiene grupos lipofilicos, por lo que sus propiedades
emulsionantes son pobres, sus ventajas incluyen poco sabor y se puede usar en
altas concentraciones. Otro ejemplo son los alginatos, los cuales pueden
reaccionar con iones de calcio y formar un gel estable. También hay materiales a
base de proteínas como la polipeptona, proteínas de soya, derivados de leche y
derivados de gelatinas, pero su principal desventaja es su alto costo, su
solubilidad en agua fría y el potencial de reaccionar con grupos carbonilo. También
se pueden emplear componentes lipídicos (liposomas) y ciclodextrinas (Gibbs,
1999). De todos estos materiales el más utilizado es el alginato, el cual es un
heteropolisacárido lineal de ácido L- gulorónico y ácido D-manurónico extraído de
varias especies de algas. Las propiedades funcionales del alginato como un
material de soporte está fuertemente asociada con la composición y secuencia de
los ácidos L- gulorónico y D-manurónico. Los cationes divalentes como el Ca2+ se
36
enlazan preferentemente al polímero del ácido L-gulorónico (Krasaekoopt y col.,
2003).
Las células encapsuladas pueden tener mayores ventajas sobre las células libres
dentro de las cuales se incluye el mantenimiento de una biocatálisis estable y
activa, productividad alta, brinda protección a la célula contra daños y reduce la
susceptibilidad de contaminación. Muchos factores pueden afectar la eficiencia de
las cápsulas en la protección de la bacteria encapsulada. En general, la viabilidad
de la célula en la microcápsula incrementa con el aumento en tamaño de la
cápsula de alginato y la concentración del gel (Chen y col., 2006). La
supervivencia de bifidobacterias encapsuladas es fuertemente dependiente de la
concentración de alginato, número inicial de células y especie (Lee y Heo, 2000).
Se han empleado por lo menos cinco métodos para encapsular probióticos:
cubierta por aspersión, secado por aspersión y tecnologías de gelación de
partícula: extrusión, emulsión y enfriado por aspersión (spray chilling or spray
cooling)[Gibbs, 1999]. Como el componente bioactivo o a encapsular puede estar
en forma líquida, algunas técnicas están basadas en la aspersión. En enfriado por
aspersión una matriz fundida con bajo punto de fusión (32-42°C) que contiene el
componente bioactivo es atomizado a través de una boquilla dentro del
contenedor. Este proceso es similar al de secado por aspersión con respecto a la
producción de gotas finas; aunque éste se basa en la inyección de aire frío dentro
del secador para permitir la solidificación de la partícula de gel, en lugar del aire
caliente el cual seca las gotas produciendo finas partículas de polvo. En la técnica
de cubierta por aspersión el material bioactivo necesita estar en forma sólida y es
mantenido en movimiento en recipientes especialmente diseñados, ya sea por
inyección de aire en la parte baja o por acción rotatoria (Figura 8). El material
líquido, de envoltura, es asperjado sobre el material bioactivo y solidifica para
formar una capa sobre la superficie. El material de envoltura puede ser inyectado
de varios ángulos (Figura 9) y esto influye en las propiedades de la cubierta
(Ubbink y col., 2003).
37
Figura 9. Métodos de cubierta por aspersión para encapsular probióticos. Las tres técnicas ilustradas difieren principalmente en el tipo de aire fluidizado empleado y el sitio en el recipiente donde el material de envoltura es asperjado. Las bacterias probióticas son puestas como partículas de polvo fino, estas son preparadas por los métodos tradicionales (fermentación, concentración, liofilización y granulación), este polvo es mantenido en movimiento en el envase. Se puede emplear como material de envoltura gluten, caseína, derivados de celulosa, carragenina y alginato.
Otras de las tecnologías más empleadas para encapsular probióticos es la de
gelación de partícula (Doleyres y Lacroix, 2004), Dentro de las anteriores
tecnologías, la de enfriado por aspersión es considerada la más económica
(Gouin, 2004). En la encapsulación por gelación, la formación del gel es inducida
por cambios de temperatura, en el caso de agar, agarosa, -carragenina y goma
gelana y por gelación ionotropica realizada por entrecruzamiento de cadenas
polionicas con iones multivalentes opuestos, como ocurre con alginato, quitosana,
carboximetil celulosa y goma guar.
Las cápsulas se forman en un proceso de dos pasos que involucran dispersión y
endurecimiento. La dispersión puede ser formada ya sea por extrusión o por
emulsión. En el método de extrusión la suspensión de células-polímero se hace
salir a través de una aguja, generando gotas esféricas las cuales caen dentro de la
solución de endurecimiento. La técnica de emulsión involucra la dispersión de la
38
fase acuosa la cual consiste en la suspensión de células en el polímero dentro de
una fase orgánica, resultando en una emulsión agua en aceite. Las gotas acuosas
dispersas son endurecidas por enfriamiento o adición de un agente gelante.
También se puede llevar a cabo una co-encapsulación externa por la adición de
un segundo agente activo en la suspensión de alginato células. Así mismo se
puede aplicar una segunda cubierta a la capsula previamente formada (Figura 10).
Por la técnica de emulsión las cápsulas son de diámetros más pequeños en
comparación al método de goteo y es más propicio para aplicaciones de
escalamiento (Grobiollot y col., 1994).
La encapsulación de probióticos para su adición dentro de los alimentos y bebidas
ofrece varios beneficios tecnológicos (Cuadro 5). Esto puede ser argumentado
por que la encapsulación sirve como ―liberador‖ de células viables dentro del
alimento, aunque algunas veces este no sea liberado en el producto.
Figura 10. Tecnologías de gelación de partícula para la microencapsulación de probióticos. Proceso de extrusión (izquierda), el tamaño de la partícula puede ser ajustado por el empleo de vibración de la aguja o efectos piezo eléctricos. Proceso de emulsión (centro y derecha) el tamaño de la cápsula se puede ajustar por medio de la velocidad de agitación o tipo de mezclador. La emulsión es llevada a cabo por la adición de la suspensión células-alginato o carragenina en una fase aceitosa. La solidificación ocurre por la adición de una solución de CaCl2 o una solución ácida.
39
Cuadro 5. Efectos favorables de la encapsulación de probióticos.
EFECTO FAVORABLE PRODUCTO
Facilita la producción de cultivos sensibles al oxígeno Cultivo probiótico seco
Facilita la recuperación de cultivos sensibles a la
centrifugación
Cultivo probiótico seco
Disminuye los problemas de contaminación Cultivo probiótico seco
Los cultivos pueden ser secados con aire Cultivo probiótico seco
Mejora la supervivencia a exposiciones de soluciones
gástricas
Nutraceuticos
Mejora la supervivencia a exposiciones de soluciones
biliares
Nutraceuticos
Mejora la estabilidad durante el almacenamiento en
forma seca
Nutraceuticos
Mejora la tasa de acidificación Embutidos secos
Mejora la supervivencia al calor Panificación
Mejora la supervivencia en frío Helados, jugos y medios a base
de leche
Mejora la retención en el producto final Queso
Protección contra bacteriófagos Leches fermentadas
Protección contra levaduras contaminantes Leches fermentadas
Mejora la sobre vivencia durante el almacenamiento Yogurt, mayonesa, leche
Fuente Champagne y Fustier, 2007.
Independientemente de los problemas tecnológicos para la producción de
probióticos, los cultivos que son encapsulados en esferas de alginato mejoran la
resistencia a la acidez del medio ambiente gástrico y a las soluciones biliares
(Chandramouli, 2004). Con las partículas de gel las células no son liberadas
dentro de los productos alimenticios cuando son adicionadas; estudios in Vitro y ex
vivo han mostrado que las cápsulas mantienen su integridad en condiciones
gástricas simuladas, pero subsecuentemente son liberadas en el tracto intestinal
(Iyer, 2004).
40
III JUSTIFICACIÓN
Las bifidobacterias y otros cultivos iniciadores son empleados generalmente en
forma congelada o seca (congelados o liofilizados) para su inoculación directa en
lotes de leche. La viabilidad de estos cultivos a lo largo de su proceso de
obtención y almacenamiento depende de muchos factores como son; la
concentración inicial, condiciones de crecimiento, medio de crecimiento y
rehidratación. Las desventajas que presentan la congelación o liofilización son
principalmente en el manejo, debido al alto costo de almacenamiento y transporte,
además de los efectos perjudiciales en la viabilidad por el ciclo de congelación-
deshielo, por lo cual se han empleado otras tecnologías para su manejo como es
el secado por aspersión. Independientemente del método aplicado para su
conservación, los cultivos de bifidobacterias están expuestos a condiciones
ambientales desfavorables, debido a la mayor concentración de soluto, la
formación de hielo intracelular (en el caso de la congelación), la exposición a
temperaturas elevadas durante el secado por aspersión y en general, a la
deshidratación. Además, la viabilidad de las bifidobacterias en el sistema de
liberación (i.e. alimento) depende de la cepa seleccionada, interacción entre las
especies microbianas presentes, producción de peróxido de hidrógeno del
metabolismo bacteriano, actividad acuosa y la acidez del producto final.
Adicionalmente la viabilidad puede ser afectada por la disponibilidad de nutrientes,
promotores de crecimiento e inhibidores, concentración de azúcares, potencial
redox (presencia de oxígeno) y permeabilidad del empaque al oxígeno, cantidad
de inóculo y tiempo de fermentación. Por esta razón, las técnicas de
encapsulación y microencapsulación son un método prometedor para mejorar la
eficiencia y liberación de bifidobacterias fisiológicamente activas al sitio donde
deben ejercer su acción benéfica.
41
IV HIPÓTESIS
El proceso de encapsulación incrementa la viabilidad de las bifidobacterias en el
kéfir durante el almacenamiento y la digestión gástrica.
V. OBJETIVOS
V.1 Objetivo general
Estudiar el proceso de encapsulación de Bifidobacterium animalis subsp. lactis
para emplearse como probiótico en Kéfir.
V.2 Objetivo específicos
Seleccionar el proceso adecuado empleando alginato para encapsular a
Bifidobacterium animalis subsp. lactis de tal manera que resista la acción
de ácidos gástricos y sales biliares.
Caracterizar el proceso de conservación por secado de encapsulados de
bifidobacterias, así como la morfología de las capsulas humedas y
deshidratadas por análisis de imágenes.
Evaluar la sensibilidad de Bifidobacterium animalis subsp. lactis a la nisina y
antibióticos.
Utilizar las bifidobacterias encapsuladas para incorporarlas en el kéfir y
estimar la viabilidad de las mismas durante el almacenamiento refrigerado
42
VI. MATERIALES Y METODOS
VI.1. Materiales
Microorganismo: Cepa Bifidobacterium animalis subsp. lactis (F-DVS BB-12)
donada por Chr Hansen México.
Reactivos
Alginato de sodio (Fluka)
Extracto de bilis bovina (Sigma B-8391. Lot. 99H0733 )
Pepsina de mucosa de estomago de cerdo (Sigma Lot.70H0437)
Nisina (Nisaplin, OXD. Danisco)
Reactivos de grado analítico
Clorhidrato de L- Cisteína monohidratada (MP lot. R20392)
Medio TPYG el cual consiste en (gL-1) peptona de soya 5, peptona de caseína
10, extracto de levadura 2.5, glucosa 10, MgCl26H2O 0.5, K2HPO4 2.0, ZnSO47
H2O 0.25, CaCl2 0.125, FeCl3 0.003, Cisteína 0.5 y Tween 80 un mL.
Agar MRS al cual se le adiciono (gL-1) cisteína 0.5, Na2CO3 0.2 y CaCl2 0.1
Leche en polvo Difco
Equipo
Cámara de anaerobiosis (Forma Scientific) con una composición de aire de 5% H2,
10% CO2 y 85% N2.
Centrífuga.
Material de vidrio propio del laboratorio
Espectrofotómetro.
Estufa de cultivo
Microscopio óptico compuesto Carl Zeiss
Potenciómetro. Marca Orion. Modelo 920, pH 0-14
Agitador tipo vortex
Esterilizador.
43
VI.2. Desarrollo experimental
Activación de la bacteria
Bifidobacterium animalis subsp. lactis
Prueba de
confirmación de
género
Conservación de la cepa
Encapsulado en polímeros
Curva tipo
Simulación
gástrica
Susceptibilidad
a la Nisina
Incorporación a
un producto
Susceptibilidad
a
antimicrobianos
Análisis de
imágenes
44
VI.3. Metodología
Activación de la bacteria.
Se pesó 1 g de la cepa liofilizada (BB12, Chr. Hansen) y se resuspendió en 9 mL
de caldo MRS modificado el cual consiste de caldo MRS 52 gL-1, cisteína 0.5 gL-1,
Na2CO3 0.2 gL-1 y CaCl2 0.1 gL-1. Se homogeneizó y se tomaron alícuotas de 1ml
y se inocularon 5 tubos que contenian 9 mL de caldo MRS modificado (González
y col., 2004), finalmente se incubaron por 12 horas a 39°C en una cámara de
anaerobiosis (Forma Scientific) con una composición de aire de 5% H2, 10% CO2 y
85% N.
Acondicionamiento de la bacteria.
Se tomaron alícuotas de los tubos anteriores y se inocularon al 10% v/v frascos
viales con medio TPYG para un volumen final de 80mL; a los que previamente se
les gaseó CO2 puro y se sellaron herméticamente (Azaola y col., 1999). Los
frascos se incubaron a 37°C y 180 r.p.m. por 8 horas.
Conservación de la cepa.
Se tomaron alícuotas de los frascos anteriores y se inocularon al 10% v/v 10
frascos viales con medio TPYG para un volumen final de 80mL. Previamente los
viales se gasearon con CO2, para producir la anaerobiosis, se sellaron
herméticamente y se esterilizaron a 121°C por 15minutos. Los frascos se
incubaron a 37°C por 12 horas y 180r.p.m. Posteriormente el contenido de los
viales se centrifugó a 3000 x g por 15min a 4°C, el sobrenadante se descarto y el
paquete celular se lavó con agua peptonada dos veces, se concentró y se
resuspendió con 30 mL de leche descremada con 20% de glicerol y se mezcló de
manera homogénea. Se transfirió el contenido a viales Eppendorf 1.5 mL, y se
sembró por vaciado en placa por diluciones 101 hasta 1010, para determinar las ufc
45
contenidas en un mililitro. Los viales se guardaron en congelación hasta su
posterior utilización.
Confirmación del género.
La enzima clave en la fermentación tipo glicolítica es la fructosa 6 fosfato
fosfocetolasa (F6PPK), la cual puede ser usada como un carácter taxonómico en
la identificación del género, aunque ésta no hace posible la diferenciación ínter
especie (Masco y col., 2004).
Las células se cultivaron por 24 horas en caldo TPYG a 38°C, se tomaron 20 mL
del caldo y se centrifugó a 3000 x g por 10 minutos. El paquete celular se
resuspendió en 15 mL de solución salina por agitación en vortex; este
procedimiento se realizó por duplicado, se centrifugó nuevamente a las mismas
condiciones y el paquete celular se resuspendió con 2 mL de amortiguador de
fosfatos 0.05M adicionando cisteína; se colocó en un baño de hielo y se aplicó
sonicación 3 veces con pulsos de 5 s y períodos de descanso de 5 s. El producto
de la sonicación se mezcló con 250 µL de solución 1(6mg NaF y 10mg Na yodo
acetato en 1 mL de agua) y 250 µL de solución 2 (fructosa -6-P 80mg/L); se agitó
por 30 minutos a 37°C, la reacción se paró por adición de 1.5 mL de solución 3
(hidroxilamina – HCl, 13.9 g/100mL, recién neutralizada con NaOH a pH 6.5). La
mezcla se dejó reposar 10 minutos a temperatura ambiente y después se
adicionaron 1mL de solución 4 (TCA 15% p/v en agua) y 1 mL de solución 5 (HCl
4M), se agitó y dejó reposar por 5 minutos. Finalmente se adicionó 1 mL de
solución reveladora 6 (FeCl3.6H2O 5% p/v) en HCl 0.1M. El desarrollo de un color
rojizo-violeta inmediatamente después de agitar el tubo indicó la presencia de
F6PPK. Esta enzima es única para bifidobacterias. El resultado es negativo si el
color formado hubiera sido amarillo claro (Scardovi, 1986).
46
Elaboración de la curva estándar de crecimiento.
Las células se cultivaron en caldo TPYG por 12 horas, a 38°C, cada 2 horas se
tomó una alícuota de 2 mL y se centrifugó a 3000 x g por 10 minutos. El
sobrenadante se descartó y el paquete celular se lavó con solución salina al
0.85% estéril, se realizó el conteo de ufc por siembra en placa con agar MRS,
haciendo diluciones de 10-1 hasta 10-9 con solución salina, por duplicado, y se leyó
a 660 nm. Las placas se incubaron por 48 horas a 38°C, en la cámara de
anaerobiosis. Se realizó una gráfica del tiempo contra la absorbancia y unidades
formadoras de colonias (Saarela y col., 2005).
Preparación del cultivo a encapsular.
Se utilizaron 2 g de cultivo de Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BB12, Chr.
Hansen) liofilizado y se resuspendió en 18 mL de caldo MRS estéril, se mezcló de
manera homogénea y posteriormente se tomaron alícuotas para inocular al 1% v/v
5 tubos con medio MRS estéril (González y col., 2004) y se incubaron por 12
horas a 39°C en cámara de anaerobiosis (Forma Scientific) con una composición
de 5% H2, 10% CO2 y 85% N2. Posteriormente se tomaron alícuotas de los tubos
anteriores y se inocularon al 10% v/v frascos viales que contenían medio TPYG
para un volumen final de 80mL; a los que previamente se les gaseó CO2 puro, y
se sellaron herméticamente (Azaola y col., 1999). Los frascos se incubaron a 37°C
y 180 r.p.m. por 8 horas. Las células se cosecharon por centrifugación a 3000 x g
por 15 minutos, el paquete celular se resuspendió con solución salina al 0.9% y se
ajustó por densidad óptica a una concentración aproximada de 1 x109 ufc/mL, por
último se almacenaron a 3°C para su posterior utilización.
47
Encapsulación de las bifidobacterias.
Se prepararon soluciones de alginato de sodio al 1,2 y 3%; se esterilizaron a
121°C por 15 minutos y después individualmente se mezclaron con 1% de células
resuspendidas con una concentración aproximada de 1x109 ufc. Las cápsulas se
obtuvieron por goteo de la mezcla del polímero- células, a través de una aguja
20G, 22G y 27G en caída libre a 10 cm por arriba de una solución de CaCl2, (0.2
M), las cápsulas se dejaron en la solución por 20 minutos para permitir el
endurecimiento (Lee y Heo, 2000). Posteriormente se cocecharon y se
almacenaron a 3°C con solución de agua peptonada al 0.03%.
Viabilidad de las células encapsuladas.
Las cápsulas se lavaron con solución salina al 0.85% p/v y se disuelvieron por 20
minutos en 10 mL de solución de citrato de sodio 0.1M (Lee and Heo, 2000). Se
realizaron diluciones de 10-1 hasta 10-7 y se sembró por la técnica de vaciado en
placa con agar MRS bajo condiciones anaeróbicas a 37°C por 2 días. Lo anterior
se realizó para un periodo de 4 semanas.
Secado de las cápsulas
Las cápsulas preparadas con 3% de alginato y aguja 20, se almacenaron en
solución de agua peptonada al 0.1% a 4ºC. Posteriormente las cápsulas se
sometieron a un secado por lecho fluidizado con una velocidad del aire de
3.25m/s y tres esquemas de temperatura de deshidratación: (A) 20ºC durante todo
el proceso, (B) 40ºC por 15 minutos y 20ºC hasta terminar el proceso de
deshidratación y (C) 40ºC durante todo el proceso, las cápsulas deshidratadas se
almacenaron en frascos de polipropileno a temperatura ambiente (20-25°C). Para
determinar el tamaño y geometría de las cápsulas deshidratadas se utilizó la
técnica de procesamiento de imágenes (Du and Sun, 2004), la adquisición de la
48
imagen se realizó por medio de un microscopio de barrido (Scanning microscope
JSM-5800LU), posteriormente la segmentación de la imagen se efectuó con la
técnica de thresholding. Se tomaron los parámetros morfométricos de circularidad
o factor de forma circular, así como el diámetro de Feret; estos parámetros los
proporciona directamente el programa Image J v1.41 (Wayne Rasband, National
Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).
Para medir la viabilidad de las cápsulas deshidratadas, estas se disolvieron por
20 minutos en 10 mL de solución de citrato de sodio 0.1M (Lee and Heo, 2000) y
se sembró por la técnica de vaciado en placa con agar MRS modificado bajo
condiciones anaeróbicas a 37°C por 2 días. Lo anterior se realizó por un periodo
de 3 meses.
Prueba de susceptibilidad a la nisina.
Se disolvió 1 mg de nisina liofilizada en 1 mL de HCl 0.02 M (pH2) y se almacenó
en refrigeración. La solución de nisina se diluyó en factores de 2 para obtener las
siguientes concentraciones 500, 250, 125, 62.5, 31.2, 15.62, 7.8, 3.9, 1.9, 0.96,
0.48 y .24 μg/mL
Se utilizó el método de difusión en placa, a 14 cajas de petri de 90mm de diámetro
se le adicionó 1 mL de células sin encapsular a una concentración aproximada de
1x107ufc por vaciado en 10mL de medio MRS modificado. Se dejó secar hasta
solidificar y se realizaron 4 perforaciones de 10mm. A los pozos se les adicionaron
80μL de Nisina con concentraciones preparadas anteriormente, al control sólo se
le adicionan 80 μL de HCl 0.02M. Se metieron a refrigerar x 3h para permitir la
difusión de la nisina, posteriormente se sacaron y se incubaron a 40°C x 24h en
anaerobiosis. La CMI se identificó como la dilución más baja de nisina que
presentó un halo de inhibición (Rada y Dlabal, 1998).
49
El efecto de protección de las cápsulas se detectó por crecimiento en viales con
medio TPYG, se emplearon 14 viales a los cuales se les adicionó nisina para
obtener concentraciones de 500, 250, 125, 62.5, 31.2,15.62, 7.8, 3.9, 1.9 ug de
nisina/mL y se les adicionaron 1 g de bifidobacterias encapsuladas ó 1mL de
bifidobacterias sin encapsular con una concentración de 1x107 ufc/g, se incubaron
durante 12 horas a 37°C en anaerobiosis y se midió la D.O. a 650 nm (Kheadr y
col., 2004).
Susceptibilidad a los antimicrobianos.
Se utilizó como inóculo una suspensión de 108 células mL-1 y se realizó una
prueba de sensibilidad por medio de la técnica de difusión en disco. Se sembró 1
mL de inóculo por el método de vaciado en placa utilizando medio MRS
modificado. Cuando el agar se enfrió se procedió a colocar el disco estándar con
12 agentes antimicrobianos (Moubareck, y col., 2004). El disco se tomó con una
pinza esteril y se colocó en el medio en un tiempo menor de 15 minutos después
de haber inoculado la placa, se incubó a 37°C por 48 horas en anaerobiosis. La
zona de inhibición se midió y el resultado se reportó como positivo o negativo.
Digestión in vitro, simulación de jugos gástricos
La solución gástrica se preparó suspendiendo 3g/L de pepsina en solución salina
al 0.5% v/v y se ajustó el pH a 2 adicionando HCl 12N (Lian ycol., 2003). Se
adicionaron 10mL de la solución gastrica y 1g de cápsulas ó 1mL de células sin
encapsular con concentración de 6.8 ufc/mL, a viales; estos se incubarón a 37°C
por 3h y 180 r.p.m. Se tomaron viales cada hora y se evaluó la viabilidad.
Viabilidad de cápsulas en presencia de sales biliares.
La solución biliar se preparó adicionando 6g de bilis (oxgall) a 100 mL de solución
salina al 0.85% p/v.
50
Las cápsulas puestas en HCl se enjuagaron con solución salina, se les adiciono
10 mL de solución biliar y se incubaron a 37°C durante 3 horas. Al terminar se
cosecharon las cápsulas, por medio de un tamiz 40 (0.425mm), se lavaron con
solución salina al 0.85% y se disuelvieron por 20 minutos en 30 mL de solución de
citrato de sodio 0.1M en agitación a 200 rpm a 25°C. Las células se cultivan en
diluciones de 10-1 a 10-6 en placa con agar MRS modificado bajo condiciones
anaeróbicas a 37°C por 48 horas (Hou y col., 2003).
Las células sin encapsular, provenientes del HCl, se centrifugaron para separar las
células del líquido y posteriormente se les adicono 10 mL de solución de bilis,
cada hora se tomo un vial y se cultivaron las células en agar MRS modificado bajo
condiciones anaeróbicas a 37°C por 48 horas, para obtener la viabilidad.
Análisis de imágenes
Se capturaron imágenes de las cápsulas testigo y tratadas en condiciones de
simulación gástrica cada hora por 6 h utilizando un estereomicroscopio Nikon,
SMZ 1500, Japan, a una amplificación de 2X. Las imágenes se trataron con el
programa Image J v1.41 NIH (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).
Se analizó, tanto la circularidad como el diámetro de Feret de las imágenes
capturadas.
Preparación del kéfir
Se empleó leche entera pasteurizada, se inoculó con 2% de cultivo liofilizado de
kéfir (Swedish Dairies Association, Malmo, Sweden). Se dejó fermentar a
temperatura de 26°C por 24 horas. El coagulo formado se rompió; se dividió en
tres porciones y se agregaron en recipientes sellados de 100mL. Una porción fue
el control (sin Bifidobacterias), a las otras dos partes se les adicionaron
bifidobacterias encapsuladas y sin encapsular por separado para tener una
51
concentración inicial de 2 a 3 x 107 CFU/ g y 2 x108 CFU/mL respectivamente.
Después se dejó madurar de 12-14°C por 24 horas (Otles and Cagindi, 2003) y
por último se almacenaron a 3°C para su posterior análisis. Esto se realizó por
triplicado.
Digestión in vitro, simulación de jugos gástricos de las bifidobacterias
encapsualdas y libres adicionadas al Kéfir.
La solución gástrica se preparó suspendiendo 3g/L de pepsina en solución salina
al 0.5% v/v y se ajustó el pH a 2 adicionando HCl 12N (Lian ycol., 2003). Cada
semana, se tomó un gramo de cápsulas contenidas en el kéfir almacenado, las
cuales se separaron por medio de un tamiz 40 (0.425mm), ó se tomó una alícuota
de 1.0 mL de kéfir con células libres. Las muestras se pusieron en viales y se les
adicionó 10.0 mL de solución gástrica y se incubó a 37°C por 3 h con agitación a
180rpm. La simulación gástrica se realizó semanalmente por un periodo de 28
días.
Viabilidad de las células encapsuladas y sin encapsular adicionadas al Kéfir.
Después de la digestió, las cápsulas se lavaron con solución salina al 0.85% y se
disolvieron por 20 minutos en 10 mL de solución de citrato de sodio 0.1M (Lee and
Heo, 2000). Se realizaron diluciones 10-1 hasta 10-7 y se sembró por la técnica de
vaciado en placa con agar MRS modificado bajo condiciones anaeróbicas a 37°C
por 2 días. Lo anterior se realizó para un periodo de 4 semanas.
Para las células libres después de la simulación gástrica se centrifugaron, se
enjuagaron con solución salina al 0.85% dos veces, se realizaron diluciones y se
sembró en placa con agar Columbia modificado (Beerens, 1991), al cual se le
adicionó 5g/L de rafinosa, 0.5g Cisteína, 3 mL/L de ácido propiónico y 2g/L de
cloruro de litio.
52
Características físico químicas del kéfir después del almacenamiento
pH. El pH se determinó para todas las muestras con un medidor de pH, marca
Orion modelo 920, pH 0-14, semanalmente.
Acidez Titulable. La acidez titulable se midió como porcentaje de ácido láctico, se
realizó para todas las muestras a los 0, 7, 14, 21 y 28d utilizando NaOH (0.1 N) y
solución fenolftaleína al 1% como indicador (Marshall, 1992)
Grasa total y lactosa se determinó por medio de espectroscopia infrarroja, con el
espectro fotómetro de luz infrarroja Miko-Skan 133B
Determinación de alcohol del kéfir Se determinó por un método colorimétrico
utilizando el kit BioVision (Ethanol Assay kit Catalogo #K620-100). Primero se
realizó una curva estándar: se adicionó 11.7μL de etanol (9.2 mg) y se mezcló con
988.3 μL de amortiguador para etanol. A continuación se tomaron 10 μL del
diluyente y se mezcló con 990μL de amortiguador. Se agregaron 0, 4, 8, 12, 16 y
20μL del etanol diluido en las celdas y se ajustó el volumen a 50μL con
amortiguador para etanol. A cada celda se le adicionó 50 μL de la mezcla de
reactivos (46 μL de regulador para etanol, 2 μL de etanol con dimetilsulfoxido y 2
μL de enzima alcohol oxidasa previamente preparada) y se leyo la densidad óptica
de cada celda a 570nm, con estos datos se realizó la curva tipo.
La muestra se preparó tomando 1 ml de kéfir y se diluyó con 1 mL de regulador y
se realizaron diluciones con el amortiguador. Se tomaron 50 μL de muestra diluida
y se adicionaron en una celda, junto 50 μL de la mezcla de reactivos y se leyó a
570nm. La concentración de etanol se obtuvó, por cálculo directo en la curva tipo
y multiplicado por el factor de dilución.
53
VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Conservación de la cepa y confirmación del género
La cepa conservada en glicerol y leche descremada, tuvó una concentración de
inicial de 2 ± 0.33 x109 ufc/mL, depsues de cinco meses en congelación la
viabilidad fue de 1.88 ± 0.11 x 109 ufc/mL. La congelación no afecto la viabilidad
debido a que tanto la leche como el glicerol son considerados crioprotectores. El
glicerol es un crioprotector penetrante, el cual penetra en la célula e incrementa el
volumen de la solución intracelular y aumenta la permeabilidad de la membrana
citoplasmática contribuyendo a la deshidratación; adicionalmente a los
crioprotectores penetrantes, se les atribuye la acción de disminuir el punto de
fusión de la solución intracelular, factor decisivo para evitar la formación de
cristales de hielo en el medio intracelular. Así mismo, la leche se considera un
crioprotector no penetrante, actuando fundamentalmente como agente osmótico
desde el medio externo y contribuyendo a reducir la cantidad de agua intracelular
que puede congelarse (Mazur, 1984). Por lo cual, la mezcla de ambos
crioprotectores dio mayor estabilidad a las células a bajas temperaturas.
Las células, mostraron la morfología típica de las bifidobacterias al ser observadas
al microscopio a 1000X (Figura 11). La prueba enzimática mostró actividad de la
enzima fructosa 6 fosfato fosfocetolasa, la cual es usada como un carácter
taxonómico en la identificación del género (Masco y col., 2004), esta enzima
cataliza la reacción Fructosa 6-P acetil-P + eritrosa-4-P, con lo cual se aseguró
que la célula sigue la vía metabólica de las bifidobacterias, en cuanto a la
determinación de la especie se necesitaría hacer un análisis genético de la misma.
54
Figura 11. Morfología de las bifidobacterias a 1000X
Curva estándar de ufc vs Absorbancia.
El máximo crecimiento célular se obtuvó a las 10 horas de fermentación (Figura
12), inoculando al inicio de la fermentación con 3 x10 6 ufc/mL (6.7 log ufc/mL) de
bifidobacterias, a las seis horas se llegó a tener concentración de 6.7 x 107
ufc/mL (7.8 log ufc/mL) y a las 10 horas se tuvó una concentración de 1.3 x 108
ufc/mL (8.1 log ufc/mL) e inició la fase estacionaria; a las 24 horas las
concentración disminuyó a 7x107 ufc/mL (7.8 log ufc/mL). Esto difiere con lo
reportado por Saarela y col. (2005), quienes mencionaron que después de 15 h de
fermentación B. animalis subsp. lactis, alcanza la fase final logarítmica y después
de 22h están en la fase estacionaria y el número de células alcanzado en este
momento fue de 9.7 log ufc/mL.
Figura 12. Cinética de la fermentación de Bb 12
55
La diferencia en los resultados, se debe principalmente al tipo de fermentación
que se empleó en éste trabajo, comparada con el de Saarela y col., los cuales
emplearon un fermentador New Brunswick-IF40 (Edison, NJ, USA) y diferente
medio de cultivo (glucosa, peptona soya, extracto de levadura y sulfato de
magnesio). Con lo cual se demuestra la importancia de la realización de la gráfica
de cinetica de crecimiento para cada fermentación. Conjuntamente, la gráfica es
útil para determinar el momento en el cual hay que cosechar las células para
encapsular, se considera generalmente que los cultivos jóvenes son más
sensibles al manejo como puede ser centrifugación y concentración, que los
cultivos en fase logarítmica tardía o que están en la fase estacionaria (Heckly,
1985).
Con los datos de la gráfica anterior, se realizó una curva tipo (Figura 13),
utilizando sólo los datos de crecimiento exponencial, la cual sirvió para calcular
indirectamente la cantidad de células por mililitro, que estaban presentes cuando
estas eran suspendidas en solución salina y de esta forma, ajustar a la cantidad
de células que se desean encapsular.
Figura 13. Curva tipo bacterias vs absorbancia a 660 nm para Bb12
56
Encapsulación
El tamaño de las cápsulas estuvó relacionado con el grosor de la aguja. Las
formadas con aguja 27 tuvieron un diámetro entre 1.19 y 1.65mm, para las
formadas con aguja 22 y 20 su diámetro estuvo entre1.29 y 2.1mm y entre 1.4 y
2.68 mm respectivamente (Cuadro 6), la concentración de alginato interfiere con el
tamaño y el peso, independientemente del grosor de la aguja, a menor
concentración las cápsulas son más pequeñas, existe una mayor adherencia entre
ellas y son más suaves.
Cuadro 6. Peso y diámetro de las cápsulas de alginato
Grosor de la aguja
en mm (cal.)
Peso (mg) Diámetro (mm)
Alginato de calcio Alginato de calcio
3% 2% 1% 3% 2% 1%
0.42 (27G) 6.7±0.9 5.2±1.1 2.2 ±0.3 1.65±0.14 1.48±0.17 1.19±0.2
0.72 (22G) 10.9±0.8 5.6±0.4 2.8±0.3 2.1±0.15 1.92±0.14 1.29±0.19
0.91 (20G) 12.9±1.4 7.5±1.0 5.5±0.6 2.68±0.20 2.52±0.08 1.4±0.25
Smidron y Skjak-Braek (1990), utilizaron agujas de 0.27mm para la formación de
las esferas y obtuvieron diámetros de 2-3 mm; mayores a las obtenidas en este
trabajo. Anal y Stevens (2005) indican que el tamaño de las esferas es
generalmente dependiente de la viscosidad de la solución y el diámetro del orificio
de la aguja, por otro lado según Krasaekoopt y col (2003), la forma está
relacionada con la distancia de la caída libre entre la salida y la solución de
coagulación. Martinsen y col. (1989) concluyeron que las propiedades físicas de
las esferas, también depende en gran medida de la composición, el peso
molecular y la secuencia de los ácidos L-gulorónico y D-manurónico del alginato
empleado para su formación, esferas pequeñas resultan de alginatos con bajo
ácido gulorónico.
La reducción de tamaño aun empleando el mismo diámetro de la aguja puede
deberse a la facilidad de extrusión del gel al pasar a través de la aguja, lo cual
provoca que salgan rápidamente un tras otra y disminuye su tamaño antes de
57
gelificarse, pues Kim (1990) menciona, que una vez formada la gota después de
la extrusión esta mantiene la misma forma cuando entra en contacto con los iones
de la solución de calcio e instantáneamente se forma la esfera. Inicialmente el
centro del alginato de calcio no reacciona, pero transcurrido un tiempo el ion de
calcio puede difundir hacia el centro y formar un estructura calcio - alginato.
Durante el proceso de gelificación el gel se va formando sobre la superficie hacia
el centro, mientras los iones de calcio van penetrando por la capa porosa
gelificada. Así mismo, la concentración de alginato es importante para tener
cápsulas esféricas, así a mayor concentración se tiene una mejor forma esférica y
homogeneidad.
Smirdsrod y Draget (1996) mencionan, que durante la formación de los geles de
alginato hay una contracción lo cual provoca una pérdida de agua (sinéresis) y un
aumento en la concentración del polímero. Las cápsulas con mayor concentración
de alginato son más grandes y duras, lo que refleja una mayor sinéresis del gel a
altas concentraciones de alginato. Las cápsulas más fuertes tenían mayores
concentraciones de alginato y al ser expuestas a los cationes divalentes del CaCl2
por el mismo periodo de tiempo que las demás, formaron una densa red de gel
firme con una mayor contracción y sinéresis.
Champagne y col. (1994) señalan que el diámetro de las esferas es un importante
parámetro para la actividad de los biocatalizadores. Diámetros pequeños pueden
mejorar la productividad volumétrica de un reactor con células inmovilizadas por
que incrementa la biomasa atrapada con el mismo volumen en el bioreactor. El
diámetro optimo para una alta productividad puede estar entre 0.5 y 0.8 mm.
La cantidad de células atrapadas por gramo de cápsulas varió de 5.9x106 ufc a 3.2
x107 ufc (Cuadro 7), siendo el menor valor para las células atrapadas en alginato
de calcio al 1% y formadas con la aguja calibre 27.
El tamaño de las cápsulas no afecto significativamente el número de ufc por
gramo de material. Aunque Chandramouli y col. (2004), así como Sheu y col.
58
(1993) concluyeron, que existen varios factores que afectan la eficacia de la
capsula en la protección de las bacterias como es la concentración de alginato, de
CaCl2, el tiempo de endurecimiento y concentración de células.
Cuadro 7. Células atrapadas por gramo de cápsulas Concentración de
Alginato (%)
Log ufc (Calibre de la aguja)
20G (0.91mm) 22G(0.77mm) 27G(0.42mm)
1 7.4 ± 0.63 7.2 ± 0.09 6.7 ± 0.34
2 7.3 ± 0.04 7.3± 0.17 7.2 ± 0.43
3 7.4 ± 0.05 7.2 ± 0.07 7.5 ± 0.23
Cinética de secado y características de las cápsulas
Al iniciar el secado, se partió de una humedad de 93.3% (b.h) y el proceso finalizó
con una humedad del 2% (b.h). En la Figura 14, se presentan las curvas de
secado (X/Xo) vs tiempo de secado y en la Figura 15, presenta las gráficas de
velocidad de secado (-LsdX/Adt), observándose que existe una tendencia a
presentar un período constante de secado que representa la mayor parte del
proceso, seguido por uno de velocidad decreciente. De las figuras se observa que
la temperatura de secado tuvó el efecto esperado en el tiempo total del proceso; a
mayor temperatura, menos tiempo de secado. A 40ºC, se obtuvo el menor tiempo
(30min) para alcanzar la humedad de equilibrio; al deshidratar a 40°C por 15
minutos y posteriormente a 20°C hasta alcanzar la humedad de equilibrio, el
proceso tomó 38 minutos y cuando se deshidrató a 20ºC durante todo el proceso,
éste tomó 70 minutos. La humedad final en todos los casos fue prácticamente la
de equilibrio (2% b.h).
59
Figura 14. Curvas de secado de las esferas de alginato al 4% con 2% de células, por lecho fluidizado a () 20ºC durante todo el proceso, (X) 40ºC x 15 min + 20ºC resto del proceso y () 40ºCdurante todo el proceso.
Figura 15. Efecto de la temperatura de secado del aire sobre la rapidez de secado a () 20ºC durante todo el proceso, (X) 40ºC x 15 min + 20ºC resto del proceso y () 40ºCdurante todo el proceso.
60
En las Figuras 16 y 17(A, B y C), se observa el tamaño relativo y geometría de las
esferas antes y después de la deshidratación por diferentes procesos. La
temperatura del proceso de secado tuvó una incidencia directa tanto en la
geometría como en el tamaño de la cápsula, en el Cuadro 8 se hace la
comparación entre las cápsulas no deshidratadas y deshidratadas por los tres
procesos descritos anteriormente.
Figura 16. Cápsulas hidratadas de alginato al 3% conteniendo bifidobacterias y su imagen binarizada.
Figura 17. Imágenes de microscopia de barrido de las cápsulas deshidratadas a temperatura de
20ºC (A), de 40ºC x 15 minutos (B) y de 40ºC (C) y correspondientes imágenes binarizadas del
área proyectada.
A C B
61
Cuadro 8. Comparación de las características de las cápsulas hidratadas y deshidratadas
Peso (mg) Diámetro Feret (mm) Circularidad
Hidratadas 18.78±0.78
3.19±0.15 0.89±0.02
Deshidratadas proceso (A) 1±0.02 1.9 0.50
Deshidratadas proceso (B) 1±0.02 1.23 0.84
Deshidratadas proceso (C) 1± 0.02 0.74 0.81
(A) T=20°C todo el proceso, (B) T=40°C x 15min y el resto del proceso a 20°C (C) 40°C todo el proceso.
La deshidratación, causó una disminución de la circularidad de las esferas, Según
Pertusa (2003), la circularidad o factor de forma circular, cuando el valor se aleja
más de la unidad el perímetro del objeto es más irregular, esto se aprecia
perfectamente para las capsulas secas en el proceso A. La cual era de esperarse
por la eliminación de agua y tratamiento térmico. Asimismo, el secado causó un
encogimiento de los materiales (Cuadro 8), determinado por el diámetro de Feret
mismo que fue menor a mayores temperaturas y menores tiempos de proceso.
Pertusa (2003), decribe el diámetro de Feret como: el valor de la distancia entre 2
paralelas tangentes a la silueta proyectada de la partícula y que son
perpendiculares a una dirección fija. Éste resultado es congruente con procesos
de endurecimiento superficial que es más pronunciado a mayores temperaturas
(Aguilera y Stanley, 1999), protegiendo, así el interior de las cápsulas. En estas
condiciones, también se obtuvo una mayor protección de la viabilidad de las
bacterias.
Para percibir el efecto de la deshidratación, se efectuó el conteo de células viables
por gramo de cápsulas húmedas o deshidratadas. En 1g de capsulas humedas la
viabilidad fue de 1.3 x 108 ufc (8.1± 0.01 log ufc); posteriormente se tomó un
gramo de capsulas humedas, se deshidartaron y estas tuvieron una viabilidad de
6.3 ± 1.3 x 107 ufc (7.83±0.06 log ufc). Después de tres meses de
almacenamiento, la viabilidad disminuyó 0.59 log en las cápsulas húmedas, 1.3
log para las cápsulas del proceso (A), 0.23 y 0.5 log para las cápsulas de los
62
procesos (B) y (C), respectivamente, el proceso de secado influyó en la viabilidad
(Figura 18), como se puede observar las cápsulas deshidratadas a 20ºC la
supervivencia es menor, después de 90 días de almacenamiento, esto pudiera
explicarse por qué las cápsulas de alginato de calcio tienden a ser muy porosas
(Anal y Singh, 2007), lo cual permite el paso del oxígeno y provocar que las
bifidobacterias mueran; en cuanto al proceso B y C, la viabilidad se mantiene
después de deshidratadas las cápsulas, pero la hidratación de las mismas es más
tardada en la cápsulas deshidratadas por el proceso (C) en comparación con las
otras dos, esto se debe a que la cápsula es más compacta y con menos porosidad
(ver Figura 17), a demás de que las cápsulas de alginato restringen la difusión del
oxígeno a través del gel, creando regiones anoxicas (Talwalkar y Kailasapathy,
2003).
Figura 18. Viabilidad de las células encapsuladas (X) hidratadas y deshidratadas, durante el almacenamiento por 90 días. () 20ºC durante todo el proceso, () 40ºC x 15 min + 20ºC resto del proceso y () 40ºCdurante todo el proceso.
La deshidatacion de las esferas por el método realizado, de acuerdo a la viabilidad
encontrada, es una buena alternativa de conservación y preservación de la
bifidobacterias; comparando esto con la deshidratación por liofilización, en donde
es neserario utilizar crioprotectores para mejorar la viabilidad de las bifidobacterias
(Saxelin, 1999) y el costo es mayor, debido tanto al proceso, como al
almacenamiento del producto deshidratado. Por ejemplo Saarela y col. (2005)
63
utilizaron sacarosa como crioprotector y encontraron que la viabilidad de
Bifidobacterium animalis ssp. lactis disminuía en 1.2 logaritmos después de dos
meses a 5ºC, mayor a lo obtenido en este trabajo que fue de 0.7 logaritmos de
disminución de la viabilidad a los dos meses para en el proceso A, que fue el de
mayor disminución en la viabilidad a los tres meses.
Otro método utilizado, es el secado por aspersión en donde el inconveniente es
que la mayoría de los probióticos no sobreviven bien durante el proceso, debido a
la temperatura y extremos a los cuales son sometidos durante el secado (Selmer y
col., 1999). Picot y Lacroix (2004), reportaron tasas de supervivencia de
probioticos de solo 26% a las pocas semanas después de secar por aspercion
cepas probioticas. Esto es asociado con el estrés producido por los cambios de
temperatura, cambios de fase y deshidratación, combinación que tiende a dañar la
membrana celular y las proteínas asociadas a ella (Anal y Singh, 2007). En
general son dos los principales mecanismos responsables del deterioro en el
secado de cultivos bacterianos: la inactivación por deshidratación (efecto
osmótico) y la inactivación por calor, estos mecanismos afectan un gran número
de componentes celulares como ADN, ARN, proteínas, membrana, pared celular
entre otros (Masters, 1985).
Shin y col. (2004), deshidrataron capsulas de alginato que contenían células
mediante frío utilizando un congelador a temperatura de -15ºC, el tiempo para
deshidratar las cápsulas fue de 24 horas, manteniendo estable la actividad de las
células; pero no reportan la humedad final de la cápsula, ni viabilidad de las
células.
El encapsular en alginato y deshidratarlas por lecho fluidizado, es un alternativa
para conservar y almacenar a temperatura de 20°C a las bifidobacterias,
manteniéndolas viables.
64
Efecto de la simulación gástrica en el tamaño de las cápsulas
Las bifidobacterias encapsuladas al ser sometidas al ácido clorhídrico pH2, no se
observo ningún cambio en la conformación de la capsulas. Aunque despues de
analizar las imagenes tomadas durante su estancia en el ácido, se tuvó como
resultado que todas las capsulas se achicaron, es decir disminuyeron su diámetro
entre 20.6% y 29.79%, dependiendo el tamaño. Las esferas pequeñas se
achicaron menos que las grandes (Cuadro 9). Según Rayment y col. (2009), esto
se debe a un contenido mayor de agua en las esferas grandes; estos autores
concluyeron que el encogimiento de las cápsulas se debe a la reducción de cargas
de repulsión electrostáticas al bajar el pH. Asimismo, Norton y col. (2006) aluden
que existe una disociación de los iones de calcio a bajo pH, lo cual forma un gel
ácido donde los grupos carboxilo están protonados, permitiendo que las cadenas
de alginato esten más unidas y formen enlaces de hidrógeno.
Las cápsulas al pasar de la solución ácida a las sales biliares, empiezan a
hincharse llegando en algunos casos a desintegrarse, después de una hora en la
solución de sales biliares (capsulas al 1% de alginato de los tres tamaños
diferentes y capsulas de 1.48 mm al 2%) y en otros a fraccionarse después de
dos horas en la solución de bilis (cápsulas al 3% de 1.65mm, Figura 19). Este
fenómeno se da principalmente en las cápsulas de tamaño pequeño, las cápsulas
de mayor tamaño solo se hinchan pero no se desintegran. Esto concuerda con lo
reportado con Rayment y col. (2009), quienes indican que las cápsulas de alginato
una vez en la solución intestinal (sales biliares), comienzan a hincharse en
diversos grados, debido a un aumento en la fuerza de repulsión electrostática a un
pH por encima de los valores de pKa de los grupos de ácido urónico del alginato y
que la desintegración presumiblemente es consecuencia de la mayor
concentración de iones monovalentes.
65
Figura 19. Efecto de las sales biliares en cápsulas de 1.65 mm y 3% de alginato.
En el Cuadro 9, se muestran indicadores morfométricos de las diferentes cápsulas
que se trataron en las condiciones de simulación del tracto gastro intestinal. Es
importante resaltar, que las partículas, en general, no cambian marcadamente su
apariencia. Sin embargo, el tamaño tiende a regularizarse hacia la forma esférica
(ver valores de la circularidad) y a aumentar su tamaño (ver valores del los
diámetros de Feret).
Cuadro 9. Indicadores morfométricos de cápsulas tratadas en condiciones de simulación gástrica.
Tiempo
(min)
1% alginato 2% alginato 3% Alginato
D.
Feret
(mm)
Circ.
%
dism.
D.
Feret
(mm)
Circ.
%
dism.
D.
Feret
(mm)
Circ
%
dism.
D.
Feret
(mm)
Circ
%
dism.
D.
Feret
(mm)
Circ
%
dism.
0 1.19 0.80 0 1.48 0.77 0 2.5 0.89 0 1.65 0.89 0 2.68 0.83 O
60 * 0.88 0.84 26 1.10 0.89 25.64 1.89 0.89 24.2 1.31 0.88 20.60 2.12 0.89 20.73
120* 0.85 0.87 28 1.07 0.88 27.81 1.83 0.89 26.89 1.25 0.88 24.52 2.07 0.90 22.61
180* 0.84 0.90 29.4 1.07 0.90 27.81 1.76 0.89 29.79 1.19 0.90 27.95 2.07 0.90 22.67
240** 3.43 0.78 2.67 0.90 2.69 0.90
300** 3.42 0.89 2.72 0.90
360** 3.42 0.88 2.90 0.90
420** 3.50 0.88 3.36 0.90
* Cápsulas en solución acida. ** Cápsulas en solución de sales biliares
D. Feret= Diámetro de Feret; Circ.= circularidad ó factor de forma circular; % dism. = % que disminuyó la esfera de tamaño.
Hoad y col. (2009), evaluaron cápsulas de alginato a través del tracto gastro
intestinal, en un modelo in vivo. Obteniendo como resultado, que el tiempo en que
3h 1h 2h
66
las cápsulas llegan al inicio del ciego fue de 120 minutos en promedio. Así mismo,
las cápsulas son visibles después de 4 horas, tiempo que duró el experimento,
demostrando que las cápsulas no se desintegran en el intestino y concluyen que
las esferas de alginato tanto fuertes como débiles, son claramente visibles en el
estómago y en el intestino delgado, estas se observaron en las imágenes de
resonancia magnética (RM). Las cápsulas son más visibles en el íleon el cual
tenía una apariencia más distendida en las imágenes de RM, comparado con el
duodeno y yeyuno. Además, estos autores, no encontraron diferencias
significativas en la morfología de las diferentes capsulas durante su paso por el
tracto gastro intestinal. Lo anterior difiere con lo encontrado en este trabajo, en
donde algunas cápsulas se desintegran después de una hora en la solución de
sales biliares y con los datos proporcionados por Rayment y col. (2009), los cuales
en experimentos in vitro encontraron que algunas cápsulas se desintegraron una
vez colocadas en la solución intestinal.
Viabilidad de las bifidobacterias encapsuladas durante la simulación
gástrica.
La viabilidad de las bifidobacterias libres disminuye de 6.8 x 108 ufc a 4.68 x 105
ufc/mL, después de tres horas en ácido clorhídrico pH 2 (Cuadro 10), Ding y Sha
(2007), encontraron que la viabilidad de las células de B. lactis tipo BI04 y 07
después de dos horas en ácido (pH2) disminuyo 63%.
Favaro-Trindade y Grosso (2002), reportaron que B. lactis (Bb12) es eliminada
después de solo 1 hora en condiciones acidas (pH1 y 2), en contra parte,
Vernazza y col (2006) mencionan que de 5 cepas de bifodobacterias sometidas a
pH2, solo Bb-12 mostró incremento en la supervivencia.
Las bifidobacterias encapsuladas, después de ser sometidas durante tres horas a
HCl, pH2, mantuvieron su viabilidad en general en más del 90%, la viabilidad se
vio afectada por el tamaño de la cápsula y la concentración de alginato, las
67
esferas chicas de 1.19 mm y 1% de alginato tuvieron una pérdida de viabilidad de
10%, comparado con el original. Las cápsulas que tuvieron la mejor viabilidad
fueron las obtenidas con aguja 20 al 2% y 3% (diámetro de 2.52 mm y 2.68 mm
respectivamente), donde la viabilidad se mantuvo (Cuadro 10). Estos resultados
concuerdan con Lee y Heo (2000), quienes concluyeron que en general la
viabilidad de las células en las cápsulas se incrementa con el aumento de la
concentración de alginato y el tamaño de la cápsula. Por otro lado Annan y col.
(2008), mencionan que una cubierta con gelatina a las esferas de alginato ayuda a
mejorar la viabilidad de las bifidobacterias después de someterse a la simulación
gástrica.
Cuadro 10. Viabilidad de las bifidobacterias libres y encapsuladas por tamaño y concentración de alginato después de la simulación gástrica.
Tamaño
cápsula
(mm)
Concentración
alginato %
Tiempo (horas)
Log ufc /g de cápsulas
0 1 2 3
1.4±0.25 1 7.4±0.06 7.33±0.06 7.23±0.06 6.92±0.098
2.52±0.08 2 7.29±0.04 7.27±0.04 7.25±0.05 7.2±0.1
2.68±0.20 3 7.41±0.05 7.39±0.06 7.38±0.08 7.35±0.12
1.29±0.19 1 7.2±0.09 7.1±0.06 7.1±0.006 7.1±0.011
1.92±0.14 2 7.3±0.17 7.3±0.14 7.28±0.10 7.23±0.01
2.1±0.15 3 7.2±0.07 7.2±0.07 7.2±0.07 7.23±0.01
1.19±0.20 1 6.7±0.34 6.6±0.31 6.5±0.26 6.0±0.09
1.48±0.17 2 7.2±0.43 7.1±0.38 7.0±0.31 6.6±0.05
1.65±0.14 3 7.5±0.23 7.3±0.65 7.14±0.48 6.9±0.43
Células sin encapsular 8.8±0.11 6.6±0.04 6.4±0.04 5.7±0.01
68
Chen y col. (2005) concluyeron, que para tener una alta viabilidad de las células
probióticas, la cubierta de la cápsula debe estar compuesta por 1% de alginato de
sodio adicionando 1% de péptidos y 3% de fructooligosacaridos, aunque
posteriormente, los mismos autores argumentan que esta combinación no provee
la suficiente protección para los probióticos durante el almacenamiento y
simulación gástrica, por lo cual en un trabajo posterior recomiendan emplear para
la formulación de la esferas 3% de alginato de sodio con 1% de péptidos y 3% de
fructooligosacaridos (Chen y col., 2006), se puede ver que el componente que le
da mayor resistencia a la cápsula es el alginato, a mayor concentración mejor
viabilidad, semejante a lo obtenido en este trabajo. En otra propuesta para mejorar
la ecapsulación con alginato, Sultana (2000) sugiere para encapsular
bifidobacterias utilizar 2% almidón (Hi-Maize) y 2% de alginato, el almidón ayuda a
mejorar la viabilidad de las células, debido a que el alginato y el almidón tienden a
ser sinérgicos y como resultado se obtiene una mejor protección y sugieren que es
necesario evaluar con diferentes concentraciones de alginato y tamaños de
cápsulas para ver la efectividad de las mismas. En contraparte Simpson y col.
(2005) aluden que el efecto en la viabilidad durante la simulación ácida no es solo
atribuible al material de envoltura sino también de la tolerancia intrínseca de las
diferentes especies de bifidobacterias que se utilicen, como puede ser tolerancia al
calor, oxígeno y acidez.
Más aun Matsumoto y col. (2004) argumentaron que generalmente, cuando las
bacterias son expuestas a condiciones ácidas, estas mantienen la homeostasis del
pH por la descarga de iones H+ de la célula. Este proceso depende de la actividad
de la H+-ATPasa. Las cepas no ácido tolerantes se dañan en condiciones acidas,
ya que la actividad de su H+-ATPasa no puede ser aumentada, mientras que
cepas ácido tolerantes se ven menos afectadas y son capaces de sobrevivir a
causa de su rápido aumento de la actividad de su H+-ATPasa.
69
No obstante de que Bifidobacterium animalis subsp lactis, cuando no esta
encapsulada, es considerada como cepa ácido tolerante, en este trabajo su
viabilidad se ve afectada al someterse a la simulación de gástrica.
Tolerancia de las bifidobacterias encapsuladas a las sales biliares
La viabilidad después de someter a las bifidobacterias sin encapsular a la
simulación gástrica y posteriormente a las sales biliares, disminuye 3% después
de tres horas en las sales biliares. La cuenta inicial de 8.8 Log ufc/mL disminuyo a
5.2 Log ufc/mL después de 6 horas de simulación gastrointestinal (ácida más
sales biliares). Ding y Shah (2007) describen que la viabilidad de Bifidobacterium
animalis después de someterse a 4 horas a sales biliares se ve disminuida de 10.5
a 6.35 ufc/ml, (39.6 %). En cuanto a las bifidobacterias encapsuladas estas
pierden un 1% de viabilidad en general, después de 3 horas en la solución de
sales biliares, se observó que ciertas cápsulas después de una hora se
desintegraban y por lo cual no se pudo cuantificar la viabilidad en las esferas; lo
obtenido en este trabajo difiere con lo reportado por Favaro-Trindade y Grosso
(2002), los cuales reportan que Bb12 encapsulado fue resistente a 12 horas en
solución de sales biliares. La desintegración de las capsulas se debe a que ciertas
sustancias como citrato, presente en las sales biliares, tiene una alta afinidad por
los iones Ca+2 , secuestra los iones calcio de enlace, con la consecuente
desestabilización del gel. Ademas debido a que el ion Ca+2 puede ser
intercambiado con otro catión, el gel también va a ser desestabilizado por altas
concentraciones de iones no inductores de gel, como el Na+ (SmidsrØd y Skajak,
1990).
La trascendencia de determinar la resistencia a las sales biliares por las
bifidobacterias radica en que estas las deben desconjugar, pues según Tanaka y
col (2000) las sales biliares desconjugadas pueden disminuir los niveles de
colesterol sérico en los seres humanos hipercolesterolémicos o prevenir la
hipercolesterolemia en individuos con niveles normales de colesterol. Asimismo
70
una importante actividad metabólica que exhiben casi todas las bifidobacterias es
la desconjugación de las sales biliares, que se produce naturalmente en los seres
humanos, por lo cual es necesario mantener viables a las bifidobacterias en altas
concentraciones cuando están en contacto con las sales biliares y sobrevivan para
su implantación en el intestino grueso por lo cual la encapsulación en alginato es
una buena alternativa.
Susceptibilidad a la nisina
Usando el método de difusión en agar (Figura 20), la bifidobacteria estudiada fue
sensible a concentraciones de 62.5 a 250 μg /mL de nisina, produciendo zonas de
inibición del rango de 1- 4 mm. La concentración mínima inhibitoria fue por lo tanto
62.5 μg/mL para la bifidobacteria libre. Este resultado, es diferente a lo reportado
por Rada y Dlabal (1998) los cuales examinaron 13 cepas de bifidobacterias las
cuales fueron sensibles a concentraciones de 1mg /mL con zonas de inhibición de
3 a 18mm.
En cuanto al medio TPY se determinó que la CMI para las células libres fue de 1.9
μg/mL, lo cual es mayor en comparación a lo reportado por Kheadr y col. (2004)
en donde la CMI de nisina para Bb12 es de 0.24μg/mL.
Figura 20. Difusión en agar, se muestra el efecto inhibitorio de la nisina a concentración de
62.5μg/mL. T es el pozo testigo.
71
El modo en que la nisina lisa a las bifidobacterias es por formación de poros en la
membrana de las bacterias, lo que resulta en una salida rápida de los compuestos
citoplasmáticos, por ejemplo aminoácidos, potasio, fostafo inorgánico, rubidio
preacumulado, glutamato y ATP. En la formación del poro la nisina primero une su
extremo carboxilo terminal a los lípidos aniónicos de la membrana por medio de
interacciones electrostáticas (Figura 21). Enseguida su extremo amino terminal se
inserta en la membrana lipídica, mientras que el péptido adopta una orientación en
paralelo con respecto a la superficie de la membrana y por tanto distorsiona la
bicapa de lípidos para formar un poro, la nisina seguirá un modelo de cuña para
formar el poro. La formación del poro es transitoria, de modo que los péptidos
pueden rápidamente regresar a la orientación original en paralelo en el exterior de
la cubierta (Bauer y Dicks, 2005).
Figura 21. Modelo general para la formación de poros. Paso 1: Unión de la nisina por medio de su carbón terminal. Paso 2: inserción de la nisina en la membrana. La profundidad de la inserción depende del porcentaje de lípidos aniónicos y concentración de nisina. Paso 3: Cuña / formación de poro. Paso 4: translocación de los péptidos en el interior de la membrana.
Las bifidobacterias encapsuladas no se ven afectadas por las concentraciones de
nisina utilizadas en este experimento, 0.5 mg de nisina por mililitro equivalente a
40,000 UI/mL. Esto puede deberse a que la nisina no entra en contacto inmediato
con las bacterias lo cual puede provocar que estas se reproduzcan dentro de la
cápsula y salgan de la misma, en estas nuevas células la nisina se une y las
72
destruye hasta el momento en que la concentración de nisina no es suficiente para
unirse a más bacterias.
Esta evaluación es importante para comprender el comportamiento de las
bifidobacterias en medios que contengan nisina como inhibidor. Puesto que la
nisina ha demostrado ser un eficaz biopreservador natural en alimentos, inocuo,
sensible a las proteasas digestivas (puede ser hidrolizado a aminoácidos en el
intestino por la quimotripsina) y no produce cambios en las propiedades
sensoriales de los alimentos (Guerra y col. 2007). Por ejemplo, la nisina se puede
agregar a los quesos (a los cuales se les pueden adicionar bifodobacterias) y en
alimentos enlatados, sin límite en el Reino Unido, Australia, Francia y Perú,
mientras que en México, Italia, Brasil y Argentina se permiten concentraciones
máximas de 500UI/g (Juncioni de Arauz y col., 2009). Asimismo, a escala
industrial se puede afectar la viabilidad de la propagación de bifidobacterias, al ser
adicionados en leches fermentadas, por ejemplo, Quiao y col. (1997) determinaron
que en fermentaciones con condiciones optimas para L. lactis los títulos máximos
de nisina obtenidos van de 1,000 – 5,000 U.I. /mL. Además Murina y Kanach
(1995) encontraron concentraciones de nisina en productos lácteos comerciales
de un rango de 10 a 500 U.I./mL. También pudiera haber incompatibilidad si se
incorpora al Bb12 a productos lácteos fermentados que contengan cepas de
lactociccus lactis productoras de nisina.
Por lo tanto las bifidobacterias encapsuladas en alginato puede resitir
perfectamente la concentración más alta de nisina que se adicona como
conservador en un producto.
Susceptibilidad a antimicrobianos
Bifidobacterium animalis subsp. lactis fue sensible a los β-lactamicos, como
ampicilina, cetotaxina cefalotina, cefuroxina, penicilina G, carbenicilina y
ceftriaxona. Los antibioticos β-lactamicos son bactericidas, actúan inhibiendo la
73
síntesis de la barrera de peptidoglicanos de la pared celular bacteriana. Se
determinó que es también sensible a la amikacina, que es un bactericida del grupo
de los aminoglucosidos, estos inhiben la síntesis proteica actuando sobre la
unidad 30S de los ribosomas; así como a nitrofurantoina, tetraciclina y
eritromicina. La cepa fue resistente a pefloxacina, gantamicina, dicloxacilina y
trimetropim-sulfametoxazol. Estos resultados son semejantes a lo reportado por
Khear y col. (2004), quienes discuten que la evaluación de la sensibilidad de las
bifidobacterias a los antibióticos tiene varios propósitos como son:
1) La identificación selectiva de antibióticos para el recuento de bifidobacterias
en los productos fermentados.
2) Predecir alteraciones en los rasgos de las bifidobacterias que puedan
ocurrir debido al tratamiento con antibióticos y
3) Determinar el papel de las bifidobacterias en la transferencia de genes
resistentes a los antibióticos a otros grupos de bacterias intestinales.
Supervivencia de las bifidobacterias encapsuladas y no encapsuladas en
kéfir durante el almacenamiento
Los resultados muestraron una disminución del 31% de la población de bacterias
encapsuladas y del 76% de bifidobacterias no encapsuladas (Figura 22), durante
el periodo de almacenamiento del kéfir en refrigeración. Adhikariy col. (2000)
adicionaron Bifidobacterium longum en yogurt, reportaron una disminución del
78% de las bacterias no encapsuladas, pero no tuvieron diferencias en las
muestras con bacterias encapsuladas después de 30 días de almacenamiento.
Por otro lado Sultana y col. (2000), realizaron un monitoreo por 8 semanas
encontrando que las células inmovilizadas disminuyeron 0.5 log en la cuenta
viable, mientras que en las células libres disminuyó 1 log cuando fueron
incorporadas al yogurt.
74
Figura 22. Viabilidad de las bifidobacterias encapsuladas (●) y no encapsuladas ( ) durante el periodo de almacenamiento del Kéfir de 0 a 28 días en refrigeración.
El kéfir difiere con el yogurt en la preparación, en el kéfir se distinguen dos fases la
fermentación y la maduración. La fermentación es generalmente hecha entre 18 y
22°C durante 18 a 20 horas, mientras las bajas temperaturas favorece a las
levaduras y las altas a las bacterias lácticas y por lo tanto el proceso de
acidificación. Después de la etapa de maduración a temperatura entre 8 a 10°C
por 1 a 3 días, se incrementa la concentración de etanol, debido a la actividad de
la levaduras y otros componentes que le dan aroma y sabor (Koroleva, 1991);
después de estos pasos se refrigera el producto, durante el almacenamiento la
cuenta viable de bacterias ácido acéticas y levaduras permanece constante
mientras que las bacterias ácido lácticas disminuye después de 7 y 14 días
(Irigoyen y col., 2005), lo cual puede indicar la disminución de las bifidobacterias
tanto encapsuladas como libres.
Sumado a lo anterior, el oxígeno puede entrar al producto a través del material de
empaque durante el almacenamiento, el oxígeno afecta a las bifidobacterias de
dos formas. Primero es toxico para las células tal vez expresado directamente por
el propio cultivo sensible al oxígeno. Esto resulta en la acumulación intracelular de
peróxido de hidrógeno y como consecuencia la muerte celular (Dave y Shah,
1997). Segundo, L. delbrueckii ssp. bulgaricus es conocido por producir peróxido
de hidrógeno en presencia de oxígeno, el cual puede afectar a las bifidobacterias
indirectamente (Villegas y Gilliland, 1998), así mismo Lankaputhra and Shah
75
(1996) describen un efecto sinérgico de la acidez y el peróxido de oxígeno en la
inhibición de las bifidobacterias.
Supervivencia de las bifidobacterias en la simulación gástrica después del
almacenamiento del kéfir
La encapsulación, mejoró la supervivencia de las bifidobacterias después de la
exposición a 3 horas en ácido clorhídrico a pH2, antes y después del periodo de
almacenamiento del kéfir y posterior digestión (Figura 23).
Figura 23. Viabilidad de Bifidobacterium lactis encapsulada (▲, ) y sin encapsular (●, o) durante el
almacenamiento del Kéfir por 28 días en refrigeración antes (▲, ●) y después ( , o) de someterse
a la simulación gástrica a pH2.
En comparación las células libres después de la digestión su vibilidad disminuyo
11.54% en kéfir al primer día, 30.28 y 11.92% para la primera y segunda semana
respectivamente después de someterse a la digestión gástrica (comparando la
disminución, con el conteo de ufc que se tuvo antes de iniciar la digestión);
después de los 21 días de almacenar el kéfir y someterlo a digestión gástrica no
se observo viabilidad de las bifidobacterias. Lo anterior difiere con Charteris y col.
(1998) los cuales reportaron que la viabilidad de Bifidobacterium bifidum, B.
0123456789
0 7 14 21 28
Log 10 UFC/mL
tiempo (días)
76
infantis, B. breve y B. adolescentis disminuyo en 3.0 log ufc/mL después de ser
expuestas a la simulación en ácido gástrico; sumado a esto Lee and Heo (2000)
encapsularon B. longum y encontraron que la viabilidad de las bifidobacterias
encapsuladas disminuía proporcionalmente con el tiempo de exposición a la
simulación a ácidos gástricos y que en las bifidobacterias sin encapsular disminuía
su viabilidad después de 30 minutos de exposición al ácido de 1.28 x 109 a 1 x103
ufc/ml.
Por otro lado Favaro-Trindade and Grosso (2002), encapsularon Bb12 en acetato
ftalato celulosa por la técnica de secado por aspersión y encontraron que las
encapsulación favorece a la supervivencia de la bifidobacteria, en comparación
con las libres las cuales se morían después de estar sólo una hora en condiciones
ácidas a pH2. Así mismo, Lian y col. (2003), no encontraron diferencias
significativas en la viabilidad de B. longum B6, encapsuladas por aspersión con
goma arábiga, gelatina y almidón soluble después de ser expuestas por 4 h en la
simulación de ácidos gástricos a pH2. Por otro lado Jung y col. (2007) realizo una
doble encapsulación de B. breve CBG-C2, como capa interna empleo aceite y
posteriormente la recubrieron con almidón y gelatina, las adicionaron a yogurt y la
sometieron a la simulación gástrica, demostrando que la doble encapsulación
favorece la viabilidad de la bifidobacterias. Nuestros resultados demuestran la
efectividad de la encapsulación en alginato aun después de estar el producto en
almacenamiento.
Cambios de pH y acidez titulable durante el almacenamiento
Los cambios de pH en el kéfir tanto del control como los experimentales durante el
almacenamiento a 4°C por un periodo de 28 días se muestra en el cuadro 11. El
control mostró el pH más bajo. El pH final del kéfir (después de los 28 días de
almacenamiento) con bacterias sin encapsular fue menor que el del kéfir con
bifidobacterias encapsuladas. El pH del kéfir preparado con granos de kéfir por lo
general debe estar entre 4.3 y 4.6 (Wider, 2001). Iroyen y col. (2005) no
77
encontraron diferencia en el pH del kéfir durante el almacenamiento, atribuyendo
esto a que la población de bacterias ácido lácticas disminuye con el transcurso del
tiempo. En este caso, el pH del kéfir con bifidobacterias encapsuladas no
disminuyó significativamente (p>0.05).
Cuadro 11. Cambios de pH del kéfir con bifidobacterias durante el almacenamiento
Tiempo almacenamiento
(Semanas)
Control
Kéfir con bifidobacterias libres
Kéfir con bifidobacterias encapsuladas
0 4.7 4.7 4.7 1 4.7 4.7 4.7 2 4.7 4.7 4.7 3 4.6 4.6 4.6 4 4.3 4.4 4.6
En otras leches fermentadas como el yogurt el pH decrece con el tiempo de
almacenamiento hasta 3.95 (Kailasapathy, 2006) debido a que los cultivos
iniciadores del yogurt incluyen a L. delbrueikii subsp bulgaricus and S.
thermophilus los cuales son activos aun a temperatura de refrigeración y pueden
producir pequeñas cantidades de ácido láctico lo que resulta en disminución del
pH (Shah y col., 1995).
La acidez titulable aumentó ligeramente con el tiempo de almacenamiento, siendo
mayor para el testigo y menor para el kéfir con bifidobacterias encapsuladas
(Figura 24); esto concuerda con lo dicho por Litopoulou-Tzanetaki and Tzanetakis
(2004), los cuales mencionan que la acidez titulable en el kéfir es de 1%; así
mismo Beshkova y col. (2002), encontró ligeras variaciones en la acidez titulable
entre el kéfir recién elaborado y el almacenado después de 7 días. En yogurt esta
puede ser de 1.2 % después de 30 días de almacenamiento en refrigeración y de
1.1 en yogurt con bifidobacterias encapsuladas y sin encapsular (Adhikari y col.,
2000), Collar (1996) menciona que las bacterias ácido lácticas producen más
ácido láctico y ácido acético en cultivos puros que en cultivos mezclados con
levaduras.
78
Figura 24. Cambios en la acidez titulable del kéfir (▲) testigo y del kéfir conteniendo Bifidobacterium lactis encapsuladas (●) y sin encapsular (■) durante el almacenamiento en refrigeración por 28 días.
Grasa total y lactosa
Después del almacenamiento por 28 días, el contenido de grasa disminuyó de
3.18% que tenía la leche a 2.53 % en el kéfir. En el kéfir con bifidobacterias tanto
libres como encapsuladas la grasa fue de 2.37%; esto concuerda con lo hallado
por Chin-Yun y Ching-Wen (1999), en donde el contenido de grasa del kéfir
elaborado es menor que el de la leche que se utilizo, esta diferencia puede ser
atribuible a la producción de lipasas por los granos de kéfir durante la
fermentación de la leche (Vujicic y col., 1992). En contraste Irigoyen y col. (2005)
no encontraron diferencias en el contenido de grasa del kéfir y la leche utilizada en
el procesamiento del mismo.
El contenido de lactosa en los tres kéfires fue el mismo 2.53%, el nivel disminuyó
en 16.55% con respecto al nivel de lactosa presente en la leche. La cantidad de
lactosa se mantuvo prácticamente constante durante el periodo de
almacenamiento, esto concuerda con lo descrito por García y col. (2006), donde el
contenido de lactosa disminuyó un 18% en el kéfir con respecto a la leche
79
empleada; así mismo Irigoyen col. (2005) reportaron que el nivel de lactosa se
mantiene constante después de 16 días de almacenamiento.
Determinación de alcohol
El contenido de etanol fue de 4.41± 0.38 μg/mL de producto, Garcia y col., (2006)
reportaron una cantidad de alcohol de 0.018 % (p/p) en contra parte Wszolek y col.
(2001) reportaron una cantidad de alcohol entre 4.22 y 5.51 ug/g y concluyeron
que la diferencia en alcohol se debe principalmente a las diferencias en el balance
de microorganismos de los diferentes cultivos con los que se prepara el kéfir.
80
VIII CONCLUSIONES
A mayor concentración de alginato se obtiene una mejor viabilidad de las
bifidobacterias encapsuladas.
Las esferas de mayor tamaño soportan mejor la digestión ácida y de sales biliares
y contiene la misma cantidad de ufc por gramo de cápsulas.
La encapsulación ejerce un efecto protector de las bifidobacterias contra el pH
ácido, con respecto a los microorganismos no encapsulados.
La concentración de alginato no tiene efecto en la resistencia de las esferas a la
digestión gástrica.
El mejor método de conservación, por deshidratación en lecho fluidizado es de
40°C por 15 minutos y el resto del proceso a 20°C (Proceso B), en el que la
supervivencia de las bifidobacterias solo disminuyó 3% después de tres meses de
almacenamiento a temperatura ambiente.
La deformación de las cápsulas deshidratadas bajo las condiciones del
procesamiento B (ver anterior), fue menor que las alcanzadas por medio de los
procesos A y C.
La concentración mínima de nisina para que Bb12 sin encapsular no cresca en
medio líquido es de 1.9 μg de nisina/mL, mientras que las células encapsuladas
resistieron hasta 500 μg de nisina/mL.
La cepa BB12 resultó ser sensible a los antibioticos reportados en la literatura para
B. animalis subsp lactis.
81
Durante la refrigeración del Kéfir, las bifidobacterias encapsuladas mantienen
mejor su viabilidad, en comparación con las no encapsuladas; sin embargo ambas
presentan una disminución en su población.
Las células encapsuladas en el Kéfir almacenado, presentan una viabilidad mayor
que las células no encapuladas después de someterse a la digestión gástrica.
La adición de bifidobacterias no encapsuladas y encapsuladas no afecta a las
propiedades del kéfir como el pH, cantidad de grasa, lactosa y etanol.
Ampliacio futura del trabajo Seria conveniente evaluar la viabilidad con el tiempo de almacenamiento para
diferentes tipos y concentraciones de alginato y células.
Probar una secuencia experimental que incluya encapsular, inocular en el
producto y posteriormente realizar la simulación de la digestión gástrica.
Evaluar el proceso de encapsulación de las bifidobacterias para ver si proteje de la
actividad de los antibioticos.
Realizar un estudio más amplio del fenómeno de transferencia de agua durante la
deshidratación que incluya intervalos más amplios de temperaturas, velocidad del
aire y relación de tiempo de deshidratación a altas y bajas temperaturas.
Realizar pruebas de deshidratación, asociadas a estudios morfométricos de los
que se obtengan parámetros tales como tamaño de poro y coarteaduras, perdida
de esfericidad y evaluación de las dimensiones fractales de contorno y de textura.
82
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