Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN

CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE:

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

Clonación de un gen codificante para una acetil-xilan esterasa de Cellulomonas flavigena y su potencial

aplicación en alimento para ganado.

Que para obtener el Título de Ingeniero Biotecnológo

Presenta

CLARA ALICIA CRUZ RAMÍREZ

DIRECTOR DE PROYECTO EXTERNO: Dra. MARÍA EUGENIA HIDALGO LARA

DIRECTOR DE PROYECTO INTERNO: Dra. MARÍA DEL CARMEN OLIVER SALVADOR

México, D.F. Mayo 2007

El presente trabajo se realizó en el departamento de Biotecnología y Bioingeniría del CINVESTAV-IPN, bajo la dirección de la Doctora María Eugenia Hidalgo Lara

AGRADECIMIENTOS

Al IPN, por haberme permitido realizar mis sueños de ser una profesionista.

A la UPIBI por darme los conocimientos que necesite para mi formación como

Ingenira Biotecnóloga.

A mis maestros por compartir sus conocimientos y haber contribuido a mi

formación profesional.

Al CINVESTAV-IPN, en especial al departamento de Biotecnología y

Bioingeniería, por el apoyo para la realización de este proyecto.

A mi asesora externa, Dra. María Eugenia Hidalgo Larra por la dirección y

compromiso en este proyecto; por las sugerencias, aportaciones y revisión de

este trabajo. Así como su apoyo incondicional, consejos y motivación que

siempre me brindo.

A mi asesora interna, Dra. María del Carmen Oliver, por los consejos,

sugerencias y revisión de este trabajo.

A mi sinodal, M en C. Rosa Isela Carvaja de Nova, por sus consejos y apoyo

mostrado durante la conducción del proyecto, ademas del tiempo dedicado en

la revisión de este trabajo

DEDICATORIA

A mi mamy por que siempre demostró interés en mi carrera profesional y me

brindo su apoyo incondicional, además de sus sabios consejos que me han

ayudado a formarme, no solo como profesionista, si no como persona. Pero

sobre todo por ser padre y madre para mis hermanos y para mí, por su gran

fortaleza que nos ha demostrado, y que gracias a eso, ella es mi ejemplo a

seguir. Este trabajo es tuyo mamy.

A mis hermanos por su cariño,

paciencia y apoyo, que siempre me

han brindado.

A mis sobrinitas que con su magia e

inocencia, me han brindado alegría y

felicidad.

A Omar, mi esposo, por su amor,

cariño, comprensión, paciencia y por

ser un pilar en mis momentos de

debilidad. Además de su apoyo para

la realización de este trabajo.

A mis amigos del Laboratorio 20 de

Biocatalisis: Lorenita, Angelita, Lulú,

Jazmín, Alex, Paty, Vanesa, Catia,

Fabiola, Olga, Chucho, Carmen y

Janet, por su apoyo, consejos,

cariño y solidaridad mostrados

durante mi estancia en el

Laboratorio

A mis amigas, Chela, Isela, Judyth y

Caro por todos los momentos que

compartimos.

i. ÍNDICE GENERAL 1 INTRODUCCIÓN 1

2 ANTECEDENTES 3

2.1 GÉNERO Cellulomonas 3

2.2 ESTRUCTURA DE LA XILANA 5

2.2.1 BIODEGRADACIÓN DE LA XILANA 5

2.3 XILANASAS 5

2.4 ORGANISMOS PRODUCTORES DE XILANASAS 8

2.5 XILANASAS DE ORIGEN EXTREMOFÍLICOS 9

2.6 FACTORES QUE AFECTAN LA PRODUCCIÓN DE XILANASAS 9

2.6.1 INDUCCIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE XILANASAS 10

2.6.2 REGULACIÓN A NIVEL MOLECULAR 11

2.6.3 REPRESIÓN CATABÓLICA 11

2.7 PROPIEDADES BIOQUÍMICAS 12

2.8 CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DE LOS GENES DE XILANASAS 13

2.9 EVOLUCIÓN MOLECULAR 13

2.10 ALGUNAS APLICACIONES DE XILANASAS 13

2.11 ACETIL-XILAN ESTERASA 15

3.0 JUSTIFICACIÓN 19

4.0 OBJETIVOS 20

4.1 OBJETIVO GENERAL 20

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 20

5.0 HIPÓTESIS 20

6.0 METODOLOGÍA 21

6.1 EQUIPOS Y REACTIVOS 21

6.1.1 EQUIPOS 21

6.1.2 REACTIVOS 21

6.1.3 SOLUCIONES 21

6.2 SECUENCIA EXPERIMENTAL 22

6.2.1 DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS ESPECÍFICOS 23

6.2.2 PCR 23

6.2.3 ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA 24

6.2.4 PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR 25

6.2.5 MARCAJE DE LA SONDA MOLECULAR ESPECÍFICA 25

6.2.6 TITULACIÓN DE LA BIBLIOTECA GENÓMICA 26

6.2.7 HIBRIDACIÓN 27

6.2.8 REVELADO DE LAS PLACAS 27

6.2.9 RECUPERACIÓN DE LAS CLONAS SELECCIONADAS 28

6.2.10 ESCISIÓN in vivo DE LAS CLONAS SELECCIONADAS 28

6.2.11 ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DE LAS CLONAS SELECCIONADAS 29

6.2.12 POTENCIAL APLICACIÓN DE ACETIL-XILAN ESTERASA DE Cellulomonas flavigena EN ALIMENTO PARA GANADO 29

7 RESULTADOS Y ANÁLISIS 30

7.1 OBTENCIÓN DE UNA SONDA MOLECULAR POR PCR 30

7.2 PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR 30

7.3 CLONACIÓN DE LA SONDA EN EL VECTOR pDrive PARA EL ANÁLISIS DE LA SECUENCIA 31

7.4 MARCAJE DE LA SONDA MOLECULAR 32

7.5 TAMIZAJES 33

7.6 ESCISIÓN in vivo DE LAS CLONAS SELECCIONADAS 36

7.7 ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DE LAS CLONAS SELECCIONADAS 37

7.8 POTENCIAL APLICACIÓN DE ACETIL-XILAN ESTERASA DE Cellulomonas flavigena EN ALIMENTO PARA GANADO 39

8 CONCLUSIONES 46

9 BIBLIOGRAFÍA 47

ANEXO 50

ii.

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Xilanasas purificadas de C. flavigena 8

Tabla2 Hongos xilanolíticos 9

Tabla 3 Secuencias encontradas 38

Tabla 4 Niveles mínimos garantizados de enzimas y

probióticos

44

Tabla 5 Acción de las enzimas comerciales en alimento para

ganado

45

iii.

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Árbol filogenético de C. flavigena 4

Figura 2 Huella genética de la xilanasa de C. flavigena 6

Figura 3 Regulación de la biosísntesis de la xilanasa 11

Figura 4 Acción enzimática sobre hemicelulosa 15

Figura 5 Diagrama de la molécula de la acetil-xilan esterasa de T. reesi 17

Figura 6 Diagrama topológico de los elementos de la estructura secundaria 17

Figura 7 Dos diferentes mecanismos de reacción de la acetil-xilan esterasa 18

Figura 8 Diagrama de bloques de la metodología 22

Figura 9 Estructura del gen codificante para una xilanasa de C. flavigena 23

Figura 10 Fundamento de PCR 24

Figura 11 Función de la enzima Klenow 26

Figura 12 Análisis electroforético de la amplificación por PCR de la sonda 30

Figura 13 Análisis electroforético de la amplificación por PCR de la purificación de la

sonda 31

Figura 14 Análisis electroforético de la liberación del inserto 32

Figura 15 Sonda molecular marcada 32

Figura 16 Placas fotográficas del primer tamizaje 33

Figura 17 Análisis electroforético de la amplificación por PCR del primer tamizaje 34

Figura 18 Placas fotográficas del segundo tamizaje 34

Figura 19 Análisis electroforético de la amplificación por PCR del segundo tamiz 35

Figura 20 Placas fotográficas del tercer tamizaje 35

Figura 21 Análisis electroforético de la amplificación por PCR del tercer tamizaje 36

Figura 22 Análisis electroforético de la escisión in vivo 37

Figura 23 Digestión de la vaca 39

Figura 24 Transformación de carbohidratos en la vaca 41

Figura 25 Sustratos que degradan las enzimas comerciales 43

M 1 2 3 Kb 10.0 3.0 2.0 1.5 1.0 0.5

M 1 2

Kb 10.0 3.0 2.0 1.5 1.0 0.5

M 1 2 3

CLONACIÓN DE UN GEN CODIFICANTE PARA ACETIL-XILAN ESTERASA DE Cellulomonas flavigena Y SU POTENCIAL APLICACIÓN EN ALIMENTO PARA GANADO

Clara Alicia Cruz Ramírez, Lorena Amaya Delgado, Alejandro Santiago Hernández, Graciela Ruíz Ramírez, María Eugenia Hidalgo Lara*. Depto. de Biotecnología y Bioingeniería del CINVESTAV. Av. IPN No 2508. San Pedro Zacatenco. CP 07360. México D. F.Fax (55) 5061-3313. E-mail ehidalgo@cinvestav.mx

Palabras clave: Cellulomonas flavigena, xilanasa, acetil-xilan esterasa, sonda molecular, tamizaje

Introducción. La mayoría de los estudios en enzimas xilanolíticas se han llevado a cabo en hongos mesofílicos. Sin embargo, se han encontrado enzimas de origen bacteriano que poseen características similares y, en muchos casos, con ventajas sobre las de origen fúngico (1). El género Cellulomonas agrupa bacterias mesofílicas productoras de celulasas y xilanasas, entre las cuales se encuentran C. fimi, C. uda y C. flavigena. Una de las grandes ventajas de estas enzimas es que pueden mejorar los aspectos económicos de los procesos de la materia lignocelulolítica para la generación de combustibles y químicos. En los últimos años, la celulosa libre de xilana ha tenido un gran impacto en el desarrollo de tecnologías ambientales, por ejemplo en la industria del papel y en alimento para ganado. Metodología. Se amplificó por PCR la región codificante para un dominio acetil esterasa, a partir del ADN genómico de C. flavigena y oligonucleótidos específicos diseñados a partir de la secuencia de nucleótidos del gen xynA de esta bacteria. El fragmento amplificado, aprox. 450 pb (acrIA), se marcó por el método de “Random Primer” con dUTP-fluoreceína (Amersham) y se utilizó como sonda para tamizar el banco genómico de C. flavigena bajo condiciones de alta astringencia. Las señales positivas se detectaron por autorradiografía sobre placas de rayos X (Amersham), dichas señales se les realizó una escisión in vivo, para analizar dichas secuencias.

Resultados y discusión. Se obtuvo por PCR una sonda especifica de aprox. 450 nt, el tamaño esperado, con secuencias codificantes para un dominio acetil esterasa (Fig. 1). Fig. 1. Amplificación de la sonda acrIA a diferentes temperaturas (ºC) de alineamiento. Carriles 1-3: 55.5, 57.5 y 60.6, respectivamente.

El tamizaje de la biblioteca genómica de C. flavigena con la sonda acrIA permitió el aislamiento de cuatro clonas candidato (Fig. 2).

Fig. 2. Autorradiografía del tamizaje por duplicado. Para verificar que las clonas candidato contienen secuencias codificantes para un dominio acetil esterasa, los iniciadores utilizados para obtener la sonda acrIA se utilizaron para amplificar el fragmento de 450 nt a partir del ADN de las clonas genómicas candidato, obteniéndose el fragmento del tamaño esperado de 450 nt (Fig. 3).

Fig. 3 Amplificación de la sonda acrIA a partir de las clonas genómicas candidato. Carril 1 y 2 amplificaron el fragmento de 0.45 kb. Se realizarón tres tamizjes, de los cuales se obtuvieron 3 clonas candidatos para la realización de la escisión in vivo, de éstas se obtuvo sólo una secuencia la cual fue analizada por homologia con secuencias previamente reportadas en las bases de datos. En el análisis se obtuvo que la secuencia tiene homología con: NOCSJ Binding-protein-dependent transport systems y ARTAT Putative alpha-glucosides ABC transporter. Se piensa que debido al alto contenido de GC (~73%) en el genoma de C. flavigena, es necesario utilizar condiciones de lavado más estrictas, a fin de evitar hibridación inespecífica con la sonda de la acetil xilan esterasa, por lo que se propone modificar dichas condiciones. Conclusiones y perspectivas. Se obtuvieron tres clonas de un tercer tamizaje, a las cuales se les determinó su secuecia de nucleótidos. El análisis por homología con el programa BLAST reveló que las clonas aisladas comparten homología nivel de aminoácidos con proteínas de transporte. Agradecimientos. Este trabajo fue financiando por el CINVESTAV, MÉXICO D. F. Referencias. Sunna, A. and Antranikian and Kato, K. (1997) Xylanolitic enzymes form fungi and bacteria. Crit. Rev. Biotechnol. 17, 39-67.

G43

G4-2

G4-1

G4-4 G4-1´

G4-2´ G4-3´

G4-4´

0.45

0.45

- 1 -

CLONACIÓN DEL GEN DE UNA ACETIL-XILAN-ESTERASA DE Cellulomonas flavigena Y SU POTENCIAL APLICACIÓN

EN ALIMENTO PARA GANADO

1. INTRODUCCIÓN

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio 20 “Biocatálisis” del Departamento de

Biotecnología y Bioingeniería del CINVESTAV, bajo la dirección de la Dra. MARÍA EUGENIA

HIDALGO LARA.

En este trabajo nos propusimos clonar y secuenciar el gen codificante para acetil-xilan

esterasa de Cellulomonas flavigena, a partir de una biblioteca genómica de este

microorganismo. Hasta el momento, se cuenta con una clona de aproximadamente 1.5 kb

(CPCR-1.5), la cual fue obtenida por amplificación por PCR a partir de DNA genómico de C.

flavigena y oligonucleótidos específicos diseñados a partir de secuencias conservadas de

xilanasas microbianas. CPCR-1.5 codifica para un polipéptido con homología de 75%, a nivel

de aminoácidos, con la xilanasa XynD de C. fimi perteneciente a la familia 11 de las

glicosilhidrolasas (GH), y contiene secuencias codificantes para el dominio catalítico

característico de la familia 11, un CBD tipo II y un dominio catalítico de desacetilasa. CPCR

contiene aproximadamente el 80% de la secuencia del gen, comparada con el tamaño del

gen xynD de C. fimi, y para completar la región codificante del gen es necesario conocer la

secuencia de los extremos 5’ y 3’. El extremo 5’ del gen contiene las secuencias codificantes

para el extremo N-terminal de la xilanasa y, muy probablemente un péptido señal; ya que en

este microorganismo produce y secreta las xilanasas al medio de cultivo. El extremo 3’ del

gen, contiene las secuencias codificantes para el extremo C-terminal de la xilanasa, el codón

de terminación de la traducción (TAA, TGA ó TAG) y, muy probablemente el terminador de la

transcripción.

Con la finalidad de completar el gen, se llevó a cabo el tamizaje de una biblioteca genómica

de C. flavigena utilizando una sonda molecular específica que contiene secuencias

codificantes para el dominio catalítico de desacetilasa, ya que este es característico de la

xilanasa que se busca y distinta de las demás xilanasas de C. flavigena. La sonda molecular,

- 2 -

obtenida por métodos de amplificación por PCR, se marcó con d-CTP/fluoresceína y con ella

se llevó a cabo el escrutinio de la biblioteca genómica para aislar y clonar el gen codificante

para acetil-xilan esterasa de C. flavigena.

Por otra parte, se realizó el diseño de la aplicación de la xilanasa en alimento para ganado, a

partir de las características principales de la acetil-xilan esterasa de C. flavigena.

- 3 -

2. ANTECEDENTES

2.1 Género Cellulomonas

Es una bacteria que tiene forma de bastón irregular de 0.5 por 2µm de dimensión, anaerobio

facultativo, no forma endoesporas, sus colonias son de color marfil. Es capaz de llevar a

cabo la hidrólisis enzimática de la celulosa, por lo cual tiene un gran valor desde el punto de

vista económico, ya que proporciona azúcares solubles. Algunas especies de Cellulomonas

son móviles debido a la presencia de uno o más flagelos laterales (usualmente polar o

subpolar). Es un organismo Gram (+), sin embargo, la célula fácilmente se decolora

obteniéndose una mezcla de bacilos Gram (+) y Gram(-); son quimioorganótrofos, es decir,

metabolismo respiratorio: O2 aceptor final de electrones. Muchas cepas producen ácidos de

glucosa bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas, son catalasa (+).

La mayoría de los estudios en enzimas xilanolíticas se han llevado a cabo en hongos

mesofílicos. Sin embargo, se han encontrado enzimas de origen bacteriano que poseen

características similares y, en muchos casos, con ventajas sobre las de origen fúngico.

Dentro de las bacterias productoras de xilanasas se encuentran: C. fimi, C. uda, C.

flavigena, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Microspora bispora, entre otros. El

género de Cellulomonas ha sido estudiado, ya que produce una amplia variedad de

glucanasas, se considera que este género comprende siete especies, las cuales pueden ser

aisladas de fuentes naturales, manteniéndolas en una mayor concentración de sales

minerales, biotina, tiamina y celulosa como fuente de carbono.

Los estudios con C. flavigena comenzaron en el año de 1970 y en los últimos años se han

enfocado a la identificación de genes de celulasas y xilanasas de esta bacteria.

Recientemente, se han reportado secuencias parciales de genes codificantes para celulasas

y xilanasas que presentan homología con los reportados para C. fimi. En la figura 1 se

muestra la homología de las xilanasas de diferentes bacterias con C. flavigena en un árbol

filogenético. Sin embargo, en ninguno de los casos se ha determinado la organización

estructural de las proteínas. Aun cuando se a logrado la caracterización de un número

considerable de xilanasas, no se conoce el número de genes cuyos productos están

involucrados en la hidrólisis de celulosa, sobre todo de C. flavigena.

- 4 -

Figura 1. Árbol filogenético de Celllomonas flavigena. Con un producto de 489 aa se realizó la comparación, la cual presentó alta homología con xilanasas de Cellulomonas fimi (71%), Xylanomicrobium pachnodae (70%), Streptomyces viridosporus (68%), Streptomyces lividans (68%) y Thermomonospora fusca (67%). Asi mismo, el árbol filogenético (Fig. 3) mostró que la xilanasa XYLA, esta estrechamente relacionada con las xilanasas de C. fimi y Xylanomicrobium pachnodae principalmente (tomado de Trabajo de Proyecto de investigación, Jiménez Norma, 2005).

Xylanomicrobium pachnodae

0

36.9

5 10 15 20 25 30 35

Cellulomonas flavigena

Cellulomonas fimi

Ruminococcus flavefaciens

Clostridium cellulovorans

Ruminococcus albus

Clostridium thermocellum

Microbulbifer hydrolyticus

Thermomonospora fusca

Streptomyces viridosporus

Cellvibrio japonicus

Cellvibrio mixtus

Streptomyces lividans

Pseudomonas sp. ND137

Caldicellulosiruptor sp.

- 5 -

2.2. Estructura de la xilana

Las β−1,4-xilanas son heteropolisacáridos con una cadena homopolimérica de D-

xilanopiranósidos unidas por enlace β−1,4. La columna consiste de O-acetil, α−L-

arabinofuranosil, enlace α−1,2 glucurónico ó sustituyentes ácido 4-O-metilglucurónico. Las

xilanas de la madera existen como O-acetil-4-O-metilglucuronoxilanas en madera dura o

como arabino-4-O-metilglucoronoxilanas en madera suave.

2.2.1. Biodegradación de la xilana.

Debido a que las xilanas de distintas fuentes presentan variaciones considerables tanto en

composición como en estructura, su degradación completa requiere la acción de diferentes

tipos de enzimas. Entre éstas, se encuentran la endo β-1,4-xilanasas (también referida

únicamente como xilanasa) (E. C. 3. 2. 1. 8), la cual es la enzima más importante ya que

inicia la degradación de las xilanasas a través del rompimiento de los enlaces β−1-4-

glicosídicos, produciendo la liberación de xilooligosacáridos y la disminución del grado de

polimerización de las xilanas. Otras enzimas requeridas para la hidrólisis de la xilana en sus

componentes monoméricos, incluyen a la β-xilosidasa (E.C. 3. 2. 1. 37), la cual hidroliza los

xilosacáridos y xilobiosa a unidades de xilosa; α-L-arabinofuranosidasa (E. C. 3. 2. 1. 55) que

libera grupos α -L-arabinofuranosil de la cadena de arabinoxilana; α -D-glucuronidasa (E. C.

3. 2. 1. 1) cuya función es romper el enlace α-1.2-glicosídico existente entre la xilosa y el

ácido D-glucurónico; acetil xilana esterasa (E. C. 3. 1. 1. 6) encargada de eliminar los grupos

O-acetil, de las posiciones C-2 y C-3 presentes en la xilosa ó en los xilooligosacáridos y por

último esterasas feruroil y p-cumaroil implicadas en la liberación de los ácidos esterificados

ferúlico y cumárico, respectivamente.

2.3. Xilanasas

Las xilanasas son un tipo particular de las glicosil hidrolasas, que ha la fecha se han definido

en 110 familias agrupadas por la similitud que comparten en la secuencia de aminoácidos

del dominio catalítico (Henrissat y col. 1993, http://www.cazy.org/fam/acc_fam.html). En

particular, las xilanasas se encuentran agrupadas en las familias 10 y 11. La familia 10

- 6 -

incluye principalmente xilanasas ácidas y de alto peso molecular, conteniendo de 269 a 809

residuos de aminoácidos (PM > a 30 kDa), mientras que las básicas y de bajo peso

molecular pertenecen a la familia 11, conteniendo de 182 a 234 residuos (PM < 30 kDa),

siendo estas últimas las más comunes. La más importante aplicación de las xilanasas es en

la industria papelera. Estas son además frecuentemente usadas en la industria agropecuaria

y alimentaría, tal como en la extracción de café, aceite vegetal y almidón, además de otros

(Beg y col. 2001).

En este trabajo, se va a partir del fragmento de 1.5 kb que contiene la secuencia parcial del

gen codificante para una xilanasa de C. flavigena, reportado en el proyecto de investigación

de Jiménez 2005. Para obtener el dominio de la acetil-xilan esterasa que falta, se sabe que

es de la familia 11, porque se determinó la huella genética de la enzima (figura 2).

Región I: [PSA] - [LQ] - x - E - Y - Y - [LIVM](2) - [DE] - x - [FYWHN] Región II: [LIVMF] - x(2) - E - [AG] - [YWG] - [QRFGS] - [SG] - [STAN] - G - x - [SAF] Donde E en ambas regiones es un residuo del sitio de activo

Figura 2. Huella genética de la xilanasa de Cellulomonas flavigena, comparada con xilanasas de otros microoganismos. (Tomado de Trabajo de Proyecto de investigación, Jiménez Norma, 2005).

Los microorganismos hemicelulolíticos juegan un papel significativo en la naturaleza por

reciclar la hemicelulosa, que es uno de los principales componentes de polisacáridos en las

plantas. La composición de biomasa en plantas lignocelulósicas consiste de 20-30% de

material hemicelulósico los cuales son polisacáridos heterogéneos encontrados en

asociación con celulosa (Neeta Kulkarni y col. 1999).

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**:*****:.* *:***********.:.:

Cellulomonas flavigena

Cellulomonas fimi

Xilanimicrobium pachnodae

Streptomyces viridosporus

Thermomonospora fusca

- 7 -

Las xilanasas (EC 3.2.1.8) catalizan la hidrólisis de xilana, que es el constituyente general de

la hemicelulosa. Una de las grandes ventajas de estas enzimas es que pueden mejorar los

aspectos económicos de los procesos de la materia lignocelulolítica para la generación de

combustibles y químicos. En los últimos años, la celulosa libre de xilana ha tenido un gran

impacto en el desarrollo de tecnologías ambientales, por ejemplo en la industria del papel.

En microorganismos que producen xilanasas de bajo peso molecular, fragmentos de la

xilana y su posición isomérica juega un papel clave en la regulación de la biosíntesis.

Algunos análisis de las xilanasas han revelado distintos dominios de unión del sitio catalítico

y la celulosa, con un domino no catalítico separado que se ha reportado para confirmar la

estabilidad aumentada en algunas xilanasas.

Las xilanas microbianas (1,4-D-xilan xilanohidrolasa, EC 3.2.1.8) se pueden considerar

excelentes biocatalizadores por su adecuada hidrólisis de la xilana, debido a su alta

especificidad, sus condiciones de reacción, por la insignificante pérdida de sustrato, y la alta

generación de productos. El costo de la ruptura de biomasa es uno de los factores que limita

la viabilidad económica en la recuperación de la enzima. La producción de xilanasas puede

por lo tanto ser mejorado por mutantes inducidas para excretar cantidades más grandes de

enzima.

Las investigaciones que se hacen actualmente, principalmente se enfocan a las aplicaciones

de xilanasas en los aspectos moleculares y bioquímicos de esta enzima de la familia de las

glicosil hidrolasas. Considerando las perspectivas a futuro de las xilanasas por la explotación

biotecnológica, especialmente en el campo de la biopulpa y de la clarificación, es esencial

para verificar las propiedades de las xilanasas con respecto a la regulación de biosíntesis y

mecanismos de acción. Un importante número de publicaciones, en años recientes,

describen una cantidad de xilanasas nuevas, su clonación, secuenciación, mutagénesis y

análisis cristalográfico. Muchos de estos reportes son acerca de hemicelulosas que facilitan

el blanqueo de la pulpa de papel por el proceso Kraft, usado en la industria del papel. Debido

a que las xilanasas son enzimas industrialmente importantes, muchos estudios han sido

publicados cubriendo varios aspectos de las enzimas (Neeta Kulkarni y col. 1999).

Últimamente se han hecho búsquedas para incrementar la productividad de xilanasas

usando diferentes enfoques, tal como usar diferentes microorganismos, optimización de los

medios, variación de los sistemas biológicos utilizando la ingeniería genética (Kebir et al.

- 8 -

2000; Montes-Horcasitas et al. 2004; Schneider et al. 2001; Techapun et al. 2002; Vega-

Estrada et al. 2002). Cellulomonas flavigena es óptima para la producción de un sistema

multienzimático, incluyendo xilanasas y celulasas. Un requisito para obtener una producción

óptima de xilanasa es mantener baja concentración de azúcares en el medio en todo

momento (Hidalgo-Lara et al. 2005), esto es importantísimo en el momento en que se

encuentra un gen se secuencia, caracteriza y finalmente se le da una aplicación a nivel

industrial.

Tabla 1. Xilanasas purificadas de Cellulomonas flavigena.

Xilanasa PM (KDa) T. óptima pH óptimo Vmax

Xil 1 20.4 50 5.5 1551

Xil 2 40.1 50 5.5 1129

Xil 3.1 32.5 65 6.5 3135

Xil 3.2 12.7 ND ND ND

Xil 3.3 57.3 ND ND ND

Xyl 1 63.0 60 6.0-7.0 91

Xyl 2 17.0 60 6.0-7.0 117

Xyl 3 35.0 60 6.0-7.0 333

Xil-56-CS 56.0 55 6.5 5.8

ND = No determinada (Adaptado de Martínez, 2000).

2.4 Organismos productores de xilanasas

Las xilanasas son producidas por un gran número de organismos como bacterias, algas,

hongos, protozoarios gastrópodos y artrópodos (Dekker, 1976), la mayoría de los hongos y

bacterias producen xilanasas extracelulares, las cuales actúan sobre el material

hemicelulolítico liberando xilosa como producto final asimilable, permitiendo de esta forma el

crecimiento de algunos organismos heterotróficos sobre la xilana.

Particularmente, los hongos filamentosos son importantes productores de xilanasas (Tabla 2)

no sólo porque son capaces de excretar las enzimas sino porque los niveles de enzimas

producidos por estos son mucho mayores que las enzimas de levaduras y bacterias. Sin

- 9 -

embargo, aunque los hongos sean mejores productores que las bacterias, éstas poseen

velocidades de duplicación superiores a la de los hongos, representando una gran ventaja.

Tabla 2. Hongos xilanolíticos*

* Tomado de Sunna & Antranikian, 1997.

2.5 Xilanasas de origen extremofílicos.

A nivel industrial se necesitan xilanasas con alta estabilidad en las condiciones de operación.

Al usar xilanasas de alta estabilidad trae como ventajas tal como reducir la contaminación, y

una rápida reacción. En general, los parámetros tales como el pH, temperatura, estabilidad

química y enzimática son importantes para la aplicación de las enzimas a nivel industrial.

Uno de los mecanismos para verificar que la xilanasas se pueda aplicar a nivel industrial es

obtener las xilanasas de microorganismos extremofílicos. Adams, de la Universidad de

Georgia, uno de los pioneros en el estudio de extremófilos dijo: “si buscas una alta

estabilidad enzimática, debes de ir a los ambientes extremos.”

2.6. Factores que afectan la producción de xilanasas

La producción de xilanasas en un proceso de fermentación, se encuentra regido por una

cantidad pequeña de factores claves, además de los parámetros estándar. Cuando la

fermentación de xilanasas es llevada en un complejo heterogéneo de sustratos, varios

Organismo Referencia

Aspergillus awamori CMI 142717 Kormelin, F,J, Searle-Van Leeuwen, Word, T. M. 1993a

Aspergillus flavipes Sherief, A.A. 1990

Aspergillus nidulans CECT 2544 Fernández Espinar, M., Piñaga, F., Gras, L., Viser, J, 1993

Fusarium oxysporum Alconada T. y Martínez, M. 1994

Gleophyllum trabeum Ritschkoff, A.C., Buchert, J y Vilkari, L.. 1994

Neurospora crassa Mishra, C., Keskar, S., Rao, M. 1984

Penicillum chrysogenum Q176 Hass, H., Herfurth, E., Stôffler, G. y Redi, B. 1992

Penicillum purpurogenum Eyzaguirre, J., Scarpa, J. Belancic, A.., y Steiner, J. 1992

Pîchia striptis CBS 5575 Ôzcan, S., Kôtter, P., Ciriacy, M. 1991

Schizophylum commune Jurasek, L. y Paice, M. G. 1988

Trichoderma harzianum E 58 Tan, L. U., Wong, K. Saddler, J. 1985, 1986.

Trichoderma lignorum Jonh, M. Y Schmidt. J. 1988.

- 10 -

factores tienen un efecto combinado a nivel de expresión de éstas enzimas. Estos incluyen la

accesibilidad a sustrato, el índice de la cantidad de la liberación de los xilooligosacáridos y su

naturaleza química y la cantidad de xilosa liberada, la cual actúa como la fuente de carbono

y como un inhibidor en la síntesis de xilanasas en la mayoría de los casos. Generalmente, la

baja liberación del inductor y la posibilidad de filtrar el cultivo, convierten al inductor en un

derivado no metabolizable, esto es el significado de un estímulo del nivel de la actividad de la

xilanasa (Neeta Kulkarni y col. 1999).

Algunos parámetros en un proceso de fermentación que pueden afectar a la actividad y

productividad de xilanasas, incluyen el pH, temperatura y agitación (Neeta Kulkarni y col.

1999).

2.6.1. Inducción de la producción de xilanasas

La xilana es un polímetro de alto peso molecular, no puede penetrar a la célula. Los

fragmentos de bajo peso molecular, juegan un papel clave en la regulación de la biosíntesis

de xilanasas. Estos fragmentos incluyen xilosa, xilobiosa, xilooligosacáridos,

heterodisacáridos de xilosa y glucosa y su isómero posicional. Estas moléculas son liberadas

de la xilana por la acción de pequeñas cantidades de productos enzimáticos constitutivos. Se

ha mostrado que la celulosa actúa como un inductor de las xilanasas en pocos casos, pero

esto no es claro si el efecto de inducción está relacionado con la contaminación de la

fracción de xilana. En Streptomyces sp., la actividad de las xilanasas se incrementa con la

cristalización del sustrato celulósico. El bagazo de caña de azúcar es el mejor inductor de

xilanasas y β-xilosidasas en Cellulomonas flavigena. Un efecto sinergético en la síntesis de

ambas enzimas se observó cuando la celulosa y hemicelulosa se usaron juntas como fuente

de carbón. Relativamente, poco se ha reportado en relación al cAMP en la inducción de

xilanasas.

- 11 -

Figura 3. Regulación de la biosíntesis de xilanasa (modelo hipotético). Las xilanasas constitutivas degradan la xilana a xilooligosacáridos y xilobiosa, los cuales son llevados dentro de la célula e inducen otros genes de xilanasas. Las xilanasas inducidas degradan la xilana a xilooligosacárdisos y xilobiosa. La β-xilosidasa, la cual puede producir constitutivamente y/o indeciblemente, convierte xilobiosa a xilosa y muchos subsecuentes transglicosilaciones de éste a XylB1-2Xyl y GlcB1-2Xyl. Estos compuestos salen por la célula y actúan como inductores adicionales de genes repetidos de las enzimas xilanolíticas. (Tomada de Kraulis et al 1991).

2.6.2. Regulación a nivel molecular

La biosíntesis de las xilanasas y el fenómeno de inducción enzimática a nivel molecular han

sido comparativamente menos investigadas. Esto puede ser debido a la escasez de

sistemas libres de células, los cuales son necesarios para la evaluación de inductores que

sus condiciones se encuentren por debajo de las experimentales, lo cual prevé su transporte

dentro de la célula. Una regulación separada para la formación de xilanasas y celulasas se

han reportado en pocos microorganismos (Neeta Kulkarni y col. 1999). A pesar de esta

evidencia, un enlace adicional gobierna la síntesis de los dos sistemas de enzimas, mismos

para ser presentados como evidencia se requiere de más de una mutación, causando la

eliminación de ambos genes de celulasas y xilanasas (Neeta Kulkarni y col. 1999).

- 12 -

2.6.3. Represión catabólica

La represión catabólica por glucosa es un fenómeno común observado en la biosíntesis de

xilanasas. El cAMP no tiene efectos en la represión causada por D-xilosa. Se ha sugerido,

que el sitio de regulación del ciclo del AMP se encuentra en una secuencia a 15-pb de

nucleótidos, río arriba del gen de la β-xilanasa. En Aspergillus tubigensis esta secuencia se

encuentra a 158-pb de la región, 5´ río arriba del gen de la xilanasa, por lo que se mostró

que estas secuencias están involucradas en la inducción específica de la xilana. Algunos

investigadores reportaron que la represión catabólica de las xilanasas parece ser controlada

a dos niveles, directamente por represión de la trascripción de genes e indirectamente por

represión del activador transcripcional.

2.7. Propiedades bioquímicas

La información disponible acerca de las propiedades de las xilanasas proviene en su

mayoría de estudios en bacterias y enzimas fúngicas. Las xilanasas microbianas son

proteínas con masa molecular entre 8-145 kDa (Sunna y col. 1997).

La temperatura óptima de endoxilanasas de bacterias y hongos se encuentran entre 40-

600C. Las xilanasas de hongos son generalmente menos termoestables que las xilanasas

de bacterias. Se ha reportado que algunos hongos mesofílicos producen xilanasas; por

ejemplo Ceratocystis paradoxa produce una xilanasa que es termoestable a 800C por 1h

(Dekker y col. 1975). Se ha visto que Acremonium alcalophilum sintetiza carboximetil

celulasas y xilanasas que presentan actividad a bajas temperaturas. La actividad de

xilanasas y celulasas a 00C presentaron un 25 y 48.8% respectivamente en comparación a

sus actividades a su temperatura óptima de 400C (Kazuya y col. 1997). Las xilanasas de

diferentes organismos son usualmente estables sobre un amplio rango de pH, y muestran un

pH óptimo entre 4-7. El punto isoeléctrico de endoxilanasas de varias fuentes indica que es

de 3 a 10. La composición de aminoácidos de xilanasas reportados de varias fuentes indica

que predominan el ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, serina y treonina.

- 13 -

2.8. Clonación y expresión de los genes de xilanasas

Para la realización comercial y económica en la viabilidad de la producción de xilanasas, es

necesaria la identificación de organismos, los cuales pueden hiperproducir las enzimas. Las

técnicas de recombinación de DNA ofrecen un aumento en la producción de las proteínas.

Los genes de xilanasas de diferentes microorganismos se han clonado en otros hospederos.

Los genes de xilanasas se han aislado de diferentes microorganismos y expresados en E.

coli. La expresión en E. coli presenta algunas desventajas como el confinamiento al

citoplasma ó en la región periplásmica. La ausencia de las modificaciones postraduccionales,

tal como glicosilación en E. coli y la acumulación intracelular de las xilanasas recombinantes,

son las razones principales de los bajos niveles de la actividad. Se ha reportado actividad

extracelular en E. coli recombinante con xilanasas alcalofílicas como Aeromonas, Bacillus y

Cellulomonas sp.

2.9. Evolución molecular

Recientes desarrollos en genética de xilanasas han aportado una nueva dimensión en los

estudios de evolución. El alineamiento de la secuencia es un conocimiento básico para

obtener información acerca de la función y evolución entre estos. El análisis de la secuencia

de aminoácidos de las xilanasas y celulasas ha revelado que la forma de las isoenzimas en

diversos organismos son una consecuencia de muchas familias de multigenes.

Existe un gran número de estudios en donde se reporta la homología de la secuencia de

xilanasas. En general, secuencias de la misma familia (10 o 11) exhiben más homología.

Estos criterios han sido usados para asignar la secuencia de aminoácidos a cierta familia.

2.10. Algunas aplicaciones de xilanasas

Las xilanasas juegan un papel principal en la maceración de materia vegetal, clarificación de

vinos y jugos, licuefacción de mucílago de café para fabricar café líquido, extracción de

sabores y pigmentos, aceite de plantas para blanquear y para incrementar la eficiencia en la

producción de forraje agrícola (Sunna y col. 1997).

- 14 -

En la práctica, la especificidad de acción de estas enzimas no es tanta como lo que sugieren

sus nombres. De hecho, es el tipo de enlace sobre el que actúan lo que determina su

especificidad, pudiendo atacar un mismo tipo de enzima tanto las cadenas de celulosa como

de xilana. La gran diversidad de enzimas que se aprecia en la figura 4 se justifica teniendo

en cuenta la variabilidad y complejidad de la estructura química de la pared celular vegetal.

Por otra parte, es curioso que cada microorganismo, en lugar de una sola, produzca varias

enzimas que actúan de forma muy similar, entre estas enzimas encontramos a la acetil-

xilan esterasa, que es parte primordial del complejo xilanolítico.

Se sabe que los rumiantes son los animales que pueden digerir la celulosa y las xilanas. Se

asume que el proceso de digestión enzimática de la celulosa en el rumen sigue el modelo

observado en los hongos aerobios. Este proceso se inicia con el ataque de endo-1,4 ß

glucanasas (celobiohidrolasas) a las regiones más amorfas de la celulosa, rompiendo

aleatoriamente las cadenas en celodextrinas y creando así extremos libres para la acción de

exo-1,4 ß glucanasas, que liberan unidades de celobiosa a partir del extremo de la cadena.

Estas celobiosas son finalmente hidrolizadas a glucosa por ß-glucosidasas.

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(a) exo- 1, 4- ß glucanasa (celobiohidrolasa). (b) endo- 1,4- ß glucanasa. (c) celodextrinasa. (d) 1,4- ß

glucosidasa (celobiasa). (e) endo- 1, 4- ß xilanasa. (f) ??-L- arabinofuranosidasa. (g) acetil - xilan

esterasa. (h) ácido ferúlico esterasa. (i) - glucuronidasa. (j) 1,4- ß xilosidasa.

Figura 4. Acción enzimática sobre celulosas y hemicelulosas. Glu: glucosa; Xil: xilosa ; Ara:

arabinofuranosa ; Ac: grupo acetilo; Fer: ácido ferúlico ; me Glc: ácido 4-O- metil

glucurónico. (Tomada de: Flint, 1994).

2.11. Acetil-xilan esterasa Acetil-xilan esterasa (E.C. 3.1.1.72) cataliza la hidrólisis de las ramificaciones de los grupos

acetilados de xilana (glucuronoxilana) sustituidos por grupos glucurónicos, los cuales son los

principales componentes de la hemicelulosa de la madera dura, es glucuronoxilana, O-acetil-

4-Ometilglucuronoxilana esta compuesto por el enlace β−1,4 y residuos D-xilopiranosidos.

Aproximadamente cada 10 unidades de xilosa traen ramificaciones ácido 4-O-

metilglucuronico que se encuentra unida en la posición 2 de la xilosa, y 7 de 10 residuos de

la xilosa contienen una ramificación del grupo O-acetil en el C2 o C3 o en ambos. La

biodegradación de la xilana se realiza por medio de un grupo complejo de enzimas, entre

acetil-xilan esterasa

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éstas la acetil-xilan esterasa (figura 4). Las enzimas que degradan la cadena principal de la

xilana han sido extensivamente estudiadas (Derewenda etal., 1994; Harris et al., 1994;

To¨rro¨nen et al., 1994; Wakarchuk et al., 1994; White et al., 1994), pero los genes, y

estructuras de las enzimas que hidrolizan las ramificaciones de la cadena principal aun se

desconocen del todo. En recientes años, un número de diferentes acetil-xilan esterasas de

varios organismos han sido purificadas, estos difieren con otros en su secuencia de

aminoácidos y su relación o interacción con otros aunque aún son parcialmente inciertos. En

consecuencia, pocas estructuras se han reportado sobre las acetil-xilan-esterasas, tal como

la estructura tridimensional de acetil-xilan esterasa de Penicillium purpurogenum ha sido

publicada, pero poco se dijo acerca del sitio catalítico de la enzima o del mecanismo de

desacetilación de la acetil-xilan- esterasa.

Existen diversos estudios sobre acetil-xilan esterasa con la cual se estudian los parámetros

cinéticos de dicha enzima en diferentes microorganismos, como en Schizophyllum commune

(P.Biely 1988) y Streptomyces (Johnson K. G. 1988), también en la formación de

combinaciones de ésta enzima con mananasas y xilanasas como tal y su potencial efecto en

la hidrólisis de algunos compuestos solubles en carbohidratos, como la lignina (Ross K.G,

1992). También se ha investigado sobre la acción de la acetil-xilan esterasa sobre

compuestos monoacetilados o diacetilados y la comparación de la respuesta de la enzima

sobre los dos tipos de compuestos. En un estudió sobre la especificidad por el sustrato de la

acetil-xilan esterasa de Streptomyces lividans, en donde los compuestos glucopiranosidos

metil acetilados fueron los sustratos, se trataron como parcial y totalmente acetilados, por lo

que la enzima presentó desacetilación regio selectiva, lo cual fue evidente en la degradación

del compuesto. Los resultados sugieren que en la degradación de la acetil xilana la enzima

rápidamente desacetila los residuos xilanopiranosidos monoacetilados, pero también ataca a

los residuos dobleacetilados mucho más lentamente (P. Biely, Noviembre1996).

Experimentos similares se han llevado a cabo en diversos microorganismos como

Schizophyllum commune (Peter biela, 1996), y Trichoderma reesei (figura 5) (P. Biely, 1997).

Se encontró que el enlace NodB del dominio de la Xilanasa D de Cellulomonas fimi es un

miembro de la pequeña familia de proteínas homólogas estructurales, las cuales incluyen

una quitin desacetilasa de Mucor rouxii, una acetil-xilan esterasa de Stroptomyces lividans y

la proteína NodB de Rhizobia (Laurie 1997).

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Figura 5. (a). Diagrama de la molécula de la acetil-xilan esterasa de Trichoderma reesei. Estructura

secundaria, los elementos y residuos se encuentran marcados. El sitio de glucosilación se encuentra

marcado junto con un residuo GlcNac. (b) Enlace disulfuro en la molécula de la acetil-xilan esterasa de

Trichoderma reesei. (TOMADA DE Hakulinen Nina et al. 2001)

Figura 6. Diagrama topológico de los elementos de la estructura secundaria. Las cadenas se

muestran como flechas y las α-hélices como rectángulos. (a) Se muestran marcados los elementos y

residuos catalíticos de la acetil-xilan esterasa de Trichoderma reesei. (TOMADA DE Nina Hakulinen et

al. 2001).

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Figura 7. Propuesta de dos diferentes mecanismos de reacción para la hidrólisis de grupos acetil de

xilana por la acetil-xilan esterasa. (a) Mecanismo Propuesta por Biela. (b) Mecanismo propuesta por

Nina. (TOMADA DE Hakulinen Nina et al. 2001).

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3. JUSTIFICACIÓN

Considerando la poca información que se tiene sobre los genes codificantes para xilanasas y

en específico de la región codificante para la acetil-xilan esterasa de Cellulomonas flavigena,

se pretende dar a conocer la secuencia codificante para la acetil-xilan esterasa de

Cellulomonas flavigena, de esta forma aportar valiosa información a nivel molecular de éste

gen.

El estudio de los genes de Cellulomonas flavigena ha comenzado recientemente, por lo que

el conocer este gen y las características de la enzima, se le puede dar una aplicación valiosa

a nivel industrial como lo es en alimento para ganado, ya que actualmente se usan xilanasas

de otros microorganismos como aditivos en piensos, es por ello que el trabajo escrito se ha

complementado con una investigación, acerca de las enzimas comerciales en alimento para

ganado y la comparación de éstas con la acetil-xilan esterasa de Cellulomonas flavigena, de

esta manera poder ver la mejoría en la calidad y cantidad tanto de carne como de leche de la

vaca al agregar dicha enzima en el alimento para ganado.

- 20 -

4.0. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

� Clonar el gen de una acetil-xilan-esterasa de Cellulomonas flavigena.

4.2. Objetivos específicos

• Diseñar oligonucleótidos específicos para la amplificación de una sonda molecular del

dominio deacetil de la xilanasa de la familia 11 de Cellulomonas flavigena.

• Amplificar por PCR de una sonda molecular de aproximadamente 400pb.

• Marcaje de la sonda molecular que detecta el dominio deacetil de la xilanasa de la

familia 11 de Cellulomonas flavigena.

• Tamizaje de la biblioteca genómica de Cellulomonas flavigena

• Evaluar la incorporación de la enzima acetil-xilan esterasa de Cellulomonas flavigena

a piensos para alimentación de ganado.

5. HIPÓTESIS El tamizaje de la biblioteca genómica de Cellulomonas flavigena con una sonda molecular

diseñada de forma específica, permitirá la clonación del gen codificante para la acetil-xilan

esterasa de Cellulomonas flavigena.

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6. METODOLOGÍA

6.1. Equipos y reactivos

6.1.1 Equipos Software: DNA Start, Primer Select, BLAST, CLUSTALW

MyCyclerTM thermalcycler BIO-RAD

Transluminador de luz UV (Transluminador Hoefer-Uvis-20 de UV y visible)

6.1.2. Reactivos Master mix (Qiagen)

MgCl2 25mM (Sigma)

Gel de agarosa al 1.2% (BioRad)

Marcador de tamaño 1Kb “ladder” (New England Biolabs)

Bromuro de etidio (0.5µg/mL)

Primers del Random Primer

Gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1.2% (BioRad)

6.1.3. Soluciones Solución Q5X

Buffer de Hibridación

TE Buffer

EDTA 0.2M

SDS 10%

Solución de depuración 250 mM HCl

Solución de desnaturalización

Solución de neutralización

Solución de Lavado

Tween 20 0.3% (v/v)

Buffer A

Buffer TBE 0.5X

Buffer de carga 6X

Solución de bloqueo 1:10 en buffer A

Conjugado AP

Solución EB

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6.2. Secuencia experimental

Para el cumplimiento del trabajo experimental se realizó la siguiente secuencia de trabajo.

Figura 8. Diagrama de bloques de la metodología

Diseño de oligonucleótidos

PCR para la amplificación de una sonda molecular específica

Marcaje de la sonda molecular

Escisión in vivo y análisis de la secuencia del gen encontrado.

Tamizaje de la biblioteca genómica de Cellulomonas

flavigena para aislar el gen de la acetil-xilan-esterasa.

Potencial aplicación de la acetil-xilan esterasa de Cellulomonas

flavigena en alimento para ganado.

Electroforesis en gel de agarosa

Purificación del producto de PCR (sonda

molecular específica)

Titulación de la biblioteca genómica de Cellulomonas

Hibridación

Revelado de placas

Recuperación de las clonas (fagos)

Se manda secuenciar el producto de PCR

- 23 -

6.2.1. Diseño de oligonucleótidos específicos.

Se diseñaron oligonucleótidos específicos con el programa Primer Select (DNA Star) para la

amplificación de la sonda molecular específica del gen de la acetil-xilan-esterasa de

Cellulomonas flavigena. A partir de un fragmento del gen de una xilanasa de la familia 11, de

la cual ya se tenía el sitio catalítico, un péptido de unión (“linker”) y el CBM (módulo de unión

a carbohidrato, “cellulose binding module”), sólo que ahora se buscó a partir del dominio de

deacetilasa en adelante hasta el final del gen, teniendo cuidado en que la diferencia de las

temperaturas medias del oligonucleótido directo y el reverso no sea mayor a 100C, y que no

terminen en T, A ni en triple G.

Péptido Sitio catalítico Pep. linker CBM-1 Dom. acetilasa Pep. Linker CBM-2 señal

LO QUE SE BUSC LO QUE YA SE TIENE LO QUE SE BUSCA

Figura 9. Estructura del gen codificante para una xilanasa de Cellulomonas flavigena.

6.2.2. PCR

La sonda molecular específica para el gen de la acetil-xilan-esterasa de Cellulomonas

flavigena se amplificó por PCR a partir de ADN genómico de C. flavigena y de los

oligonucleótidos diseñados como iniciadores (primers). La PCR se realizó siguiendo las

instrucciones descritas por el fabricante (HotStar High Fidelity PCR Handbook). La mezcla se

sometió a un programa diseñado en el equipo MyCyclerTM thermalcycler BIO-RAD, el

programa se diseño según las temperaturas de los oligonucleótidos que se diseñaron

previamente.

- 24 -

Figura 10. Diagrama del fundamento de PCR

6.2.3. Electroforesis en gel de agarosa.

La muestra se analizó por electroforesis en gel de agarosa al 1.2%, de acuerdo al método

descrito por Sambrook y col. (1989). La agarosa se disolvió en buffer TBE 0.5X. Las

muestras se prepararon como sigue: 1µL de buffer de carga 6X, 2µL del marcador (1Kb)

DNA muestra y 3µL de H2O destilada. Las muestras se corrieron en una cámara de

electroforesis con TBE 0.5X a 70 V, el tiempo necesario para la separación de la muestra.

Después, el gel se tiñó con bromuro de etídio (0.5µg/mL) durante 5 minutos, se lavó con

agua y se analizó en un transluminador de luz UV (Transluminador Hoefer-Uvis-20 de UV y

visible) con ayuda del software Kodak Digital Science 1D v3.0.1 y una cámara digital Kodak

DC120.

DESNATURALIZACION

30-40 CICLOS

ADENILACIÓN

EXTENSIÓN

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6.2.4. Purificación del producto de PCR

El producto de PCR se analizó por electroforesis en gel de agarosa (BioRad) al 1.2 %. El

fragmento de PCR de 450 pb se purificó utilizando el kit de purificación “QIAquick” (Qiagen)

para purificación por geles de agarosa, siguiendo las instrucciones descritas por el

fabricante. Se utilizó agarosa de bajo punto de fusión (BioRad), el gel se preparó al 1.2% y

se tiño con bromuro de etidio (0.5µg/mL).

Una vez que se visualizó la banda deseada, se cortó la banda del fragmento con una navaja

estéril tratando de obtener la menor cantidad posible de gel. El material recortado se colocó

en un tubo estéril prepesado y por diferencia se obtuvo el peso del gel. Se agregó 2

volúmenes de buffer QG por volumen de gel (100 mg de gel =200 µL de buffer QG). Se

incubó a 50°C por 10 minutos hasta disolver completamente el gel, mezclando con Vortex

cada 2-3 minutos. Se adicionó un volumen de isopropanol en la misma proporción que el

buffer QG. En una columna de sílica gel se pasaron 750 µL de la muestra y se centrifugó a

13,000 rpm por un minuto. Este paso se repitió tres veces. Se desechó el filtrado. Para el

lavado, se adicionaron 750 µL de buffer PE y se centrifugó por un minuto a 13,000 rpm.

Finalmente, se desechó el filtrado y se centrifugó un minuto más.

Para obtener la primera elución se colocó el filtro de la columna en un tubo Eppendorf estéril,

se agregaron 50µL de buffer EB (10mM Tris-HCl) en el centro de la membrana y se

centrifugó por un min. Para la segunda elución, se le agregaron otros 50µL de buffer EB. Se

realizó una electroforesis en gel para comprobar la purificación del fragmento deseado

tiñéndolo con bromuro de etídio.

6.2.5. Marcaje de la sonda molecular específica.

Para marcar la sonda molecular se siguieron las especificaciones del kit Gene Images

Random Prime Labeling (Amersham). Éste kit utiliza el fragmento Klenow en lugar de la

polimerasa. El fragmento Klenow no tiene el fragmento 5´-3´ exonucleasa (Figura 11). La

mezcla realizada se sometió a una temperatura de 370C en el equipo Thermostat plus

Eppendorf. Se diluyó la muestra de ADN purificado hasta que se obtuvo una concentración

total de 100 ng/µL.

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El ADN se desnaturalizó manteniéndolo a ebullición por 5 minutos en un baño de agua,

posteriormente se colocó en una baño de hielo para dejarlo enfriar. En un tubo Eppendorf se

realizó la mezcla de los componentes, pero además se usaron los oligonucleótidos con los

que se amplifico la sonda molecular. Una vez que se realizó la mezcla, se llevó a cabo la

reacción durante 1 hora a 37°C. Para parar la reacción, se agregó EDTA a una

concentración final de 20 mM. La sonda se almacenó a una temperatura de -15°C a -30°C en

condiciones de oscuridad.

Figura 11. Diagrama de la función de la enzima Klenow

6.2.6. Titulación de la biblioteca genómica.

Para obtener la titulación de la biblioteca genómica de C. flavigena se realizó una serie de

diluciones de la biblioteca genómica según indicaciones del manual λZap Express

(Stratagene), en donde a partir de esta titulación se determinó el número de cajas Petri con

las que se comenzó a realizar el tamizaje, también al observar las diluciones se elegió la

adecuada para el comienzo, en donde se buscó como característica principal que se

encontrara totalmente llena de placas líticas, para asegurar con estas características

mencionadas que se tenga el gen que se busca de toda la biblioteca genómica de C.

flavigena. La infección se llevó a cabo en células de E. coli XL1–Blue MRF´, según

indicaciones del manual λZap Express.

f-dUTP

- 27 -

6.2.7. Hibridación

Se infectarón células de E. coli XL1-Blue MRF’ (según indicaciones del manual λZap

Express) con los fagos de la genoteca, aquí se obtuvieron ufp (unidades formadoras de

placas líticas), ya que se trata de fagos que infectarán las células de E. coli XL1-Blue MRF’,

por lo que los fagos siguen el ciclo lítico. Los fagos se adsorben a con membranas de nylon

cargadas positivamente, para lo cual se pusieron en contacto las membranas de nylon con

las placas de cultivo por duplicado, y se procedió a pasarlas por tres diferentes soluciones:

desnaturalización, neutralización y lavado, con la finalidad de separar el DNA que se pego en

las membranas, estabilizar la reacción y eliminar el exceso de las anteriores soluciones,

respectivamente. Posteriormente, las membranas de nylon se expusieron a luz UV, esto para

unir covalentemente el DNA a las membranas de nylon. Una vez fijo el ADN, se inició la

prehibridación, en donde las membranas de nylon con el DNA ya desnaturalizado se puso en

contacto con un buffer de hibridación, después se colocó la sonda molecular desnaturalizada

en contacto con las membranas y el buffer de hibridación, siguen lavados, con 1X SSC, al

0.1% con SDS y 0.5 X SSC 0.1% con SDS, finalmente sigue un paso muy importante que es

el bloqueo e incubación del anticuerpo que consiste en: la incubación de los filtros

sumergidos en una solución que contenía agente de bloqueo 1:10 en buffer A (100 mM Tris-

HCl, 300 mM NaCl pH 9.5) a temperatura ambiente con agitación durante 1h. Para la

incubación del anticuerpo se incubaron los filtros en una solución que contenía el conjugado

AP (fosfatasa alcalina anti-fluorescente dilución 1:5000 en ABS al 0.5% (p/v) en buffer A con

agitación suave durante 1h. Se realizó una serie de tres lavados para remover el conjugado

AP de 10 min. Cada uno en una solución de Tween 20 al 0.3% (v/v) en buffer A, al terminar

sigue la formación de señal y revelado.

6.2.8. Revelado de las placas

Este proceso se realizó en el cuarto de revelado bajo luz roja. Los filtros se colocaron sobre

papel filtro forrado de plástico (Klenn pack) con la cara de ADN hacia arriba se deben de

humedecer con agente de detección (CDP-star) durante 10 min. Posteriormente se desalojó

el agente de detección. Los filtros se cubrieron con plástico (Klenn pack) finalmente se

expusieron a una placa de rayos X (Kodak) durante 8 horas.

- 28 -

Para el revelado las placas se sumergieron en una solución de revelado hasta que se

observó la aparición de puntos obscuros sobre la placa, se enjuagaron las placas con agua

abundante, la placas se sumergieron en una solución fijadora y por ultimo se sometieron a

un último lavado con agua abundante entonces se dejaron secar al aire.

Con ayuda de los puntos asimétricos se logró orientar las placas y comparar cada una con

su duplicado con el fin de identificar señales que se duplicaron de manera idéntica en las dos

placas. Una vez que se identificaron las señales positivas se sobrepusieron en las cajas de

Petri que contenían el ADN expuesto identificando la placa correspondiente a la señal

positiva, esto indicará las ufp (unidades formadoras de placa), o clonas positivas.

6.2.9. Recuperación de las clonas seleccionadas (fago)

Después de identificar las ufp que presentaron una señal positiva, bajo condiciones de

esterilidad se picaron con un capilar obteniendo las ufp acompañadas de agar y carga

bacteriana, se colocaron en un Eppendorf estéril de 1.5 mL que contenía 1ml de buffer SM y

30µL de cloroformo, la mezcla se homogenizó inmediatamente con un vortex durante 9s

posteriormente se realizó dos veces más el procedimiento desde la hibridación para obtener

cada vez mas puro el gen, las placas líticas picadas del tercer tamizaje son ahora las clonas

seleccionadas, con las que se realizo la escisión in vivo.

6.2.10. Escisión in vivo de las clonas seleccionadas (fago)

Las clonas positivas después del tercer tamizaje se escindieron in vivo con el fin de trabajar

las clonas como plásmido y no como fagos, para evitarse así un procedimiento de

subclonación para la secuenciación del inserto. Después de la tercera etapa de purificación

se identificaron clonas positivas, éstas se aislaron con 500µL de SM, y 10µL de cloroformo,

se agitaron 9 segundos en vortex y se incubaron toda la noche a 40C.

Para llevar a cabo la escisión in vivo se mezcló lo siguiente en tubos estériles de 50 mL:

20 µL de XL1 Blue MRF´ D.O600=1.0. 300 µL de suspensión de cada una de las clonas

candidato en SM, 1 µL del Fago “cooperador” R408.

- 29 -

Los tubos se incubaron 15 min a 370C, se le añadieron 5 mL de medio 2TY (NaCl 1%,

Extracto de levadura 1%, Bactotriptona 1.6%, pH 7.5) y se incubaron toda la noche con

agitación 200 rpm. Las mezclas de escisión in vivo se calentaron 20 min a 700C para lisar

las bacterias, posteriormente se centrifugaron a 9,000 rpm X 5 min a 40C, los sobrenadantes

se decantaron en tubos estériles, se tomaron 200 µL de este sobrenadante y se mezclaron

con 300 µL de E.coli XL1 Blue MRF´ D.O= 1.0, los tubos se incubaron 15 min a 370C

posterior a este tiempo se le añadieron 300 µL de NZY 45 min a 370C y se tomaron 100 µL

de esta mezcla para plaquear en medio sólido LB-Kanamicina y se dejaron crecer toda la

noche a 370C; a las colonias que crecieron se les realizo una extracción de DNA plasmídico

según el protocolo de QIAGEN plasmid Midi Kits, posteriormente al DNA plasmídico se le

sometio a una digestión con Bam H1, para verificar la liberación del inserto para finalmente

secuenciar.

6.2.11. Análisis de la secuencia de las clonas seleccionadas (fago)

Debido a que la escisión in vivo se inició a realizar en diciembre, y por cuestiones del fago,

después de la técnica; no se pudo concluir si no hasta mediados de marzo, por lo tanto el

DNA plasmídico se mando a secuenciar la semana pasada, es por esto que aún no se tiene

un análisis de la secuencia, pero se espera en la siguiente semana.

6.2.12. Potencial aplicación de la acetil-xilan esterasa de Cellulomonas flavigena en alimento para ganado.

Para la realización de esta parte se consultaron artículos, páginas de Internet y libros, para

evaluar si la enzima acetil-xilan esterasa de C. flavigena al encontrarse en alimento para

ganado puede ayudar en la digestión en las vacas y los rumiantes en general, ya que ésta es

una enzima que no la tienen en forma natural dichos animales. Como se mencionó

anteriormente, la acetil-xilan esterasa es una enzima que ayuda a degradar las

ramificaciones acetiladas de la cadena principal de la hemicelulosa, por lo que le proporciona

a la vaca fragmentos más pequeños, que son de mayor asimilación, incrementando la

ingesta calórica de la vaca, por lo que es posible obtener una leche de mejor calidad;

además por las características de la enzima es posible que sea funcional bajo las

condiciones naturales de temperatura, pH y tensión de oxígeno en el rumen de la vaca.

- 30 -

7. RESULTADOS Y ANÁLISIS

7.1 Obtención de una sonda molecular por PCR. En la figura 12, se muestra la amplificación de la sonda molecular específica por PCR. La

sonda se esperaba de aproximadamente 0.45 Kb. Se realizó un gradiente de temperaturas, y

en los tres casos se obtuvo amplificación, como se muestra en la figura 12, por lo que se

decidió trabajar a la temperatura de 57.5 para realizar las siguientes amplificaciones.

Figura 12. Análisis electroforético de la amplificación por PCR de la sonda molecular específica a diferentes temperaturas de alineamiento (gradiente de temperatura); carril 1: 55.50C, carril 2: 57.50C, carril 3: 60.60C.

7.2 Purificación del producto de PCR.

Una vez verificado el tamaño de amplificación de la sonda molecular específica se realizó la

purificación del fragmento amplificado, esto para eliminar amplificaciones inespecíficas,

como se observa en la figura 13.a, se aprecia el gel de bajo punto de fusión usado para la

purificación del fragmento amplificado; en la figura 13.b, se aprecia el gel de comprobación

10.0 8.0 6.0 5.0 4.0

3.0 2.0 1.0 0.5

1 2 3

kDa

M

0.45 Kpb

CARRIL T( ºC ) 1 55.5

- 31 -

de la purificación esto para asegurarse de que se encontrara puro el fragmento amplificado y

para verificar que no se haya perdido la muestra en la purificación.

Figura 13. a) Análisis electroforético de la purificación de la sonda molecular específica, en

todos los carriles es la misma muestra; b) Análisis electroforético para comprobar la purificación, carril 1: elución 1, carril 2: elución 2.

7.3 Clonación de la sonda en el vector pDrive para el análisis de la secuencia.

Una vez que ya se obtuvo la sonda molecular específica pura, se tiene que analizar la

secuencia amplificada para asegurarse de que se amplificó exactamente el fragmento que se

desea. Para poder analizar la secuencia se necesitó introducir la sonda molecular específica

en el vector pDrive, por lo tanto se verificó que se haya insertado la sonda en dicho vector

como se muestra en la figura 14, donde se observa que en el carril 1 se encuentra un control

que es el vector pDrive que tiene un tamaño de 3.8 Kpb, en el segundo carril se observa el

plásmido (construcción) digerida con EcoRI, donde se aprecian dos bandas, una del tamaño

del vector pDrive y la segunda del tamaño de la sonda molecular específica; en el tercer

carril se observa el plásmido sin digerir y la banda que presenta se encuentra arriba de 4

Kpb, es decir los 3.8 Kpb del vector más lo 0.45 Kpb de la sonda que da un total de 4.25

M 1 2

kpb

10.0 8.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0

CARRIL 1 Elusión

1 2 Elusión

Sonda 0.45 Kpb

a) b)

- 32 -

Kpb; por lo que este gel demostró que efectivamente se tiene la sonda molecular específica

insertada en el plásmido.

Figura 14. Análisis electroforético de la liberación del inserto (sonda molecular específica), carril 1: pDrive, carril 2: digestión de la construcción, carril 3: plásmido sin digerir.

7.4 Marcaje de la sonda molecular.

Una vez que se analizó la secuencia y se verificó que si era la sonda buscada, se procedió a

marcarla con fluoresceína, como se observa en la figura 15, el círculo es la sonda marcada

sobre una membrana de nylon, que se observa en un transluminador de luz U.V.

Figura 15. Sonda molecular específica marcada con fluoresceína vista en un transluminador UV.

1 2 3 M kpb

10.0 8.0 6.0 5.0 4.0

3.0 2.0 1.0 0.5

CARRIL 1) pDrive 2) Digestión del plásmido

3) Plásmido sin digerir.

0.45 Kpb

- 33 -

7.5 Tamizajes

Una vez que se tuvo la sonda molecular marcada con fluorescencia, se realizaron tres

tamizajes para purificar las clonas con señales positivas. Señal positiva es cuando se

observa en las placas fotográficas manchas oscuras y nítidas por duplicado, como se

muestra en las figuras 16, 18, y 20 para el primero, segundo y tercer tamizajes,

respectivamente. Pero para comprobar que las clonas seleccionadas tengan al menos la

secuencia homóloga a la sonda y de que no son falsos positivos se les realizó amplificación

por PCR con los oligonucleótidos diseñados para amplificar la sonda molecular, por lo que se

buscó que amplificará un fragmento del tamaño de la sonda (0.45 Kb) como se observa en

las figuras 17, 19 y 21, para el primero, segundo y tercer tamizaje, respectivamente.

Figura 16. Placas fotográficas representativas del primer tamizaje de la biblioteca genómica de Cellulomonas flavigena.

- 34 -

Figura 17. Gel de amplificación por PCR con oligonucleótidos diseñados, de las clonas seleccionadas del primer tamizaje, carril 1: clona G1-3, carril 2: clona G4-1, carril 3: clona G4-3.

Figura 18. Placas Fotográficas representativas del segundo tamizaje de la biblioteca genómica de Cellulomonas flavigena de la clona G4-3.

10.0 8.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.5

kpb

M 1 4 5 CARRIL 1) G1-3

4)) G4-1 5)) G4-3

0.45Kpb

0.45 Kpb

- 35 -

Figura 19. Análisis electroforético de la amplificación por PCR con oligonucleótidos diseñados, de las

clonas seleccionadas del segundo tamizaje.

Figura 20. Placas Fotográficas representativas del tercer tamizaje de la biblioteca genómica de Cellulomonas flavigena de la clona G4-3b.

10.0 8.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.5

kpb

M 1 2 3 4 5 6 7 8

0.45Kpb

CARRIL 1) G1-5a

2) G1-5d 3) G2-1a 4) G4-3c 5) G4-3b 6) G1-5b 7) G1-3c 8) G4-3a

- 36 -

Figura 21. Análisis electroforético de la amplificación por PCR con oligonucleótidos diseñados, de las clonas seleccionadas del tercer tamizaje.

A las tres clonas seleccionadas del tercer tamizaje, que presentaron amplificación en 0.45

Kpb, como se muestra en la figura 21, se seleccionaron para realizar la escisión in vivo, para

posteriormente analizar la secuencia de dichas clonas.

7.6 Escisión in vivo de las clonas seleccionadas.

Se realizo la escisión in vivo de las tres clonas seleccionadas, pero la única de la que se

obtuvieron colonias fue la clona α, seleccionando dos de éstas clonas, nombrándolas α1 y

α2; en la figura 22 se muestra el DNA plasmídico en el primer carril, posteriormente la

digestión con BamH1, y en el siguiente la amplificación de la sonda molecular con los

primers de diseño y como molde el DNA plamídico; de α1 y α2, respectivamente.

0.45Kpb

10.0 8.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.75 0.5

CARRIL 1) G4-3bα

2) G4-3bδ 3) G4-3bθ

1 2 3 M

kb

- 37 -

Figura 22. Análisis electroforético de la escisión in vivo, de las subclonas α1 y α2; carril 1: DNA plasmídico de α1, carril 2: digestión con Bam H1 de α1, carril 3: amplificación por PCR de α1 con los oligonucleótidos diseñados para amplificación de la sonda molecular, carril 4: DNA plasmídico de α2, carril 5: digestión con Bam H1 de α2, carril 6: amplificación por PCR de α2 con los oligonucleótidos diseñados para amplificación de la sonda molecular.

7.7 Análisis de la secuencia de nucleótidos de las clonas seleccionadas.

Las subclonas α1 y α2 que se secuenciaron resultaron ser la misma, ya que presentaron la

misma secuencia de nucleótidos. El análisis de homología a nivel de aminoácidos del

producto deducido de las clonas α1 y α2, mediante el programa BLAST Y CLUSTALW,

mostró que la clona α no presenta homología con el gen codificante para acetil xilan

esterasa, sino con una proteína del sistema de transporte ABC. Este sistema participa en

0.45Kpb

M

10.0 8.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.5

kb

1 2 3 4 5 6 CARRIL 1) α1DNA plamídico

2) α1 Digestión Bam H1 3) α1 PCR

4) α2DNA plamídico 5) α2 Digestión Bam H1 6) α2 PCR

- 38 -

trasporte de oligosacaridos, tales como celobiosa o xilobiosa, al interior de la célula, para su

posterior hidrólisis en los monosacáridos correspondientes.

Tabla 3. Secuencias encontradas de las clonas seleccionadas

Score E-value

tr A1SNM8 _NOCSJ Binding-protein-dependent transport systems inne... 135 4e-31

tr A1R206 _ARTAT Putative alpha-glucosides ABC transporter, perme... 128 9e-29

tr A1SNM8 _NOCSJ Binding-protein-dependent transport systems inne... 128 9e-29

tr A3TKE5 _9MICO ABC-type glucosylglycerol transport system perme... 125 6e-28

tr A1R206 _ARTAT Putative alpha-glucosides ABC transporter, perme... 122 6e-27

tr A1GD81 _9ACTO Binding-protein-dependent transport systems inne... 121 9e-27

tr Q0L4X7 _9ACTO Binding-protein-dependent transport systems inne... 119 4e-26

tr A3TKE5 _9MICO ABC-type glucosylglycerol transport system perme... 119 4e-26

tr A1GD81 _9ACTO Binding-protein-dependent transport systems inne... 114 2e-24

tr Q0L4X7 _9ACTO Binding-protein-dependent transport systems inne... 111 9e-24

tr A4AFT2 _9ACTN ABC-type glucosylglycerol transport system perme... 110 2e-23

tr Q47MF1 _THEFY ABC-type glucosylglycerol transport system perme... 109 4e-23

tr Q3DVN1 _CHLAU Binding-protein-dependent transport systems inne... 105 6e-22

tr A4AFT2 _9ACTN ABC-type glucosylglycerol transport system perme... 104 1e-21

tr A1SNM9 _NOCSJ Binding-protein-dependent transport systems inne... 74 6e-12

tr Q0L4X8 _9ACTO Binding-protein-dependent transport systems inne... 74 6e-12

tr A1SNM9 _NOCSJ Binding-protein-dependent transport systems inne... 74 3e-12

tr Q0L4X8 _9ACTO Binding-protein-dependent transport systems inne... 74 3e-12

tr A1GD82 _9ACTO Binding-protein-dependent transport systems inne... 72 6e-12

El aislamiento del gen relacionado con el sistema de transporte ABC, puede ser debido a

que la sonda utilizada en el tamizaje, hibridó de manera inespecífica, esto probablemente

debido al alto contenido de nucleótidos G/C en el genoma de C. flavigena, que es de

aproximadamente 73%. Con la finalidad de aumentar la especificidad de la hibridación, y de

esta forma evitar el aislamiento de genes no relacionados ó diferentes al gen de interés, en

lo sucesivo llevaremos a cabo los experimentos de hibridación bajo condiciones más

estrictas, por ejemplo aumentando la temperatura de los lavados de 60 a 65-70 ºC; es decir,

5 a 10 ºC arriba de la temperatura de lavado actual.

Dicha propuesta ya no fue posible realizarla por falta de tiempo, pero es útil para las

personas que continúen dicho trabajo.

- 39 -

7.8 Potencial aplicación de acetil-xilan esterasa de Cellulomonas flavigena en alimento para ganado

Cuando una vaca come, mastica sólo lo suficiente para tragar la comida. Esta pasa a los dos

primeros estómagos, el rumen y el retículo, figura 23.

El rumen ó panza es el estómago más grande, junto con el retículo tienen una capacidad de

200 litros en los animales adultos. Aquí se lleva a cabo la fermentación del alimento por

medio de microorganismos que se encargan de hacer digeribles la fibra y los carbohidratos

de los forrajes.

Cuando la vaca se siente llena deja de comer. Luego devuelve a la boca bolas de comida

medio masticadas, llamadas bolo alimenticio. La vaca las vuelve a masticar (a esto se le

llama rumia) y después las vuelve a tragar.

Las partículas pequeñas del alimento rumiado pasan al omaso ó libro, donde son molidas en

partículas más finas. En el abomaso o cuajar se agregan enzimas al alimento para llevar a

cabo la digestión propiamente dicha, aquí el proceso es igual al de animales no rumiantes,

pasando después a los intestinos para seguir procesos de digestión y absorción de

nutrientes (figura 23).

Figura 23. Digestión de la vaca

Los carbohidratos son la fuente más importante de energía y de los principales precursores

de grasa y azúcar (lactosa) en la leche de la vaca. Los microorganismos, que son del género

- 40 -

Ruminococcus, en el rumen permiten a la vaca obtener energía de los carbohidratos fibrosos

(celulosa y hemicelulosa) que son ligados a la lignina en las paredes de las células de

plantas. La fibra es voluminosa y se retiene en el rumen donde la celulosa y la hemicelulosa

fermentan lentamente. Mientras que madura la planta, el contenido de lignina de la fibra

incrementa y el grado de fermentación de celulosa y hemicelulosa en el rumen se reduce. La

presencia de fibra en partículas largas es necesaria para estimular la ruminación. La

ruminación aumenta la separación y fermentación de fibra, estimula las contracciones del

rumen y aumenta el flujo de saliva hacia el rumen. La saliva contiene bicarbonato de sodio y

fosfatos que ayudan a mantener la acidez (pH) del contenido del rumen en un pH casi

neutral. En los casos en los que faltan fibra suficiente resultan en un porcentaje bajo de

grasa en la leche y contribuyen a desordenes de digestión, tales como desplazamiento del

abomaso y acidosis del rumen.

Los carbohidratos no-fibrosos (almidones y azúcares) fermentan rápidamente y

completamente en el rumen. El contenido de carbohidratos no-fibrosos incrementa la

densidad de calorías en la dieta, y así mejora el suministro de energía y determina la

cantidad de proteína bacteriana producida en el rumen. Sin embargo, los carbohidratos no-

fibrosos no estimulen la ruminación ó la producción de saliva y cuando se encuentran en

exceso pueden inhibir la fermentación de fibra.

Así, el equilibrio entre carbohidratos fibrosos y no-fibrosos es importante en alimentar las

vacas lecheras para la producción eficiente de leche. La Figura 24 resume la transformación

de carbohidratos en varios órganos. En la vaca lactante, el rumen, el hígado y la glándula

mamaria son los principales órganos involucrados en el metabolismo de carbohidratos.

Durante la fermentación rumenal, la población de microorganismos, principalmente bacteria,

fermenta los carbohidratos para producir energía, gases (métano - CH4 y bióxido de carbón -

CO2), calor y ácidos. El ácido acético (vinagre), ácido propiónico y ácido butírico son ácidos

grasas volátiles (AGV) y conformen la mayoría (>95%) de los ácidos producidos en el rumen.

También la fermentación de aminoácidos generados en el rumen produce ácidos, llamados

iso-ácidos. La energía y los iso-ácidos producidos durante la fermentación son utilizados por

las bacteria para crecer (es decir principalmente para sintetizar proteína). El CO2 y CH4 son

eructados, y la energía todavía presente en el CH4 se pierde. Si no es necesario para

- 41 -

mantenimiento de la temperatura del cuerpo, el calor producido durante fermentación se

disipa.

Figura 24. Transformación de carbohidratos en varios órganos de la vaca.

- 42 -

Los AGV son productos finales de la fermentación microbiana y son absorbidos a través de

la pared del rumen. La mayoría de el acetato y todo el propionato son transportados al

hígado, pero la mayoría del butirato se convierte en la pared del rumen a una cetona que se

llama [beta]-hidroxibutirana. Las cetonas son la fuente principal de energía (combustible)

para la mayoría de tejidos del cuerpo. Las cetonas provienen principalmente del butirato

producido en el rumen, pero en las etapas iniciales de lactancia vienen también de la

movilización de tejidos adiposos.

En el rumen podemos encontrar bacterias, hongos y protozoos. Las bacterias del rumen se

caracterizan en base a su morfologia (coco, bacilo, espiroqueta, etc), el sustrato que utilizan

(celulosa, almidón, lactato, pectinas, etc.) y los productos de la fermentación que se obtienen

(acetato, lactato, formiato, succinato, etc.) entre otros factores. Muchos de ellos están ligados

formando sintrofias (cadenas de degradacion, una especie de simbiosis). La misión de las

bacterias es degradar substancias en otras que serán aprovechadas por otras bacterias ó

por la vaquita ó rumiante en cuestión. Pero la función más importante es degradar la

celulosa. También están las que tienen como producto el metano. Los protozoos son en su

mayor parte ciliados y se comen los fragmentos más grandes. Hongos y protozoos están en

una proporción mucho menor y no son del todo esenciales, pero mejoran el proceso.

Se coincide en que la celulosa — el componente mayoritario de la pared de la célula vegetal

— es el compuesto orgánico más abundante en el mundo y probablemente el más barato.

Sin embargo, sólo los microorganismos pueden utilizar la celulosa como substrato y, por lo

tanto, convertirla en algo útil.

La vaca y otros rumiantes son fábricas andantes que utilizan los microorganismos para

convertir la celulosa en carne y leche. Estos rumiantes obtienen la celulosa (y pequeñas

cantidades de otros substratos) al ingerir hierba y otros forrajes que mastican para

desmenuzarlos en pequeñas porciones que llegan al rumen, la gran cámara del estómago,

constituido por cuatro compartimientos. Asimismo, se han demotrado que el rumen de la

vaca funciona como un quimiostato, un sistema que se utiliza para cultivar microorganismos.

Los nutrientes llegan de forma continua al rumen, donde los microorganismos crecen y parte

de su contenido pasa continuamente al sistema digestivo. Esto no significa que las vacas

estén siempre comiendo. Por el contrario, los rumiantes aportan nutrientes al rumen de

manera regular, rumiando el forraje, es decir, masticando el forraje regurgitado. Cuando

mastican, fluyen al rumen fragmentos de forraje suspendidos en la saliva. La vaca no rumia

siempre que no esté comiendo, pero el aporte de nutrientes al rumen es esencialmente

- 43 -

continuo porque los fragmentos sólidos de celulosa actúan como reservorios de nutrientes

para los microorganismos (Hungate et al. 1997).

A pesar de que la vaca contiene enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas, no se ha

encontrado la enzima acetil-xilan esterasa, ya que al adicionar dicha enzima en el alimento

para ganado mejoraría considerablemente la digestión de los rumiantes, así como la

producción de leche en el caso de las vacas, ya que como se mencionó anteriormente, dicha

enzima cataliza la hidrólisis de las ramificaciones acetiladas de la cadena principal de la

xilana, además de que esta enzima al ser de la familia 11 tiene condiciones óptimas de

actividad en las condiciones naturales del rumen, esto en cuanto a pH.

En el mercado ya existen enzimas comerciales que se agregan en alimento para ganado,

entre éstas encontramos las de la empresa Rovabio™, una combinación única de 19

enzimas totalmente compatibles entre si, producidas por el Pennicillium funiculosum, en la

figura 25 se muestra el tipo de sustrato que degradan dichas enzimas y el beneficio que

ofrecen las enzimas al degradar dichos sustratos; los beneficios que ofrece la empresa al

usar las enzimas son:

• Una mejor eficacia alimenticia.

• Un aumento de peso en matadero en aves y cerdos.

• Una mejor homogeneidad de los animales.

• Mejores condiciones de cría.

Figura 25. Sustratos que degradan las enzimas de la empresa Rovabio™ y los beneficios de la acción

enzimática.

- 44 -

También existe otro producto comercial, el Hydroenzime, que es un suplemento concentrado

de 8 enzimas y 4 probióticos para ser usada opcionalmente en el agua de beber o en el

alimento, empleado con el objeto de lograr una digestión eficaz y completa, mejorando

substancialmente la absorción de nutrientes. La Hydroenzime se dosifica en la primera agua

de beber de cada día a razón de un sobre diario de 75, haciendo una dilución previa en 2

litros de agua antes de verterla en el tanque de agua. Para alimento la dosis es de 100 ppm

(100 gramos por ton).

Tabla 4. Niveles mínimos garantizados de enzimas y probióticos

Enzima UNIDADES / KG

Probióticos UFC/KG- Min.

Proteasa 1,000,000 Lactobacilus Acidofilus

90.000.000.000

Amilasa 7,500,000 Bifedobacterium Thermophilum

90.000.000.000

Celulasa 400.000 Bifedobacterium Longum

90.000.000.000

Peptinasa 200.000 Streptococus Faecium

90.000.000.000

Lipasa 300.500 Lactasa 5.000 Xylanasa 40,000 Fitasa 2,200

Pero a pesar de que ya existe un gran número de enzimas comerciales, no se encuentra

todavía la enzima acetil-xilan esterasa, como lo es la de Cellulomonas flavigena, que si se

agregara a un cóctel enzimático, como los anteriormente mencionados se tendrían mejores

resultados en cuanto a la digestibilidad de el alimento y por lo tanto al uso de materias

primas más económicas, lo que trae por consiguiente un ahorro en el alimento y por lo tanto

se puede reducir el costo de los productos derivados del animal, como lo son la carne y la

leche.

Pensar en un proceso de purificación de la acetil-xilan esterasa de Cellulomonas flavigena,

elevaría los costos, ya que todo proceso de purificación es costoso y más si hablamos de

enzimas ya que requieren de columnas cromatográficas las cuales son sofisticadas y

costosas; por lo tanto se propone no separar la enzima acetil-xilan esterasa del resto de la

xilanasa, ya que esta enzima además beneficiaria también a la digestibilidad de los animales,

- 45 -

ya que como se muestra en las tablas 4 y 5, dicha enzima tiene una uso comercial en

alimento para ganado; por lo tanto, la xilanasa de Cellulomnas flavigena que contiene un

dominio deacetil que pertenece a la acción enzimática de una acetil-xilan esterasa,

únicamente se separaria de la célula, con un rompimiento celular, y así se evitarían los

costros extras y los ganaderos podrian hacer el gasto de los aditamentos ya que se les

reduce el de el alimento, y no se elevaría en nada el costo actual de la carne y el queso (ver

anexo).

Tabla 5. Acción de las enzimas comerciales en alimento para ganado

Proteína + Proteasa = Peptina + Aminoácidos Almidón + Amilasa = Glucosa Celulosa + Celulasa = Glucosa + Celubiosa Grasa + Lipasa = Glicerina Peptina + Peptinasa = Acido Galactutónico Lactosa + Lactasa = Glucosa + Galactosa Xilanasa + Xilans = Xilosa + Reducción

de digesta

- 46 -

8. CONCLUSIONES

• Se diseñaron oligonucleótidos del dominio deacetil esterasa.

• Se amplificó por PCR una sonda molecular específica de 0.45 Kb.

• La sonda molecular específica permitió realizar tres tamizajes de la biblioteca

genómica de C. flavigena.

• Se seleccionaron 3 clonas candidatas del tercer tamizaje, las cuales podrían

contener secuencias codificantes para el gen acetil-xilan esterasa de C. flavigena.

• Se realizo la escisión in vivo de la clona α, obteniendo dos colonias, α1 y α2.

• Se extrajo el DNA plasmídico de α1 y α2.

• Se libero el inserto de α1 y α2.

• Se pudo amplificar por PCR la sonda molecular de 0.45 Kb con los

oligonucleótidos diseñados específicamente del dominio deacetil esterasa.

• Se clono en E. coli XL1 Blue MRF´el gen codificante para una acetil-xilan esterasa

de Cellulomonas flavigena.

• La evaluación de la aplicación de la acetil-xilan esterasa como posible aditivo del

pienso para ganado indica que seria rentable y no afectaría en los costos finales

de la carne y la leche.

- 47 -

9. BIBLIOGRAFIA

1) Akin, D. E. y L. L. Rigsby. 1985. Influence of phenolic acids on rumen fungi. Agron. J. 77:

180-182.

2) Akin, D. E. y R. Benner. 1988. Degradation of polysaccharides and lignin by ruminal

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3) Beg, Q. K., Bhushan, B., Kapoor, M. Hoondal, G. S. 2001. Enhanced producción of a

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5) Ferrer. J. E. Agranco Corp. (Estados Unidos)

Productos para la alimentación animal: Suplementos enzimáticos.

Absorventes de micotoxinas selectiva de fusarium y aspergillus

Además productos para el procesamiento de alimentos e industrias de la caña de azúcar

y agrícola. http://www.engormix.com/hydroenzime_s_products780-3882.htm

6) Flint, H. J., 1994. Degradation of plant cell wall polysaccharides by rumen bacteria. pp.

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8) Hidalgo-Lara ME, Farrés GS, Montes-Horcasitas MC 2005. β- Methyl-xyloside: positive

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9) Jiménez B. N 2005. Trabajo de Proyecto de Investigación, “Obtención por PCR de una

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11) Kazuya, H., Youchi, N., Taksuro, M., Nachiro, M., Tai, U., Heido, S., Kazuo, K. and

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- 49 -

18) P. Biely, G. L. Côté, L. Kremnický, R. V. Greene and M. Tenkanen, 1997. Action of

acetylxylan esterase from Trichoderma reesei on acetylated methyl glycosides FEBS

Letters, Volume 420, Issues 2-3, Pages 121.

19) P. Biely, G. L. Côté, L. Kremnický, R. V. Greene, C. Dupont and D. Kluepfel, 1996.

Substrate specificity and mode of action of acetylxylan esterase from Streptomyces

lividans FEBS Letters, Volume 396, Issues 2-3, Pages 257-260.

20) P. Biely, Gregory L. Côté, Lubomír Kremnický, David Weisleder and Richard V. Greene

(5 December 1996) Substrate specificity of acetylxylan esterase from Schizophyllum

commune: mode of action on acetylated carbohydrates Biochimica et Biophysica Acta

(BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology, Volume 1298, Issue 2, Pages 209-

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flavigena on sugar cane bagasse. Appl Microbiol Biotechnol 58:435–438

- 50 -

ANEXO Costos mínimos y máximos de carne en México

Artículo Tienda Mínimo Tienda Máximo Bistec de Diezmillo de Res, 1 Kg. Granel

COMERCIAL MEXICANA BODEGA 57.20 MERCADO PUBLICO 69.00

Bistec de Espaldilla de Res, 1 Kg. Granel

COMERCIAL MEXICANA BODEGA 57.20 MERCADO PUBLICO 69.00

Cabeza de Cerdo, 1 Kg. Granel BODEGA AURRERA 16.50 MERCADO PUBLICO 20.00 Carne Molida de Cerdo, 1 Kg. Granel. O Pulpa Molida BODEGA AURRERA 43.00 MERCADO PUBLICO 54.00

Carne Molida de Res, 1 Kg. Granel. popular/comercial

COMERCIAL MEXICANA BODEGA 43.10 MERCADO PUBLICO 68.00

Chuleta de Cerdo, 1 Kg. Granel MERCADO PUBLICO 53.00 SUMESA 67.22 Chuleta de Res/chuleta Costilla/chuleton, 1 Kg. Granel MERCADO PUBLICO 70.00 SUPERAMA 77.00

Espinazo de Cerdo, 1 Kg. Granel

MERCADO SOBRE RUEDAS 37.00 SUPERAMA 59.00

Falda de Res, 1 Kg. Granel O Para Deshebrar BODEGA AURRERA 56.33 MERCADO PUBLICO 69.00

Filete de Res, 1 Kg. Granel. COMERCIAL MEXICANA BODEGA 154.90 SUPERAMA 172.00

Higado de Res, 1 Kg. Granel COMERCIAL MEXICANA BODEGA 11.90 MERCADO PUBLICO 26.00

Lomo de Cerdo, 1 Kg. Granel / Caña de Lomo / en Trozo MERCADO PUBLICO 50.00 COMERCIAL

MEXICANA BODEGA 74.90

Milanesa de Cerdo, 1 Kg. Granel SUMESA 45.20 MERCADO PUBLICO 54.00

Milanesa de Res, 1 Kg. Granel MERCADO SOBRE RUEDAS 60.00 SUPER G 70.90

Milanesa de Ternera, 1 Kg. Granel WAL MART 83.67 SUPERAMA 89.00

Panza O Menudo de Res, 1 Kg. Granel. Cocidos MERCADO PUBLICO 30.00 SUMESA 35.60

Panza O Menudo de Res, 1 Kg. Granel. Crudos BODEGA AURRERA 17.50 SUMESA 23.36

Pata de Cerdo, 1 Kg. Granel MERCADO SOBRE RUEDAS 14.00 SUPERAMA 20.90

Pechuga de Pavo, Alpino. Pavino, 1 Kg. Granel. Ahumada BODEGA AURRERA 91.00 SUPER G 102.00

Pechuga de Pollo, 1 Kg. Granel con Hueso O Anatomica

MERCADO SOBRE RUEDAS 38.00 SUMESA 49.90

Pierna de Cerdo Entera/pernil, 1 Kg. Granel con Hueso

COMERCIAL MEXICANA BODEGA 40.60 SUPERAMA 46.00

Pierna de Pollo, 1 Kg. Granel. O Pierna Bate MERCADO PUBLICO 22.00 GIGANTE 32.90

- 51 -

Pollo Entero, 1 Kg. Granel. con Viceras O Tipo Super GIGANTE 20.45 SUPER G 23.90

Pulpa de Ternera, 1 Kg. Granel WAL MART 86.00 SUPERAMA 87.50 Retazo C/hueso de Res, 1 Kg. Granel

MERCADO SOBRE RUEDAS 37.00 MERCADO PUBLICO 45.00

Costos mínimos y máximos de carne en México Formula Lactea, Nan 2, en Polvo Para Lactante. Lata 400 Gr. IMSS 68.49 SUPERAMA 73.50

Formula Lactea, Nutrileche, Ultrapasteurizada. con Grasa Vegetal. Caja 1 Lt.

IMSS 8.16 SUMESA 8.47

Leche Pasteurizada, Al-dia, Entera. Botella 1 Lt. WAL MART 9.10 BODEGA

AURRERA 9.15

Leche Pasteurizada, Alpura. Clasica, Entera. Caja 1 Lt. WAL MART 9.19 SUMESA 9.38

Leche Pasteurizada, Alpura. Semi, Parcialmente Descremada. Caja 1 Lt.

BODEGA AURRERA 9.20 SUMESA 9.38

Leche Pasteurizada, Lala, Semi-descremada. Bolsa 1 Lt. WAL MART 8.48 SUMESA 8.67

Leche Pasteurizada, Lala. Facil Digestion, Semidescremada. Deslactosada. Caja 1 Lt.

GIGANTE 10.00 SUMESA 11.22

Leche Pasteurizada, Lala. Light, Parcialmente Descremada. Botella 1.89 Lt.

BODEGA AURRERA 17.40 SUMESA 17.75

Leche Pasteurizada, Lala. Light, Parcialmente Descremada. Caja 1 Lt.

BODEGA AURRERA 9.20 SUMESA 9.38

Leche Pasteurizada, Lala. Premium, Entera. Botella 1.89 Lt. WAL MART 17.36 BODEGA

AURRERA 17.40

Leche Pasteurizada, Lala. Premium, Entera. Botella 3.78 Lt. WAL MART 33.92 BODEGA

AURRERA 34.00

Leche Pasteurizada, Lala. Premium, Entera. Caja 1 Lt. WAL MART 9.18 MERCADO

PUBLICO 9.50

Leche Ultrapasteurizada, Alpura 2000. Clasica, Parcialmente Descremada. Caja 1 Lt.

BODEGA AURRERA 10.00 MERCADO

PUBLICO 10.25

Leche Ultrapasteurizada, Alpura 2000. Deslactosada, Parcialmente Descremada. de Facil Digestion. Caja 1 Lt.

BODEGA AURRERA 11.00 SUMESA 11.22

Leche Ultrapasteurizada, Alpura 2000. Light Extra, Parcialmente Descremada. Caja 1 Lt.

BODEGA AURRERA 11.00 SUMESA 11.22

Leche Ultrapasteurizada, Alpura 2000. BODEGA 10.00 SUMESA 10.20

- 52 -

Light, Parcialmente Descremada. Baja en Grasa. Caja 1 Lt.

AURRERA

Leche Ultrapasteurizada, Alpura 2000. Light. Deslactosada, Parcialmente Descremada. Caja 1 Lt.

BODEGA AURRERA 11.00 SUMESA 11.22

Leche Ultrapasteurizada, Alpura 2000. Semi, Parcialmente Descremada. Caja 1 Lt.

BODEGA AURRERA 10.00 SUMESA 10.20

Leche Ultrapasteurizada, Alpura 2000. Sin Colesterol, con Grasa Vegetal. Caja 1 Lt.

BODEGA AURRERA 11.00 SUMESA 11.22

Leche Ultrapasteurizada, Alpura Lac Del, Entera. Caja 1 Lt. IMSS 10.00 IMSS 10.00

Leche Ultrapasteurizada, Fortileche, con Grasa Vegetal. Caja 1 Lt.

BODEGA AURRERA 8.30 SUMESA 8.47

Leche Ultrapasteurizada, Lala. Light, Parcialmente Descremada. Caja 1 Lt.

BODEGA AURRERA 10.00 SUMESA 10.20

Leche Ultrapasteurizada, Lala. Premium, Entera. Caja 1 Lt.

BODEGA AURRERA 10.00 SUMESA 10.20

Leche Ultrapasteurizada, Lala. Semi, Semidescremada. Adicionada C/vitaminas a y D. Caja 1 Lt.

SUMESA 9.50 BODEGA AURRERA 10.00

Leche Ultrapasteurizada, Lala. Siluette Plus, Descremada. Caja 1 Lt.

BODEGA AURRERA 10.45

COMERCIAL MEXICANA BODEGA

11.00

Leche Ultrapasteurizada, Lala. Vive Deslactosada, Semidescremada. Facil Digestion. Caja 1 Lt.

IMSS 10.93 SUMESA 11.22

Leche Ultrapasteurizada, Parmalat, Entera. Adicionada con Vitamina a y D. Caja 1 Lt. (Letras Rosas)

BODEGA AURRERA 9.70 BODEGA

AURRERA 9.70

Leche Ultrapasteurizada, Parmalat, Semidescremada. Adicionada con Vitamina a y D. Caja 1 Lt. (Letras Azules)

BODEGA AURRERA 9.70 BODEGA

AURRERA 9.70

Leche Ultrapasteurizada, San Marcos, Semidescremada. Caja 1 Lt.

BODEGA AURRERA 10.00 BODEGA

AURRERA 10.00

Leche Ultrapasteurizada, Svelty. Nestle, Descremada. con Lactofibras. Caja 1 Lt.

SUMESA 11.09 GIGANTE 12.10

Leche en Polvo, Alpura, Bolsa 500 Gr. BODEGA AURRERA 31.20 IMSS 36.49

Leche en Polvo, Alpura, Lata 1800 Gr. COMERCIAL MEXICANA BODEGA

108.13 GIGANTE 121.62

Leche en Polvo, Alpura. Kids, Niños. Bolsa 500 Gr.

COMERCIAL MEXICANA BODEGA

34.16 IMSS 40.47

Leche en Polvo, Alpura. Kids, Niños. BODEGA 125.00 IMSS 142.45

- 53 -

Lata 1,800 Gr. AURRERA Leche en Polvo, Carnation. Clavel, Bolsa 500 Gr. SUPERPRECIO 29.30 SUPERAMA 33.00

Leche en Polvo, Fortileche, Bolsa 500 Gr.

BODEGA AURRERA 26.62 SUMESA 30.80

Leche en Polvo, Nido, Lata 1.8 Kg. IMSS 117.00 BODEGA AURRERA 124.00

Leche en Polvo, Nido, Lata 400 Gr. WAL MART 28.95 SUPERAMA 29.28 Leche en Polvo, Nido, Lata 900 Gr. GIGANTE 62.50 SUPERAMA 67.00

Leche en Polvo, Nido, Niños. Calci-n. 6 +. Lata 900 Gr. IMSS 71.24

COMERCIAL MEXICANA BODEGA

76.50

Leche en Polvo, Nido, Niños. Lactohierro. 3+. Lata 900 Gr. SUPERPRECIO 73.70

COMERCIAL MEXICANA BODEGA

76.50

Leche en Polvo, Nido. Kinder, Niños. Fortalecimiento. 1+. Prebio 1. Lata 1.8 Kg.

BODEGA AURRERA 138.00 SUPERAMA 145.00

Leche en Polvo, Nido. Kinder, Niños. Fortalecimiento. 1+. Prebio 1. Lata 400 Grs.

WAL MART 34.98 SUPERAMA 35.90

PROFECO, 2007.